JPWO2007091678A1 - 経口摂取用関節リウマチ抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
該RAの炎症には、プロスタグランジン(PGE)、プロスタサイクリン(PGI)、ヒスタミンやブラジキニンを代表とするキニンが関与していると考えられるため、その治療には、まずNSAID(非ステロイド性抗炎症薬)に代表される抗炎症薬が処方される例が多い。そして、抗炎症薬で効果がない場合、Tリンパ球、Bリンパ球を介した免疫調節作用に関わる、TNFα、インターロイキン1(IL-1)、IL-6等の炎症性サイトカインを抑制し、免疫全般の働きを抑える免疫抑制薬や、RAに関連する免疫の異常な働きのみを抑える免疫調整薬等の抗リウマチ薬が処方され、最近では初期の段階でも該抗リウマチ薬が処方される場合も出てきている。
しかし、従来の免疫抑制薬や免疫調整薬等の抗リウマチ薬では、何等かの副作用の影響があり、その処方にある程度の制限が必要である。そこで、最近では、このような副作用を少しでも抑制するために、RAの病態を悪化させる分子のみを標的とした分子生物学的アプローチがなされている。例えば、抗TNFαモノクローナル抗体、可溶性TNFαレセプター(sTNFR)融合蛋白、IL-1レセプター拮抗薬、IL-6レセプター抗体等を利用した生物学的製剤の開発も進められている。
しかしながら、食品素材として知られ、その安全性が十分確保されている乳成分やその分解物等にRA抑制作用があることについては従来知られていない。
本発明の別の課題は、日常的に連用可能で、安全性に優れ、関節リウマチに係る関節炎等の抑制作用が期待できる、健康食品、特定保健用食品等の機能性食品を提供することにある。
また本発明によれば、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含有する関節リウマチ抑制作用を有する機能性食品が提供される。
更に本発明によれば、経口摂取用関節リウマチ抑制剤を製造するための、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物の使用が提供される。
更にまた本発明によれば、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物の有効量を、経口投与する関節リウマチの抑制方法が提供される。
本発明の関節リウマチ抑制剤及び機能性食品は、獣乳カゼインをアミノ酸残基数として平均鎖長が特定範囲になるように加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチド混合物を、好ましくはカゼイン加水分解物全量に対して80重量%以上、特に好ましくは80〜90重量%含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含む。特に、該ペプチドが、Xaa Pro配列を有するジペプチド及びXaa Pro Pro配列を有するトリペプチドからなる生体内難分解性ペプチドを特定割合で含むことが好ましい。但し、ペプチドはペプチド塩としても良い。
該平均鎖長は、例えば、アミノ基に反応して発色するOPA(o-フタルアルデヒド)試薬を用いたOPA法により、加水分解物中のモル濃度を評価し、平均鎖長=(カゼイン酸加水分解物中のモル数)/(カゼイン酵素加水分解物中のモル数)として求めることができる。
また、前記生体内難分解性ペプチドとは、生体の腸管から吸収された際に、生体内ペプチダーゼ群に対して分解抵抗性が高い、カルボキシ末端にProを有するジペプチドXaa Pro及びトリペプチドXaa Pro Proを意味する。
前記カゼイン加水分解物中に含まれるXaa Pro配列を有するジペプチドの含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常5重量%以上、好ましくは5〜25重量%である。該含有割合が5重量%未満の場合には、所望の作用が低下する恐れがある。
前記カゼイン加水分解物中に含まれるXaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常1重量%以上、好ましくは1〜5重量%である。該含有割合が1重量%未満の場合には、所望の作用が低下する恐れがある。
前記カゼイン加水分解物には、前記ペプチド及び遊離アミノ酸の他に、例えば市販の獣乳カゼイン等に通常含まれる、脂質、灰分、炭水化物、食物繊維、水分等が10〜20重量%程度含まれていても良く、また、必要に応じてこれらのうちの適当な成分の一部若しくは全部を除去しても良い。
獣乳カゼインは、Proを多く含む食品等に用いられる安全性が確認されたタンパク質であり、例えば、牛乳、馬乳、山羊乳、羊乳等のカゼインが挙げられ、特に牛乳カゼインが好ましく使用できる。
獣乳カゼインを加水分解する際のカゼイン濃度は、特に限定されないが前記加水分解物を効率良く生産するために、3〜19重量%が好ましい。
