JPWO2006077857A1 - Method for coating particles with lipid membrane - Google Patents

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Abstract

被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる方法を提供することを目的とし、この目的を達成するために、正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、前記正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記正帯電性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理する。An object of the present invention is to provide a method in which a particle to be coated can be coated with two lipid membranes having a space between them. To achieve this object, two positively charged particles are used. A method of coating with a lipid membrane, wherein a plurality of negatively chargeable SUV liposomes are brought into contact with the positively chargeable particles, and the negatively chargeable particles are electrostatically bonded to the positively chargeable particles and the positively chargeable particles. A negatively chargeable complex containing SUV-type liposomes is formed, and the negatively chargeable complex is treated with a cation.

Description

本発明は、粒子を脂質膜で被覆する方法に関する。  The present invention relates to a method of coating particles with a lipid membrane.

近年、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するためのベクターの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。  In recent years, vectors for reliably delivering drugs, nucleic acids, peptides, proteins, sugars and the like to target sites have been actively developed. For example, in gene therapy, viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses have been developed as vectors for introducing a target gene into target cells. However, since viral vectors have problems such as difficulty in mass production, antigenicity, and toxicity, liposome vectors with few such problems are attracting attention. Liposome vectors also have the advantage that directivity with respect to target sites can be improved by introducing functional molecules such as antibodies, proteins, and sugar chains on the surface thereof.

リポソームの調製方法としては、例えば、脂質膜の単純水和法が知られている。脂質膜の単純水和法によれば、遺伝子等の目的物質の存在下、脂質膜を水和させることにより目的物質が封入された多重膜リポソームを調製することができる（非特許文献１）。こうして調製された多重膜リポソームに対して脂質膜の単純水和法を再度適用することにより、多重膜リポソームの外側にさらに新たな脂質膜を重層することができる。このように脂質膜の単純水和法を繰り返し行うことにより、多重膜リポソームに含まれる脂質膜の数を増加させることができる。
Ｋｏｇｕｒｅ等，「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ」，２００４年，９８巻，３１７−３２３頁 As a method for preparing liposomes, for example, a simple hydration method of a lipid membrane is known. According to the simple hydration method of lipid membranes, multilamellar liposomes in which the target substance is encapsulated can be prepared by hydrating the lipid film in the presence of the target substance such as a gene (Non-patent Document 1). By applying the lipid membrane simple hydration method again to the multilamellar liposomes thus prepared, a new lipid membrane can be further layered outside the multilamellar liposomes. Thus, the number of lipid membranes contained in multilamellar liposomes can be increased by repeating the simple hydration method of lipid membranes.
Kogure et al., “Journal of Controlled Release”, 2004, 98, 317-323.

しかしながら、脂質膜の単純水和法等の従来の方法では、脂質膜が不均一に重層されるため、多重膜リポソームに含まれる脂質膜の数を制御することは困難であった。また、脂質膜の単純水和法等の従来の方法では、脂質膜が地層のように何層にも重ねられるだけであり、脂質膜の間に空間を形成させることは困難であった。  However, in conventional methods such as the simple hydration method of lipid membranes, the lipid membranes are heterogeneously layered, so it is difficult to control the number of lipid membranes contained in multilamellar liposomes. Further, in conventional methods such as the simple hydration method of lipid membranes, the lipid membranes are simply stacked in layers such as a formation, and it is difficult to form a space between the lipid membranes.

そこで、本発明は、被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる方法、及び該方法によって被覆対象である粒子を２枚の脂質膜で被覆して得られるリポソームを提供することを目的とする。  Therefore, the present invention provides a method capable of coating a particle to be coated with two lipid membranes having a space between them, and a method to coat the particle to be coated with two lipid membranes by the method. An object of the present invention is to provide a liposome obtained in this manner.

本発明の第１の方法は、正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、前記正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記正帯電性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理することを特徴とする。  The first method of the present invention is a method of coating positively charged particles with two lipid membranes, wherein a plurality of negatively charged SUV liposomes are brought into contact with the positively charged particles, and the positively charged particles And negatively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the positively chargeable particles are formed, and the negatively chargeable complex is treated with a cation.

本発明の第１の方法によれば、正帯電性粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる。正帯電性粒子を本発明の第１の方法により被覆して得られるリポソームにおいて、正帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜（正帯電性粒子の外側に形成された第１の脂質膜及び第１の脂質膜の外側に形成された第２の脂質膜）の間には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることができる。  According to the first method of the present invention, the positively charged particles can be coated with two lipid membranes having a space formed therebetween. In the liposome obtained by coating the positively charged particles by the first method of the present invention, two lipid membranes that coat the positively charged particles (the first lipid membrane formed outside the positively charged particles and A space is formed between the second lipid membrane formed outside the first lipid membrane, and a desired substance can be held in this space.

本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子が目的物質の凝集体であることが好ましい。この場合、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームを作製することができる。  In the first method of the present invention, the positively chargeable particles are preferably aggregates of the target substance. In this case, aggregates of the target substance are encapsulated, and bilamellar liposomes in which a space is formed between the two lipid membranes covering the aggregate of the target substance can be produced.

本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子が正帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることが好ましい。この場合、正帯電性ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。  In the first method of the present invention, the positively charged particles are preferably positively charged n-lamellar liposomes (n is an integer of 1 or more). In this case, (n + 2) single membrane liposome in which a space is formed between two lipid membranes covering the positively charged n single membrane liposome can be produced.

本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子のゼータ電位が２０〜３０ｍＶであり、前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであることが好ましい。この場合、正帯電性粒子と該正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を効率よく形成させることができる。  In the first method of the present invention, it is preferable that the positively charged particles have a zeta potential of 20 to 30 mV, and the negatively charged SUV liposome has a zeta potential of -20 to -30 mV. In this case, a negatively chargeable complex including positively chargeable particles and a plurality of negatively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the positively chargeable particles can be efficiently formed.

本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることが好ましい。この場合、正帯電性粒子と該正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を効率よく形成させることができる。  In the first method of the present invention, the positively charged particles preferably have a particle size of 50 nm or more. In this case, a negatively chargeable complex including positively chargeable particles and a plurality of negatively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the positively chargeable particles can be efficiently formed.

本発明の第２の方法は、負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、前記負帯電性粒子に複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記負帯電性粒子と前記負帯電性粒子に静電的に結合した前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を形成させ、前記正帯電性複合体をアニオンで処理することを特徴とする。  The second method of the present invention is a method of coating negatively charged particles with two lipid membranes, wherein a plurality of positively charged SUV liposomes are contacted with the negatively charged particles, and the negatively charged particles And the positively chargeable SUV-type liposome electrostatically bonded to the negatively chargeable particles are formed, and the positively chargeable complex is treated with an anion.

本発明の第２の方法によれば、負帯電性粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる。負帯電性粒子を本発明の第２の方法により被覆して得られるリポソームにおいて、負帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜の間（負帯電性粒子の外側に形成された第１の脂質膜及び第１の脂質膜の外側に形成された第２の脂質膜）には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることができる。  According to the second method of the present invention, negatively chargeable particles can be coated with two lipid membranes with a space formed therebetween. In the liposome obtained by coating the negatively charged particles by the second method of the present invention, between the two lipid membranes covering the negatively charged particles (the first lipid formed outside the negatively charged particles) A space is formed in the membrane and the second lipid membrane formed outside the first lipid membrane, and a desired substance can be held in this space.

本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子が目的物質の凝集体であることが好ましい。この場合、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームを作製することができる。  In the second method of the present invention, the negatively chargeable particles are preferably aggregates of the target substance. In this case, aggregates of the target substance are encapsulated, and bilamellar liposomes in which a space is formed between the two lipid membranes covering the aggregate of the target substance can be produced.

本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子が負帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることが好ましい。この場合、負帯電性ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。  In the second method of the present invention, the negatively charged particles are preferably negatively charged n-lamellar liposomes (n is an integer of 1 or more). In this case, (n + 2) single membrane liposome in which a space is formed between two lipid membranes covering the negatively charged n single membrane liposome can be prepared.

本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子のゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであり、前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が２０〜３０ｍＶであることが好ましい。この場合、負帯電性粒子と該負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を効率よく形成させることができる。  In the second method of the present invention, it is preferable that the negatively charged particles have a zeta potential of −20 to −30 mV, and the positively charged SUV liposome has a zeta potential of 20 to 30 mV. In this case, a positively chargeable complex including negatively chargeable particles and a plurality of positively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the negatively chargeable particles can be efficiently formed.

本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることが好ましい。この場合、負帯電性粒子と該負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を効率よく形成させることができる。  In the second method of the present invention, the negatively chargeable particles preferably have a particle size of 50 nm or more. In this case, a positively chargeable complex including negatively chargeable particles and a plurality of positively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the negatively chargeable particles can be efficiently formed.

本発明の方法によれば、被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる。したがって、被覆対象である粒子として目的物質の凝集体を使用すれば、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームを作製することができ、被覆対象である粒子としてｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）を使用すれば、ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。正帯電性粒子又は負帯電性粒子を本発明の方法により被覆して得られるリポソームにおいて、正帯電性粒子又は負帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜の間には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることができる。  According to the method of the present invention, particles to be coated can be coated with two lipid membranes with a space formed between them. Therefore, if the aggregate of the target substance is used as the particles to be coated, the aggregate of the target substance is enclosed, and a space is formed between the two lipid membranes that coat the aggregate of the target substance. Bilamellar liposomes can be prepared. When n-lamellar liposomes (n is an integer of 1 or more) are used as the particles to be coated, the two lipid membranes that coat the n-lamellar liposomes are used. (N + 2) membrane liposomes with a space formed between them can be produced. In the liposome obtained by coating positively charged particles or negatively charged particles by the method of the present invention, a space is formed between the two lipid membranes covering the positively charged particles or the negatively charged particles. In this space, a desired substance can be held.

