JPWO2009069702A1 - Method for producing γ-aminobutyric acid - Google Patents
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Abstract
本発明は、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートすることによりγ−アミノ酪酸を生成させるγ−アミノ酪酸の製造方法を提供する。The present invention provides a method for producing γ-aminobutyric acid which produces γ-aminobutyric acid by incubating a liquid containing barley pulverized product, glutamic acid or glutamate and water.
Description
本発明は、γ−アミノ酪酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing γ-aminobutyric acid.
大麦は健康食材として注目されているが、商品として流通するのは、大麦の種子から表層部が削り取られた剥皮大麦又は精白大麦であり、これらの製造過程では、副産物として大量の大麦糠が生じる。大麦糠は、主に家畜の飼料として利用されているが、その流通価格は非常に低いため、一部は廃棄処分されているのが現状である。 Barley is attracting attention as a health food ingredient, but it is peeled barley or milled barley from which the surface layer has been scraped off from barley seeds, and a large amount of barley straw is produced as a by-product in these manufacturing processes. . Barley straw is mainly used as livestock feed, but the distribution price is very low, so some are currently disposed of.
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、動植物界に広く分布しているアミノ酸の一種で、哺乳動物の脳や脊髄に存在する神経伝達物質である。γ−アミノ酪酸は、脳の血流を活発にし、酸素供給量を増加させ、脳細胞の代謝機能を亢進するため、脳卒中後遺症や脳動脈硬化症等による頭痛、耳鳴り、記憶障害、意欲低下等の改善に効果があるとされている。さらに最近では、γ−アミノ酪酸は、抗利尿ホルモンの分泌を抑制し、利尿作用を活性化するため、血圧を下げる効果があることにも注目されている。 γ-aminobutyric acid (GABA) is a kind of amino acid widely distributed in the animal and plant kingdoms, and is a neurotransmitter present in the brain and spinal cord of mammals. γ-Aminobutyric acid activates blood flow in the brain, increases oxygen supply, and enhances the metabolic function of brain cells. It is said that it is effective for improvement. More recently, γ-aminobutyric acid is also attracting attention because it suppresses the secretion of antidiuretic hormone and activates the diuretic action, thus lowering blood pressure.
γ−アミノ酪酸は、グルタミン酸がグルタミン酸脱炭酸酵素と反応することによって生成され、補酵素としてピリドキサルリン酸が存在すれば、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が顕著に高まることが報告されている（特許文献１）。 It has been reported that γ-aminobutyric acid is produced by the reaction of glutamic acid with glutamic acid decarboxylase, and if pyridoxalphosphate is present as a coenzyme, the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid is significantly increased. (Patent Document 1).
γ−アミノ酪酸の製造方法としては、乳酸菌（特許文献２）や麹菌（特許文献３）にグルタミン酸を加えて培養し、菌自身にγ−アミノ酪酸を生産させる方法、グルタミン酸を含む液に米胚芽又は胚芽を含む米糠を添加して、米胚芽に含まれるグルタミン酸脱炭酸酵素を利用してγ−アミノ酪酸を生成させる方法（特許文献４）、さらには、グルタミン酸を含む液に米糠と酵母を添加し、米糠に含まれるグルタミン酸脱炭酸酵素と酵母に含まれるピリドキサルリン酸とを利用し、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を高めてγ−アミノ酪酸を生成させる方法（特許文献５）等が報告されている。 As a method for producing γ-aminobutyric acid, a method in which glutamic acid is added to lactic acid bacteria (Patent Document 2) and Neisseria gonorrhoeae (Patent Document 3) and cultured to produce γ-aminobutyric acid by itself, rice germ in a liquid containing glutamic acid Alternatively, a method of adding rice bran containing germ and generating γ-aminobutyric acid using glutamic acid decarboxylase contained in rice germ (Patent Document 4), and further adding rice bran and yeast to a solution containing glutamic acid In addition, a method of generating γ-aminobutyric acid by using glutamic acid decarboxylase contained in rice bran and pyridoxalphosphoric acid contained in yeast to increase the conversion rate of glutamic acid to γ-aminobutyric acid (Patent Document 5), etc. It has been reported.
しかしながら、乳酸菌や麹菌等の微生物を用いてγ−アミノ酪酸を製造するには、大型の培養設備が必要となり、培養期間についても少なくとも２〜３日を要するものであった。さらに、上記微生物を用いてγ−アミノ酪酸を製造する場合であっても、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は十分に高いものとはいえず、効率面でさらなる改善が求められていた。 However, in order to produce γ-aminobutyric acid using microorganisms such as lactic acid bacteria and koji molds, a large-scale culture facility is required, and the culture period also requires at least 2 to 3 days. Furthermore, even when γ-aminobutyric acid is produced using the above-mentioned microorganism, the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid cannot be said to be sufficiently high, and further improvement in efficiency has been demanded. .
また、米胚芽又は米糠に含まれるグルタミン酸脱炭酸酵素を利用してγ−アミノ酪酸を製造するには、反応液のｐＨを４．５〜６．５に調整する必要があり、この場合であってもグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は上記微生物を用いてγ−アミノ酪酸を製造した場合には到底及ばないものであった。さらに、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を上げるために補酵素であるピリドキサルリン酸を添加することが可能であるが、ピリドキサルリン酸は食品添加物としては認められておらず、食品向けのγ−アミノ酪酸の製造にピリドキサルリン酸を使用できないという問題点があった。 In addition, in order to produce γ-aminobutyric acid using glutamic acid decarboxylase contained in rice germ or rice bran, it is necessary to adjust the pH of the reaction solution to 4.5 to 6.5. However, the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid was not as high as when γ-aminobutyric acid was produced using the microorganism. Furthermore, in order to increase the conversion rate of glutamic acid to γ-aminobutyric acid, it is possible to add pyridoxal phosphate, a coenzyme, but pyridoxal phosphate is not recognized as a food additive, and γ for food -There was a problem that pyridoxal phosphate could not be used for the production of aminobutyric acid.
