JP2014114267A - Peptide for imparting transition ability to lipid membrane structure into hepatic endothelial cell and/or enhancing the same, lipid membrane structure having transition ability into hepatic endothelial cell or having had enhanced transition ability into hepatic endothelial cell, and agent for imparting transition ability to lipid membrane structure into hepatic endothelial cell and/or enhancing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤に関し、より詳細には、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）またはＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）である、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、当該ペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに当該ペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤に関する。 The present invention provides a peptide that imparts and / or enhances the ability to transfer to a liver vascular endothelial cell with respect to a lipid membrane structure, the ability to transfer to a liver vascular endothelial cell, or the ability to transfer to a liver vascular endothelial cell is enhanced In particular, the lipid membrane structure and an agent that imparts and / or enhances the ability of the lipid membrane structure to migrate to hepatic vascular endothelial cells are described in detail. The amino acid sequence is KLGRKRTLR (SEQ ID NO: 1) or RLTRKRGLK (sequence No. 2), a peptide that imparts and / or enhances the ability to transfer to a liver vascular endothelial cell to a lipid membrane structure, and the ability to transfer to a liver vascular endothelial cell comprising a lipid bound to the peptide as a constituent lipid A lipid membrane structure having enhanced ability to migrate to hepatic vascular endothelial cells, and a lipid membrane structure comprising the peptide as an active ingredient Migration ability to 臓血 endothelial cells for imparting and / or enhancing dosage.
従来、アミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチド（以下、「ＲＬＴＲペプチド」という。）は、ＡｐｏＢ−１００タンパク質の３３５９〜３３６７番目に相当する配列からなることが知られており、非特許文献１には、ＡｐｏＢ−１００タンパク質の３３５９〜３３６７番目のドメインが３１４７〜３１５７番目のドメインとヘテロダイマーを形成してＬＤＬレセプターに結合する領域であることが開示されている（非特許文献１）。
Conventionally, a peptide whose amino acid sequence is RLTRKRGLK (SEQ ID NO: 2) (hereinafter referred to as “RLTR peptide”) is known to be composed of a sequence corresponding to positions 3359 to 3367 of the ApoB-100 protein.
一方、特定の細胞へ薬剤を送達する為に、薬剤の担体として様々な脂質膜構造体が開発されている。例えば、特許文献１には、血管内皮細胞へ核酸を送達する為の脂質膜構造体として、カチオン性脂質、中性ヘルパー脂質および核酸からなるリポプレックスが開示されている（特許文献１）。
On the other hand, in order to deliver drugs to specific cells, various lipid membrane structures have been developed as drug carriers. For example,
しかしながら、非特許文献１にはＲＬＴＲペプチドについて記載されているのにとどまり、ＲＬＴＲペプチドの逆配列である、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）であるペプチド（以下、「ＫＬＧＲペプチドという。）については記載や示唆がない。また、非特許文献１および特許文献１には、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドが脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するということ、あるいはＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体が選択的かつ効率的に肝臓血管内皮細胞へ移行することについての記載はおろか、示唆もされていない。さらに、特許文献１に記載のリポプレックスは、肝臓の他に肺や膵臓、腎臓、小腸、胃など、身体全体の様々な器官の血管内皮細胞へ移行するものであり（特許文献１［０１６９］など）、肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行するものではない。
However, Non-Patent
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）またはＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）である、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびにＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such a problem, and the liver vascular endothelium with respect to a lipid membrane structure whose amino acid sequence is KLGRKRTLR (SEQ ID NO: 1) or RLTRKRGLK (SEQ ID NO: 2). A peptide that imparts and / or enhances the ability to migrate to cells, a lipid that binds to KLGR peptide or a lipid that binds to RLTR peptide as a constituent lipid, has the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, or to liver vascular endothelial cells To provide a lipid membrane structure with enhanced migration ability, and an agent that imparts and / or enhances the ability to migrate to a liver vascular endothelial cell with respect to the lipid membrane structure, comprising KLGR peptide or RLTR peptide as an active ingredient With the goal.
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドが、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与することや増強すること、および、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体が、選択的かつ効率的に肝臓血管内皮細胞へ移行することを見出し、下記の各発明を完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that KLGR peptides and RLTR peptides impart and enhance the ability to migrate to lipid vascular endothelial cells to lipid membrane structures, and lipids bound to KLGR peptides. And lipid membrane structures containing lipids bound to RLTR peptides as constituent lipids were found to selectively and efficiently migrate to liver vascular endothelial cells, and the following inventions were completed.
（１）アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）である、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド。 (1) A peptide that imparts and / or enhances the ability of a lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells, the amino acid sequence of which is KLGRKRTLR (SEQ ID NO: 1) and / or the amino acid sequence of RLTRKRGLK (SEQ ID NO: 2) .
（２）アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）であるペプチドと結合した脂質および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体。 (2) A lipid bound to a peptide having an amino acid sequence of KLGRKRTLR (SEQ ID NO: 1) and / or a lipid bound to a peptide having an amino acid sequence of RLTRKRGLK (SEQ ID NO: 2) as a constituent lipid to liver vascular endothelial cells A lipid membrane structure having a migration ability or enhanced migration ability to liver vascular endothelial cells.
（３）ペプチドと結合した脂質が、ペプチドのＮ末端にグリシン残基、グリシン残基、システイン残基、親水性ポリマーおよび脂質がこの順で結合してなるペプチドと結合した脂質である、（２）に記載の脂質膜構造体。 (3) A lipid bound to a peptide is a lipid bound to a peptide formed by binding a glycine residue, a glycine residue, a cysteine residue, a hydrophilic polymer and a lipid in this order to the N-terminus of the peptide (2 ) Lipid membrane structure according to the above.
（４）親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、（３）に記載の脂質膜構造体。 (4) The lipid membrane structure according to (3), wherein the hydrophilic polymer is polyethylene glycol.
（５）他の構成脂質総量に対して、ペプチドと結合した脂質の割合Ｐが１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％である、（２）から（４）のいずれかに記載の脂質膜構造体。 (5) The lipid membrane structure according to any one of (2) to (4), wherein the ratio P of the lipid bound to the peptide is 1 mol% ≦ P ≦ 10 mol% relative to the total amount of other constituent lipids.
（６）アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）および／またはＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤。 (6) Giving a lipid membrane structure the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, comprising as an active ingredient a peptide whose amino acid sequence is KLGRKRTLR (SEQ ID NO: 1) and / or RLTRKRGLK (SEQ ID NO: 2) Agents to enhance.
本発明に係るペプチド、脂質膜構造体ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤によれば、脂質膜構造体を肝臓血管内皮細胞へ選択的かつ効率的に移行させることができ、さらにその細胞内で脂質膜構造体が内包していた薬剤の機能を発揮させることができる。これにより、薬剤の効果を適切に得ることができ、薬剤が肝臓血管内皮細胞以外で作用することに起因する副作用の低減や、薬剤の投与量の削減に貢献することができる。また、本発明に係るペプチド、脂質膜構造体ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤によれば、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドと脂質との結合にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介さずとも、脂質膜構造体を効率的に肝臓血管内皮細胞に移行させることができることから、脂質膜構造体におけるＰＥＧ修飾の低減ないし省略をすることができる。これにより、ＰＥＧ修飾によって脂質膜構造体の血中滞留性を向上させることができ、同時にＰＥＧ修飾によって脂質膜構造体の細胞内取り込みが抑制されてしまうという、いわゆるＰＥＧのジレンマの解決に寄与することができる。 According to the peptide, lipid membrane structure, and agent for imparting and / or enhancing the ability to migrate to liver vascular endothelial cells to the lipid membrane structure according to the present invention, the lipid membrane structure is selectively used for liver vascular endothelial cells. In addition, the function of the drug encapsulated in the lipid membrane structure can be exhibited in the cell. Thereby, the effect of a medicine can be acquired appropriately and it can contribute to reduction of the side effect resulting from a medicine acting other than a liver vascular endothelial cell, and reduction of the dosage of a medicine. In addition, according to the peptide, lipid membrane structure, and lipid membrane structure according to the present invention, the agent that imparts and / or enhances the ability to migrate to hepatic vascular endothelial cells binds KLGR peptide or RLTR peptide to lipid. Since the lipid membrane structure can be efficiently transferred to the liver vascular endothelial cells without using polyethylene glycol (PEG), the PEG modification in the lipid membrane structure can be reduced or omitted. As a result, the blood retention of the lipid membrane structure can be improved by PEG modification, and at the same time, it contributes to the solution of the so-called PEG dilemma that the PEG modification suppresses intracellular uptake of the lipid membrane structure. be able to.
以下、本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤について詳細に説明する。 Hereinafter, a peptide that imparts and / or enhances the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, or the ability to migrate to liver vascular endothelial cells to the lipid membrane structure according to the present invention. The enhanced lipid membrane structure and the agent that imparts and / or enhances the ability of the lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells will be described in detail.
本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドは、リポソームに代表される脂質膜構造体に肝臓血管内皮細胞へ移行することができる機能（肝臓血管内皮細胞への移行能）を付与し、あるいはリポソームに代表される脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能を増強する。すなわち、本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドは、肝臓血管内皮細胞への移行能を有さない脂質膜構造体に対しては肝臓血管内皮細胞への移行能を付与し、あるいは肝臓血管内皮細胞への移行能を付与するとともにその移行能を増強し、肝臓血管内皮細胞への移行能を有する脂質膜構造体に対してはその移行能を増強する。 The peptide that imparts and / or enhances the ability to transfer to the liver vascular endothelial cells with respect to the lipid membrane structure according to the present invention is capable of transferring to the liver vascular endothelial cells into the lipid membrane structure typified by liposome. (Ability to migrate to liver vascular endothelial cells) is imparted, or the ability of lipid membrane structures represented by liposomes to migrate to liver vascular endothelial cells is enhanced. That is, the peptide that imparts and / or enhances the ability to migrate to liver vascular endothelial cells with respect to the lipid membrane structure according to the present invention can be used for lipid membrane structures that do not have the ability to migrate to liver vascular endothelial cells. Imparts the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, or enhances the ability to migrate to liver vascular endothelial cells and enhances the ability to migrate to liver vascular endothelial cells. Enhances its ability to migrate.
ここで、本発明において、「脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞へ移行する」とは、脂質膜構造体が、肝臓血管内皮細胞の周辺、細胞表面、細胞上あるいは細胞内に位置するようになることをいう。本発明において、脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞への移行能を有するか否か、あるいは、脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能が増強されたか否かは、常法に従い確認することができる。そのような方法としては、例えば、ローダミンなどの蛍光物質で標識した脂質膜構造体を生体に投与するとともに、肝臓血管内皮細胞をＩｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４などの蛍光物質で染色した後、肝臓を蛍光観察する方法を挙げることができる。この場合、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光が検出されれば、脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞への移行能を有すると判断することができる。また、黄色の蛍光強度が増加するあるいは黄色の蛍光を示す箇所数が増加すれば、脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能が増強されたと判断することができる。 Here, in the present invention, “the lipid membrane structure is transferred to the liver vascular endothelial cell” means that the lipid membrane structure is located around the liver vascular endothelial cell, on the cell surface, on the cell or in the cell. Say that. In the present invention, whether or not the lipid membrane structure has the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, or whether or not the ability of the lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells has been enhanced, is confirmed according to a conventional method. can do. As such a method, for example, a lipid membrane structure labeled with a fluorescent substance such as rhodamine is administered to a living body, and liver hepatic endothelial cells are stained with a fluorescent substance such as Iselectin B4, and then the liver is fluorescently observed. Can be mentioned. In this case, if yellow fluorescence indicating an overlap between the fluorescence of rhodamine (red) and the fluorescence of Iselectin B4 (green) is detected, it is determined that the lipid membrane structure has the ability to migrate to liver vascular endothelial cells. Can do. Moreover, if the yellow fluorescence intensity increases or the number of places showing yellow fluorescence increases, it can be determined that the ability of the lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells is enhanced.