（ａ）は各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定した結果を示す図であり、（ｂ）は各フラクションのローダミン含量及びＮＢＤ含量を蛍光強度によって測定した結果を示す図である。(A) is a figure which shows the result of having measured the DNA content of each fraction by DNA agarose gel electrophoresis, (b) is a figure which shows the result of having measured the rhodamine content and NBD content of each fraction by fluorescence intensity. （ａ）は各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定した結果を示す図であり、（ｂ）は各フラクションのローダミン含量及びＮＢＤ含量を蛍光強度によって測定した結果を示す図である。(A) is a figure which shows the result of having measured the DNA content of each fraction by DNA agarose gel electrophoresis, (b) is a figure which shows the result of having measured the rhodamine content and NBD content of each fraction by fluorescence intensity. 各種多重リポソームによって細胞内に導入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現活性を示す図である。It is a figure which shows the expression activity of the luciferase gene introduce | transduced in the cell by various multi-liposome.

本発明の第１の方法においては、まず、正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、正帯電性粒子と正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させる。
本発明の第２の方法においては、まず、負帯電性粒子に複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、負帯電性粒子と負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を形成させる。In the first method of the present invention, first, a negatively chargeable SUV type in which a plurality of negatively chargeable SUV liposomes are brought into contact with positively chargeable particles and electrostatically bound to the positively chargeable particles and the positively chargeable particles. A negatively charged complex containing liposomes is formed.
In the second method of the present invention, first, a positively chargeable SUV type in which a plurality of positively chargeable SUV liposomes are brought into contact with negatively chargeable particles and electrostatically bound to the negatively chargeable particles and the negatively chargeable particles. A positively charged complex containing liposomes is formed.

正帯電性粒子のゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常１０〜６０ｍＶ、好ましくは２０〜５０ｍＶ、さらに好ましくは２０〜３０ｍＶである。負帯電性粒子のゼータ電位は負である限り特に限定されるものではないが、通常−１０〜−６０ｍＶ、好ましくは−２０〜−５０ｍＶ、さらに好ましくは−２０〜−３０ｍＶである。ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常２５℃である。  The zeta potential of the positively chargeable particle is not particularly limited as long as it is positive, but is usually 10 to 60 mV, preferably 20 to 50 mV, and more preferably 20 to 30 mV. The zeta potential of the negatively chargeable particles is not particularly limited as long as it is negative, but is usually −10 to −60 mV, preferably −20 to −50 mV, and more preferably −20 to −30 mV. The measurement conditions for the zeta potential are not particularly limited, but the temperature condition is usually 25 ° C.

正帯電性粒子及び負帯電性粒子の粒径は特に限定されるものではないが、粒径の下限値は、好ましくは５０ｎｍ、さらに好ましくは７０ｎｍであり、粒径の上限値は、好ましくは５００ｎｍ、さらに好ましくは２００ｎｍである。正帯電性粒子の粒径が上記範囲にあると、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームをカチオンで処理したときに、正帯電性粒子を２枚の脂質膜で効率よく被覆することができる。また、負帯電性粒子の粒径が上記範囲にあると、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームをアニオンで処理したときに、負帯電性粒子を２枚の脂質膜で効率よく被覆することができる。  The particle size of the positively charged particles and the negatively charged particles is not particularly limited, but the lower limit value of the particle size is preferably 50 nm, more preferably 70 nm, and the upper limit value of the particle size is preferably 500 nm. More preferably, it is 200 nm. When the particle size of the positively charged particles is within the above range, when the negatively charged SUV liposome electrostatically bound to the positively charged particles is treated with a cation, the positively charged particles are separated by two lipid membranes. It can coat efficiently. When the particle size of the negatively charged particles is in the above range, when the positively charged SUV liposome electrostatically bonded to the negatively charged particles is treated with anions, the negatively charged particles are separated into two lipids. The film can be efficiently coated.

正帯電性粒子は、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質及び／又はアニオン性物質を含んでいてもよい。負帯電性粒子は、全体として負に帯電する限り、アニオン性物質に加え、中性物質及び／又はカチオン性物質を含んでいてもよい。  The positively chargeable particles may contain a neutral substance and / or an anionic substance in addition to the cationic substance as long as it is positively charged as a whole. The negatively charged particles may contain a neutral substance and / or a cationic substance in addition to the anionic substance as long as it is negatively charged as a whole.

正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、目的物質（例えば細胞内又は核内に送達すべき物質）の凝集体を使用することができる。正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用する場合、正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより、目的物質が封入された２枚膜リポソームを作製することができる。目的物質の凝集体は、目的物質のみから構成されていてもよいし、目的物質以外の物質（例えば、目的物質を保持する担体）を含んでいてもよい。  As positively or negatively charged particles, for example, aggregates of target substances (for example, substances to be delivered into cells or nuclei) can be used. When the aggregate of the target substance is used as the positively or negatively charged particles, the bilayer liposome encapsulating the target substance is coated by coating the positively or negatively charged particles with two lipid membranes. Can be produced. The aggregate of the target substance may be composed of only the target substance, or may contain a substance other than the target substance (for example, a carrier that holds the target substance).

目的物質が正に帯電している場合、例えば、目的物質とアニオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負に帯電している場合、例えば、目的物質とカチオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、目的物質とカチオン性物質とを適当な様式（例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等）で結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、目的物質とカチオン性物質又はアニオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。  When the target substance is positively charged, an aggregate of the target substance can be prepared by, for example, electrostatically binding the target substance and the anionic substance to form a complex. When the target substance is negatively charged, for example, an aggregate of the target substance can be prepared by electrostatically binding the target substance and the cationic substance to form a complex. When the target substance is not negatively or positively charged, the target substance and the cationic substance are combined in an appropriate manner (for example, physical adsorption, hydrophobic bond, chemical bond, etc.) to form a complex. Thus, an aggregate of the target substance can be prepared. When complexing, an aggregate of the target substance that is positively or negatively charged as a whole can be prepared by adjusting the mixing ratio of the target substance and the cationic substance or anionic substance.

目的物質は特に限定されるものではなく、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、糖、これらの複合体等が挙げられる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。  The target substance is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids, peptides, proteins, drugs, sugars, and complexes thereof. The “nucleic acid” includes analogs or derivatives thereof (for example, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.) in addition to DNA or RNA. Further, the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be either linear or circular.

目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸の凝集体を調製することができる。  When the target substance is a nucleic acid, an aggregate of nucleic acids can be prepared by electrostatically binding the nucleic acid and the cationic substance to form a complex. By adjusting the mixing ratio of the nucleic acid and the cationic substance at the time of complexing, an aggregate of nucleic acids that are charged positively or negatively as a whole can be prepared.

目的物質の凝集体を調製する際に使用するカチオン性物質は、分子中にカチオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質としては、例えば、カチオン性脂質（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））；カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、グルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロタミン等を使用することができる。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。  The cationic substance used when preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having a cationic group in the molecule. Examples of the cationic substance include cationic lipids (for example, Lipofectamine (manufactured by Invitrogen)); polymers having a cationic group; polylysine, polyarginine, homopolymers of basic amino acids such as a copolymer of lysine and arginine, and the like. Polymers or copolymers or derivatives thereof (for example, stearyl derivatives); polycationic polymers such as polyethyleneimine, poly (allylamine), poly (diallyldimethylammonium chloride), glucosamine; protamine sulfate and the like can be used. The number of cationic groups possessed by the cationic substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more. The cationic group is not particularly limited as long as it can be positively charged. For example, an amino group; a monoalkylamino group such as a methylamino group or an ethylamino group; a dialkylamino group such as a dimethylamino group or a diethylamino group; Group; a guanidino group and the like.

目的物質の凝集体を調製する際に使用するアニオン性物質は、分子中にアニオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。アニオン性物質としては、例えば、アニオン性脂質；アニオン性基を有する高分子；ポリアスパラギン酸等の酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、ポリサッカライド、カラギーナン等のポリアニオン性ポリマー等を使用することができる。アニオン性物質が有するアニオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。アニオン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、末端カルボキシル基を有する官能基（例えば、コハク酸残基、マロン酸残基等）、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。  The anionic substance used when preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having an anionic group in the molecule. Examples of anionic substances include anionic lipids; polymers having anionic groups; homopolymers or copolymers of acidic amino acids such as polyaspartic acid or derivatives thereof; xanthan gum, carboxyvinyl polymer, carboxymethylcellulose polystyrene sulfone. Polyanionic polymers such as acid salts, polysaccharides and carrageenans can be used. The number of anionic groups contained in the anionic substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more. The anionic group is not particularly limited as long as it can be negatively charged. For example, a functional group having a terminal carboxyl group (for example, a succinic acid residue, a malonic acid residue, etc.), a phosphoric acid group, a sulfuric acid group, etc. Can be mentioned.

正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、正帯電性又は負帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）を使用することができる。正帯電性又は負帯電性粒子としてｎ枚膜リポソームを使用する場合、正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより、（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。正帯電性又は負帯電性ｎ枚膜リポソームの内部には目的物質（例えば細胞内又は核内に送達すべき物質）が封入されていてもよいし、封入されていなくてもよい。正帯電性ｎ枚膜リポソームは、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質及び／又はアニオン性物質を含んでいてもよい。負帯電性ｎ枚膜リポソームは、全体として負に帯電する限り、アニオン性物質に加え、中性物質及び／又はカチオン性物質を含んでいてもよい。  As the positively or negatively charged particles, for example, positively or negatively charged n-lamellar liposomes (n is an integer of 1 or more) can be used. When n-membrane liposomes are used as positively or negatively charged particles, (n + 2) membrane liposomes can be prepared by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes. . A target substance (for example, a substance to be delivered into cells or nuclei) may or may not be enclosed in the positively or negatively charged n-lamellar liposomes. The positively charged n-lamellar liposome may contain a neutral substance and / or an anionic substance in addition to the cationic substance as long as it is positively charged as a whole. The negatively charged n-membrane liposome may contain a neutral substance and / or a cationic substance in addition to the anionic substance as long as it is negatively charged as a whole.

ｎ枚膜リポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。また、ｎ枚膜リポソームは、本発明の方法を使用して正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより作製することができる。  The n-lamellar liposomes should be prepared using known methods such as hydration, sonication, ethanol injection, ether injection, reverse phase evaporation, surfactant method, freezing / thawing method, etc. Can do. In addition, n-membrane liposomes can be prepared by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes using the method of the present invention.