そこで本発明の目的は、無細胞の系で、反応液のｐＨを調整することなく、かつ、ピリドキサルリン酸を使用することなく、短時間で大量のγ−アミノ酪酸を製造することにある。また本発明の目的は、グルタミン酸又はグルタミン酸塩からγ−アミノ酪酸への変換率が、乳酸菌等の微生物にγ−アミノ酪酸を生産させた場合と比べて優れているγ−アミノ酪酸の製造方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to produce a large amount of γ-aminobutyric acid in a short time without adjusting the pH of the reaction solution and without using pyridoxal phosphate in a cell-free system. Another object of the present invention is to provide a method for producing γ-aminobutyric acid, in which the conversion rate from glutamic acid or glutamate to γ-aminobutyric acid is superior to the case where γ-aminobutyric acid is produced by a microorganism such as lactic acid bacteria. It is to provide.
上記目的を達成するため、本発明は、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートすることによりγ−アミノ酪酸を生成させるγ−アミノ酪酸の製造方法を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing γ-aminobutyric acid that produces γ-aminobutyric acid by incubating a liquid containing barley grind, glutamic acid or glutamate, and water.
本発明者らは、大麦の粉砕物の水懸濁液にグルタミン酸又はグルタミン酸塩を加えて室温でインキュベートすると、短時間（少なくとも２時間）でγ−アミノ酪酸に効率よく変換されることを見出した。上記の製造方法は、ピリドキサルリン酸を使用しなくても、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が、乳酸菌にγ−アミノ酪酸を生産させた場合よりも優れている。 The present inventors have found that when glutamic acid or glutamate is added to an aqueous suspension of barley pulverized product and incubated at room temperature, it is efficiently converted to γ-aminobutyric acid in a short time (at least 2 hours). . In the above production method, the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid is superior to the case where lactic acid bacteria produce γ-aminobutyric acid without using pyridoxal phosphate.
上記液は、ｐＨを調製することなくインキュベートされることが好ましい。 The liquid is preferably incubated without adjusting the pH.
上記製造方法は、ｐＨを調製することなく、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートするだけでγ−アミノ酪酸を製造できるため、乳酸菌等の微生物の培養に必要な特別な機械及び設備を必要としない。さらに、上記の製造方法は、反応液中に、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含んでいれば、他にはいかなる成分も必要としないため、反応液からのγ−アミノ酪酸の単離・精製が容易である。 In the above production method, γ-aminobutyric acid can be produced simply by incubating a liquid containing barley grind, glutamic acid or glutamate and water without adjusting the pH. Does not require special machinery and equipment. Furthermore, the above production method does not require any other components as long as the reaction solution contains barley grind, glutamic acid or glutamate, and water, so that γ-aminobutyric acid from the reaction solution is not required. Isolation and purification are easy.
上記粉砕物は、大麦糠であることが好ましく、大麦を搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠であることがより好ましい。 The pulverized product is preferably barley koji, more preferably barley koji obtained by milling barley with a kneading accuracy of 30 to 40%.
大麦の粉砕物として、大麦糠、特に、搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠を使用すれば、大麦の粉砕物の単位質量当たりのγ−アミノ酪酸の生成量が高まり、単位時間当たりのγ−アミノ酪酸の生産量及びグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率をさらに高めることができる。 If barley koji, especially barley koji obtained by milling with a kneading accuracy of 30 to 40%, is used as the barley pulverized product, the amount of γ-aminobutyric acid produced per unit mass of the barley crushed product is increased. The production amount of γ-aminobutyric acid per hour and the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid can be further increased.
本発明によれば、反応液のｐＨを調整したり、反応液にピリドキサルリン酸を添加したりすることなく、無細胞の系でγ−アミノ酪酸を効率よく製造でき、乳酸菌にγ−アミノ酪酸を生産させた場合よりも、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への高い変換率を実現できる。また本発明によれば、乳酸菌等の微生物の培養に必要な特別な機械及び設備を必要とせず、簡易かつ短時間でγ−アミノ酪酸を製造できる。 According to the present invention, γ-aminobutyric acid can be efficiently produced in a cell-free system without adjusting the pH of the reaction solution or adding pyridoxalphosphoric acid to the reaction solution. A higher conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid can be realized than in the case of production. Further, according to the present invention, γ-aminobutyric acid can be produced easily and in a short time without requiring special machinery and equipment necessary for culturing microorganisms such as lactic acid bacteria.
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described.
本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法は、大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベートすることによりγ−アミノ酪酸を生成させることを特徴としている。 The method for producing γ-aminobutyric acid according to the present invention is characterized in that γ-aminobutyric acid is produced by incubating a liquid containing barley grind, glutamic acid or glutamate and water.
本明細書における「大麦」とは、大麦種子のことであり、麦芽も含まれる。大麦の粉砕物の原料としては、例えば、はるな二条、ＣＤＣ Ａｌａｍｏ、ＣＤＣ Ｆｉｂａｒ、ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ、りょうふうの種子を挙げることができる。グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への高い変換率を実現するためには、ＣＤＣ Ｆｉｂａｒの種子が特に適している。 As used herein, “barley” refers to barley seeds and includes malt. Examples of the raw material for the barley pulverized product include Haruna Nijo, CDC Alamo, CDC Fibar, CDC Kendall, and Ryofu seeds. In order to achieve a high conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid, CDC Fibar seeds are particularly suitable.