その他の確認方法として、例えば、肝臓血管内皮細胞の培養細胞に蛍光物質で標識した脂質膜構造体を添加し、一定時間インキュベートした後、細胞を洗浄してから溶解し、蛍光強度を測定してもよい。この場合、脂質膜構造体に由来する蛍光が検出されれば、当該培養細胞に脂質膜構造体が取り込まれたと考えられるため、脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞への移行能を有すると判断することができる。また、脂質膜構造体に由来する蛍光の強度が増加すれば、脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能が増強されたと判断することができる。 Other confirmation methods include, for example, adding a lipid membrane structure labeled with a fluorescent substance to cultured cells of hepatic vascular endothelial cells, incubating for a certain period of time, washing and lysing the cells, and measuring the fluorescence intensity. Also good. In this case, if fluorescence derived from the lipid membrane structure is detected, it is considered that the lipid membrane structure has been taken up by the cultured cells, and therefore it is determined that the lipid membrane structure has the ability to migrate to liver vascular endothelial cells. can do. Further, if the intensity of fluorescence derived from the lipid membrane structure increases, it can be determined that the ability of the lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells is enhanced.
本発明に係るペプチド、すなわち脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドは、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）のペプチド（ＫＬＧＲペプチド）および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）のペプチド（ＲＬＴＲペプチド）である。なお、アミノ酸Ｋ，Ｌ，Ｇ，Ｒ，Ｔはそれぞれ、リシン残基、ロイシン残基、グリシン残基、アルギニン残基、トレオニン残基を示す。 The peptide according to the present invention, that is, a peptide that imparts and / or enhances the ability of the lipid membrane structure to migrate to hepatic vascular endothelial cells is a peptide having the amino acid sequence KLGRKRTL (SEQ ID NO: 1) (KLGR peptide) and / or It is a peptide (RLTR peptide) having an amino acid sequence of RLTRKRGLK (SEQ ID NO: 2). The amino acids K, L, G, R, and T represent lysine residue, leucine residue, glycine residue, arginine residue, and threonine residue, respectively.
本発明に係るペプチドは、その配列を基にして、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成するペプチド合成法の他、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、作製したベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地にて培養し、得られた培養物から採取する方法や、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させて得る方法などを挙げることができる。なお、いずれの合成法も、当業者により広く知られている一般的な方法の他、あらゆる方法を利用することができる。 The peptide according to the present invention can be synthesized based on the sequence using a method that can be appropriately selected by those skilled in the art. As such a method, for example, in addition to a peptide synthesis method in which each amino acid is chemically polymerized to synthesize a polypeptide, a recombinant vector containing a DNA encoding the peptide according to the present invention is prepared, A transformant obtained by introducing the prepared vector into an appropriate host cell is cultured in a medium and collected from the obtained culture, or a DNA encoding the peptide according to the present invention is synthesized with a cell-free protein. Examples thereof include a method obtained by expressing in a system. In addition, any synthesis method other than a general method widely known by those skilled in the art can be used for any synthesis method.
本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。 In the present invention, a conservative amino acid substitution is a range that can generally be made without changing the physiological activity of the resulting molecule, that is, a conservative substitution range (Watson et al., Molecular Biology of Gene, etc.). For example, acidic amino acids of aspartic acid and glutamic acid; basic amino acids of lysine, arginine and histidine; non-polar amino acids of alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan; glycine, asparagine, cysteine, Glutamine, serine, threonine and tyrosine polar uncharged side chain amino acids; phenylalanine, tryptophan and tyrosine aromatic amino acids Mention may be made of the substitutions that take place (Family inside of the amino acid). Similarly, acidic amino acids of aspartic acid and glutamic acid; basic amino acids of lysine, arginine and histidine, aliphatic amino acids of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine and threonine (classified as aliphatic-hydroxyamino acids of serine and threonine Can be classified); aromatic amino acids of phenylalanine, tyrosine and tryptophan; amides of asparagine and glutamine); sulfur-containing amino acids of cysteine and methionine.
次に、本発明は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体を提供する。本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体は、上述した本発明に係るペプチドと結合した脂質、すなわちＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含んでいる。なお、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体において、上述した本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドと同等または相当する構成については再度の説明を省略する。 Next, the present invention provides a lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells. The lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or having enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells according to the present invention binds to the lipid bound to the peptide according to the present invention, that is, the KLGR peptide. And lipids bound to RLTR peptides are included as constituent lipids. In addition, in the lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells, the lipid membrane structure according to the present invention described above can be applied to liver vascular endothelial cells. A description of the same or equivalent structure to the peptide that imparts and / or enhances the migration ability is omitted.
本発明において、脂質膜構造体の好ましい形態は、脂質二重層膜構造を有する閉鎖小胞であり、そのような脂質膜構造体としては、例えば、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）の他、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）などの一枚膜リポソームを挙げることができる。 In the present invention, a preferred form of the lipid membrane structure is a closed vesicle having a lipid bilayer membrane structure. Examples of such a lipid membrane structure include SUV (small) in addition to multilamellar liposomes (MLV). Unilamellar liposomes such as unilamella vesicles, LUVs (large unilamella vesicles), and GUVs (giant unilamella vesicles) can be mentioned.
本発明における、脂質膜構造体を構成する脂質（「構成脂質」）の種類は特に限定されず、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、これらのうちのいずれであってもよい。また、カチオン性脂質、ｐＨ依存性カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質のいずれであってもよい。 In the present invention, the type of lipid constituting the lipid membrane structure (“constituent lipid”) is not particularly limited, and examples thereof include phospholipids, glycolipids, sterols, long-chain aliphatic alcohols or glycerin fatty acid esters. It can be any of these. Moreover, any of a cationic lipid, a pH-dependent cationic lipid, a neutral lipid, and an anionic lipid may be sufficient.
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）など）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、またはこれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなど）などを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を用いることができる。 Examples of the phospholipid include phosphatidylcholine (for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine (EPC)), phosphatidylglycerol (for example, dioleoylphosphatidylglycerol). , Dilauroyl phosphatidyl glycerol, dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol, etc. Fatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), dioleoylglycerophosphoethanolamine (DOPE), etc.), phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, or hydrogenation thereof Natural lipids (for example, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.) derived from food, egg yolk, soybean and other animals and plants, etc., and one or more of these can be used.
糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどのグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。 Examples of glycolipids include glyceroglycolipids such as sphingomyelin, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride and glycosyl diglyceride, and sphingoglycolipids such as galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside and ganglioside. 1 type, or 2 or more types of these can be used.
ステロールとしては、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的または化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために用いることができる。 Sterols derived from animals such as cholesterol (Chol), cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol, plant-derived sterols (phytosterols) such as stigmasterol, sitosterol, campesterol and brassicasterol And sterols derived from microorganisms such as timosterol and ergosterol, and one or more of these can be used. These sterols can generally be used to physically or chemically stabilize lipid bilayers and to regulate membrane fluidity.
長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、アラキジン酸、マルガリン酸、ツベルクロステアリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エレオステアリン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができ、具体的には、１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＭＧ）、１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＳＧ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。 As the long-chain fatty acid or long-chain aliphatic alcohol, a fatty acid having 10 to 20 carbon atoms or an alcohol thereof can be used. Examples of such long-chain fatty acids or long-chain aliphatic alcohols include palmitic acid, stearic acid, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, arachidic acid, margaric acid, tuberculostearic acid and other saturated fatty acids, palmitoleic acid, Mention of unsaturated fatty acids such as oleic acid, arachidonic acid, vaccenic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, eleostearic acid, oleyl alcohol, stearyl alcohol, lauryl alcohol, myristyl alcohol, cetyl alcohol, linolyl alcohol Specifically, 1,2-dimyristol-sn-glycerol (DMG), 1,2-disteayl-sn-glycerol (DSG) and the like can be mentioned, and one or more of these can be mentioned. It can be used.
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。 Examples of the glycerin fatty acid ester include monoacyl glycerides, diacyl glycerides, and triacyl glycerides, and one or more of these can be used.
カチオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＣ−６−１４）などのジエタノールアミン塩酸塩、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。 Examples of the cationic lipid include, in addition to the above-described lipids, for example, diethanolamine hydrochloride such as dietanolamine chloride (DC-6-14), dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC), N- (2,3-oleyloxy). ) Propyl-N, N, N-trimethylammonium (N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium, DOTMA), didodecylammonium bromide (DDAB), 1,2-Geo Railoxy-3-trimethylammonium propane (1,2-dioleoyloxy-3-trim thylammoniopropane, DOTAP), 3β-N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) carbamol cholesterol (3β-N- (N ′, N ′,-dimethyl-aminoethane) -carbamol cholesterol, DC-Chol), 1,2-Dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium (1,2-dimethyloxypropyl-3-dimethylethylamine, DMRIE), 2,3-dioleoyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N , N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate (2,3-dioleoyloxy-N- [2 (superminecarbo amido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate, DOSPA) and the like can be illustrated, may be used alone or two or more thereof.
ｐＨ依存性カチオン性脂質としては、１−ｍｅｔｈｙｌ−４，４−ｂｉｓ［（９Ｚ，１２Ｚ）−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１２−ｄｉｅｎ−１−ｙｌｏｘｙ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＹＳＫ０５）、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＤＡＰ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる Examples of pH-dependent cationic lipids include 1-methyl-4,4-bis [(9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dien-1-yloxy] piperidine (YSK05), 1,2-dioleoyl-3- dimethylammonium probe (DODAP) can be used, and one or more of these can be used.
また、中性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＣＨＥ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、アニオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。 In addition to the above-mentioned lipids, examples of neutral lipids include diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, ceramide, and cholesteryl hexetheryl ether (CHE). One or more of these may be used. Can do. Examples of the anionic lipid include diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidic acid, N-succinylphosphatidylethanolamine (N-succinylPE), phosphatidylethylene glycol, and the like in addition to the above-described lipids. Species or two or more can be used.
本発明に係るペプチドと結合した脂質は、本発明に係るペプチドのＮ末端側に結合した脂質でもよく、Ｃ末端側に結合した脂質でもよい。また、本発明に係るペプチドと脂質とは直接結合していてもよく、アミノ酸やペプチド、親水性ポリマーなど、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。なお、本発明において、ペプチドと脂質との結合様式としては、例えば、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合などの非共有結合や、ジスルフィド結合、ペプチド結合などの共有結合を挙げることができる。 The lipid bound to the peptide according to the present invention may be a lipid bound to the N-terminal side of the peptide according to the present invention or a lipid bound to the C-terminal side. Further, the peptide according to the present invention and the lipid may be directly bonded, or may be bonded via some kind of linker such as an amino acid, a peptide, or a hydrophilic polymer. In the present invention, examples of the binding mode between the peptide and the lipid include non-covalent bonds such as hydrogen bonds, ionic bonds, hydrophobic bonds and van der Waals bonds, and covalent bonds such as disulfide bonds and peptide bonds. Can do.