酵素群(X)は、活性中心にセリンを持つ、セリンタイプのプロティナーゼもしくは、活性中心に金属を持つ金属プロティナーゼを含むことが好ましい。金属プロティナーゼとしては、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼ等が挙げられ、これらの少なくとも1種を更に含むことが、所望の加水分解物を効率良く、且つ短時間で、更には1段階反応で得ることができる点で好ましい。また前記Pro Xaa配列が切断可能なペプチダーゼとしては、等電点が酸性域を示す酵素であることが好ましい。
アスペルギルス・オリゼー由来の酵素群としては、市販品を利用することができ、例えば、スミチームFP、LP又はMP(以上、登録商標、新日本化学(株)製)、ウマミザイム(登録商標、天野エンザイム(株)製)、Sternzyme B11024、PROHIDROXY AMPL(以上、商品名、株式会社樋口商会製)、オリエンターゼONS(登録商標、阪急バイオインダストリー(株)製)、デナチームAP(登録商標、ナガセ生化学社製)が挙げられ、特に、スミチームFP(登録商標、新日本化学(株)製)の使用が好ましい。
これら市販の酵素群を用いる場合には、通常、至適条件が設定されているが、前記カゼイン加水分解物が得られるように条件、例えば、使用酵素量や反応時間等を、用いる酵素群に応じて適宜変更して行なうことができる。
反応条件は、酵素群に応じて目的のカゼイン加水分解物が得られるように適宜選択できる。例えば、反応温度は、通常25〜60℃、好ましくは45〜55℃であり、pHは、3〜10、好ましくは5〜9、特に好ましくは5〜8である。また、酵素反応時間は、通常2〜48時間、好ましくは7〜15時間である。
酵素反応停止後、必要に応じて沈澱物を、遠心分離除去や各種フィルター処理により除去することが好ましい。
また、必要に応じて、得られる加水分解物から苦味や臭味を有するペプチドを除去することもできる。このような苦味成分や臭味成分の除去は、活性炭又は疎水性樹脂を用いて行なうことができる。例えば、得られた加水分解物中に、使用したカゼイン量に対して活性炭を1〜20重量%添加し、1〜10時間反応させることにより実施できる。使用した活性炭の除去は、遠心分離や膜処理操作等の公知の方法により行なうことができる。
このような粉末には、栄養的バランスや風味等を改善するために、各種補助添加剤を含有させることもできる。例えば、各種炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類、甘味料、香料、色素、テクスチュア改善剤が挙げられる。
関節リウマチ抑制剤の投与期間は、その症状等により調整することができ、通常1〜365日間で、常用的な摂取が好ましい。
前記製剤化は、例えば、適宜必要に応じて、薬剤として許容される担体、アジュバント、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、pH調節剤、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、保存剤、抗酸化剤等を用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で製造することができる。
特に関節リウマチ抑制作用を得るための摂取量は、機能性食品が、連用可能であり、常用的に長期間摂取することを鑑みると、ヒトの場合、1日あたり、前記カゼイン加水分解物の乾燥量又はカゼイン加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸混合物の乾燥量として、通常0.04〜100g、特に0.2〜20g程度が好ましいが、1日あたりの摂取回数に応じて、機能性食品における1回あたりの摂取量を前記量より更に低くすることも可能である。
本発明の機能性食品の摂取期間は、特に限定されず、長期間摂取することが好ましいが、上記効能を得るために、通常1日間以上、特に20日間〜12か月程度、常用的に摂取することが好ましい。
本発明の機能性飲食品の形態は、前記カゼイン加水分解物又は該カゼイン加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸を、そのまま、若しくは粉末や顆粒とし、各種飲食品に添加することで、固形物、ゲル状物、液状物の何れの形態とすることができ、例えば、飲料、ヨーグルト、流動食、ゼリー、キャンディ、レトルト食品、錠菓、クッキー、カステラ、パン、ビスケット、チョコレート等とすることができる。
製造例1
牛乳由来カゼイン(日本NZMP社製)1gを約80℃に調整した蒸留水99gに加えて充分に撹拌した後、1N水酸化ナトリウム(和光純薬社製)溶液を添加してpH7.0とし、また温度を20℃に調整して基質溶液を調製した。
得られた基質溶液にアスペルギルス・オリゼー由来であり、少なくとも金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼを含む市販の酵素(登録商標「スミチームFP」、新日本化学工業社製)を、酵素/カゼインの重量比が1/25となるように添加して、50℃で14時間反応させた。続いて、110℃で10分間のオートクレーブにより酵素を失活させ、カゼイン酵素分解物溶液を得た。次に、得られた酵素分解物溶液をスプレードライヤーにより乾燥し、粉末を調製した。