ｎ枚膜リポソームを構成する物質（例えば、脂質膜構成成分、リポソーム内部に封入される物質等）の種類及び含有量を調節することにより、正帯電性又は負帯電性ｎ枚膜リポソームを作製することができる。また、負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をカチオン性物質で修飾することにより、正帯電性ｎ枚膜リポソームを作製することができ、正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をアニオン性物質で修飾することにより、負帯電性ｎ枚膜リポソームを作製することができる。  A positively or negatively charged n-lamellar liposome is prepared by adjusting the type and content of a substance constituting the n-lamellar liposome (for example, a lipid membrane constituent, a substance enclosed in the liposome). be able to. Further, by modifying the surface of negatively charged n-lamellar liposomes or neutral n-lamellar liposomes with a cationic substance, positively-charged n-lamellar liposomes can be produced. By modifying the surface of neutral n-lamellar liposomes with an anionic substance, negatively-charged n-lamellar liposomes can be prepared.

ｎ枚膜リポソームは、例えば、水和法により次のように作製することができる。脂質膜の構成成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、多重膜リポソームに転換することができる。多重膜リポソームから１枚膜リポソームへの転換又は１枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換は公知の方法に従って行うことができる。ｎ枚膜リポソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分布を持ったｎ枚膜リポソームを得ることができる。  The n-lamellar liposome can be prepared, for example, by the hydration method as follows. After the constituent components of the lipid membrane are dissolved in an organic solvent, the lipid membrane is obtained by evaporating and removing the organic solvent. In this case, examples of the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene; methanol, ethanol, and the like Lower alcohols; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; ketones such as acetone and the like. These may be used alone or in combination of two or more. The lipid membrane can then be hydrated and converted to multilamellar liposomes by stirring or sonication. Conversion from multilamellar liposomes to single membrane liposomes or from single membrane liposomes to multilamellar liposomes can be performed according to known methods. By passing the n-membrane liposomes through a filter having a predetermined pore size, n-membrane liposomes having a certain particle size distribution can be obtained.

目的物質が水溶性である場合、ｎ枚膜リポソームの製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質又はその凝集体を添加することにより、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、ｎ枚膜リポソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質又はその凝集体を添加することにより、リポソームの脂質膜に目的物質を封入することができる。  When the target substance is water-soluble, the target substance or an aggregate thereof is added to the aqueous solvent used when hydrating the lipid membrane in the production of n-lamellar liposomes, so that the target substance is added to the aqueous phase inside the liposome. Can be enclosed. In addition, when the target substance is fat-soluble, the target substance can be encapsulated in the lipid membrane of the liposome by adding the target substance or an aggregate thereof to an organic solvent used in the production of n-lamellar liposomes. it can.

負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をカチオン性物質で修飾する場合、例えば、負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの外液に、疎水性基を有するカチオン性物質を添加する。これにより、カチオン性物質が脂質膜から露出するように疎水性基が脂質膜に挿入され、負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面にカチオン性物質を導入することができる。  When the surface of the negatively charged n-membrane liposome or neutral n-membrane liposome is modified with a cationic substance, for example, a hydrophobic group is added to the external liquid of the negatively charged n-membrane liposome or neutral n-membrane liposome. The cationic substance which has is added. Thereby, a hydrophobic group is inserted into the lipid membrane so that the cationic material is exposed from the lipid membrane, and the cationic material can be introduced onto the surface of the negatively charged n-membrane liposome or neutral n-membrane liposome. .

正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をアニオン性物質で修飾する場合、例えば、正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの外液に、疎水性基を有するアニオン性物質を添加する。これにより、アニオン性物質が脂質膜から露出するように疎水性基が脂質膜に挿入され。正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面にアニオン性物質を導入することができる。  When the surface of positively charged n-lamellar liposomes or neutral n-lamellar liposomes is modified with an anionic substance, for example, a hydrophobic group is added to the external liquid of positively-charged n-lamellar liposomes or neutral n-lamellar liposomes. The anionic substance which has is added. As a result, a hydrophobic group is inserted into the lipid membrane so that the anionic substance is exposed from the lipid membrane. An anionic substance can be introduced on the surface of positively charged n-lamellar liposomes or neutral n-lamellar liposomes.

疎水性基は、脂質膜に挿入され得る限り特に限定されるものでない。疎水性基としては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール残基等のステロール残基、リン脂質残基、糖脂質残基、長鎖脂肪族アルコール残基（例えば、フォスファチジルエタノールアミン残基等）、ポリオキシプロピレンアルキル基、グリセリン脂肪酸エステル残基等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。  The hydrophobic group is not particularly limited as long as it can be inserted into the lipid membrane. Examples of the hydrophobic group include a saturated or unsaturated fatty acid group such as a stearyl group, a sterol residue such as a cholesterol residue, a phospholipid residue, a glycolipid residue, and a long-chain aliphatic alcohol residue (for example, phosphate). Fatidylethanolamine residue, etc.), polyoxypropylene alkyl group, glycerin fatty acid ester residue, etc., among these, fatty acid groups having 10 to 20 carbon atoms (for example, palmitoyl group, oleyl group, stearyl group, Arachidyl group and the like are preferred.

ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分は、脂質二重層の形成を阻害しない限り特に限定されるものではなく、脂質膜構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。  The lipid membrane constituent in the n-membrane liposome is not particularly limited as long as it does not inhibit the formation of the lipid bilayer. Examples of the lipid membrane constituent include lipids, membrane stabilizers, antioxidants, and charged substances. And membrane proteins.

正帯電性ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ｎ枚膜リポソームが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ｎ枚膜リポソームが全体として負に帯電するように調節される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば、カチオン性脂質、カチオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、アニオン性脂質、アニオン性膜安定化剤等が挙げられる。なお、ｎ枚膜リポソームの内部に所定の物質（例えば目的物質の凝集体）が封入されている場合、ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ｎ枚膜リポソームの内部に封入されている物質全体の電荷を考慮して調節される。  The type and content of the lipid membrane constituents in the positively charged n-membrane liposome are adjusted so that the n-membrane liposome is positively charged as a whole, and the type and content of the lipid membrane constituents in the negatively charged n-membrane liposome and The content is adjusted so that the n-membrane liposomes are negatively charged as a whole. Examples of lipid membrane constituents that impart a positive charge include cationic lipids and cationic membrane stabilizers, and lipid membrane constituents that impart a negative charge include anionic lipids and anionic membranes. A stabilizer etc. are mentioned. In addition, when a predetermined substance (for example, an aggregate of a target substance) is encapsulated inside the n-membrane liposome, the type and content of the lipid membrane constituents in the n-membrane liposome are determined within the n-membrane liposome. It is adjusted taking into account the overall charge of the encapsulated material.

ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）型リポソームは、粒径（直径）が１００ｎｍ以下である１枚膜リポソームである。ＳＵＶ型リポソームの粒径（直径）は１００ｎｍ以下である限り特に限定されるものではないが、通常３０〜１００ｎｍ、好ましくは３０〜７０ｎｍ、さらに好ましくは３０〜５０ｎｍである。  SUV (small unilamellar vesicle) type liposomes are unilamellar liposomes having a particle size (diameter) of 100 nm or less. The particle size (diameter) of the SUV-type liposome is not particularly limited as long as it is 100 nm or less, but is usually 30 to 100 nm, preferably 30 to 70 nm, and more preferably 30 to 50 nm.

多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、ＳＵＶ以外の１枚膜リポソーム（例えばＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）等）は、粒子径が１００ｎｍ以上であるため（一般的に１００ｎｍ以上の粒子径を有する脂質膜は平面膜として考えられる）、膜の曲率及び表面エネルギーが小さく、リポソーム同士の凝集が生じ難い。これに対して、ＳＵＶ型リポソームは、粒子径が１００ｎｍ未満であるため、膜の曲率及び表面エネルギーが大きく、リポソーム同士の凝集が生じ易い。したがって、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームをカチオンで処理すると、効率よく負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることができる。また、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームをアニオンで処理すると、効率よく正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることができる。  Multilamellar liposomes (MLV) and single membrane liposomes other than SUV (for example, LUV (large unilamellar vesicle), GUV (giant unilamellar vesicle), etc.) have a particle size of 100 nm or more (generally a particle size of 100 nm or more Lipid membranes having a low molecular weight are considered as planar membranes), and the curvature and surface energy of the membrane are small and aggregation of liposomes is difficult to occur. On the other hand, since the SUV type liposome has a particle diameter of less than 100 nm, the curvature of the membrane and the surface energy are large, and the liposomes tend to aggregate. Therefore, when negatively charged SUV liposomes electrostatically bonded to positively charged particles are treated with a cation, the negatively charged SUV liposomes can be efficiently membrane-fused with each other. In addition, when positively charged SUV liposomes electrostatically bonded to negatively charged particles are treated with anions, the positively charged SUV liposomes can be efficiently membrane-fused with each other.

ＳＵＶ型リポソームは、例えば、超音波法により次のようにして作製することができる。脂質膜の構成成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波槽を用いた超音波処理により多重膜リポソームを作製することができる。得られた多重膜リポソームを、さらにプローブ型超音波装置によって超音波処理することにより、小さい１枚膜リポソームであるＳＵＶ型リポソームを調製することができる。  The SUV-type liposome can be produced, for example, by the ultrasonic method as follows. After the constituent components of the lipid membrane are dissolved in an organic solvent, the lipid membrane is obtained by evaporating and removing the organic solvent. In this case, examples of the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene; methanol, ethanol, and the like Lower alcohols; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; ketones such as acetone and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Next, the lipid membrane can be hydrated, and multilamellar liposomes can be prepared by stirring or ultrasonic treatment using an ultrasonic bath. The obtained multilamellar liposomes are further subjected to sonication with a probe-type ultrasonic device, whereby SUV-type liposomes, which are small unilamellar liposomes, can be prepared.

ＳＵＶ型リポソームにおける脂質膜構成成分は、脂質二重層の形成を阻害しない限り特に限定されるものではなく、脂質膜構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。  The lipid membrane component in the SUV-type liposome is not particularly limited as long as it does not inhibit the formation of the lipid bilayer. Examples of the lipid membrane component include lipids, membrane stabilizers, antioxidants, charged substances, Examples thereof include membrane proteins.