リンカーを介して結合したものである場合、リンカーとなるアミノ酸の種類、ペプチドの構成アミノ酸や長さ、親水性ポリマーの種類や重合数などは、ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドと脂質とが結合でき、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体を構成することができる限り特に限定されない。そのようなリンカーのアミノ酸としては、例えば、システイン（Ｃ）を挙げることができ、リンカーのペプチドとしては、例えば、Ｎ末端がＣで残りが中性アミノ酸残基であるものを挙げることができ、より具体的には、ＣＧＧ−（配列番号３）、ＣＡＡ−（配列番号４）、ＣＬＬ−（配列番号５）、ＣＶＶ−（配列番号６）、ＣＬＡ−（配列番号７）、ＣＧ−（配列番号８）、ＣＧＧＧ−（配列番号９）、ＣＧＧＧＧ−（配列番号１０）、ＣＧＧＧＧＧ−（配列番号１１）（Ｇはグリシン、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｖはバリンをそれぞれ示す。）などを挙げることができる。また、リンカーの親水性ポリマーとしては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルボキシレート基、ヒドロキシエチル基、ポリオキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ポリオキシプロピル基、アミノ基、アミノエチル基、アミノプロピル基、アンモニウム基、アミド基、カルボキシメチル基、スルホン酸基、リン酸基などの親水性基を有するものを挙げることができ、具体的には、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、デンプン誘導体、カルボキシメチルセルロースおよびそのナトリウム塩、セルロースアセテート、アルギン酸ナトリウム、酢酸ビニル−マレイン酸コポリマー類、スチレン−マレイン酸コポリマー類、ポリアクリル酸類およびそれらの塩、ポリメタクリル酸類およびそれらの塩、ヒドロキシエチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシエチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシピロピルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシプロピルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）類、ヒドロキシプロピレンポリマー類、ポリビニルアルコール類、加水分解度が６０モル％以上、好ましくは８０モル％以上である加水分解ポリビニルアセテート、ポリビニルホルマール、ポリビニルブチラール、ポリビニルピロリドン、アクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、メタクリルアミドのホモポリマーおよびポリマー、Ｎ−メチロールアクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、アルコール可溶性ナイロン、２，２−ビス−（４−ヒドロキシフェニル）−プロパンとエピクロロヒドリンとのポリエーテルなどを挙げることができるが、ＰＥＧが好ましい。ＰＥＧの分子量は特に限定されず、例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００などを用いることができる。 In the case of binding via a linker, the type of amino acid serving as the linker, the constituent amino acid and length of the peptide, the type of hydrophilic polymer and the number of polymerizations, etc. can bind the KLGR peptide and / or RLTR peptide to the lipid. The lipid membrane structure is not particularly limited as long as it can constitute a lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells. Examples of such linker amino acids include cysteine (C), and examples of linker peptides include those in which the N-terminus is C and the rest are neutral amino acid residues, More specifically, CGG- (SEQ ID NO: 3), CAA- (SEQ ID NO: 4), CLL- (SEQ ID NO: 5), CVV- (SEQ ID NO: 6), CLA- (SEQ ID NO: 7), CG- (sequence) No. 8), CGGG- (SEQ ID NO: 9), CGGGGG- (SEQ ID NO: 10), CGGGGGG- (SEQ ID NO: 11) (G represents glycine, A represents alanine, L represents leucine, and V represents valine). Can be mentioned. Examples of the hydrophilic polymer of the linker include, for example, hydroxy group, carboxyl group, carboxylate group, hydroxyethyl group, polyoxyethyl group, hydroxypropyl group, polyoxypropyl group, amino group, aminoethyl group, aminopropyl group. , Ammonium groups, amide groups, carboxymethyl groups, sulfonic acid groups, phosphoric acid groups and other hydrophilic groups such as gum arabic, casein, gelatin, starch derivatives, carboxymethylcellulose and Its sodium salt, cellulose acetate, sodium alginate, vinyl acetate-maleic acid copolymers, styrene-maleic acid copolymers, polyacrylic acids and their salts, polymethacrylic acids and their salts, hydroxyethyl methacrylate Homopolymers and copolymers, hydroxyethyl acrylate homopolymers and copolymers, hydroxypyrrole methacrylate homopolymers and copolymers, hydroxypropyl acrylate homopolymers and copolymers, hydroxybutyl methacrylate homopolymers and copolymers, hydroxybutyl acrylate homopolymers and copolymers Polyethylene glycol (PEG), hydroxypropylene polymers, polyvinyl alcohol, hydrolyzed polyvinyl acetate, polyvinyl formal, polyvinyl butyral, polyvinyl pyrrolidone, acrylamide having a hydrolysis degree of 60 mol% or more, preferably 80 mol% or more. Homopolymers and copolymers, methacrylamide homopolymers and Examples include polymers, homopolymers and copolymers of N-methylolacrylamide, alcohol-soluble nylon, polyethers of 2,2-bis- (4-hydroxyphenyl) -propane and epichlorohydrin, and PEG is preferred. . The molecular weight of PEG is not particularly limited, and for example, PEG200, PEG400, PEG500, PEG2000, PEG5000, PEG10000, PEG20000, PEG30000, PEG35000 and the like can be used.
なお、後述する実施例においては、本発明に係るペプチドと結合した脂質として、図１に示すように、ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドのＮ末端に、グリシン残基（Ｇ）、グリシン残基（Ｇ）、システイン残基（Ｃ）および親水性ポリマーがこの順で結合してなる高分子化合物を介して結合した脂質を用いている。具体的には、ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドに付加したシステイン残基を介してマレイミド化された親水性ポリマーの一部に結合し、さらにこの親水性ポリマーが脂質と結合した構造を有するものである。 In the examples described later, as shown in FIG. 1, as the lipid bound to the peptide of the present invention, a glycine residue (G), a glycine residue (G) at the N-terminus of the KLGR peptide and / or the RLTR peptide. G), a lipid in which a cysteine residue (C) and a hydrophilic polymer are bonded in this order is used via a polymer compound. Specifically, it has a structure in which it binds to a part of a maleimidized hydrophilic polymer via a cysteine residue added to the KLGR peptide and / or RLTR peptide, and this hydrophilic polymer further binds to a lipid. is there.
親水性ポリマーと本発明に係るペプチドとは、例えば、親水性ポリマーが有する官能基と、本発明に係るペプチドが有する官能基との間に共有結合を形成させて結合させることができる。一般的に、共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基などを挙げることができ、本発明に係るペプチドの場合には、例えば、チオール基を有するシステイン残基を本発明に係るペプチドに付加し、このチオール基を用いて親水性ポリマーと結合させることができる。 For example, the hydrophilic polymer and the peptide of the present invention can be bonded by forming a covalent bond between the functional group of the hydrophilic polymer and the functional group of the peptide of the present invention. In general, combinations of functional groups capable of forming a covalent bond include, for example, amino group / carboxyl group, amino group / acyl halide group, amino group / N-hydroxysuccinimide ester group, amino group / benzotriazole carbonate group, An amino group / aldehyde group, a thiol group / maleimide group, a thiol group / vinylsulfone group, and the like can be mentioned. In the case of a peptide according to the present invention, for example, a cysteine residue having a thiol group is a peptide according to the present invention. This thiol group can be used to bind to a hydrophilic polymer.
システインなどのチオール基を有するアミノ酸残基を付加した本発明に係るペプチドを、チオール基を介して親水性ポリマーに結合させる方法、ならびにこの様な親水性ポリマーと脂質との結合は、Ｌｕら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ、２００６年、第１１０巻、第５０５−５１３頁）によって報告されており、本発明に係るペプチドと結合した脂質は、このＬｕらの方法を利用して調製することができるが、係る方法には限定されない。チオール基を有するアミノ酸残基の付加は、本発明に係るペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれでもよい。 A method of binding a peptide according to the present invention to which an amino acid residue having a thiol group such as cysteine is added to a hydrophilic polymer via a thiol group, and binding of such a hydrophilic polymer to a lipid are described in Lu et al. J. Controlled release, 2006, 110, 505-513), the lipid bound to the peptide of the present invention can be prepared using the method of Lu et al. The method is not limited. Addition of an amino acid residue having a thiol group may be on either the N-terminal side or the C-terminal side of the peptide according to the present invention.
脂質は一般にカルボニル基、アミノ基または水酸基などの化学的に活性化可能な官能基を有しており、これらの適当な官能基と本発明に係るペプチドが有する官能基、本発明に係るペプチドに付加されたアミノ酸が有する官能基、あるいは前記親水性ポリマーの有する官能基との間の化学反応によって、上述した調製法の他、本発明に係る「ペプチドと結合した脂質」を調製することができる。例えば、脂質がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、これに前記高分子化合物を介してＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドを結合させる場合には、Ｍａｒｔｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９２年、第１１１３巻、第１７１−１９９頁）が知られている。すなわち、前記親水性ポリマーの水酸基をカルボン酸に変換し、そのカルボキシル基とＰＥのアミノ基との間で縮合反応を行うことで、本発明に係るペプチドと結合したＰＥを調製することができる。 Lipids generally have a chemically activatable functional group such as a carbonyl group, an amino group, or a hydroxyl group. These appropriate functional groups and the functional groups possessed by the peptide according to the present invention, the peptide according to the present invention, and the like. In addition to the preparation methods described above, the “lipid bound to a peptide” according to the present invention can be prepared by a chemical reaction between the functional group of the added amino acid or the functional group of the hydrophilic polymer. . For example, when the lipid is phosphatidylethanolamine (PE) and KLGR peptide and / or RLTR peptide is bound thereto via the polymer compound, the method of Martin et al. (Biochem. Biophys. Acta, 1992, 1113, pp. 171-199) are known. That is, PE bonded to the peptide of the present invention can be prepared by converting the hydroxyl group of the hydrophilic polymer into a carboxylic acid and performing a condensation reaction between the carboxyl group and the amino group of PE.
上述した高分子化合物を介して本発明に係るペプチドと結合したステロール類を作製する方法としては、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａらの報告(Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００１年、第１７巻、第２０６７−２０７５頁) が知られている。すなわち、ステロール類が有する水酸基をトシル基などで活性化し、有機溶媒中で上述した親水性ポリマーの水酸基によるＳＮ２反応を用いることで、本発明に係るペプチドと結合したステロール類を調製することができる。 Bhattacharya et al. (Langmuir, 2001, Vol. 17, pp. 2067-2075) is known as a method for producing sterols bonded to the peptide of the present invention via the above-described polymer compound. . That is, sterols bonded to the peptide according to the present invention can be prepared by activating the hydroxyl group of sterols with a tosyl group or the like and using the SN2 reaction with the hydroxyl group of the hydrophilic polymer described above in an organic solvent. .
さらに、上述した高分子化合物を介して本発明に係るペプチドと結合した長鎖脂肪酸を調製する方法としては、上述した親水性ポリマーにアミノ基を導入し、このアミノ基と長鎖脂肪酸のカルボキシル基との間で縮合反応を行うことで、本発明に係るペプチドと結合した長鎖脂肪酸を調製することができる。 Furthermore, as a method for preparing the long-chain fatty acid bonded to the peptide according to the present invention via the above-described polymer compound, an amino group is introduced into the above-mentioned hydrophilic polymer, and this amino group and the carboxyl group of the long-chain fatty acid are used. A long chain fatty acid bonded to the peptide according to the present invention can be prepared by performing a condensation reaction with the peptide.
なお、本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体を構成する脂質膜は、本発明に係るペプチドと結合した脂質を複数種類含んでいてもよい。例えば、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＫＬＧＲペプチドと結合した別のリン脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＫＬＧＲペプチドと結合したステロール、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＫＬＧＲペプチドと結合した糖脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したステロールとＲＬＴＲペプチドと結合した糖脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合した糖脂質、ＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合した別のリン脂質、ＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合したステロール、ＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合した糖脂質など、任意に選択することができる。 The lipid membrane constituting the lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells according to the present invention or having enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells comprises a lipid bound to the peptide according to the present invention. Multiple types may be included. For example, a phospholipid combined with a KLGR peptide and another phospholipid combined with a KLGR peptide, a phospholipid combined with a KLGR peptide and a sterol combined with a KLGR peptide, a phospholipid combined with a KLGR peptide and a glycolipid combined with a KLGR peptide Phospholipid combined with KLGR peptide and phospholipid combined with RLTR peptide, sterol combined with KLGR peptide and glycolipid combined with RLTR peptide, phospholipid combined with KLGR peptide and glycolipid combined with RLTR peptide, RLTR peptide A phospholipid bound to RLTR peptide, a phospholipid bound to RLTR peptide, a sterol bound to RLTR peptide, a phospholipid bound to RLTR peptide and a glycolipid bound to RLTR peptide, etc. It can be selected to mind.
また、本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体における、本発明に係るペプチドと結合した脂質の割合Ｐは、本発明に係るペプチドと結合した脂質を除く構成脂質（他の構成脂質）の総量を１００ｍｏｌ％とした場合、当該総量に対して、１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％が好ましい。 In the lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells according to the present invention or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells, the ratio P of lipid bound to the peptide according to the present invention is When the total amount of the constituent lipids (other constituent lipids) excluding the lipid bound to the peptide according to the invention is 100 mol%, 1 mol% ≦ P ≦ 10 mol% is preferable with respect to the total amount.