「大麦の粉砕物」とは、大麦を、例えば、精麦機、ピンミル、ハンマーミル、ボールミル等の粉砕機で粉状にしたものをいい、大麦糠も含まれる。 The “barley pulverized product” refers to a product obtained by pulverizing barley with a pulverizer such as a wheat mill, pin mill, hammer mill, ball mill or the like, and also includes barley straw.
上記のγ−アミノ酪酸の製造方法は、グルタミン酸又はグルタミン酸塩を加えた大麦の粉砕物の水懸濁液中で、大麦由来のグルタミン酸脱炭酸酵素がグルタミン酸を脱炭酸することによってγ−アミノ酪酸を生成させるものである。 In the above-mentioned method for producing γ-aminobutyric acid, in an aqueous suspension of barley pulverized product to which glutamic acid or glutamate is added, glutamic acid decarboxylase derived from barley decarboxylates glutamic acid to produce γ-aminobutyric acid. It is generated.
本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法の実施形態としては、大麦の粉砕物を水に懸濁した後にグルタミン酸又はグルタミン酸塩を加えて溶解して得られる液、又は、グルタミン酸又はグルタミン酸塩の水溶液に大麦の粉砕物を懸濁させて得られる液、を４〜７０℃の条件下で２時間以上インキュベートしてγ−アミノ酪酸を生成させる方法を例示できる。 As an embodiment of the method for producing γ-aminobutyric acid of the present invention, a suspension obtained by suspending a barley pulverized product in water and then adding and dissolving glutamic acid or glutamate, or an aqueous solution of glutamic acid or glutamate The liquid obtained by suspending the barley pulverized product can be exemplified by a method in which γ-aminobutyric acid is produced by incubating at 4 to 70 ° C. for 2 hours or more.
上記の液は、ｐＨを調製する必要がなく、そのままインキュベートすればよい。 The above liquid does not need to be adjusted in pH and may be incubated as it is.
インキュベートは、上記の液を振盪又は撹拌しながら行うことが好ましく、振盪又は撹拌の程度は、大麦の粉砕物が沈殿することなく、懸濁状態が維持される程度が好ましい。 Incubation is preferably performed while shaking or stirring the above liquid, and the degree of shaking or stirring is preferably such that the suspended state is maintained without precipitation of the barley grind.
大麦の粉砕物としては、大麦糠が好ましく、大麦を搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠であることがより好ましい。 As a pulverized product of barley, barley koji is preferable, and barley koji obtained by milling barley with a kneading accuracy of 30 to 40% is more preferable.
ここで搗精度とは、精麦の程度を表す数値（％）のことをいい、「削り取られる大麦の表層部（糠部分）の重量」を「大麦の重量」で除して、１００を乗じた値である。したがって、「搗精度３０〜４０％で精麦して得られる大麦糠」とは、糠部分が３０〜４０％で、削られずに残った大麦の中心部分が６０〜７０％であることを意味している。なお、「精麦」とは、大麦の表層部（糠部分）を削り取る作業のことをいう。 Here, culling accuracy refers to a numerical value (%) representing the degree of barley, divided by “weight of barley surface portion (grass portion) to be scraped” by “barley weight” and multiplied by 100. Value. Therefore, “barley straw obtained by milling with 30% to 40% straw accuracy” means that the straw part is 30-40% and the central part of barley remaining without being shaved is 60-70%. ing. “Wheat” refers to the work of scraping off the surface layer (barley portion) of barley.
上記の液には、大麦糠が５０〜１５０ｍｇ／ｍＬ含まれることが好ましく、１００〜１５０ｍｇ／ｍＬ含まれることがより好ましく、１４０〜１５０ｍｇ／ｍＬ含まれることがさらに好ましい。また、グルタミン酸又はグルタミン酸塩は、上記の液に、２．５〜４０ｍＭ含まれることが好ましく、５〜２０ｍＭ含まれることがより好ましく、１０〜２０ｍＭ含まれることがさらに好ましい。 The liquid preferably contains 50 to 150 mg / mL of barley koji, more preferably 100 to 150 mg / mL, and even more preferably 140 to 150 mg / mL. Moreover, it is preferable that 2.5-40 mM is contained in said liquid, glutamic acid or glutamate is contained more preferably 5-20 mM, and it is further more preferable that 10-20 mM is contained.
上記のγ−アミノ酪酸の製造方法で製造されたγ−アミノ酪酸は、上記の液を濾過又は遠心分離することによって大麦の粉砕物を取り除き、当業者であれば公知の方法によって、上記の液からγ−アミノ酪酸を精製できる。 The γ-aminobutyric acid produced by the above method for producing γ-aminobutyric acid is obtained by removing the barley pulverized product by filtering or centrifuging the above solution. Can be used to purify γ-aminobutyric acid.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these Examples.
１．大麦糠を利用したγ−アミノ酪酸の生成条件
１）大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を使用したγ−アミノ酪酸の生成
脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒの種子を、搗精度が４０％となるように精麦して大麦の外層部の粉砕物（大麦糠）を得た。また、脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒの種子をミルで完全に粉砕することによって、大麦全粒の粉砕物を得た。こうして得られた大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を原料として用い、以下の方法でγ−アミノ酪酸の無細胞系での生成を試みた。1. Production conditions of γ-aminobutyric acid using barley koji 1) Production of γ-aminobutyric acid using barley koji or crushed whole barley grains Seeds of barley variety CDC Fibar after threshing have a koji accuracy of 40% Thus, pulverized matter (barley koji) was obtained from the outer layer of barley. Moreover, the barley variety CDC Fibar seeds after threshing were completely pulverized with a mill to obtain a pulverized whole barley. Using the barley koji or barley whole grains obtained in this manner as a raw material, production of γ-aminobutyric acid in a cell-free system was attempted by the following method.