正帯電性ＳＵＶ型リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ＳＵＶ型リポソームが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性ＳＵＶ型リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ＳＵＶ型リポソームが全体として負に帯電するように調節される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば、カチオン性脂質、カチオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、アニオン性脂質、アニオン性膜安定化剤等が挙げられる。正帯電性ＳＵＶ型リポソームは、全体として正に帯電する限り、正の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、負の電荷を付与する脂質膜構成成分及び／又は中性の脂質膜構成成分を含んでいてもよく、負帯電性ＳＵＶ型リポソームは、全体として負に帯電する限り、負の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、正の電荷を付与する脂質膜構成成分及び／又は中性の脂質膜構成成分を含んでいてもよい。  The type and content of lipid membrane components in positively charged SUV liposomes are adjusted so that the SUV liposomes are positively charged as a whole, and the type and content of lipid membrane components in negatively charged SUV liposomes are: The SUV type liposome is adjusted so as to be negatively charged as a whole. Examples of lipid membrane constituents that impart a positive charge include cationic lipids and cationic membrane stabilizers, and lipid membrane constituents that impart a negative charge include anionic lipids and anionic membranes. A stabilizer etc. are mentioned. As long as the positively chargeable SUV liposome is positively charged as a whole, in addition to a lipid membrane component that imparts a positive charge, a lipid membrane component and / or a neutral lipid membrane component that imparts a negative charge. As long as the negatively chargeable SUV liposome is negatively charged as a whole, in addition to the lipid membrane component that imparts a negative charge, the lipid membrane component and / or neutral that imparts a positive charge The lipid membrane component may be included.

正帯電性ＳＵＶ型リポソームが正の電荷を付与する脂質膜構成成分としてカチオン性脂質を含む場合、カチオン性脂質の配合量は脂質の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜１５％（モル比）である。
負帯電性ＳＵＶ型リポソームが負の電荷を付与する脂質膜構成成分としてアニオン性脂質を含む場合、アニオン性脂質の配合量は脂質の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜１５％（モル比）である。When the positively chargeable SUV liposome contains a cationic lipid as a lipid membrane constituent that imparts a positive charge, the amount of the cationic lipid is usually 5 to 30% (molar ratio) of the total amount of the lipid, preferably It is 10 to 20% (molar ratio), more preferably 10 to 15% (molar ratio).
When the negatively charged SUV liposome contains an anionic lipid as a lipid membrane constituent that imparts a negative charge, the amount of the anionic lipid is usually 5 to 30% (molar ratio) of the total amount of the lipid, preferably It is 10 to 20% (molar ratio), more preferably 10 to 15% (molar ratio).

正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常１０〜６０ｍＶ、好ましくは２０〜５０ｍＶ、さらに好ましくは２０〜３０ｍＶであり、負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は負である限り特に限定されるものではないが、通常−１０〜−６０ｍＶ、好ましくは−２０〜−５０ｍＶ、さらに好ましくは−２０〜−３０ｍＶである。ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常２５℃である。  The zeta potential of the positively chargeable SUV liposome is not particularly limited as long as it is positive, but is usually 10 to 60 mV, preferably 20 to 50 mV, more preferably 20 to 30 mV. The zeta potential is not particularly limited as long as it is negative, but is usually −10 to −60 mV, preferably −20 to −50 mV, and more preferably −20 to −30 mV. The measurement conditions for the zeta potential are not particularly limited, but the temperature condition is usually 25 ° C.

ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、脂質は脂質膜の必須成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常３０〜１００％（モル比）、好ましくは５０〜１００％（モル比）、さらに好ましくは７０〜１００％（モル比）である。  In n-lamellar liposomes or SUV-type liposomes, lipid is an essential component of the lipid membrane, and its blending amount is usually 30 to 100% (molar ratio), preferably 50 to 100% (molar ratio) of the total blending amount of lipid membrane components. Molar ratio), more preferably 70 to 100% (molar ratio).

脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等が挙げられる。糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等が挙げられる。ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。  Examples of lipids include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like. Examples of the phospholipid include phosphatidylcholine (e.g., dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine), phosphatidylglycerol (e.g., dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, Dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol, etc.), phosphatidyl ethanolamine (eg dioleoyl phosphatidylethanolamine, dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoy) Phosphatidylethanolamine, distearoyl phosphatidyl diethanolamine), phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc. These hydrogenated products thereof. Examples of glycolipids include glyceroglycolipid (eg, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), glycosphingolipid (eg, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside) and the like. Can be mentioned. Examples of sterols include animal-derived sterols (for example, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol), plant-derived sterols (phytosterol) (for example, stigmasterol, sitosterol, campesterol, Brush casterol), microorganism-derived sterol (for example, timosterol, ergosterol) and the like. Examples of saturated or unsaturated fatty acids include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.

脂質は、中性脂質、カチオン性脂質及びアニオン性脂質に分類され、中性脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド等が挙げられ、カチオン性脂質としては、例えば、例えば、ＤＯＤＡＣ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＤＡＢ（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）等が挙げられ、アニオン性脂質としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられる。  Lipids are classified into neutral lipids, cationic lipids and anionic lipids. Examples of neutral lipids include diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, cholesterol, ceramide, sphingomyelin, cephalin, and cerebroside. Examples of sex lipids include, for example, DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride), DOTMA (N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylaluminium), DDAB (didodecylbromodiimide, -3-trimethylamylopropane), DC-Chol (3β- -(N ', N',-dimethyl-aminoethylane) -carbamoylcholesterol), DMRIE (1,2-dimethylristopropylpropyl-3-dimethyoxyethylamine-nitroxyloxymethylene) N, N-dimethyl-1-propanamine trifluoroacetate) and the like, and examples of the anionic lipid include cardiolipin, diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidic acid, N-succinylphosphatidylethanolamine (N-succinylPE), phosphatidic acid, Phosphatidylinositol, Phosph Examples include watidylglycerol, phosphatidylethylene glycol, and cholesterol succinic acid.

ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常１０〜５０％（モル比）、好ましくは２０〜５０％（モル比）、さらに好ましくは３０〜５０％（モル比）である。  In n-lamellar liposomes or SUV-type liposomes, the membrane stabilizer is an optional component that is added to physically or chemically stabilize the lipid membrane or to regulate the fluidity of the lipid membrane. The blending amount is usually 10 to 50% (molar ratio), preferably 20 to 50% (molar ratio), more preferably 30 to 50% (molar ratio) of the total blending amount of the lipid membrane components.

膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。  Examples of the film stabilizer include sterol, glycerin or fatty acid ester thereof. Specific examples of sterols are the same as those described above, and examples of glycerin fatty acid esters include triolein and trioctanoin.

ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜３０％（モル比）、さらに好ましくは２０〜３０％（モル比）である。  In n-lamellar liposomes or SUV-type liposomes, the antioxidant is an optional component added to prevent oxidation of the lipid membrane, and its blending amount is usually 5 to 30% of the total blending amount of the lipid membrane components. (Molar ratio), preferably 10 to 30% (molar ratio), more preferably 20 to 30% (molar ratio).

抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。  Examples of the antioxidant include tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene and the like.

ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜１５％（モル比）である。  In n-lamellar liposomes or SUV-type liposomes, the charged substance is an optional component added to impart a positive charge or negative charge to the lipid membrane, and its blending amount is usually 5 of the total blending amount of the lipid membrane constituent components. -30% (molar ratio), preferably 10-20% (molar ratio), more preferably 10-15% (molar ratio).

正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステロールコハク酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。  Examples of the charged substance that imparts a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane, and the like. Examples of the charged substance to be imparted include dicetyl phosphate, cholesterol succinic acid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.

ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常０．１〜２％（モル比）、好ましくは０．５〜２％（モル比）、さらに好ましくは１〜２％（モル比）である。  In n-lamellar liposomes or SUV-type liposomes, the membrane protein is an optional component added to maintain the structure of the lipid membrane or to impart functionality to the lipid membrane. It is usually 0.1 to 2% (molar ratio), preferably 0.5 to 2% (molar ratio), more preferably 1 to 2% (molar ratio) of the total amount of components.

膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。  Examples of membrane proteins include membrane surface proteins and membrane integral proteins.

正帯電性又は負帯電性粒子にそれぞれ負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させる条件は特に限定されるものではないが、温度は通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは通常６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５であり、時間は通常１〜２０分間、好ましくは５〜１０分間である。接触させる際に用いる溶媒は特に限定されるものではないが、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、生理食塩水、ショ糖溶液等を用いることができる。溶媒中に分散させる負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソームの量は、通常、正帯電性又は負帯電性粒子に対して過剰量であり、例えば、正帯電性又は負帯電性粒子の封入に理論上最低限必要な負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソーム量の２〜４倍量である。  There are no particular restrictions on the conditions in which the negatively charged or positively charged SUV liposomes are brought into contact with the positively charged or negatively charged particles, respectively, but the temperature is usually 10 to 40 ° C., preferably 20 to 30 ° C. The pH is usually 6.5 to 8.0, preferably 7.0 to 7.5, and the time is usually 1 to 20 minutes, preferably 5 to 10 minutes. Although the solvent used when making it contact is not specifically limited, For example, a HEPES buffer, a physiological saline, a sucrose solution, etc. can be used. The amount of negatively charged or positively charged SUV liposomes to be dispersed in a solvent is usually an excessive amount with respect to positively charged or negatively charged particles. For example, for inclusion of positively charged or negatively charged particles. The amount is 2 to 4 times the amount of negatively charged or positively charged SUV-type liposome that is theoretically required.

正帯電性粒子に負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させると、正帯電性粒子と負帯電性ＳＵＶ型リポソームとは静電的相互作用を介して結合し、正帯電性粒子の表面は複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームによって覆われる。これにより、正帯電性粒子と正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体が形成される。この際、ゼータ電位が−２０〜−５０ｍＶの負帯電性複合体が形成されることが好ましく、ゼータ電子が−２０〜−３０ｍＶの負帯電性複合体が形成されることがさらに好ましい。これにより、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームを効率よくカチオンで処理することができる。負帯電性複合体のゼータ電位は、正帯電性粒子及び負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位、粒径等を調節することにより調節することができる。  When the negatively charged SUV liposome is brought into contact with the positively charged particles, the positively charged particles and the negatively charged SUV liposome are bonded through electrostatic interaction, and the surface of the positively charged particles has a plurality of negatively charged surfaces. Covered by chargeable SUV-type liposomes. As a result, a negatively chargeable complex including positively chargeable particles and a plurality of negatively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the positively chargeable particles is formed. At this time, a negatively chargeable complex having a zeta potential of −20 to −50 mV is preferably formed, and a negatively chargeable complex having a zeta electron of −20 to −30 mV is more preferably formed. As a result, negatively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to positively chargeable particles can be efficiently treated with cations. The zeta potential of the negatively chargeable complex can be adjusted by adjusting the zeta potential, particle size, etc., of the positively chargeable particles and the negatively chargeable SUV liposomes.