本発明において、脂質膜構造体の脂質膜には、上述した脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェートなどの負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質などの膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。 In the present invention, the lipid membrane of the lipid membrane structure has positive charges such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene, stearylamine, oleylamine and the like in addition to the lipids described above. A charged substance to be provided, a charged substance to impart a negative charge such as dicetyl phosphate, a membrane protein such as a membrane surface protein and an integral membrane protein can be contained, and the content thereof can be appropriately adjusted.
本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体は、あらかじめ本発明に係るペプチドと結合した脂質を調製し、これを用いて脂質膜構造体を調製することにより製造してもよく、脂質膜構造体を調製した後、当該脂質膜構造体に本発明に係るペプチドと結合した脂質を添加して、他の構成脂質の間隙に、本発明に係るペプチドと結合した脂質を挿入し、これを構成脂質とすることにより製造してもよい。あるいは、脂質膜構造体を調製した後、当該脂質膜構造体に本発明に係るペプチドや何らかのリンカーを結合した本発明に係るペプチドを添加して、本発明に係るペプチドや何らかのリンカーを結合した本発明に係るペプチドを構成脂質に結合させることにより製造してもよい。 The lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells according to the present invention or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells is prepared by preparing a lipid bound to the peptide according to the present invention in advance. It may be produced by preparing a lipid membrane structure, and after preparing the lipid membrane structure, a lipid bound to the peptide according to the present invention is added to the lipid membrane structure, and other lipid components You may manufacture by inserting the lipid couple | bonded with the peptide which concerns on this invention in a space | gap, and making this into a constituent lipid. Alternatively, after preparing the lipid membrane structure, the peptide according to the present invention in which the peptide according to the present invention or any linker is bound to the lipid membrane structure is added, and the peptide according to the present invention or any linker is bound The peptide according to the invention may be produced by binding to a constituent lipid.
なお、本発明において、脂質膜構造体は、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法を用いて作製することができる。例えば水和法の場合、本発明に係るペプチドと結合した脂質、さらにはその他の脂質や先に記載した脂質膜に含まれる任意成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得た後、脂質膜を水和させ、攪拌または超音波処理することにより、本発明に係るペプチドと結合した脂質を膜の構成成分として含む脂質膜構造体を製造することができる。 In the present invention, the lipid membrane structure is a known method such as a hydration method, an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, a surfactant method, or a freezing / thawing method. Can be used. For example, in the case of the hydration method, the lipid bound to the peptide according to the present invention, and other lipids and optional components contained in the lipid membrane described above are dissolved in an organic solvent, and then the organic solvent is removed by evaporation. After obtaining the lipid membrane, the lipid membrane is hydrated and stirred or sonicated to produce a lipid membrane structure containing lipid bound to the peptide according to the present invention as a component of the membrane.
上述した方法において、有機溶媒として、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノールなどの低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類などを、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。 In the above-described method, examples of the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, methanol, and ethanol. Lower alcohols such as methyl acetate, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, ketones such as acetone and the like can be used alone or in combination of two or more.
次に、本発明は、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤を提供する。本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤は、上述した本発明に係るペプチド、すなわちＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドを有効成分とする。なお、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤において、上述した本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／もしくは増強するペプチドまたは肝臓血管内皮細胞への移行能を有するもしくは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。 Next, the present invention provides an agent that imparts and / or enhances the ability of a lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells. The agent that imparts and / or enhances the ability of the lipid membrane structure of the present invention to migrate to hepatic vascular endothelial cells comprises the above-described peptide of the present invention, that is, the KLGR peptide or the RLTR peptide. In addition, in the agent that imparts and / or enhances the ability to migrate to liver vascular endothelial cells to the lipid membrane structure, the ability to migrate to liver vascular endothelial cells is imparted to the lipid membrane structure according to the present invention described above. The description of the peptide that enhances and / or the lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or the ability to migrate to liver vascular endothelial cells to be equivalent or equivalent is omitted.
最後に、本発明は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体の製造方法を提供する。本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体の製造方法は、下記（ａ）の工程を有する；
（ａ）ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程。
なお、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体の製造方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／もしくは増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するもしくは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体または脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／もしくは増強する剤と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
Finally, the present invention provides a method for producing a lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells. The method for producing a lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells according to the present invention or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells has the following step (a);
(A) A step of modifying a lipid membrane structure with a KLGR peptide and / or an RLTR peptide.
In the method for producing a lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells, the liver vascular endothelium is compared with the lipid membrane structure according to the present invention described above. Peptide imparting and / or enhancing the ability to migrate to cells, lipid membrane structure having ability to migrate to liver vascular endothelial cells or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells, or liver for lipid membrane structures The description of the same or equivalent configuration to the agent that imparts and / or enhances the ability to migrate to vascular endothelial cells is omitted.
工程（ａ）において、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチド、すなわち本発明に係るペプチドで脂質膜構造体を修飾する態様としては、脂質膜構造体の構成脂質に本発明に係るペプチドを結合する態様や、脂質膜構造体の構成脂質の間隙に本発明に係るペプチドを挿入する態様などを挙げることができる。 In the step (a), the KLGR peptide or the RLTR peptide, that is, the lipid membrane structure is modified with the peptide according to the present invention, the mode in which the peptide according to the present invention is bound to the constituent lipid of the lipid membrane structure, the lipid Examples include a mode in which the peptide according to the present invention is inserted into the gap between the constituent lipids of the membrane structure.
工程（ａ）において、本発明に係るペプチドで脂質膜構造体を修飾する方法は特に限定されず、当業者が適宜選択可能な手法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、下記（ｉ）〜（ｖ）を挙げることができる；
（ｉ）本発明に係るペプチドを先ず脂質に結合させた後、このペプチドと結合した脂質を構成脂質とする脂質膜構造体を調製する方法、
（ｉｉ）脂質膜構造体を調製した後に本発明に係るペプチドと結合した脂質を添加して、他の構成脂質の間隙に、本発明に係るペプチドと結合した脂質を挿入して、これを構成脂質とする方法、
（ｉｉｉ）脂質膜構造体を調製した後に本発明に係るペプチドを添加し、構成脂質に本発明に係るペプチドを結合させる方法、
（ｉｖ）脂質膜構造体を調製した後に本発明に係るペプチドを添加し、構成脂質の間隙に本発明に係るペプチドを挿入する方法、
（ｖ）脂質膜構造体の調製時に本発明に係るペプチドを添加し、構成脂質の間隙に本発明に係るペプチドを挿入する方法。
In the step (a), the method of modifying the lipid membrane structure with the peptide according to the present invention is not particularly limited, and can be performed using a technique that can be appropriately selected by those skilled in the art. Examples of such methods include the following (i) to (v);
(I) a method for preparing a lipid membrane structure comprising a lipid according to the present invention as a constituent lipid after first binding the peptide to a lipid;
(Ii) After preparing the lipid membrane structure, the lipid bound to the peptide according to the present invention is added, and the lipid bound to the peptide according to the present invention is inserted into the gap between other constituent lipids to constitute the structure. How to make lipids,
(Iii) a method of adding a peptide according to the present invention after preparing a lipid membrane structure and binding the peptide according to the present invention to a constituent lipid;
(Iv) a method of adding a peptide according to the present invention after preparing a lipid membrane structure and inserting the peptide according to the present invention into a gap between constituent lipids,
(V) A method of adding the peptide according to the present invention at the time of preparation of the lipid membrane structure and inserting the peptide according to the present invention into the gap between the constituent lipids.
なお、工程（ａ）において、脂質膜構造体は、本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体に用いることのできる脂質膜構造体と同様のものを用いることができる。また、本発明に係るペプチドを脂質または構成脂質に結合させる場合は、直接結合させてもよく、上述したリンカーを介して結合させてもよい。また、本発明に係るペプチドを構成脂質の間隙に挿入する場合、本発明に係るペプチドを直接挿入してもよく、本発明に係るペプチドに上述した抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質などを結合した上で、これを挿入するなどしてもよい。なお、本発明に係るペプチドと脂質とを結合する方法、脂質膜構造体を調製する方法については、上述の通りである。 In step (a), the lipid membrane structure can be used for a lipid membrane structure having the ability to migrate to liver vascular endothelial cells according to the present invention or enhanced ability to migrate to liver vascular endothelial cells. The same lipid membrane structure can be used. Further, when the peptide according to the present invention is bound to a lipid or a constituent lipid, it may be bound directly or via the above-mentioned linker. Further, when the peptide according to the present invention is inserted into the gap between the constituent lipids, the peptide according to the present invention may be directly inserted, and the above-mentioned antioxidant, charged substance, membrane protein, etc. are bound to the peptide according to the present invention. Then, it may be inserted. The method for binding the peptide according to the present invention and the lipid and the method for preparing the lipid membrane structure are as described above.
本発明の脂質膜構造体には、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質を封入することができ、診断、治療などの目的に応じて適宜選択することができる。生理活性物質が水溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体内部の水相に生理活性物質を封入することができる。また、生理活性物質が脂溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり使用される有機溶剤に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体の膜あるいは内部に生理活性物質を封入することができる。 Various physiologically active substances such as drugs, nucleic acids, peptides, proteins, sugars or complexes thereof can be encapsulated in the lipid membrane structure of the present invention, and the lipid membrane structure is appropriately selected according to the purpose of diagnosis, treatment, etc. be able to. When the physiologically active substance is water-soluble, the aqueous phase inside the lipid membrane structure can be obtained by adding the physiologically active substance to an aqueous solvent used for hydrating the lipid membrane in the production of the lipid membrane structure. A physiologically active substance can be encapsulated. In addition, when the physiologically active substance is fat-soluble, the physiologically active substance is encapsulated in or inside the lipid membrane structure by adding the physiologically active substance to the organic solvent used in the production of the lipid membrane structure. can do.
本発明において、脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、本発明において脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。さらに、本発明において、脂質膜構造体は、経口投与することができる他、静脈、腹腔内、皮下、経鼻などへの非経口投与も可能である。 In the present invention, the lipid membrane structure can be used by being dispersed in an appropriate aqueous solvent such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, and acetate buffer. Additives such as saccharides, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH adjusters, and hydration accelerators may be appropriately added to the dispersion. In the present invention, the lipid membrane structure can be stored in a state where the dispersion is dried. Furthermore, in the present invention, the lipid membrane structure can be administered orally, and can also be administered parenterally to veins, intraperitoneally, subcutaneously, nasally, and the like.
以下、本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。 Hereinafter, a peptide that imparts and / or enhances the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, the ability to migrate to liver vascular endothelial cells, or the ability to migrate to liver vascular endothelial cells to the lipid membrane structure according to the present invention. Examples of an enhanced lipid membrane structure and an agent that imparts and / or enhances the ability of the lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells will be described. Note that the technical scope of the present invention is not limited to the features shown by these examples.
＜実施例１＞リポソームの調製
（１）構成脂質の調製
ＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＫＬＧＲペプチド」という。）のＮ末端に２残基のグリシン（Ｇ）およびシステイン残基（Ｃ）がこの順で付加したＣＧＧＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１２）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＫＬＧＲ付加ペプチド」とする。）をクラボウ社から購入した。マレイミド基が付加された分子量２０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)の結合体であるＭａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥとＫＬＧＲ付加ペプチドとを、ｍｏｌ比が１：１．２となるように混合して３７℃で２４時間振盪することにより、ＫＬＧＲ付加ペプチドのＮ末端のシステイン（Ｃ）のチオール基とマレイミド基とを結合して、ＫＬＧＲ付加ペプチド、ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなる脂質（ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）を得た。
<Example 1> Preparation of liposomes (1) Preparation of constituent lipids Two residues of glycine (G) and cysteine at the N-terminus of a peptide consisting of the amino acid sequence of KLGRKRTLR (SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as "KLGR peptide") A peptide consisting of the amino acid sequence of CGGKLGRKRTL (SEQ ID NO: 12) with residues (C) added in this order (hereinafter referred to as “KLGR-added peptide”) was purchased from Kurabo Industries. A molar ratio of Mal-PEG2000-DSPE, which is a conjugate of polyethylene glycol (PEG2000) having a molecular weight of 2000 to which a maleimide group has been added and distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), and a KLGR-added peptide is 1: 1.2. The mixture was shaken for 24 hours at 37 ° C. to bind the thiol group of the N-terminal cysteine (C) of the KLGR-added peptide and the maleimide group, and the KLGR-added peptide, PEG2000 and DSPE were combined in this order. Thus obtained lipid (KLGR-PEG2000-DSPE) was obtained.