得られた粉末中の含有成分の分析を行なった。タンパク質はケルダール法で測定し、アミノ酸についてはアミノ酸分析装置にて測定した。また、該タンパク質量からアミノ酸を引いた量をペプチド量とした。更に、脂質は酸分解法で、灰分は直接灰化法で、水分は常圧加熱乾燥法でそれぞれ測定した。尚、100%から各成分を引いた残りを炭水化物量とした。その結果、アミノ酸は35.8重量%、ペプチドは45.7重量%、水分は6.6重量%、脂質は0.2重量%、灰分は4.1重量%及び炭水化物は7.6重量%であった。
得られた粉末に含まれるアミノ酸及びペプチドの平均鎖長は、それに含まれる遊離アミノ酸及びペプチドのアミノ基に反応するOPA試薬でモル数を測定し、同様に測定したカゼイン酸加水分解物のモル数との比で評価した。
メタノール1mlにo-フタルアルデヒド(蛍光分析用特級試薬、ナカライテスク社製)40mgを溶解させ、β-メルカプトエタノール100μlを加えた。予め調製しておいた100mMの四ホウ酸ナトリウム溶液25mlに、20%ドデシル硫酸ナトリウム2.5mlを加えたものを用いて、上記溶解したo-フタルアルデヒドを25mlに希釈し、更に蒸留水で50mlとすることでOPA試薬を調製した。
前記酵素を反応させた1%カゼイン酵素加水分解物粉末試料を、適当な溶媒に適当な濃度で溶解し、15000rpmで10分間遠心分離を行い、上清50μlを分取した。続いて、上記OPA試薬を1ml加え、よく撹拌し、室温で5分間放置した後、吸光光度計(商品名Ubest-35、日本分光(株)製)で340nmの吸収を測定した。
検量線は1%のカゼイン酸加水分解物を調製し、適切に希釈したものを用いて同様に測定した結果から、吸光度とモル濃度の関係を求めた。そして、平均鎖長は以下の式に従って計算した。その結果、平均鎖長は1.4であった。
平均鎖長=(1%カゼイン酸加水分解物のモル濃度)/(各試料1%カゼイン酵素加水分解物のモル濃度)
上記で調製した粉末を適量の蒸留水に溶解し、自動ペプチド分析機(商品名PPSQ-10(株)島津製作所製)を用いて解析し、粉末中においてN末端側から順に如何なるアミノ酸が位置するかを調べた。結果を表1に示す。尚、自動ペプチド分析機は遊離アミノ酸を検出しない。
また、5残基目のアミノ酸の合計は120pmol、6残基目のアミノ酸の合計は100pmolであった。これらの結果より、前記粉末中に含まれるペプチドのほとんどがジペプチド及びトリペプチドであることが判った。また、2残基目のアミノ酸がProであるペプチドの割合が49.5%と顕著に上昇していた。更に3残基目のアミノ酸がProであるペプチドの割合も29.8%と多かった。
従って、前記粉末には、Xaa Pro又はXaa Pro Proが多く含まれ、これらペプチドは生体内プロテアーゼによる酵素分解作用に対する抵抗性が高いペプチドであると推定できる。
上記酵素分解物の粉末について、各種の化学合成標準ペプチドを用いて、常法に従い、該粉末に含まれる表2に示すジペプチド及びトリペプチド量を求めた。結果を表2に示す。
ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 日本国茨城県つくば市東1−1−1中央第6 寄託番号:FERM BP−6060,寄託日1997.8.15)(以下、CM4株と称す)を用意した。このCM4株は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録されており、この株は既に特許されている。
次に、市販の脱脂粉乳を固形率9%(w/w)となるように蒸留水で溶解し、オートクレーブで105℃、10分間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し、CM4株スターター発酵液(菌数5×108個/ml)を3%(v/w)接種して、37℃で24時間、静置状態で発酵させCM4発酵乳を得た。得られたCM4発酵乳を80℃達温殺菌後、凍結乾燥によりCM4発酵粉末を得た。
被験物質として、製造例1で調製したカゼイン酵素分解物(実施例1)、製造例2で調製したCM4発酵粉末(比較例1)、牛乳カゼインナトリウム(比較例2)及び牛乳カゼイン酸分解物アミノ酸(比較例3)を準備した。
一方、加熱して死菌としたM. tuberculosis H37a(和光純薬社製)を適当量秤り、メノウ乳鉢で微粉末にした。次いで、流動パラフィン(和光純薬社製)を少しずつ加えて懸濁し、5mg/mlの懸濁液を調製し、感作アジュバントとした。この感作アジュバントの調製は、後述するアジュバントの感作日に行った。
前記予備飼育終了後、8匹/群の5群のラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、上記で調製した感作アジュバントの0.1mlを右後肢の足蹠皮内に注射して関節炎を誘発した。尚、誘発日をday0とした。
次いで、day0からday21まで、4群のラットに上記被験物質のそれぞれを0.5%CMC(カルボキシメチルセルロース)溶液にて10%に希釈したものを別個に、ラット用経口ゾンデを用いて1日1回、1ml/100gの割合で強制経口投与した。対照として、被験物質を含まない0.5%CMC溶液を投与した群を1群設けた。以下の検査項目について観察を行った。
体重:day0、5、9、14、19及び22に体重計により体重を測定した。