負帯電性粒子に正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させると、負帯電性粒子と正帯電性ＳＵＶ型リポソームとは静電的相互作用を介して結合し、負帯電性粒子の表面は複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームによって覆われる。これにより、負帯電性粒子と負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体が形成される。この際、ゼータ電位が２０〜５０ｍＶの正帯電性複合体が形成されることが好ましく、ゼータ電子が２０〜３０ｍＶの正帯電性複合体が形成されることがさらに好ましい。これにより、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームを効率よくアニオンで処理することができる。正帯電性複合体のゼータ電位は、負帯電性粒子及び正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位、粒径等を調節することにより調節することができる。  When the positively charged SUV liposome is brought into contact with the negatively charged particle, the negatively charged particle and the positively charged SUV liposome are bonded through electrostatic interaction, and the surface of the negatively charged particle has a plurality of positively charged particles. Covered by chargeable SUV-type liposomes. As a result, a positively chargeable complex including negatively chargeable particles and a plurality of positively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the negatively chargeable particles is formed. At this time, a positively chargeable complex having a zeta potential of 20 to 50 mV is preferably formed, and a positively chargeable complex having a zeta electron of 20 to 30 mV is more preferably formed. As a result, positively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to negatively chargeable particles can be efficiently treated with anions. The zeta potential of the positively chargeable complex can be adjusted by adjusting the zeta potential, particle size, etc. of the negatively chargeable particles and the positively chargeable SUV liposomes.

本発明の第１の方法においては、次いで、形成された負帯電性複合体をカチオンで処理する。
本発明の第２の方法においては、次いで、形成された正帯電性複合体をアニオンで処理する。In the first method of the present invention, the formed negatively chargeable complex is then treated with a cation.
In the second method of the present invention, the formed positively chargeable complex is then treated with an anion.

カチオンは特に限定されるものではなく、例えば、Ｈ＋等の１価のカチオン；Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋等の２価のカチオン；Ａｌ３＋等の３価のカチオン等が挙げられる。Ｈ＋を生じる物質としては、例えば、塩酸、酢酸等の酸を使用することができ、Ｃａ２＋を生じる物質としては、例えば、塩化カルシウム等を使用することができ、Ｍｇ２＋を生じる物質としては、例えば、塩化マグネシウム等を使用することができ、Ａｌ３＋を生じる物質としては、例えば、塩化アルミニウム等を使用することができる。The cations are not particularly limited, and examples thereof include monovalent cations such as H + ; divalent cations such as Ca 2+ and Mg 2+ ; trivalent cations such as Al 3+ . As the substance that generates H + , for example, an acid such as hydrochloric acid or acetic acid can be used. As the substance that generates Ca 2+ , for example, calcium chloride or the like can be used, and as a substance that generates Mg 2+ For example, magnesium chloride or the like can be used, and as the substance that generates Al 3+ , for example, aluminum chloride or the like can be used.

アニオンは特に限定されるものではなく、例えば、ＯＨ−、ＳＯ４ ２−、ＰＯ４ ３−、解離型短鎖脂肪酸等が挙げられる。ＯＨ−を生じる物質としては、例えば、水酸化ナトリウム等を使用することができ、ＳＯ４ ２−を生じる物質としては、例えば、硫酸ナトリウム等を使用することができ、ＰＯ４ ３−を生じる物質としては、例えば、リン酸ナトリウム等を使用することができ、解離型短鎖脂肪酸を生じる物質としては、例えば、カプリル酸（ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ）等を使用することができる。The anion is not particularly limited, and examples thereof include OH − , SO 4 2− , PO 4 3− , dissociated short chain fatty acid and the like. As the substance that generates OH − , for example, sodium hydroxide can be used, and as the substance that generates SO 4 2− , for example, sodium sulfate or the like can be used, and a substance that generates PO 4 3−. For example, sodium phosphate or the like can be used, and as a substance that generates a dissociated short-chain fatty acid, for example, caprylic acid (CH 3 (CH 2 ) 6 COOH) or the like can be used.

負帯電性複合体をカチオンで処理する条件は特に限定されるものではないが、温度は通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは通常６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５であり、時間は通常１〜２０分間、好ましくは５〜１０分間である。カチオン処理の際に用いる溶媒は水溶液である限り特に限定されるものではなく、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を用いることができる。溶媒中に添加するカチオンの量は、カチオンの性質等に応じて適宜調節することができるが、通常、脂質量の５０倍量（カチオンモル／脂質モル）以上である。  The conditions for treating the negatively chargeable complex with a cation are not particularly limited, but the temperature is usually 10 to 40 ° C, preferably 20 to 30 ° C, and the pH is usually 6.5 to 8.0, preferably Is 7.0 to 7.5, and the time is usually 1 to 20 minutes, preferably 5 to 10 minutes. The solvent used in the cation treatment is not particularly limited as long as it is an aqueous solution, and for example, a HEPES buffer or the like can be used. The amount of the cation added to the solvent can be appropriately adjusted according to the properties of the cation, but is usually 50 times the amount of lipid (cation mole / lipid mole) or more.

正帯電性複合体をアニオンで処理する条件は特に限定されるものではないが、温度は通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは通常６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５であり、時間は通常１〜２０分間、好ましくは５〜１０分間である。アニオン処理の際に用いる溶媒は水溶液である限り特に限定されるものではなく、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を用いることができる。溶媒中に添加するアニオンの量は、アニオンの性質等に応じて適宜調節することができるが、通常、脂質量の５０倍量（アニオンモル／脂質モル）以上である。  The conditions for treating the positively charged complex with an anion are not particularly limited, but the temperature is usually 10 to 40 ° C., preferably 20 to 30 ° C., and the pH is usually 6.5 to 8.0, preferably Is 7.0 to 7.5, and the time is usually 1 to 20 minutes, preferably 5 to 10 minutes. The solvent used in the anion treatment is not particularly limited as long as it is an aqueous solution, and for example, a HEPES buffer or the like can be used. The amount of anion added to the solvent can be appropriately adjusted according to the nature of the anion and the like, but is usually 50 times the amount of lipid (anion mole / lipid mole) or more.

負帯電性複合体をカチオンで処理すると、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の負電荷が消失し、負帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接する負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、正帯電性粒子が２枚の脂質膜で被覆される。また、正帯電性複合体をアニオンで処理すると、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の正電荷が消失し、正帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接する正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、負帯電性粒子が２枚の脂質膜で被覆される。こうして正帯電性又は負帯電性粒子の外側には、正帯電性又は負帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜が新たに形成されるが、このとき、２枚の脂質膜はその間に空間が形成されるように形成される。  When the negatively charged complex is treated with a cation, the negative charge on the surface of the negatively charged SUV liposome electrostatically bound to the positively charged particles disappears, and the hydrophobicity of the surface of the negatively charged SUV liposome increases. Then, membrane fusion between adjacent negatively charged SUV-type liposomes is induced, and the positively charged particles are covered with two lipid membranes. Further, when the positively chargeable complex is treated with an anion, the positive charge on the surface of the positively chargeable SUV liposome electrostatically bound to the negatively chargeable particles disappears, and the hydrophobicity of the surface of the positively chargeable SUV type liposome is lost. Increases, membrane fusion between adjacent positively charged SUV-type liposomes is induced, and negatively charged particles are covered with two lipid membranes. In this way, two lipid membranes covering the positively or negatively charged particles are newly formed outside the positively or negatively charged particles. At this time, the two lipid membranes are in the space between them. Is formed.

正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用した場合、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームが作製され、正帯電性又は負帯電性粒子としてｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）を使用した場合、ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームが作製される。  When an aggregate of the target substance is used as positively or negatively charged particles, the aggregate of the target substance is enclosed, and a space is formed between the two lipid membranes covering the aggregate of the target substance. When the bilamellar liposomes are prepared and n-lamellar liposomes (n is an integer of 1 or more) are used as the positively or negatively charged particles, the two lipid membranes that coat the n-lamellar liposomes (N + 2) membrane liposomes with a space formed between them are produced.

本発明の第１の方法を用いて正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより得られるリポソームは、通常、負帯電性である。但し、負帯電性複合体のゼータ電位の大きさ、カチオンの種類等によっては、正帯電性である場合もあると考えられる。本発明の第２の方法を用いて負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより得られるリポソームは、通常、正帯電性である。但し、正帯電性複合体のゼータ電位の大きさ、アニオンの種類等によっては、負帯電性である場合もあると考えられる。  Liposomes obtained by coating positively charged particles with two lipid membranes using the first method of the present invention are usually negatively charged. However, depending on the magnitude of the zeta potential of the negatively chargeable composite, the type of cation, and the like, it may be positively charged. Liposomes obtained by coating negatively charged particles with two lipid membranes using the second method of the present invention are usually positively charged. However, depending on the magnitude of the zeta potential of the positively chargeable complex, the type of anion, and the like, it may be negatively charged.

本発明の第１又は第２の方法を用いて正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより正帯電性リポソームが得られた場合、得られた正帯電性リポソームを本発明の第１の方法における正帯電性粒子として使用することができる。負帯電性リポソーム又は中性リポソームが得られた場合、得られた負帯電性リポソーム又は中性リポソームの表面をカチオン性物質で修飾して正帯電性リポソームを調製し、調製された正帯電性リポソームを本発明の第１の方法における正帯電性粒子として使用することができる。このように、本発明の第１及び／又は第２の方法を繰り返し行うことにより、脂質膜の数を制御しながら多重膜リポソームを作製することができる。  When positively charged liposomes are obtained by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes using the first or second method of the present invention, the obtained positively charged liposomes are It can be used as positively chargeable particles in the first method of the present invention. When negatively charged liposomes or neutral liposomes are obtained, the surface of the obtained negatively charged liposomes or neutral liposomes is modified with a cationic substance to prepare positively charged liposomes, and the prepared positively charged liposomes Can be used as positively chargeable particles in the first method of the present invention. Thus, by repeatedly performing the first and / or second methods of the present invention, multilamellar liposomes can be produced while controlling the number of lipid membranes.