また、ＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＲＬＴＲペプチド」という。）のＮ末端に２残基のＧおよびＣがこの順で付加したＣＧＧＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＲＬＴＲ付加ペプチド」とする。）を東レ社から購入し、同様にして、ＲＬＴＲ付加ペプチドのＮ末端のシステイン（Ｃ）のチオール基とマレイミド基とを結合して、ＲＬＴＲ付加ペプチド、ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなる脂質（ＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）を得た。ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥおよびＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥの構造の模式図を図１に示す。 Further, from the amino acid sequence of CGGRLTRKRGLK (SEQ ID NO: 13) in which two residues of G and C are added in this order to the N-terminus of a peptide consisting of the amino acid sequence of RLTRKRGLK (SEQ ID NO: 2) (hereinafter referred to as “RLTR peptide”). RLTR-added peptide (hereinafter referred to as “RLTR-added peptide”) is purchased from Toray and the thiol group of the cysteine (C) at the N-terminal of the RLTR-added peptide and the maleimide group are similarly bonded. , PEG2000 and DSPE were combined in this order to obtain a lipid (RLTR-PEG2000-DSPE). A schematic diagram of the structures of KLGR-PEG2000-DSPE and RLTR-PEG2000-DSPE is shown in FIG.
また、リポソームの構成脂質として、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＣ−６−１４）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＰＥＧ２０００が結合したＤＳＰＥ（ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）、１−ｍｅｔｈｙｌ−４，４−ｂｉｓ［（９Ｚ，１２Ｚ）−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１２−ｄｉｅｎ−１−ｙｌｏｘｙ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＹＳＫ０５）、ＰＥＧ２０００が結合した１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）、ＰＥＧ２０００が結合した１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００）、ローダミンで標識したＤＯＰＥ（ローダミンＤＯＰＥ）および３Ｈで標識したＣｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ（３Ｈ−ＣＨＥ）を用意した。また、ＫＬＧＲペプチドがＰＥＧを介さずに結合した脂質として、ＫＬＧＲ付加ペプチドのＮ末端にステアリン酸が結合してなる脂質（ＫＬＧＲ−ＳＴＲ）を東レ社から購入した。 Further, as constituent lipids of liposomes, egg yolk phosphatidylcholine (EPC), cholesterol (Chol), dietanolamine chloride (DC-6-14), dioleoylglycerophosphoethanolamine (DOPE), DSPE (PEG2000-DSPE combined with PEG2000) ), 1-methyl-4,4-bis [(9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dien-1-yloxy] piperidine (YSK05), PEG2000-linked 1,2-dimethylristol-sn-glycerol (DMG) -PEG2000), 1,2-distearoyl-sn-glycerol (DSG-PEG2000) conjugated with PEG2000, DOPE labeled with rhodamine ( Rhodamine DOPE) and 3 H-labeled cholesteryl hexadecyl ether ( 3 H-CHE) were prepared. In addition, a lipid (KLGR-STR) in which stearic acid was bonded to the N-terminus of the KLGR-added peptide was purchased from Toray as a lipid to which the KLGR peptide was bonded without using PEG.
（２）リポソームの調製
［２−１］コントロールリポソームならびにＫＬＧＲペプチド、ＲＬＴＲペプチドおよびＰＥＧを修飾したリポソーム
クロロホルムおよびエタノールを混合した溶媒に、ｍｏｌ比が以下の割合１〜４となるよう各種の脂質を溶解して混合脂質溶液とし、ガラス管に入れて溶媒を減圧留去することにより脂質膜を得た。脂質膜に１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて１０分間インキュベートすることにより脂質膜を水和させた。続いて、バスタイプソニケーターを用いて約３０秒間超音波処理することによりリポソームを調製した。割合１〜４の混合脂質溶液から得られたリポソームを、それぞれコントロールリポソームＡ、コントロールリポソームＢ、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧ修飾リポソームとした。割合３においてＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが１、３、５、１０および１５の混合脂質溶液からは、他の構成脂質総量に対して、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質の割合（以下、「ＫＬＧＲペプチドの修飾割合」という。）がそれぞれ１、３、５、１０および１５ｍｏｌ％であるＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームが得られた。また、割合４においてＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが１、３、５および１０の混合脂質溶液からは、他の構成脂質総量に対して、ＲＬＴＲペプチドと結合した脂質の割合（以下、「ＲＬＴＲペプチドの修飾割合」という。）がそれぞれ１、３、５および１０ｍｏｌ％であるＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームが得られた。また、割合５においてＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが１、５、１０および１５の混合脂質溶液からは、他の構成脂質総量に対して、ＰＥＧと結合した脂質の割合（以下、「ＰＥＧの修飾割合」という。）がそれぞれ１、３、５、１０および１５ｍｏｌ％であるＰＥＧ修飾リポソームが得られた。
(2) Preparation of liposomes [2-1] Control liposomes and liposomes modified with KLGR peptide, RLTR peptide, and PEG Various lipids were mixed in a solvent in which chloroform and ethanol were mixed so that the molar ratio was 1 to 4 below. A lipid membrane was obtained by dissolving in a mixed lipid solution and placing in a glass tube and distilling off the solvent under reduced pressure. The lipid membrane was hydrated by adding 10 mmol / L HEPES buffer (pH 7.4) to the lipid membrane and incubating for 10 minutes. Subsequently, liposomes were prepared by ultrasonic treatment for about 30 seconds using a bath type sonicator. Liposomes obtained from the mixed lipid solution at a ratio of 1 to 4 were designated as control liposome A, control liposome B, KLGR / PEG modified liposome, RLTR / PEG modified liposome and PEG modified liposome, respectively. From the mixed lipid solution of KLGR-PEG2000-DSPE of 1, 3, 5, 10 and 15 at a ratio of 3, the ratio of lipid bound to the KLGR peptide relative to the total amount of other constituent lipids (hereinafter referred to as “Modification of KLGR peptide”). KLGR / PEG-modified liposomes having a ratio of 1), 3, 5, 10, and 15 mol% were obtained. In addition, from the mixed lipid solution in which RLTR-PEG2000-DSPE is 1, 3, 5 and 10 at a ratio of 4, the ratio of lipid bound to the RLTR peptide with respect to the total amount of other constituent lipids (hereinafter referred to as “modified RLTR peptide RLTR / PEG-modified liposomes with ratios of 1), 3, 5 and 10 mol%, respectively, were obtained. Further, from the mixed lipid solution of PEG2000-DSPE of 1, 5, 10 and 15 at a ratio of 5, the ratio of lipid bonded to PEG with respect to the total amount of other constituent lipids (hereinafter referred to as “PEG modification ratio”). PEG-modified liposomes with 1, 3, 5, 10 and 15 mol% respectively were obtained.
混合脂質溶液における各種の脂質の割合
割合１（コントロールリポソームＡ）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３
割合２（コントロールリポソームＢ）ＤＣ−６−１４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝４：３：３
割合３（ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ＝７０：３０：１、３、５、１０または１５
割合４（ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ＝７０：３０：１、３、５または１０
割合５（ＰＥＧ修飾リポソーム）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ＝７０：３０：１、３、５、１０または１５
Ratio 2 (control liposome B) DC-6-14: DOPE: Chol = 4: 3: 3
Ratio 3 (KLGR / PEG modified liposome) EPC: Chol: KLGR-PEG2000-DSPE = 70: 30: 1, 3, 5, 10 or 15
Ratio 4 (RLTR / PEG-modified liposome) EPC: Chol: RLTR-PEG2000-DSPE = 70: 30: 1, 3, 5 or 10
Ratio 5 (PEG-modified liposome) EPC: Chol: PEG2000-DSPE = 70: 30: 1, 3, 5, 10 or 15
［２−２］ｓｉＲＮＡ内包ｐＨ依存性カチオン性リポソーム
〈２−２−１〉ｓｉＲＮＡ内包ｐＨ依存性カチオン性リポソームの調製
脂質膜構造体にｐＨ依存性カチオン性を付与する脂質であるＹＳＫ０５（特願２０１２−１１９５２１）を構成脂質として含むとともに、ｓｉＲＮＡを内包するｐＨ依存性カチオン性リポソームを調製した。具体的には、ＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００またはＤＳＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３となるよう９０％（ｖ／ｖ）ｔＢｕｔｙｌ水溶液に加えて、混合脂質溶液とした。肝実質細胞マーカー遺伝子であるＦ７遺伝子伝令ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ−Ｆ７）、および肝血管内皮細胞マーカー遺伝子であるＴｉｅ２遺伝子伝令ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ−Ｔｉｅ２）を、それぞれ２ｍｇ／ｍＬとなるようＤＤＷに溶解してｓｉＲＮＡ溶液とした。混合脂質溶液をボルテックスミキサーにより攪拌しながらｓｉＲＮＡ溶液８０μＬを滴下した後、１ｍＬシリンジおよび２７Ｇ針を用いて全量を回収した。２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）２ｍＬを攪拌しながら、回収した溶液を全量注入することにより、ｓｉＲＮＡを内包するリポソームを形成させた。適量のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４；ＰＢＳ）を加えて希釈した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）およびＰＢＳを用いて限外ろ過を行うことにより外液をＰＢＳに交換した。ａｎｔｉ−Ｆ７を内包するリポソームをＦ７内包ＹＳＫリポソーム、ａｎｔｉ−Ｔｉｅ２を内包するリポソームをＴｉｅ２内包ＹＳＫリポソームとした。なお、ａｎｔｉ−Ｆ７およびａｎｔｉ−Ｔｉｅ２の配列は下記のとおりである。
[2-2] siRNA-encapsulated pH-dependent cationic liposome <2-2-1> Preparation of siRNA-encapsulated pH-dependent cationic liposome YSK05, a lipid that imparts pH-dependent cationic properties to lipid membrane structures (Japanese Patent Application) 2012-119521) as a constituent lipid and pH-dependent cationic liposomes encapsulating siRNA were prepared. Specifically, a mixed lipid solution was prepared by adding 90% (v / v) tButyl aqueous solution so that YSK05: Chol: DMG-PEG2000 or DSG-PEG2000 = 70: 30: 3. The siRNA (anti-F7) for the F7 gene messenger RNA, which is a liver parenchymal cell marker gene, and the siRNA (anti-Tie2) for the Tie2 gene messenger RNA, which is a hepatic vascular endothelial cell marker gene, are added to the DDW at 2 mg / mL It melt | dissolved and it was set as the siRNA solution. After stirring the mixed lipid solution with a vortex mixer, 80 μL of the siRNA solution was added dropwise, and the whole amount was collected using a 1 mL syringe and a 27G needle. While agitating 2 mL of 20 mmol / L citrate buffer (pH 4.0), the entire amount of the collected solution was injected to form liposomes encapsulating siRNA. After diluting with an appropriate amount of phosphate buffered saline (pH 7.4; PBS), the external solution was replaced with PBS by performing ultrafiltration using Amicon Ultra filter units (Millipore) and PBS. The liposome encapsulating anti-F7 was designated as F7-encapsulated YSK liposome, and the liposome encapsulating anti-Tie2 was designated as Tie2-encapsulated YSK liposome. The sequences of anti-F7 and anti-Tie2 are as follows.