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら４０℃で２４時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を以下の方法で定量した。 First, 50 mg of barley koji or crushed barley whole grains was put into a 2 mL tube with a screw cap, and 1 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added thereto, and the mixture was incubated at 40 ° C. with shaking for 24 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the amount of γ-aminobutyric acid contained in the supernatant of each reaction solution was quantified by the following method.
まず、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（ミリポア社）又はＭｉｃｒｏｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ−１０（分子量１００００；ミリポア社）に各反応液の上清（２００μＬ）をアプライし、限外濾過を行った。得られた濾液は、蒸留水で適宜希釈し、ＡｃｃＱ Ｔａｇ法（ウォーターズ社）で誘導体化を行った。具体的には、蒸留水で希釈した限外濾過液（２０μＬ）に、６０μＬのＡｃｃＱ Ｆｌｕｏｒｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ及び２０μＬのＡｃｃＱ Ｆｌｕｏｒ ｒｅａｇｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒを加えて混合し、５０℃で１０分間静置することによって誘導体化した。その後、得られた誘導体化サンプルを、以下の条件下、ＨＰＬＣで分析し、Ｅｍｐｏｗｅｒパーソナルソフトウェアー（ウォーターズ社）で解析することによりγ−アミノ酪酸の量を定量した。
・ＨＰＬＣシステム：２６９５セパレーションモジュール（ウォーターズ社）
・カラム：ＡｃｃＱ Ｔａｇカラム（３．９ｍｍ×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社）
・カラム温度：３９℃
・検出器：２４７５マルチλ蛍光検出器（Ｅｘ．２５０ｎｍ、Ｅｍ．３９５ｎｍ、ｇａｉｎ １０；ウォーターズ社）First, the supernatant (200 μL) of each reaction solution was applied to Ultrafree-MC (Millipore) or Microcon Ultracel YM-10 (molecular weight 10,000; Millipore), and ultrafiltration was performed. The obtained filtrate was appropriately diluted with distilled water and derivatized by the AccQ Tag method (Waters). Specifically, the ultrafiltrate diluted with distilled water (20 μL) was mixed with 60 μL of AccQ Fluorore buffer and 20 μL of AccQ Fluor reagent buffer, and the mixture was allowed to stand at 50 ° C. for 10 minutes for derivatization. . Thereafter, the obtained derivatized sample was analyzed by HPLC under the following conditions, and the amount of γ-aminobutyric acid was quantified by analyzing with Emperer personal software (Waters).
HPLC system: 2695 separation module (Waters)
Column: AccQ Tag column (3.9 mm × 150 mm) (Waters)
Column temperature: 39 ° C
Detector: 2475 multi-λ fluorescence detector (Ex. 250 nm, Em. 395 nm, gain 10; Waters)
図１は、大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を使用した場合におけるγ−アミノ酪酸の生成量を比較したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。 FIG. 1 is a graph comparing the amount of γ-aminobutyric acid produced when barley koji or barley whole grains are used. The amount of γ-aminobutyric acid produced is an average value of two experiments, and error bars indicate standard deviation.
その結果、大麦全粒の粉砕物を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は約０．６ｍＭであったのに対し、大麦糠を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は約２．４ｍＭであった。 As a result, when barley whole grains were used, the reaction solution had a γ-aminobutyric acid concentration of about 0.6 mM, whereas when barley koji was used, the reaction solution had γ- The aminobutyric acid concentration was about 2.4 mM.
以上の結果より、大麦の粉砕物と、グルタミン酸ナトリウムと、水とを含む反応液を振盪しながら４０℃で２４時間インキュベートすることにより、反応液中にγ−アミノ酪酸を生成できることが明らかとなり、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成量は、大麦全粒の粉砕物よりも大麦糠を使用した方が顕著に高いことが示唆された。 From the above results, it is clear that γ-aminobutyric acid can be produced in the reaction solution by incubating the reaction solution containing barley pulverized product, sodium glutamate, and water at 40 ° C. for 24 hours while shaking. It was suggested that the amount of γ-aminobutyric acid produced in the cell-free system was significantly higher when barley koji was used than when pulverized whole barley.
２）反応温度の検討
搗精度４０％の大麦糠（オオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒ）を原料として、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０又は７０℃の各反応温度で、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。2) Examination of reaction temperature Using barley koji (barley variety CDC Fibar) with a koji accuracy of 40% as a raw material at each reaction temperature of 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or 70 ° C., in a cell-free system An attempt was made to produce γ-aminobutyric acid.
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠を５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら各反応温度で２４時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。 First, 50 mg of barley koji was put into a 2 mL screw cap tube, and 1 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added thereto, and incubated at each reaction temperature for 24 hours with shaking. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the amount of γ-aminobutyric acid contained in the supernatant of each reaction solution was quantified.
図２は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす反応温度の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。 FIG. 2 is a graph showing the effect of reaction temperature on the amount of γ-aminobutyric acid produced. The amount of γ-aminobutyric acid produced is an average value of two experiments, and error bars indicate standard deviation.
その結果、反応温度が１０℃以下又は５０℃以上では、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は１．５ｍＭ以下であったが、反応温度が２０〜４０℃の間では、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は２．４〜３．０ｍＭであった。 As a result, when the reaction temperature was 10 ° C. or lower or 50 ° C. or higher, the concentration of γ-aminobutyric acid in the reaction solution was 1.5 mM or less, but when the reaction temperature was between 20 and 40 ° C. The butyric acid concentration was 2.4-3.0 mM.
以上の結果より、大麦糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成するには、反応温度が２０〜４０℃であることが好ましく、２０℃付近であることが特に好ましいことが示唆された。 From the above results, in order to produce γ-aminobutyric acid in a cell-free system using barley koji, it is suggested that the reaction temperature is preferably 20 to 40 ° C, particularly preferably around 20 ° C. It was done.