本発明の第１又は第２の方法を用いて正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより負帯電性リポソームが得られた場合、得られた負帯電性リポソームを本発明の第２の方法における負帯電性粒子として使用することができる。正帯電性リポソーム又は中性リポソームが得られる場合、正帯電性リポソーム又は中性リポソームの表面をアニオン性物質で修飾して負帯電性リポソームを調製し、調製された負帯電性リポソームを本発明の第２の方法における負帯電性粒子として使用することができる。このように、本発明の第１及び／又は第２の方法を繰り返し行うことにより、既に形成されている２枚の脂質膜の外側に新たな２枚の脂質膜を形成させることができ、脂質膜の数を制御しながら多重膜リポソームを作製することができる。なお、既に形成されている２枚の脂質膜の外側に新たな２枚の脂質膜が形成される際、既に形成されている２枚の脂質膜及び当該２枚の脂質膜の間に形成されている空間はそのまま保持される。  When negatively charged liposomes are obtained by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes using the first or second method of the present invention, the obtained negatively charged liposomes are It can be used as negatively chargeable particles in the second method of the present invention. When positively charged liposomes or neutral liposomes are obtained, negatively charged liposomes are prepared by modifying the surface of positively charged liposomes or neutral liposomes with an anionic substance, and the prepared negatively charged liposomes are used in the present invention. It can be used as negatively chargeable particles in the second method. As described above, by repeating the first and / or second methods of the present invention, two new lipid membranes can be formed outside the two already formed lipid membranes. Multilamellar liposomes can be produced while controlling the number of membranes. When two new lipid membranes are formed outside the two already formed lipid membranes, they are formed between the two already formed lipid membranes and the two lipid membranes. The space is kept as it is.

本発明の第１又は第２の方法によって正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより得られるリポソームには、目的物質が封入されていることが好ましい。目的物質が細胞内又は核内に送達すべき物質（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、糖、これらの複合体等）である場合、目的物質が封入されたリポソームを、目的物質の細胞内又は核内送達用ベクターとして使用することができる。目的物質が封入されたリポソームは、正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用することにより、また、正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質が封入されたｎ枚膜リポソームを使用することにより得ることができる。また、正帯電性又は負帯電性粒子の外側に新たに形成される２枚の脂質膜の間に目的物質を保持させることにより（例えば、目的物質を含有する液体を保持させることにより）得ることができる。  The target substance is preferably encapsulated in the liposome obtained by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes by the first or second method of the present invention. When the target substance is a substance to be delivered into the cell or nucleus (for example, nucleic acid, peptide, protein, drug, sugar, complex thereof, etc.), the liposome in which the target substance is encapsulated is inserted into the target substance's cell. Alternatively, it can be used as a nuclear delivery vector. Liposomes in which the target substance is encapsulated are obtained by using aggregates of the target substance as positively or negatively charged particles, and n-lamellar liposomes in which the target substance is encapsulated as positively or negatively charged particles. Can be obtained. Also, it can be obtained by holding the target substance between two newly formed lipid membranes outside the positively or negatively charged particles (for example, by holding a liquid containing the target substance). Can do.

目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。  The biological species from which the cell to which the target substance is to be delivered is not particularly limited and may be any animal, plant, microorganism, etc., but is preferably an animal, more preferably a mammal. preferable. Examples of mammals include humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, and the like. Moreover, the kind of cell which should deliver a target substance is not specifically limited, For example, a somatic cell, a germ cell, a stem cell, or these cultured cells etc. are mentioned.

目的物質が封入されたリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。  The liposome in which the target substance is encapsulated can be used, for example, in the state of a dispersion. As the dispersion solvent, for example, a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, and acetate buffer can be used. For example, additives such as sugars, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH regulators, hydration accelerators may be added to the dispersion.

目的物質が封入されたリポソームは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リポソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。  Liposomes in which the target substance is encapsulated can be used both in vivo and in vitro. When used in vivo, examples of the administration route include parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and nasal administration. The dosage and the number of administrations are the type and amount of the target substance enclosed in the liposome. It can adjust suitably according to etc.

〔実施例１〕
（１）ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体の形成
ＤＮＡ及びポリ−Ｌ−リシンをそれぞれ５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解した。なお、ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡ（ＣＭＶプロモータ及びその下流に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長約７ｋｂｐのプラスミドＤＮＡ）を用いた。次いで、ＤＮＡ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）及びポリ−Ｌ−リシン溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を混合し、室温下、ボルテックスを用いて攪拌し、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体含有液（ＤＮＡ濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。こうして調製されたＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体の粒径は約７０〜１００ｎｍであり、ゼータ電位は約３０〜４０ｍＶであった。なお、流体力学的直径は準弾性光散乱方法によって測定し、ゼータ電位は、電気泳動的光散乱分光測光器（ＥＬＳ−８０００）によって分析した（以下同様）。[Example 1]
(1) Formation of DNA / poly-L-lysine complex DNA and poly-L-lysine were each dissolved in 5 mM HEPES buffer (pH 7.4). As DNA, plasmid DNA (a plasmid DNA having a total length of about 7 kbp containing a CMV promoter and a luciferase gene linked downstream thereof) was used. Subsequently, the DNA solution (0.1 mg / mL) and the poly-L-lysine solution (0.1 mg / mL) are mixed, and the mixture is stirred using a vortex at room temperature to obtain a DNA / poly-L-lysine complex-containing solution. (DNA concentration 0.05 mg / mL) was prepared. The particle size of the DNA / poly-L-lysine complex thus prepared was about 70 to 100 nm, and the zeta potential was about 30 to 40 mV. The hydrodynamic diameter was measured by a quasi-elastic light scattering method, and the zeta potential was analyzed by an electrophoretic light scattering spectrophotometer (ELS-8000) (the same applies hereinafter).

（２）ＳＵＶ型リポソームの調製
卵黄ホスファチジルコリン／コレステロールコハク酸（９：２（モル比））をクロロホルム０．５ｍＬに溶解し、溶解液をガラス試験管に収容した。窒素ガスの吹き付けにより溶媒を除去した後、デシケーター内に１時間収納して乾燥させた。得られた脂質膜（０．５５μモル）を、予め２５℃まで温めておいたＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを用いて水和させ、超音波槽で超音波処理することにより脂質膜を剥離した。さらにプローブ型超音波装置により１０分間超音波処理を行うことによって、ＳＵＶ型リポソームを調製した。こうして調製されたＳＵＶ型リポソームの粒径は約５０〜１００ｎｍであり、ゼータ電位は約−３０ｍＶであった。(2) Preparation of SUV-type liposome Egg yolk phosphatidylcholine / cholesterol succinic acid (9: 2 (molar ratio)) was dissolved in 0.5 mL of chloroform, and the solution was accommodated in a glass test tube. After removing the solvent by blowing nitrogen gas, it was stored in a desiccator for 1 hour and dried. The obtained lipid membrane (0.55 μmol) was hydrated with 1 mL of HEPES buffer previously warmed to 25 ° C., and the lipid membrane was peeled off by sonication in an ultrasonic bath. Furthermore, SUV type | mold liposome was prepared by performing ultrasonication for 10 minutes with a probe type | mold ultrasonic device. The particle size of the SUV-type liposome thus prepared was about 50 to 100 nm, and the zeta potential was about −30 mV.

ＳＵＶ型リポソームの蛍光標識は、ローダミン（赤）又はＮＢＤ（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）標識化ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（青）を取り込ませることにより行った。この際、水相マーカーとしてのローダミンは脂質膜を水和する溶媒中に溶かし（１０ｍＭ）、脂質マーカーとしてのＮＢＤ標識化脂質はクロロホルム溶液に溶かした（総脂質に対して０．１モル％）。  Fluorescent labeling of SUV liposomes was performed by incorporating rhodamine (red) or NBD (4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole) labeled dioleoylphosphatidylethanolamine (blue). At this time, rhodamine as an aqueous phase marker was dissolved in a solvent that hydrates the lipid membrane (10 mM), and NBD-labeled lipid as a lipid marker was dissolved in a chloroform solution (0.1 mol% based on the total lipid). .

（３）ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体の脂質膜による被覆
ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体含有液２５０μＬにＳＵＶ型リポソーム５００μＬを添加して、両者を接触させた。これにより、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体と、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体に静電的に結合した複数のＳＵＶ型リポソームとを含む複合体が形成されると考えられる。この複合体の粒径は約５００〜３０００ｎｍであり、ゼータ電位は約−３０ｍＶであった。なお、接触は室温（約２５℃）で５分間行った。(3) Coating of DNA / poly-L-lysine complex with lipid membrane To 250 μL of the DNA / poly-L-lysine complex-containing solution, 500 μL of SUV-type liposome was added and brought into contact with each other. Thereby, it is considered that a complex including a DNA / poly-L-lysine complex and a plurality of SUV liposomes electrostatically bound to the DNA / poly-L-lysine complex is formed. The composite particle size was about 500-3000 nm and the zeta potential was about -30 mV. The contact was performed at room temperature (about 25 ° C.) for 5 minutes.

接触後、０．１Ｎ塩酸５５μＬを添加し、上記複合体をＨ＋で処理した。これにより、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体に静電的に結合したＳＵＶ型リポソームの表面の負電荷が消失し、ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接するＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起されると考えられる。Ｈ＋処理後の粒径は約８５〜１３０ｎｍであり、ゼータ電位は約−２０〜−４０ｍＶであった。Ｈ＋処理によって粒径が小さくなっていることから、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体に静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が脂質膜で被覆され、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が封入されたリポソームが形成されたことが示された。After contact, 55 μL of 0.1N hydrochloric acid was added and the complex was treated with H + . As a result, the negative charge on the surface of the SUV liposome electrostatically bound to the DNA / poly-L-lysine complex disappears, the surface hydrophobicity of the SUV liposome increases, and the adjacent SUV liposomes It is thought that membrane fusion is induced. The particle size after H + treatment was about 85-130 nm and the zeta potential was about −20 to −40 mV. Since the particle size is reduced by H + treatment, membrane fusion between SUV-type liposomes electrostatically bound to the DNA / poly-L-lysine complex is induced, and the DNA / poly-L-lysine complex is induced. Was covered with a lipid membrane, and it was shown that a liposome encapsulating the DNA / poly-L-lysine complex was formed.