ａｎｔｉ−Ｆ７
センス鎖；５’−ＧＧＡＵＣＡＵＣＵＣＡＡＧＵＣＵＵＡＣＴＴ−３’（配列番号１４）
アンチセンス鎖；５’−ＧＵＡＡＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＣＣＴＴ−３’（配列番号１５）
ａｎｔｉ−Ｔｉｅ２
センス鎖；５’−ＡＵＡＵＣＵＧＧＧＣＡＡＡＵＧＡＵＧＧ−３’（配列番号１６）
アンチセンス鎖；５’−ＣＣＡＵＣＡＵＵＵＧＣＣＣＡＧＡＵＡＵ−３’（配列番号１７）
anti-F7
Sense strand; 5′-GGAUCAUCUCUAGUCUUACTT-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
Antisense strand; 5′-GUAAGACUUGAGUGAUCUCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
anti-Tie2
Sense strand; 5'-AUAUCUGGGCAAAUGAUGG-3 '(SEQ ID NO: 16)
Antisense strand; 5'-CCAUUCAUUGCCCAGAAUAU-3 '(SEQ ID NO: 17)
〈２−２−２〉ｓｉＲＮＡ内包率の確認
本実施例１（２）［２−２］〈２−２−１〉のＦ７内包ＹＳＫリポソームについて、２本鎖の核酸にインターカレートして蛍光を発するＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を用いて、ｓｉＲＮＡ内包率を測定した。具体的には、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームを２５０倍、５００倍および１０００倍に希釈してリポソーム希釈液とした。リポソーム希釈液の半量にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．２％（ｗ／ｖ）となるよう添加して分解リポソーム希釈液とした。リポソーム希釈液および分解リポソーム希釈液各５０μＬに、２００倍に希釈したＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を５０μＬずつ加えた後、蛍光プレートリーダーを用いて、励起波長４９５ｎｍおよび蛍光波長５２５ｎｍで蛍光強度を測定した。リポソーム希釈液における蛍光強度を分解前蛍光強度とし、分解リポソーム希釈液における蛍光強度を分解後蛍光強度とした。続いて、希釈倍率ごとに、式１；ｓｉＲＮＡ内包率（％）＝｛（分解後蛍光強度−分解前蛍光強度）／分解後蛍光強度｝×１００によりｓｉＲＮＡ内包率を算出した。その後、２５０倍、５００倍および１０００倍のｓｉＲＮＡ内包率の平均値および標準偏差を求めたところ、９６±６％であった。この結果から、リポソームの調製に用いたｓｉＲＮＡの大部分がリポソームに内包されていることが確認された。
<2-2-2> Confirmation of siRNA encapsulation rate Example 1 (2) [2-2] The F7-encapsulated YSK liposome of <2-2-1> is intercalated into double-stranded nucleic acid and fluorescent. The siRNA encapsulation rate was measured using a Ribogreen reagent that emits. Specifically, F7-encapsulated YSK liposomes were diluted 250 times, 500 times, and 1000 times to obtain a liposome diluted solution. Triton X-100 was added to half of the liposome dilution so as to be 0.2% (w / v) to obtain a degraded liposome dilution. After adding 50 μL of Ribogreen reagent diluted 200-fold to 50 μL each of the liposome diluted solution and the degraded liposome diluted solution, the fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 495 nm and a fluorescence wavelength of 525 nm using a fluorescence plate reader. The fluorescence intensity in the liposome diluted solution was defined as the fluorescence intensity before decomposition, and the fluorescence intensity in the decomposed liposome diluted solution was defined as the fluorescence intensity after decomposition. Subsequently, for each dilution factor, the siRNA encapsulation rate was calculated according to
［２−３］空ｐＨ依存性カチオン性リポソーム
ｓｉＲＮＡ溶液に代えて２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて、本実施例１（２）［２−２］に記載の方法を行うことにより、ｓｉＲＮＡを内包しないｐＨ依存性カチオン性リポソームを得て、これを空ＹＳＫリポソームとした。
[2-3] Empty pH-dependent cationic liposome The method described in Example 1 (2) [2-2] using a 20 mmol / L citrate buffer (pH 4.0) instead of the siRNA solution. To obtain pH-dependent cationic liposomes that do not encapsulate siRNA, which were designated as empty YSK liposomes.
［２−４］ＫＬＧＲペプチドを修飾したｐＨ依存性カチオン性リポソーム
本実施例１（２）［２−２］のＦ７内包ＹＳＫリポソームおよびＴｉｅ２内包ＹＳＫリポソームならびに本実施例１（２）［２−３］の空ＹＳＫリポソームに、ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥまたはＫＬＧＲ−ＳＴＲを、他の構成脂質総量に対して、１、３、５または７ｍｏｌ％となるようそれぞれ添加して、室温にて３０分間インキュベートすることにより、ＫＬＧＲペプチドで各リポソームを修飾した。ここで、ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥまたはＫＬＧＲ−ＳＴＲを添加した割合は、ＫＬＧＲペプチドで修飾したリポソームにおいて「ＫＬＧＲペプチドの修飾割合」に相当する。ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを添加して得られたリポソームを、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソーム、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームとし、ＫＬＧＲ−ＳＴＲを添加して得られたリポソームを、ＫＬＧＲ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソーム、ＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ修飾空ＹＳＫリポソームとした。
[2-4] pH-dependent cationic liposome modified with KLGR peptide F7-encapsulated YSK liposome and Tie2-encapsulated YSK liposome of Example 1 (2) [2-2] and Example 1 (2) [2-3] KLGR-PEG2000-DSPE or KLGR-STR is added to the empty YSK liposome of 1, 3, 5 or 7 mol% with respect to the total amount of other constituent lipids, and incubated at room temperature for 30 minutes. As a result, each liposome was modified with the KLGR peptide. Here, the ratio of adding KLGR-PEG2000-DSPE or KLGR-STR corresponds to the “modified ratio of KLGR peptide” in the liposome modified with KLGR peptide. Liposomes obtained by adding KLGR-PEG2000-DSPE are KLGR / PEG-modified F7-encapsulated YSK liposomes, KLGR / PEG-modified Tie2-encapsulated YSK liposomes and KLGR / PEG-modified empty YSK liposomes, and obtained by adding KLGR-STR The resulting liposomes were designated as KLGR-modified F7-encapsulated YSK liposome, KLGR-modified Tie2-encapsulated YSK liposome, and KLGR-modified empty YSK liposome.
［２−５］ローダミンで標識したリポソーム
他の構成脂質総量に対して１ｍｏｌ％となるようローダミンＤＯＰＥを混合脂質溶液に添加して、本実施例１（２）［２−１］〜［２−４］に記載の方法を行うことにより、ローダミンで標識したリポソームを調製した。
[2-5] Liposomes labeled with rhodamine Rhodamine DOPE was added to the mixed lipid solution so as to be 1 mol% with respect to the total amount of other constituent lipids, and Example 1 (2) [2-1] to [2- 4] was performed to prepare liposomes labeled with rhodamine.
［２−６］３Ｈで標識したリポソーム
適量の３Ｈ−ＣＨＥを混合脂質溶液に添加して、本実施例１（２）［２−１］に記載の方法を行うことにより、３Ｈで標識したコントロールリポソームＡおよび５ｍｏｌ％ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを調製した。
[2-6] 3 H by adding 3 H-CHE labeled liposomes appropriate amount mixed lipid solution, by performing the method described in the Example 1 (2) [2-1], with 3 H Labeled control liposome A and 5 mol% KLGR / PEG modified liposomes were prepared.
（３）リポソームの物性
本実施例１（２）［２−１］のコントロールリポソームＡ、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧ修飾リポソーム、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％の本実施例１（２）［２−２］のＦ７内包ＹＳＫリポソームおよび本実施例１（２）［２−４］のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームについて、動的光散乱測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）によりＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で平均粒子径およびゼータ電位を測定した。その結果を表１に示す。
(3) Physical properties of liposome Example 1 (2) Control liposome A of [2-1], KLGR / PEG-modified liposome and PEG-modified liposome, and Example 1 (2) in which the modification ratio of KLGR peptide is 5 mol% The FSK-encapsulated YSK liposome of [2-2] and the KLGR / PEG-modified F7-encapsulated YSK liposome of Example 1 (2) [2-4] were subjected to HEPES using a dynamic light scattering measurement apparatus (Zetasizer Nano ZS; Malvern). The average particle size and zeta potential were measured in a buffer (pH 7.4). The results are shown in Table 1.
表１に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの粒子径は、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して、同等であった。一方、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームのゼータ電位は、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して大きく、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％以上では、正の値であった。これらの結果から、他の構成脂質がＥＰＣおよびＣｈｏｌの場合、他の構成脂質総量に対するＫＬＧＲペプチドと結合した脂質の割合が５ｍｏｌ％以上では、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームはカチオン性を呈することが明らかになった。 As shown in Table 1, the particle size of the KLGR / PEG-modified liposome was the same as that of the control liposome A and the PEG-modified liposome. On the other hand, the zeta potential of the KLGR / PEG-modified liposome was larger than that of the control liposome A and the PEG-modified liposome, and was a positive value when the modification ratio of the KLGR peptide was 5 mol% or more. From these results, when the other constituent lipids are EPC and Chol, it is clear that the KLGR / PEG-modified liposome exhibits a cationic property when the ratio of the lipid bound to the KLGR peptide to the total amount of the other constituent lipids is 5 mol% or more. became.
また、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームの平均粒子径は、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームと比較してやや大きかった。また、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームのいずれも、ゼータ電位はｐＨ７．４において僅かにカチオン性を呈しており、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームと比較してＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームの方がカチオン性はやや大きかった。 Moreover, the average particle diameter of the KLGR / PEG-modified F7-encapsulated YSK liposome was slightly larger than that of the F7-encapsulated YSK liposome. In addition, both the F7-encapsulated YSK liposome and the KLGR / PEG-modified F7-encapsulated YSK liposome have a slightly zeta potential at pH 7.4. Compared with the F7-encapsulated YSK liposome, the KLGR / PEG-modified F7-encapsulated YSK liposome Liposomes were slightly more cationic.
＜実施例２＞リポソームの分布
（１）カチオン性リポソームの肝臓および肺での分布
［１−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの分布
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意した。リポソームを１．６５ｎｍｏｌ／μＬの脂質濃度となるようＫｒｅｂｓ緩衝液に懸濁し、４〜５週齢のＩＣＲマウスに４００μＬずつ尾静脈内投与した。投与から２５分後に肝臓および肺を採取した。肝臓については、４０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含むＰＢＳを大静脈から流すことにより血管に残っている血液および血管内皮細胞表面のリポソームを除去した。肺については、生理食塩水で血液を洗い流した。肝臓および肺を、１０〜１５ｍｍ長さのブロックに刻んだ後、Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４を含むＨＥＰＥＳ緩衝液を添加して１時間インキュベートすることにより血管内皮細胞を染色した。その後、肝臓および肺を３．５ｃｍのガラスボトムディッシュに置いて、共焦点顕微鏡を用いてローダミンおよびＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光観察を行った。その結果を図２に示す。
<Example 2> Distribution of liposome (1) Distribution of cationic liposome in liver and lung [1-1] Distribution of KLGR / PEG-modified liposome Example 1 (2) [2-1] and [2-5] The KLGR / PEG-modified liposome and the control liposome B labeled with rhodamine and having a modification ratio of KLGR peptide of 5 mol% were prepared by the method described in 1). Liposomes were suspended in Krebs buffer to a lipid concentration of 1.65 nmol / μL, and 400 μL each was administered to 4 to 5 week-old ICR mice via the tail vein. Liver and lung were collected 25 minutes after administration. For the liver, blood remaining in the blood vessels and liposomes on the surface of vascular endothelial cells were removed by flowing PBS containing 40 U / mL heparin from the vena cava. For the lungs, blood was washed away with physiological saline. The liver and lungs were cut into 10-15 mm long blocks, and then HEPES buffer containing Iselectin B4 was added and incubated for 1 hour to stain vascular endothelial cells. Thereafter, the liver and lung were placed on a 3.5 cm glass bottom dish, and fluorescence observation of rhodamine and Iselectin B4 was performed using a confocal microscope. The result is shown in FIG.