３）反応液に添加する大麦糠の量の検討
反応液中での大麦糠の濃度が２５、５０、１００又は１５０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、搗精度４０％の大麦糠（オオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒ）を使用し、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。3) Examination of the amount of barley meal added to the reaction solution Barley meal (barley variety CDC) having a rice bran accuracy of 40% so that the concentration of barley meal in the reaction solution is 25, 50, 100 or 150 mg / mL. Fibar) was used to try to produce γ-aminobutyric acid in a cell-free system.
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠を２５、５０、１００又は１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら４０℃で２４時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。 First, 25, 50, 100, or 150 mg of barley koji was put into a 2 mL screw cap tube, and 1 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added thereto, and incubated at 40 ° C. for 24 hours with shaking. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the amount of γ-aminobutyric acid contained in the supernatant of each reaction solution was quantified.
図３は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす添加した大麦糠の量の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。 FIG. 3 is a graph showing the effect of the amount of added barley straw on the amount of γ-aminobutyric acid produced. The amount of γ-aminobutyric acid produced is an average value of two experiments, and error bars indicate standard deviation.
その結果、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は、添加した大麦糠の量にほぼ比例して上昇し、反応液中での大麦糠の濃度が５０ｍｇ／ｍＬ以下の場合には２ｍＭ以下であったが、１００ｍｇ／ｍＬの場合には約６ｍＭ、１５０ｍｇ／ｍＬの場合には約９ｍＭであった。 As a result, the concentration of γ-aminobutyric acid in the reaction solution rose almost in proportion to the amount of added barley koji, and was 2 mM or less when the barley koji concentration in the reaction solution was 50 mg / mL or less. However, in the case of 100 mg / mL, it was about 6 mM, and in the case of 150 mg / mL, it was about 9 mM.
以上の結果より、大麦糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成するには、反応液中での大麦糠の濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１５０ｍｇ／ｍＬ以上であることがより好ましいことが示唆された。 From the above results, in order to produce γ-aminobutyric acid in a cell-free system using barley koji, the barley koji concentration in the reaction solution is preferably 100 mg / mL or more, and 150 mg / mL or more. It was suggested that it is more preferable.
４）反応時間の検討
搗精度４０％の大麦糠（オオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒ）を原料とし、反応時間を変えて、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。4) Examination of reaction time The production of γ-aminobutyric acid in a cell-free system was attempted using barley koji (barley variety CDC Fibar) having a koji accuracy of 40% as a raw material and changing the reaction time.
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに大麦糠を１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、２０℃で振盪しながら２、４、６、１２、１８、２４、３６又は４８時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。 First, 150 mg of barley koji was put into a 2 mL screw cap tube, and 1 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added thereto, and incubated for 2, 4, 6, 12, 18, 24, 36, or 48 hours with shaking at 20 ° C. . Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the amount of γ-aminobutyric acid contained in the supernatant of each reaction solution was quantified.
図４は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす反応時間の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。 FIG. 4 is a graph showing the effect of reaction time on the amount of γ-aminobutyric acid produced. The amount of γ-aminobutyric acid produced is an average value of two experiments, and error bars indicate standard deviation.
その結果、反応開始後２時間目であっても、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は約８ｍＭにまで上昇し、６時間目の約１１ｍＭをピークに、４８時間目にかけて約７ｍＭまで低下することが判明した。 As a result, even after 2 hours from the start of the reaction, the concentration of γ-aminobutyric acid in the reaction solution increases to about 8 mM, peaks at about 11 mM at 6 hours, and decreases to about 7 mM at 48 hours. There was found.
以上の結果より、大麦糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成するには、反応時間を６〜１２時間とすることが好ましく、６時間とすることがより好ましいことが示唆された。 From the above results, in order to produce γ-aminobutyric acid in a cell-free system using barley straw, it is suggested that the reaction time is preferably 6 to 12 hours, and more preferably 6 hours. It was.
５）大麦糠の搗精度の検討
脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒの種子を、搗精度が１０、２０、３０、４０又は５０％となるように精麦して得られた各大麦糠又は大麦全粒の粉砕物（搗精度０％）を原料として、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。5) Examination of cocoon accuracy of barley meal Each barley meal or whole barley grains obtained by mashing the seeds of barley cultivar CDC Fibar after threshing such that the culm accuracy is 10, 20, 30, 40 or 50% A γ-aminobutyric acid was attempted to be produced in a cell-free system using a pulverized product (having accuracy of 0%) as a raw material.
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに搗精度の異なる各大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、２０℃で振盪しながら６時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。 First, 150 mg of each barley koji or barley whole grain pulverized product having different koji accuracy was put into a 2 mL tube with a screw cap, and 1 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added thereto and incubated at 20 ° C. with shaking for 6 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the amount of γ-aminobutyric acid contained in the supernatant of each reaction solution was quantified.
図５は、γ−アミノ酪酸の生成量に及ぼす大麦糠の搗精度の影響を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。なお、グラフ中の搗精度０％の値は、大麦全粒の粉砕物を使用した場合のγ−アミノ酪酸の生成量を示している。
FIG. 5 is a graph showing the effect of barley koji accuracy on the amount of γ-aminobutyric acid produced. The amount of γ-aminobutyric acid produced is an average value of two experiments, and error bars indicate standard deviation. In addition, the value of the
その結果、搗精度が１０、２０又は５０％の大麦糠又は大麦全粒の粉砕物（搗精度０％）を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は５．６〜８．７ｍＭであったが、搗精度が３０〜４０％の大麦糠を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は１１ｍＭ以上であった。
As a result, when barley koji or a barley whole grain pulverized product (
以上の結果より、無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成に使用する大麦糠の搗精度を３０〜４０％にすることにより、γ−アミノ酪酸の生成量を高められることが示唆された。 From the above results, it was suggested that the production amount of γ-aminobutyric acid can be increased by setting the barley koji accuracy used for the production of γ-aminobutyric acid in a cell-free system to 30 to 40%.