Ｈ＋処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（０，３０，６０％）上に重層し、２０℃、１６０，０００ｇの条件で２時間、超遠心分離を行った。上部から１ｍＬずつ画分を回収し、蛍光強度を測定した。不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、ＤＮＡ含量の高い画分をリポソーム含有画分とした。リポソーム含有画分は、ショ糖３０〜６０％の境界から回収することができた。The suspension after H + treatment was layered on a discontinuous sucrose density gradient (0, 30, 60%), and ultracentrifugation was performed at 20 ° C. and 160,000 g for 2 hours. 1 mL fractions were collected from the top and the fluorescence intensity was measured. Among the fractions collected by discontinuous sucrose density gradient ultracentrifugation, the fraction having a high DNA content was defined as a liposome-containing fraction. The liposome-containing fraction could be recovered from the boundary of 30-60% sucrose.

〔実施例２〕
実施例１と同様にして、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が封入されたリポソーム（以下「第１のリポソーム」という）を調製した。なお、この際、ＳＵＶ型リポソームとしてＮＢＤ標識化脂質（青）で蛍光標識したものを使用した。[Example 2]
In the same manner as in Example 1, a DNA / poly-L-lysine complex was coated with a lipid membrane to prepare a liposome encapsulating the DNA / poly-L-lysine complex (hereinafter referred to as “first liposome”). did. At this time, SUV-type liposomes that were fluorescently labeled with NBD-labeled lipid (blue) were used.

第１のリポソームの外液に１ｍｇ／ｍＬステアリル化オクタアルギニン溶液１２μＬを添加し、室温で３０分間放置することにより、第１のリポソームの表面にオクタアルギニン（総脂質の５モル％）を導入した（以下「第２のリポソーム」という）。なお、第１のリポソームのゼータ電位は負（約−３０ｍＭ）であったが、第１のリポソームの表面にオクタアルギニンを導入して得られた第２のリポソームのゼータ電位は正（約３０〜５０ｍＶ）であった。  Octarginine (5 mol% of total lipid) was introduced to the surface of the first liposome by adding 12 μL of a 1 mg / mL stearylated octaarginine solution to the external solution of the first liposome and leaving it at room temperature for 30 minutes. (Hereinafter referred to as “second liposome”). In addition, although the zeta potential of the first liposome was negative (about −30 mM), the zeta potential of the second liposome obtained by introducing octaarginine on the surface of the first liposome was positive (about 30˜ 50 mV).

実施例１と同様にして、第２のリポソーム含有液（０．３７ｍＭ，７５０μＬ）にＳＵＶ型リポソーム（粒径：約５０〜１００ｎｍ，ゼータ電位：約−３０ｍＶ，脂質濃度：０．５５ｍＭ，添加量：１．５ｍＬ）を添加し、両者を接触させた。これにより、第２のリポソームと、第２のリポソームに静電的に結合した複数のＳＵＶ型リポソームとを含む複合体が形成されると考えられる。なお、この際、ＳＵＶ型リポソームとしてローダミンで内水相を蛍光標識したものを使用した。形成された複合体の粒径は約３４０〜１５００ｎｍであり、ゼータ電位は約−３０ｍＶであった。  In the same manner as in Example 1, SUV-type liposomes (particle size: about 50 to 100 nm, zeta potential: about −30 mV, lipid concentration: 0.55 mM, added amount to the second liposome-containing liquid (0.37 mM, 750 μL) : 1.5 mL) was added and both were brought into contact. Thereby, it is considered that a complex including the second liposome and a plurality of SUV liposomes electrostatically bonded to the second liposome is formed. At this time, SUV-type liposomes in which the inner aqueous phase was fluorescently labeled with rhodamine were used. The formed composite had a particle size of about 340-1500 nm and a zeta potential of about −30 mV.

接触後、０．１Ｎ塩酸１６５μＬを添加し、上記複合体をＨ＋で処理した。これにより、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソームの表面の負電荷が消失し、ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接するＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起されると考えられる。Ｈ＋処理後の粒径は約１７０〜２４０ｎｍであり、ゼータ電位は約−６０ｍＶであった。Ｈ＋処理によって粒径が小さくなっていることから、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、第２のリポソームが脂質膜で被覆されたことが示された。After contact, 165 μL of 0.1N hydrochloric acid was added and the complex was treated with H + . As a result, the negative charge on the surface of the SUV liposome electrostatically bound to the second liposome disappears, the hydrophobicity of the surface of the SUV liposome increases, and membrane fusion between adjacent SUV liposomes is induced. It is thought. The particle size after H + treatment was about 170-240 nm and the zeta potential was about −60 mV. Since the particle size was reduced by H + treatment, membrane fusion between SUV-type liposomes electrostatically bound to the second liposome was induced, indicating that the second liposome was covered with a lipid membrane. It was done.

Ｈ＋処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（０，５，３０％）上に重層し、２０℃、１６０，０００ｇの条件で２時間、超遠心分離を行った。上部から１ｍＬずつ画分を回収した。各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定するとともに（図１（ａ）参照）、ローダミン及びＮＢＤの蛍光強度を測定してローダミン含量及びＮＢＤ含量を算出した（図１（ｂ）参照）。The suspension after H + treatment was layered on a discontinuous sucrose density gradient (0, 5, 30%), and ultracentrifugation was performed for 2 hours at 20 ° C. and 160,000 g. 1 mL fractions were collected from the top. The DNA content of each fraction was measured by DNA agarose gel electrophoresis (see FIG. 1 (a)) and the rhodamine and NBD fluorescence intensities were measured to calculate the rhodamine content and NBD content (see FIG. 1 (b)). .

不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、ＤＮＡ含量の高い画分（フラクション１１）をリポソーム含有画分とした。リポソーム含有画分は、ショ糖５〜３０％の境界から回収することができた。  Among the fractions collected by discontinuous sucrose density gradient ultracentrifugation, the fraction having a high DNA content (fraction 11) was used as the liposome-containing fraction. The liposome-containing fraction could be recovered from the boundary of 5-30% sucrose.

また、リポソーム含有画分において、ＮＢＤ、ローダミン及びＤＮＡが共存していたことから、ＳＵＶ型リポソームは、ローダミンを含有する内水相を保持したまま融合し、融合後のリポソームにおいて、ローダミンを含有する内水相が保持された空間が形成されていることが示された。  In addition, since NBD, rhodamine and DNA coexisted in the liposome-containing fraction, the SUV-type liposome was fused while retaining the inner aqueous phase containing rhodamine, and the fused liposome contains rhodamine. It was shown that a space in which the inner aqueous phase was retained was formed.

さらに、リポソーム含有画分において、ＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動は観察されなかった。第２のリポソームの脂質膜にはＮＢＤ標識化脂質（青）が含有されているので、第２のリポソームの脂質膜と、ローダミンを含有する内水相とは接触していないことが示された。すなわち、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合により、第２のリポソームは２枚の脂質膜で被覆され、ローダミンを含有する内水相は、第２のリポソームの外側に新たに形成された２枚の脂質膜の間の空間に保持されていることが示された。仮に、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合により、第２のリポソームが１枚の脂質膜で被覆されたとすれば、ローダミンを含有する内水相は、第２のリポソームの脂質膜と、第２のリポソームの外側に形成された脂質膜との間に保持されていると考えられるが、そうすると、ＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動が観察されるはずである。また、仮に、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合により、第２のリポソームの脂質膜とＳＵＶ型リポソームの脂質膜とが融合したとすれば（脂質膜の数に変化なし）、ローダミンを含有する内水相は、第２のリポソームの内部に保持されていると考えられるが、そうすると、ＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動が観察されるはずである。  Furthermore, no fluorescence energy transfer was observed between NBD and rhodamine in the liposome-containing fraction. Since the lipid membrane of the second liposome contains NBD-labeled lipid (blue), it was shown that the lipid membrane of the second liposome was not in contact with the inner aqueous phase containing rhodamine. . That is, due to membrane fusion of SUV-type liposomes electrostatically bound to the second liposome, the second liposome is coated with two lipid membranes, and the inner aqueous phase containing rhodamine is the second liposome. It was shown to be retained in the space between the two newly formed lipid membranes on the outside. If the second liposome is coated with a single lipid membrane by membrane fusion between SUV-type liposomes electrostatically bound to the second liposome, the inner aqueous phase containing rhodamine is , And the lipid membrane formed on the outer side of the second liposome, but fluorescence energy transfer should be observed between NBD and rhodamine. is there. Further, if the lipid membrane of the second liposome and the lipid membrane of the SUV liposome are fused by membrane fusion of SUV liposomes electrostatically bound to the second liposome (number of lipid membranes). The inner aqueous phase containing rhodamine is thought to be retained inside the second liposome, and then fluorescence energy transfer should be observed between NBD and rhodamine.

〔実施例３〕
ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が封入されたリポソーム（第１のリポソーム）を調製する際、ＳＵＶ型リポソームとしてローダミンで内水相を蛍光標識したものを使用した点、及び、第２のリポソームと、第２のリポソームに静電的に結合した複数のＳＵＶ型リポソームとを含む複合体を形成する際に、ＳＵＶ型リポソームとしてＮＢＤ標識化脂質で蛍光標識したものを使用した点を除き、実施例２と同様の試験を行った。Example 3
When preparing a liposome (first liposome) in which a DNA / poly-L-lysine complex is coated with a lipid membrane and the DNA / poly-L-lysine complex is encapsulated, an inner aqueous phase is formed with rhodamine as an SUV-type liposome. NBD is used as an SUV-type liposome when forming a complex comprising a fluorescently labeled one and a second liposome and a plurality of SUV-type liposomes electrostatically bound to the second liposome. The same test as in Example 2 was performed, except that a fluorescently labeled one with a labeled lipid was used.