［１−２］ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの分布
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意し、本実施例２（１）［１−１］に記載の方法によりマウスに投与して肺を観察した。その結果を図３に示す。
[1-2] Distribution of RLTR / PEG-modified liposomes RLTR labeled with rhodamine according to the method described in Example 1 (2) [2-1] and [2-5] and having a modification ratio of 5 mol% RLTR peptide / PEG modified liposome and control liposome B were prepared and administered to mice by the method described in Example 2 (1) [1-1], and the lungs were observed. The result is shown in FIG.
図２上図および図３に示すように、肝臓では、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合およびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合のいずれも、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）と同じ位置に観察され、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光が多数検出された。これに対し、コントロールリポソームＢを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）の周囲に斑点状に観察され、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光は少数であった。一方、図２下図に示すように、肺では、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）の周囲に細かい点状に観察された。また、コントロールリポソームＢを投与した場合、肝臓と同様に、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）の周囲に斑点状に観察された。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、肝臓血管皮細胞と同じ位置に検出され、かつ肺の血管内皮細胞と同じ位置に検出されなかったのに対し、コントロールリポソームＢは肝臓血管内皮細胞および肺の血管内皮細胞のいずれとも同じ位置にほとんど検出されなかった。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行することが明らかになった。 As shown in the upper diagram of FIG. 2 and FIG. 3, in the liver, the rhodamine fluorescence (red) is the fluorescence of Iselectin B4 (either red or red) when administered with KLGR / PEG-modified liposome or RLTR / PEG-modified liposome. A large number of yellow fluorescence was observed, which was observed at the same position as that of green) and showed an overlap between the fluorescence of rhodamine (red) and the fluorescence of Iselectin B4 (green). In contrast, when control liposome B was administered, rhodamine fluorescence (red) was observed in spots around the fluorescence of Iselectin B4 (green), and rhodamine fluorescence (red) and fluorescence of Iselectin B4 (green) There was a small amount of yellow fluorescence indicating duplication. On the other hand, as shown in the lower diagram of FIG. 2, in the lung, when KLGR / PEG-modified liposome was administered, the fluorescence (red) of rhodamine was observed in fine dots around the fluorescence (green) of Iselectin B4. When the control liposome B was administered, the rhodamine fluorescence (red) was observed in spots around the fluorescence of Iselectin B4 (green), as in the liver. That is, KLGR / PEG-modified liposomes and RLTR / PEG-modified liposomes were detected at the same position as liver vascular skin cells and were not detected at the same positions as lung vascular endothelial cells, whereas control liposome B was Little was detected at the same location as either endothelial cells or pulmonary vascular endothelial cells. This revealed that KLGR / PEG-modified liposomes and RLTR / PEG-modified liposomes selectively migrate to liver vascular endothelial cells.
（２）ｐＨ依存性カチオン性リポソームの肝臓での分布
実施例１（２）［２−３］〜［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、空ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームを用意した。ただし、混合脂質溶液の組成はＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３とした。これらのリポソームを、本実施例２（１）に記載の方法によりマウスに投与して肝臓を採取し、蛍光観察を行った。ただし、肝臓の採取は投与から３０分後に行った。その結果を図４に示す。
(2) Distribution of pH-dependent cationic liposome in liver Modification of empty YSK liposome and KLGR peptide labeled with rhodamine by the method described in Example 1 (2) [2-3] to [2-5] A KLGR / PEG-modified empty YSK liposome with a ratio of 5 mol% was prepared. However, the composition of the mixed lipid solution was YSK05: Chol: DMG-PEG2000 = 70: 30: 3. These liposomes were administered to mice by the method described in Example 2 (1), and livers were collected for fluorescence observation. However, the liver was collected 30 minutes after administration. The result is shown in FIG.
図４に示すように、空ＹＳＫリポソームを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）と同じ位置のみならず、Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）から、比較的離れた位置にも観察された。これに対し、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）は専らＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）と同じ位置に観察された。すなわち、空ＹＳＫリポソームは肝臓血管内皮細胞と同じ位置のみならず肝実質細胞に相当する位置にも検出されたのに対し、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームは専ら肝臓血管皮細胞と同じ位置のみで検出された。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームは肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行することが明らかになった。 As shown in FIG. 4, when empty YSK liposomes were administered, the fluorescence of rhodamine (red) was not only the same position as the fluorescence of Iselectin B4 (green) but also a position relatively distant from the fluorescence of Iselectin B4 (green) Also observed. In contrast, when KLGR / PEG-modified empty YSK liposomes were administered, the rhodamine fluorescence (red) was observed exclusively at the same position as the fluorescence of Iselectin B4 (green). That is, empty YSK liposomes were detected not only at the same position as liver vascular endothelial cells but also at positions corresponding to liver parenchymal cells, whereas KLGR / PEG-modified empty YSK liposomes were exclusively found at the same positions as liver vascular skin cells. was detected. This revealed that KLGR / PEG-modified empty YSK liposomes selectively migrate to liver vascular endothelial cells.
（３）競合阻害の効果
［３−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−１］に記載の方法により、ローダミンで標識していない、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意し、それぞれ非標識ＫＬＧＲペプチドＬＰおよび非標識コントロールＬＰとした。また、実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意し、これを標識ＫＬＧＲペプチドＬＰとした。４〜５週齢のＩＣＲマウスを３匹用意し、マウスａ、ｂおよびｃとした。本実施例２（１）に記載の方法により、これらのマウスに標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを投与して肝臓を採取し、蛍光観察を行った。ただし、標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを投与する１５分前に、マウスｂには非標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを、マウスｃには非標識コントロールＬＰを、それぞれ８．２５ｎｍｏｌ／μＬの脂質濃度で含むＫｒｅｂｓ緩衝液を４００μＬずつ前投与した。その結果を図５に示す。
(3) Effect of competitive inhibition [3-1] When KLGR / PEG-modified liposome is administered By the method described in Example 1 (2) [2-1], the modification ratio of KLGR peptide not labeled with rhodamine Prepared 5 mol% of KLGR / PEG-modified liposome and control liposome B, which were designated as unlabeled KLGR peptide LP and unlabeled control LP, respectively. In addition, by the method described in Example 1 (2) [2-1] and [2-5], KLGR / PEG-modified liposomes labeled with rhodamine and having a KLGR peptide modification ratio of 5 mol% were prepared. This was labeled KLGR peptide LP. Three 4 to 5 week-old ICR mice were prepared and designated as mice a, b and c. According to the method described in Example 2 (1), the labeled KLGR peptide LP was administered to these mice, the liver was collected, and fluorescence observation was performed. However, 15 minutes before administration of labeled KLGR peptide LP, mouse b contains unlabeled KLGR peptide LP, mouse c contains unlabeled control LP, and Krebs buffer containing a lipid concentration of 8.25 nmol / μL, respectively. 400 μL each was pre-administered. The result is shown in FIG.
［３−２］ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−１］に記載の方法により、ローダミンで標識していない、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意し、それぞれ非標識ＲＬＴＲペプチドＬＰおよび非標識コントロールＬＰとした。また、実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意し、これを標識ＲＬＴＲペプチドＬＰとした。これらのリポソームを、本実施例２（３）［３−１］に記載の方法によりマウスに投与して肝臓を観察した。その結果を図６に示す。
[3-2] When RLTR / PEG-modified liposome is administered According to the method described in Example 1 (2) [2-1], the RLTR / PEG modified ratio of the RLTR peptide not labeled with rhodamine is 5 mol%. Modified liposomes and control liposomes B were prepared and used as unlabeled RLTR peptide LP and unlabeled control LP, respectively. In addition, by the method described in Example 1 (2) [2-1] and [2-5], RLTR / PEG-modified liposomes labeled with rhodamine and having a RLTR peptide modification ratio of 5 mol% were prepared. This was labeled RLTR peptide LP. These liposomes were administered to mice by the method described in Example 2 (3) [3-1], and the liver was observed. The result is shown in FIG.
図５および図６に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームのいずれを投与した場合も、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光は、マウスａと比較して、マウスｂでは顕著に減少したのに対し、マウスｃではほぼ同等であった。すなわち、肝臓血管内皮細胞と同じ位置に検出された標識ＫＬＧＲペプチドＬＰおよび標識ＲＬＴＲペプチドＬＰの量は、非標識コントロールＬＰの前投与によっては減少しなかったのに対し、非標識ＫＬＧＲペプチドＬＰおよび非標識ＲＬＴＲペプチドＬＰの前投与によって、顕著に減少した。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行することが明らかになった。 As shown in FIG. 5 and FIG. 6, when either KLGR / PEG-modified liposome or RLTR / PEG-modified liposome was administered, the yellow color indicating the overlap between the fluorescence of rhodamine (red) and the fluorescence of Iselectin B4 (green) Fluorescence was significantly reduced in mouse b as compared to mouse a, but almost equivalent in mouse c. That is, the amount of labeled KLGR peptide LP and labeled RLTR peptide LP detected at the same position as liver vascular endothelial cells was not decreased by pre-administration of unlabeled control LP, whereas unlabeled KLGR peptide LP and non-labeled RLGR peptide LP It was significantly reduced by pre-administration of labeled RLTR peptide LP. This revealed that KLGR / PEG-modified liposomes and RLTR / PEG-modified liposomes selectively migrate to liver vascular endothelial cells.
（４）各組織におけるリポソームの濃度
［４−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−６］に記載の方法により、３Ｈで標識したコントロールリポソームＡおよびＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意した。ＩＣＲマウスを４匹ずつ２群に分け、一方の群にはコントロールリポソームＡを、他方の群にはＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを、それぞれ本実施例２（１）に記載の方法により尾静脈内投与した。投与から２５分後に解剖して、肝臓、肺、脾臓、腎臓および血液を採取し、重量を測定した。その後、各サンプルをソルエン３５０（パーキンエルマージャパン社）中で５０℃にて５時間インキュベートすることにより溶解した。続いて、血液については、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処理することにより脱色した。その後、各サンプルに１０ｍＬのＨｉｏｎｉｃ Ｆｌｏｕｒ（パーキンエルマージャパン社）を加え、液体シンチレーションカウンターを用いて３Ｈの放射線測定を行った。重量および放射線の測定結果に基づき、各サンプルの放射線濃度を算出し、投与量に対する百分率（％ＩＤ）で表して、群毎に平均値および標準偏差を算出した。その結果を図７に示す。
(4) Concentration of liposome in each tissue [4-1] KLGR / PEG-modified liposome administered In accordance with the method described in Example 1 (2) [2-6], control liposome A and KLGR labeled with 3 H A KLGR / PEG-modified liposome having a peptide modification ratio of 5 mol% was prepared. ICR mice were divided into 2 groups of 4 mice, and control liposome A was administered to one group, and KLGR / PEG-modified liposomes were administered to the other group via the tail vein according to the method described in Example 2 (1). did. Dissected 25 minutes after administration, liver, lung, spleen, kidney and blood were collected and weighed. Then, each sample was dissolved by incubating at 50 ° C. for 5 hours in Solen 350 (Perkin Elmer Japan). Subsequently, the blood was decolorized by treatment with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). Thereafter, 10 mL of Honic Floor (Perkin Elmer Japan) was added to each sample, and 3 H radiation measurement was performed using a liquid scintillation counter. Based on the measurement results of weight and radiation, the radiation concentration of each sample was calculated, expressed as a percentage (% ID) to the dose, and the average value and standard deviation were calculated for each group. The result is shown in FIG.