２．大麦糠によるγ−アミノ酪酸の生成と、小麦糠、米糠又は乳酸菌によるγ−アミノ酪酸の生成との比較
大麦糠として、オオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒ又はＣＤＣ Ａｌａｍｏ由来の大麦糠を用い、搗精度が４０％となるように精麦して各大麦糠を調製した。小麦糠として、コムギ品種１ＣＷ由来の小麦糠を用い、搗精度が４０％となるように精麦して小麦糠を調製した。米糠として、イネ品種秋田こまち又はコシヒカリ由来の米糠を用い、搗精度が４０％となるように精米して各米糠を調製した。こうして得られた各品種の大麦糠、小麦糠又は米糠を原料として、以下の方法で無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。2. Comparison of production of γ-aminobutyric acid by barley koji and production of γ-aminobutyric acid by wheat koji, rice koji or lactic acid bacteria As barley koji, barley koji derived from barley variety CDC Fibar or CDC Alamo was used, and koji accuracy was 40%. Each barley koji was prepared by milling so as to be. As wheat straw, wheat straw derived from wheat cultivar 1CW was used, and the wheat straw was prepared by mashing so that the straw accuracy would be 40%. As rice bran, rice bran derived from the rice cultivar Akita Komachi or Koshihikari was used to polish each rice bran so that the koji accuracy would be 40%. Using the barley straw, wheat straw or rice bran of the varieties thus obtained as raw materials, production of γ-aminobutyric acid was attempted in a cell-free system by the following method.
まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブに各品種の大麦糠、小麦糠又は米糠を１５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら２０℃で６時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、各反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を定量した。 First, 150 mg of barley koji, wheat koji or rice koji of various varieties was placed in a 2 mL screw cap tube, and 1 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added thereto, and incubated at 20 ° C. for 6 hours with shaking. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the amount of γ-aminobutyric acid contained in the supernatant of each reaction solution was quantified.
図６は、各品種の大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系で生成されたγ−アミノ酪酸の生成量を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の生成量は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。 FIG. 6 is a graph showing the amount of γ-aminobutyric acid produced in a cell-free system using barley straw, wheat straw or rice bran of each variety. The amount of γ-aminobutyric acid produced is an average value of two experiments, and error bars indicate standard deviation.
その結果、大麦糠を使用した場合には、反応液のγ−アミノ酪酸濃度は８．９〜１１ｍＭとなり、小麦糠（３．９ｍＭ）又は米糠（０．８〜２．９ｍＭ）を使用した場合と比較して顕著にγ−アミノ酪酸が生成されることが明らかとなった。また、大麦糠の中では、オオムギ品種ＣＤＣ Ｆｉｂａｒ由来の大麦糠がγ−アミノ酪酸の生成に適していることが明らかとなった。 As a result, when barley koji was used, the concentration of γ-aminobutyric acid in the reaction solution was 8.9 to 11 mM, and wheat koji (3.9 mM) or rice koji (0.8 to 2.9 mM) was used. It was revealed that γ-aminobutyric acid was remarkably produced compared to. Moreover, it was clarified that barley meal derived from barley variety CDC Fibar is suitable for the production of γ-aminobutyric acid.
次に、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｌ１３）をグルタミン酸の存在下で培養してγ−アミノ酪酸を生成させ、上記の大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成させた場合と、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を比較した。ここで、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率とは、生成したγ−アミノ酪酸のモル数を反応開始時又は培養開始時に添加したグルタミン酸のモル数で除して、１００を乗じた値のことである。なお、乳酸菌を用いたγ−アミノ酪酸の製造については、上野らの文献（生物工学会誌、２００７年、８５巻、ｐ．１０９−１１４）に記載されているデータを引用した。 Next, lactic acid bacteria (Lactobacillus sp. L13) are cultured in the presence of glutamic acid to produce γ-aminobutyric acid, and γ-aminobutyric acid is produced in a cell-free system using the above barley straw, wheat straw or rice bran. And the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid was compared. Here, the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid is obtained by dividing the number of moles of γ-aminobutyric acid produced by the number of moles of glutamic acid added at the start of the reaction or at the start of the culture and multiplying by 100. That is. In addition, about manufacture of (gamma) -aminobutyric acid using lactic acid bacteria, the data described in the literature of Ueno et al. (Biotechnology Journal, 2007, volume 85, p.109-114) was cited.
図７は、大麦糠、小麦糠又は米糠を使用して無細胞系でγ−アミノ酪酸を生成させた場合におけるグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率及び乳酸菌を培養してγ−アミノ酪酸を生成させた場合におけるグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率を示したグラフである。 FIG. 7 shows the conversion rate of glutamic acid to γ-aminobutyric acid when γ-aminobutyric acid is produced in a cell-free system using barley straw, wheat straw or rice bran, and lactic acid bacteria are cultured to obtain γ-aminobutyric acid. It is the graph which showed the conversion rate from glutamic acid at the time of producing | generating to (gamma) -aminobutyric acid.