関節炎スコア:感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の3箇所について、発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼で観察し、無しを0点、軽度を1点、中程度を2点、やや重度を3点、重度を4点とし、最高12点の合計点で評価した。観察日は、day0、5、9、14、19及び22とした。
足容積:右後肢及び左後肢の容積を足容積測定装置(商品名TK-105、室町機械社製)により測定した。測定日は関節炎スコア観察日と同一にした。
得られた関節炎スコアは、群毎の平均値±標準誤差として示す。対照群(1群)に対する各群の統計的有意を検定するために、解析ソフト(Stat View, Abacus Inc., USA)を用いて分散分析(ANOVA)を行い等分散であることを確認した後、Fisher's PLSD法である多重比較検定を行い群間の比較を行った。統計的有意差はp<0.05の場合を有意であるとした。
関節炎スコアの結果を表3に示す。尚、体重は、対照に比べて各群とも顕著な変化は見られなかった。一般症状は、試験の全期間を通じて全ての群が関節炎症状以外の異常症状は示さなかった。
被験物質として、製造例1で調製したカゼイン酵素分解物(実施例2)、陽性対照物質としてIbuprofen(和光純薬社製)を準備した。
一方、実施例1と同様に、後述するアジュバントの感作日に感作アジュバントの調製を行った。
前記予備飼育終了後、8匹/群の6群のラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、上記で調製した感作アジュバントの0.1mlを右後肢の足蹠皮内に注射して関節炎を誘発した。尚、誘発日をday0とした。
次いで、day0からday21まで、5群のラットに上記被験物質を0.5%CMC溶液にてカゼイン酵素分解物を、5%(EL5%)、10%(EL10%)又は20%(EL20%)に希釈したもの、Ibuprofenを0.3%に希釈したものを別個に、ラット用経口ゾンデを用いて1日1回、1ml/100gの割合で強制経口投与した。対照として、被験物質を含まない0.5%CMC溶液を投与した群を1群設け、また無処置群を1群設けた。以下の検査項目について観察及び測定を行った。
体重:day0、5、9、14、19及び21に体重計により体重を測定した。
関節炎スコア:感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の3箇所について、発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼で観察し、無しを0点、軽度を1点、中程度を2点、やや重度を3点、重度を4点とし、最高12点の合計点で評価した。観察日は、day0、5、9、14、19及び21とした。
足容積:右後肢及び左後肢の容積を足容積測定装置(商品名TK-105、室町機械社製)を使用して測定した。測定日は関節炎スコア観察日と同一にした。
血漿分析:試験終了翌日(day22)及び翌々日(day23)にエーテル吸入麻酔下で、注射器(ヘパリンNa添加)を用いて心臓より採血し、遠心後の上層(血漿)部分に対して、NO2/NO3 Assay Kit-CII Colorimetric(同仁科学社製)を用いて一酸化窒素(NO)をGriess法で測定し、Prostaglandin E2 EIA Kit-Monoclonal(Cayman Chemical社製)を用いてプロスタグランジンE2(PGE2)をEIA法で測定した。
関節炎スコアの結果を表4に、足容積における感作肢容積結果を表5に、非感作肢容積結果を表6に、血漿PGE2の結果を図1に、血漿NOの結果を図2にそれぞれに示す。尚、体重は、対照に比べて各群とも顕著な変化は見られなかった。一般症状は、試験の全期間を通じて全ての群が関節炎症状以外の異常症状は示さなかった。
表5の感作後足容積の結果、実施例2の被験物質500mg/kgを投与した群でday9、19及び21の感作後足容積増加を有意に抑制した(p<0.05)。実施例2の被験物質2000mg/kgを投与した群でday5、9、19及び21の感作後足容積増加を有意に抑制した(p<0.001)。
表6の非感作後足容積の結果、実施例2の被験物質1000mg/kg及び2000mg/kgを投与した群で、非感作後左肢容積の増加を、day9、14、19及び21で有意に抑制した(p<0.001)。
図1の血漿PGE2の結果、実施例2の被験物質2000mg/kgを投与した群で血漿PGE2濃度増加を有意に抑制した(p<0.05)。
図2のNOの結果、実施例2の被験物質500、1000、2000mg/kgを投与した群で血漿NO(NO2 -+NO3)濃度増加を有意に抑制した(p<0.05)。
Claims (2)
- 獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含有する経口摂取用関節リウマチ抑制剤。
- 前記カゼイン加水分解物が、獣乳カゼインを、麹菌由来の酵素により酵素分解して得た分解物である請求項1記載の関節リウマチ抑制剤。
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