なお、実施例２の結果から、第１のリポソーム及び第２のリポソームにおいては、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が２枚の脂質膜で被覆されており、この２枚の脂質膜の間にローダミンを含有する内水相が保持されていると考えられる。
Ｈ＋処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（０，５，３０％）上に重層し、２０℃、１６０，０００ｇの条件で２時間、超遠心分離を行った。上部から１ｍＬずつ画分を回収した。各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定するとともに（図２（ａ）参照）、ローダミン及びＮＢＤの蛍光強度を測定してローダミン含量及びＮＢＤ含量を算出した（図２（ｂ）参照）。In addition, from the result of Example 2, in the first liposome and the second liposome, the DNA / poly-L-lysine complex is covered with two lipid membranes, and between the two lipid membranes. It is considered that the inner aqueous phase containing rhodamine is retained in the water.
The suspension after H + treatment was layered on a discontinuous sucrose density gradient (0, 5, 30%), and ultracentrifugation was performed for 2 hours at 20 ° C. and 160,000 g. 1 mL fractions were collected from the top. The DNA content of each fraction was measured by DNA agarose gel electrophoresis (see FIG. 2 (a)), and the rhodamine and NBD fluorescence intensities were measured to calculate the rhodamine content and NBD content (see FIG. 2 (b)). .

不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、ＤＮＡ含量の高い画分（フラクション１１）をリポソーム含有画分とした。リポソーム含有画分は、ショ糖５〜３０％の境界から回収することができた。  Among the fractions collected by discontinuous sucrose density gradient ultracentrifugation, the fraction having a high DNA content (fraction 11) was used as the liposome-containing fraction. The liposome-containing fraction could be recovered from the boundary of 5-30% sucrose.

また、リポソーム含有画分において、ＮＢＤ、ローダミン及びＤＮＡが共存していたこと、及びＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動は観察されなかったことから、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソームが膜融合する際、第２のリポソームにおいて２枚の脂質膜の間に形成された空間（ローダミンを含有する内水相が保持された空間）が保持されることが示された。  In addition, in the liposome-containing fraction, NBD, rhodamine and DNA were coexistent, and no fluorescence energy transfer was observed between NBD and rhodamine. It was shown that when the SUV-type liposome was membrane-fused, the space formed between the two lipid membranes in the second liposome (the space in which the inner aqueous phase containing rhodamine was retained) was retained.

〔実施例４〕
実施例１（１）に従って、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を形成した。なお、ＤＮＡとしては、実施例（１）と同様に、プラスミドＤＮＡ（ＣＭＶプロモータ及びその下流に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長７０３７ｂｐのプラスミドＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだもの））を用いた。Example 4
A DNA / poly-L-lysine complex was formed according to Example 1 (1). As in Example (1), the DNA is a plasmid DNA (7037 bp full length plasmid DNA containing a CMV promoter and a luciferase gene linked downstream thereof (the luciferase gene is added to the pcDNA3.1 plasmid having the CMV promoter). Incorporated one)) was used.

実施例１（２）に従って、卵黄ホスファチジルコリン／コレステロールコハク酸（９：２（モル比））からなる脂質膜を有するＳＵＶ型リポソーム（以下「第１のＳＵＶ型リポソーム」という。）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン／コレステロールコハク酸（９：２（モル比））からなる脂質膜を有するＳＵＶ型リポソーム（以下「第２のＳＵＶ型リポソーム」という。）を調製した。  According to Example 1 (2), SUV-type liposome (hereinafter referred to as “first SUV-type liposome”) having a lipid membrane composed of egg yolk phosphatidylcholine / cholesterol succinic acid (9: 2 (molar ratio)), dioleoylphosphatidyl SUV liposomes having a lipid membrane composed of ethanolamine / cholesterol succinic acid (9: 2 (molar ratio)) (hereinafter referred to as “second SUV liposome”) were prepared.

実施例１（３）に従って、第１のＳＵＶ型リポソームを用いてＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、リポソームＡ（２枚膜）を調製した。また、第２のＳＵＶ型リポソームを用いてＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、リポソームＢ（２枚膜）を調製した。また、第２のＳＵＶ型リポソームを用いてリポソームＡを脂質膜で被覆し、リポソームＣ（４枚膜）を調製した。また、第１のＳＵＶ型リポソームを用いてリポソームＢを脂質膜で被覆し、リポソームＤ（４枚膜）を調製した。  According to Example 1 (3), the first SUV-type liposome was used to coat the DNA / poly-L-lysine complex with a lipid membrane to prepare liposome A (bilayer membrane). Moreover, the DNA / poly-L-lysine complex was covered with a lipid membrane using the second SUV-type liposome to prepare liposome B (two-layer membrane). Moreover, the liposome S was coat | covered with the lipid membrane using the 2nd SUV type | mold liposome, and the liposome C (four film | membrane) was prepared. Moreover, the liposome S was coat | covered with the lipid membrane using the 1st SUV type | mold liposome, and the liposome D (four film | membrane) was prepared.

リポソームＡ〜Ｄの外液に１ｍｇ／ｍＬステアリル化オクタアルギニン溶液１２μＬを添加し、室温で３０分間放置することにより、各リポソームの表面にオクタアルギニン（総脂質の５モル％）を導入した。なお、各リポソームの表面にオクタアルギニンを導入することにより、全てのリポソームの細胞内移行経路は統一される（マクロピノサイトーシス）。  To the external solution of liposomes A to D, 12 μL of a 1 mg / mL stearylated octaarginine solution was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to introduce octaarginine (5 mol% of total lipid) on the surface of each liposome. In addition, by introducing octaarginine to the surface of each liposome, the intracellular translocation pathway of all liposomes is unified (macropinocytosis).

各リポソーム（ＤＮＡ０．４μｇ相当）を懸濁した０．２５ｍＬの血清不含ＤＭＥＭ培地を、２４ウェルプレートで培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞（４×１０４細胞／ウェル）に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、１０％ウシ胎児血清を含む培地１ｍＬを添加し、さらに４５時間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒＰＳＮ、ＡＴＴＯ）を用いて測定した。細胞溶解液中のタンパク質量はＢＣＡタンパク質定量キット（ＰＩＥＲＣＥ、ロックフォード（ＩＬ））を使用して測定した。0.25 mL of serum-free DMEM medium in which each liposome (corresponding to 0.4 μg of DNA) is suspended is added to NIH3T3 cells (4 × 10 4 cells / well) cultured in a 24-well plate and incubated at 37 ° C. for 3 hours. did. After 3 hours, 1 mL of medium containing 10% fetal calf serum was added and incubated for an additional 45 hours. Thereafter, the cells were lysed, a luciferase activity measuring reagent (luciferase assay system, manufactured by Promega) was added to the cell lysate, and the luciferase activity was measured using a luminometer (Luminescence PSN, ATTO). The amount of protein in the cell lysate was measured using a BCA protein quantification kit (PIERCE, Rockford (IL)).

その結果を図３に示す。図３に示すように、リポソームを構成する脂質膜の組成、数等を変化させることにより、リポソームの機能（遺伝子導入能力）が変化することが示された。  The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, it was shown that the function (gene transfer ability) of the liposome changes by changing the composition, number, etc. of the lipid membrane constituting the liposome.

Claims (12)

正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、
前記正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記正帯電性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理することを特徴とする前記方法。A method of coating positively charged particles with two lipid membranes,
A negatively chargeable composite comprising a plurality of negatively chargeable SUV liposomes in contact with the positively chargeable particles, and the positively chargeable particles and the negatively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the positively chargeable particles. Forming the body and treating the negatively chargeable complex with a cation. 前記正帯電性粒子が目的物質の凝集体であることを特徴とする請求項１記載の方法。  2. The method according to claim 1, wherein the positively charged particles are aggregates of a target substance. 前記正帯電性粒子が正帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることを特徴とする請求項１記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the positively chargeable particles are positively chargeable n-lamellar liposomes (n is an integer of 1 or more). 前記正帯電性粒子のゼータ電位が２０〜３０ｍＶであり、前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであることを特徴とする請求項１記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the positively charged particles have a zeta potential of 20 to 30 mV, and the negatively charged SUV liposome has a zeta potential of -20 to -30 mV. 前記正帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。  The method according to claim 1, wherein the particle size of the positively chargeable particles is 50 nm or more. 負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、
前記負帯電性粒子に複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記負帯電性粒子と前記負帯電性粒子に静電的に結合した前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を形成させ、前記正帯電性複合体をアニオンで処理することを特徴とする前記方法。A method of coating negatively charged particles with two lipid membranes,
A positively chargeable composite comprising a plurality of positively chargeable SUV liposomes in contact with the negatively chargeable particles, and the negatively chargeable particles and the positively chargeable SUV liposomes electrostatically bonded to the negatively chargeable particles. And forming the body and treating the positively chargeable complex with an anion. 前記負帯電性粒子が目的物質の凝集体であることを特徴とする請求項６記載の方法。  The method according to claim 6, wherein the negatively chargeable particles are aggregates of a target substance. 前記負帯電性粒子が負帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることを特徴とする請求項６記載の方法。  The method according to claim 6, wherein the negatively chargeable particles are negatively chargeable n-lamellar liposomes (n is an integer of 1 or more). 前記負帯電性粒子のゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであり、前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が２０〜３０ｍＶであることを特徴とする請求項６記載の方法。  The method according to claim 6, wherein the negatively charged particles have a zeta potential of -20 to -30 mV, and the positively charged SUV liposome has a zeta potential of 20 to 30 mV. 前記負帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項６記載の方法。  The method according to claim 6, wherein the particle size of the negatively chargeable particles is 50 nm or more. 正帯電性粒子を請求項１〜５のいずれかに記載の方法により２枚の脂質膜で被覆して得られるリポソーム。  Liposomes obtained by coating positively charged particles with two lipid membranes by the method according to any one of claims 1 to 5. 負帯電性粒子を請求項６〜１０のいずれかに記載の方法により２枚の脂質膜で被覆して得られるリポソーム。  Liposomes obtained by coating negatively charged particles with two lipid membranes by the method according to any one of claims 6 to 10.
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