その結果、大麦糠を使用した場合のグルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率は、８９〜１１０％であり、小麦糠（３９％）若しくは米糠（８〜２９％）を使用した場合又は乳酸菌（８１％）を培養した場合の変換率と比較して高い値を示した。さらに、大麦糠を使用してγ−アミノ酪酸を生成させた場合の変換率は、わずか６時間の反応時間で認められた値であるのに対し、乳酸菌を培養してγ−アミノ酪酸を生成させた場合の変換率は、２日間培養した場合の変換率であるため、大麦糠で認められた変換率は、乳酸菌を培養した場合の変換率と比較した場合であっても顕著に高い値であることが示唆された。 As a result, the conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid when barley koji is used is 89 to 110%, and when wheat koji (39%) or rice koji (8 to 29%) is used or lactic acid bacteria ( 81%) showed a higher value than the conversion rate when cultured. Furthermore, the conversion rate when γ-aminobutyric acid is produced using barley koji is the value observed in a reaction time of only 6 hours, whereas lactic acid bacteria are cultured to produce γ-aminobutyric acid. Since the conversion rate in the case of culturing for 2 days is the conversion rate when cultured for 2 days, the conversion rate observed in barley koji is a significantly higher value even when compared with the conversion rate when lactic acid bacteria are cultured. It was suggested that
以上の結果より、大麦糠、グルタミン酸及び水を含む反応液をインキュベートすることによってγ−アミノ酪酸を製造する方法は、小麦糠、米糠又は乳酸菌を利用したγ−アミノ酪酸の製造方法よりも、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が高く、γ−アミノ酪酸の生成量についても、小麦糠又は米糠と比較して顕著に高いことが明らかとなった。 From the above results, the method for producing γ-aminobutyric acid by incubating a reaction solution containing barley koji, glutamic acid and water is more preferable than the method for producing γ-aminobutyric acid using wheat koji, rice bran or lactic acid bacteria. It was revealed that the conversion rate from γ-aminobutyric acid was high, and the amount of γ-aminobutyric acid produced was also significantly higher than wheat straw or rice bran.
３．麦芽を使用したγ−アミノ酪酸の生成
麦芽として、オオムギ品種りょうふう（北海道産）の麦芽を用い、以下の方法で無細胞系でのγ−アミノ酪酸の生成を試みた。まず、２ｍＬのスクリューキャップ付きチューブにりょうふう麦芽の粉砕物を５０ｍｇ入れ、そこに１ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら２０℃で８時間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸及びグルタミン酸の量を定量した。なお、りょうふう麦芽の粉砕物５０ｍｇに対してグルタミン酸ナトリウム溶液を加える代わりに、グルタミン酸ナトリウムを含まない蒸留水を加え、振盪しながら２０℃で８時間インキュベートしたものを対照として用いた。3. Production of γ-aminobutyric acid using malt Using malt of barley variety Ryofu (Hokkaido) as malt, production of γ-aminobutyric acid was attempted in a cell-free system by the following method. First, 50 mg of pulverized malt was placed in a 2 mL tube with a screw cap, 1 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added thereto, and the mixture was incubated at 20 ° C. for 8 hours with shaking. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the amounts of γ-aminobutyric acid and glutamic acid contained in the supernatant of the reaction solution were quantified. In addition, instead of adding a sodium glutamate solution to 50 mg of pulverized Ryofu malt, distilled water not containing sodium glutamate was added and incubated at 20 ° C. for 8 hours with shaking as a control.
図８は、インキュベート後の反応液の上清に含まれるγ−アミノ酪酸の量を示したグラフである。γ−アミノ酪酸の濃度は２回の実験の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示している。その結果、麦芽を使用した場合にも、上述の大麦糠又は大麦全粒の粉砕物を使用した場合と同様、γ−アミノ酪酸が生成されることが明らかとなった。 FIG. 8 is a graph showing the amount of γ-aminobutyric acid contained in the supernatant of the reaction solution after incubation. The concentration of γ-aminobutyric acid is an average value of two experiments, and error bars indicate standard deviation. As a result, even when malt was used, it was revealed that γ-aminobutyric acid was produced as in the case of using the barley koji or the pulverized whole barley.
４．γ−アミノ酪酸生成工程を備える大麦シロップ製造方法
大麦の粉砕物、グルタミン酸若しくはグルタミン酸塩及び水を含む液をインキュベーションすることによりγ−アミノ酪酸を生成させる工程を備える大麦シロップ製造方法を試みた。4). Barley syrup production method provided with a γ-aminobutyric acid production step An attempt was made to produce a barley syrup production method comprising a step of producing γ-aminobutyric acid by incubating a liquid containing barley pulverized product, glutamic acid or glutamate and water.
脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ及びりょうふうの種子をミルで完全に粉砕し、２種類の粉砕物を得た。ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ又はりょうふうの粉砕物を用い、次のようにして大麦シロップ製造用の原料液を調製した。すなわち、粉砕物１４０ｇを収容する容器に７００ｍＬの１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加え、振盪しながら２０℃で６時間インキュベートした（γ−アミノ酪酸生成工程）。 The barley varieties CDC Kendall and Ryofu seeds after threshing were completely pulverized with a mill to obtain two types of pulverized products. Using a pulverized product of CDC Kendall or Ryofu, a raw material liquid for producing barley syrup was prepared as follows. That is, 700 mL of 10 mM sodium glutamate solution was added to a container containing 140 g of the pulverized product, and incubated at 20 ° C. for 6 hours with shaking (γ-aminobutyric acid production step).
得られた原料液に所定量の下記添加成分を加えた後、６０℃で２４時間にわたって振盪することで大麦シロップを調製した。
（添加成分）
α-アミラーゼ溶液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ）：５．６ｍＬ、
アミラーゼ溶液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ）：５．６ｍＬ、
プロテアーゼ溶液（濃度５０ｍｇ／ｍＬ）：２．８ｍＬ、
プルラナーゼ原液：１４０μＬ。After adding a predetermined amount of the following additive components to the obtained raw material liquid, barley syrup was prepared by shaking at 60 ° C. for 24 hours.
(Additive ingredients)
α-amylase solution (concentration 25 mg / mL): 5.6 mL,
Amylase solution (concentration 25 mg / mL): 5.6 mL,
Protease solution (
Pullulanase stock solution: 140 μL.
一方、比較例として、脱穀後のオオムギ品種ＣＤＣ Ｋｅｎｄａｌｌ又はりょうふうの種子の粉砕物を用い、γ−アミノ酪酸生成工程を実施しなかったことの他は、上記方法と同様にして大麦シロップを調製した。すなわち、粉砕物１４０ｇを収容する容器に１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム溶液を加える代わりに、蒸留水７００ｍＬを加え、その後、上記添加成分を配合した後、６０℃で２４時間にわたって振盪することで大麦シロップを調製した。 On the other hand, as a comparative example, barley syrup was prepared in the same manner as in the above method except that the pulverized barley varieties CDC Kendall or ryofu seeds were not pulverized and the γ-aminobutyric acid production step was not performed. did. That is, instead of adding a 10 mM sodium glutamate solution to a container containing 140 g of the pulverized product, 700 mL of distilled water was added, and after adding the above-mentioned additional components, barley syrup was prepared by shaking at 60 ° C. for 24 hours. .
上記のようにして得られた４種類の大麦シロップ（試料１−４）について各種分析を以下の方法で行った。表１に結果を示す。
（１）色度の測定
ＥＢＣ標準法（European Brewery Convention編、Analytica EBC (4th Ed)、1987）に従って大麦シロップの色度を測定した。
（２）シロップ中全窒素の測定
ケルダール法によってシロップ中全窒素を測定した。
（３）エキス濃度の測定
ＥＢＣ標準法に従って大麦シロップのエキス濃度を測定した。なお、ここでいうエキスとは、大麦種子の抽出物を意味し、例えば大麦種子中の糖成分やタンパク質成分の抽出物等が挙げられる。
（４）最終発酵度の測定
ＥＢＣ標準法に従って大麦シロップの最終発酵度を測定した。
（５）β−グルカンの濃度の測定
大麦シロップを水で７．５倍希釈した後に０．４５μｍフィルターで濾過し、この濾過物について２０℃の測定室において高速液体クロマトグラフを用いてβ−グルカンの濃度を測定した。
（６）粘度の測定
ウベローデ型粘度計を用いて２０℃における大麦シロップの粘度を測定した。
（７）ｐＨの測定
ｐＨ計を用いて約２０℃における大麦シロップのｐＨを測定した。Various analyzes were performed on the four types of barley syrup (samples 1-4) obtained as described above by the following methods. Table 1 shows the results.
(1) Measurement EBC Standard Method of chromaticity (European Brewery Convention ed., Analytica EBC (4 th Ed) , 1987) was measured chromaticity barley syrup according.
(2) Measurement of total nitrogen in syrup Total nitrogen in syrup was measured by the Kjeldahl method.
(3) Measurement of extract concentration According to the EBC standard method, the extract concentration of barley syrup was measured. In addition, an extract here means the extract of a barley seed, for example, the extract of the sugar component in a barley seed, a protein component, etc. are mentioned.
(4) Measurement of final fermentation degree The final fermentation degree of barley syrup was measured according to the EBC standard method.
(5) Measurement of β-glucan concentration Barley syrup was diluted 7.5 times with water and then filtered through a 0.45 μm filter. The filtrate was subjected to β-glucan in a measurement chamber at 20 ° C. using a high performance liquid chromatograph. The concentration of was measured.
(6) Measurement of viscosity The viscosity of barley syrup at 20 ° C was measured using an Ubbelohde viscometer.
(7) Measurement of pH The pH of barley syrup at about 20 ° C. was measured using a pH meter.
上記４種類の大麦シロップにホップ０．５ｇ／２５０ｍＬをそれぞれ添加し、１０５℃で９０分間煮沸した後、Ｂｒｉｘが１１．０％になるように加水することによって冷麦汁を得た。冷麦汁に含まれるγ−アミノ酪酸及びグルタミン酸を定量した。表１に結果を示す。 After adding 0.5 g / 250 mL of hops to the above four kinds of barley syrup and boiling at 105 ° C. for 90 minutes, water was added so that Brix was 11.0% to obtain cold wort. Γ-aminobutyric acid and glutamic acid contained in the cold wort were quantified. Table 1 shows the results.
図９は、冷麦汁のγ−アミノ酪酸濃度及びグルタミン酸濃度を示したグラフである。その結果、大麦の粉砕物に含まれる澱粉質を糖化する工程に先立ち、γ−アミノ酪酸生成工程を実施することで、大麦シロップの種々の品質を維持したまま、γ−アミノ酪酸濃度を高めることができることが明らかとなった。 FIG. 9 is a graph showing the γ-aminobutyric acid concentration and glutamic acid concentration of cold wort. As a result, the γ-aminobutyric acid concentration is increased while maintaining various qualities of barley syrup by carrying out the γ-aminobutyric acid production step prior to the step of saccharifying starch contained in the barley pulverized product. It became clear that it was possible.
本発明によれば、反応液のｐＨを調整したり、反応液にピリドキサルリン酸を添加したりすることなく、無細胞の系でγ−アミノ酪酸を効率よく製造でき、乳酸菌にγ−アミノ酪酸を生産させた場合よりも、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への高い変換率を実現できる。また本発明によれば、乳酸菌等の微生物の培養に必要な特別な機械及び設備を必要とせず、簡易かつ短時間でγ−アミノ酪酸を製造できる。 According to the present invention, γ-aminobutyric acid can be efficiently produced in a cell-free system without adjusting the pH of the reaction solution or adding pyridoxalphosphoric acid to the reaction solution. A higher conversion rate from glutamic acid to γ-aminobutyric acid can be realized than in the case of production. Further, according to the present invention, γ-aminobutyric acid can be produced easily and in a short time without requiring special machinery and equipment necessary for culturing microorganisms such as lactic acid bacteria.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009069702A1 (en) | 2009-06-04 |
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