図７に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した群では、肝臓における％ＩＤが最も大きく、次いで、血液における％ＩＤが大きく、肺、脾臓および腎臓における％ＩＤは小さかった。これに対し、コントロールリポソームＡを投与した群では、血液における％ＩＤが最も大きく、次いで、肝臓における％ＩＤが大きく、肺、脾臓および腎臓における％ＩＤは小さかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、静脈内投与した後、投与量の大部分が速やかに肝臓に集積した。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは肝臓血管内皮細胞へ効率的に移行することが明らかになった。 As shown in FIG. 7, in the group to which KLGR / PEG-modified liposome was administered, the% ID in the liver was the largest, the% ID in the blood was then large, and the% ID in the lung, spleen and kidney was small. In contrast, in the group to which control liposome A was administered, the% ID in the blood was the largest, followed by the% ID in the liver, and the% ID in the lung, spleen and kidney were small. That is, most of the dose of KLGR / PEG-modified liposome was rapidly accumulated in the liver after intravenous administration. This revealed that KLGR / PEG-modified liposomes migrate efficiently to liver vascular endothelial cells.
［４−２］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−６］に記載の方法により、３Ｈで標識したコントロールリポソームＡ、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意した。これらのリポソームを本実施例（４）［４−１］に記載の方法によりマウスに投与し、肝臓、肺および脾臓における３Ｈの放射線測定を行った。また、測定結果について、コントロールリポソームＡの場合に対して、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により有意差検定を行った。その結果を図８に示す。
[4-2] When KLGR / PEG-modified liposome and RLTR / PEG-modified liposome are administered Modification of control liposome A labeled with 3 H and KLGR peptide by the method described in Example 1 (2) [2-6] A KLGR / PEG-modified liposome having a ratio of 5 mol% and a RLTR / PEG-modified liposome having a modification ratio of RLTR peptide of 5 mol% were prepared. These liposomes were administered to mice by the method described in Example (4) [4-1], and 3 H radiation measurement was performed in the liver, lung and spleen. Moreover, about the measurement result, with respect to the case of control liposome A, the significant difference test was performed by one-way ANOVA and Dunnett's test. The result is shown in FIG.
図８に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した群およびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した群では、コントロールリポソームＡを投与した群と比較して、肝臓における％ＩＤが顕著に大きかった。これに対して、肺および脾臓における％ＩＤは、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＡを投与した群のいずれにおいても同等に小さかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、静脈内投与した後、投与量の大部分が速やかに肝臓に集積した。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは肝臓血管内皮細胞へ効率的かつ選択的に移行することが明らかになった。 As shown in FIG. 8, in the group administered with KLGR / PEG-modified liposome and the group administered with RLTR / PEG-modified liposome,% ID in the liver was remarkably larger than that in the group administered with control liposome A. In contrast, the% ID in the lung and spleen was equally small in any of the groups administered KLGR / PEG modified liposome, RLTR / PEG modified liposome and control liposome A. That is, most of the dose of KLGR / PEG-modified liposome and RLTR / PEG-modified liposome was rapidly accumulated in the liver after intravenous administration. This revealed that KLGR / PEG-modified liposomes and RLTR / PEG-modified liposomes migrate efficiently and selectively to liver vascular endothelial cells.
以上の本実施例２（１）〜（４）の結果から、ＫＬＧＲペプチドおよびＲＬＴＲペプチドは、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強すること、ならびにＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体およびＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体であることが示された。 From the results of the above Examples 2 (1) to (4), the KLGR peptide and the RLTR peptide impart and / or enhance the ability of the lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells, and KLGR. Lipid membrane structures containing lipids bound to peptides as constituent lipids and lipid membrane structures containing lipids bound to RLTR peptides as constituent lipids have the ability to migrate to liver vascular endothelial cells or migrate to liver vascular endothelial cells It was shown to be a lipid membrane structure with enhanced performance.
＜実施例３＞リポソームの細胞内取り込み
（１）肝臓血管内皮初代培養細胞の単離
肝臓血管内皮初代培養細胞を既報（Ｋ．Ｈｉｄａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６４巻、第８２４９〜８２５５頁、２００４年；Ａｋｉｎｏ Ｔ.ら、ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、第１７５巻、第６号、第２６５７〜２６６７頁、２００９年；Ｏｈｇａ Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．ら、第１００巻、第１０号、第１９６３〜１９７０頁、２００９年）に従い単離した。具体的には、まず、雌性ＫＳＮヌードマウスから肝臓を摘出して、ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）溶液に加え、その溶液中でハサミを用いて肝臓を細かく切断し、細胞懸濁液とした。細胞懸濁液と同量のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いて１段階のスクロース密度勾配遠心分離を行って血球細胞を除去し、得られた細胞懸濁液を濾過した。続いて、ＣＤ３１マイクロビーズキット（ＭＡＣＳ；ミルテニーバイオテック社）およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３１抗体を用いて、添付の使用書に従い、ＣＤ３１陽性の内皮細胞を回収した。回収した細胞は１．５％のゼラチン(ＳＩＧＭＡ社)を含有するＰＢＳでコーティングした培養皿に播き、これを肝臓血管内皮初代培養細胞とした。肝臓血管内皮初代培養細胞の培養は、１０％（ｖ／ｖ）となるよう仔ウシ血清を添加した、血管内皮細胞専用培地であるＥＧＭ−２ＭＶ(Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社)を用いて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。
<Example 3> Intracellular incorporation of liposomes (1) Isolation of primary cultured cells of liver vascular endothelium Primary cultured cells of hepatic vascular endothelium have been reported (K. Hida et al., Cancer Res., Vol. 64, pages 8249-8255, 2004; Akino T. et al., AM J Pathol., 175, No. 6, pp. 2657-2667, 2009; Ohga N. et al., Cancer Sci. Et al., 100, No. 10, 1963-1970 (2009). Specifically, first, a liver was extracted from a female KSN nude mouse, added to a type II collagenase (Worthington) solution, and the liver was finely cut with scissors in the solution to obtain a cell suspension. One step of sucrose density gradient centrifugation was performed using Histopaque-1077 (SIGMA ALDRICH) in the same amount as the cell suspension to remove blood cells, and the resulting cell suspension was filtered. Subsequently, CD31-positive endothelial cells were recovered using a CD31 microbead kit (MACS; Miltenyi Biotech) and a FITC-labeled anti-CD31 antibody according to the attached instructions. The collected cells were seeded on a culture dish coated with PBS containing 1.5% gelatin (SIGMA), and used as primary cultured cells for liver vascular endothelium. The primary culture cells of liver vascular endothelium were cultured at 37 ° C., 5% using EGM-2MV (Clonetics), which is a special medium for vascular endothelial cells, supplemented with calf serum to 10% (v / v). Performed in a CO 2 atmosphere.
（２）リポソームの細胞内取り込み量
［２−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの細胞内取り込み量
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、コントロールリポソームＡ、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１〜１５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧの修飾割合が１〜１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾リポソームを用意した。本実施例３（１）の肝臓血管内皮初代培養細胞を２４ウェルプレートに４×１０４個／ウェルで播種して２４時間培養した後、ＰＢＳ（−）でウェルを洗浄した。次に、各リポソームをウェル２個ずつに添加した。添加量は２５ｎｍｏｌ（脂質量）／ウェルとした。３７℃で３時間インキュベートすることによりリポソームを細胞に取り込ませた後、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。続いて、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１ウェルにつき７５ｕＬ添加して、−８０℃で２０分間以上静置した後、解凍することにより細胞を溶解した。セルスクレーパーを用いて溶解した細胞を回収し、４℃、１５００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離を行った。上清５０μＬを回収して、励起波長５５０ｎｍおよび蛍光波長５９０ｎｍでローダミンの蛍光強度を測定した。以上の実験を３回行い、取り込ませたリポソームの種類毎に、３回の実験の測定結果の平均値および標準偏差を算出した。また、平均値について、コントロールリポソームＡの場合に対して、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により有意差検定を行った。その結果を図９に示す。
(2) Intracellular uptake of liposome [2-1] Intracellular uptake of KLGR / PEG-modified liposome Labeled with rhodamine by the method described in Example 1 (2) [2-1] and [2-5] Control liposome A, a KLGR / PEG-modified liposome having a modification ratio of KLGR peptide of 1 to 15 mol%, and a PEG-modified liposome having a modification ratio of PEG of 1 to 15 mol% were prepared. The primary cultured cells of hepatic vascular endothelium of Example 3 (1) were seeded in a 24-well plate at 4 × 10 4 cells / well and cultured for 24 hours, and then the wells were washed with PBS (−). Next, each liposome was added to two wells. The addition amount was 25 nmol (lipid amount) / well. Liposomes were taken up into the cells by incubating at 37 ° C. for 3 hours, and then the cells were washed with PBS. Subsequently, Reporter Lysis Buffer (Promega) was added at 75 uL per well, allowed to stand at −80 ° C. for 20 minutes or more, and then thawed to lyse the cells. The lysed cells were collected using a cell scraper and centrifuged at 4 ° C. and 1500 rpm for 5 minutes. 50 μL of the supernatant was recovered, and the fluorescence intensity of rhodamine was measured at an excitation wavelength of 550 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm. The above experiment was performed three times, and the average value and standard deviation of the measurement results of the three experiments were calculated for each type of liposome incorporated. Moreover, about the average value, with respect to the case of control liposome A, the significant difference test was performed by one-way ANOVA and Dunnett's test. The result is shown in FIG.
図９に示すように、蛍光強度は、ＰＥＧ修飾リポソームでは、コントロールリポソームＡと比較して、ＰＥＧの修飾割合に関わらずほぼ同等であった。これに対して、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームでは、コントロールリポソームＡと比較して、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１ｍｏｌ％の場合に大きい傾向であり、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５、１０および１５ｍｏｌ％の場合に有意に大きかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれる量が多かった。 As shown in FIG. 9, the fluorescence intensity of the PEG-modified liposome was almost the same as that of the control liposome A regardless of the modification ratio of PEG. In contrast, in the KLGR / PEG-modified liposome, compared with the control liposome A, the modification ratio of the KLGR peptide tends to be large when the modification ratio of KLGR peptide is 5, 10 and 15 mol%. Was significantly larger. That is, the amount of KLGR / PEG-modified liposome incorporated into the primary cultured cells of liver vascular endothelium was larger than that of control liposome A and PEG-modified liposome.
また、蛍光強度を、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合の間で比較すると、５ｍｏｌ％＞１０ｍｏｌ％＞１５ｍｏｌ％＞１ｍｏｌ％の順であった。すなわち、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下の場合に、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれるＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの量が特に多かった。 Moreover, when the fluorescence intensity was compared among the modification ratios of the KLGR peptide, the order was 5 mol%> 10 mol%> 15 mol%> 1 mol%. That is, when the modification ratio of the KLGR peptide was 1 mol% or more and 10 mol% or less, the amount of the KLGR / PEG-modified liposome incorporated into the primary cultured cells of liver vascular endothelium was particularly large.
［２−２］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの細胞内取り込み量
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、コントロールリポソームＡ、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１〜１０ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が１〜１０ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧの修飾割合が１〜１０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾リポソームを用意した。本実施例３（２）［２−１］に記載の方法により、これらのリポソームを肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込ませて蛍光強度を測定した。その結果を図１０に示す。
[2-2] Intracellular uptake of KLGR / PEG-modified liposome and RLTR / PEG-modified liposome Example 1 (2) Control labeled with rhodamine according to the method described in [2-1] and [2-5] Liposomes A, KLGR / PEG-modified liposomes with KLGR peptide modification rate of 1-10 mol%, RLTR / PEG-modified liposomes with RLTR peptide modification rate of 1-10 mol%, and PEG modification with PEG modification rate of 1-10 mol% Liposomes were prepared. By the method described in Example 3 (2) [2-1], these liposomes were incorporated into primary cultured cells of liver vascular endothelium, and the fluorescence intensity was measured. The result is shown in FIG.
図１０に示すように、ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた場合の蛍光強度は、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた場合と同様であった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれる量が多かった。また、蛍光強度を、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合の間で比較すると、３ｍｏｌ％＞５ｍｏｌ％＞１ｍｏｌ％≒１０ｍｏｌ％の順であったことから、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が１ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下の場合に、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれるＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの量が特に多かった。 As shown in FIG. 10, the fluorescence intensity when the RLTR / PEG-modified liposome was incorporated was the same as that when the KLGR / PEG-modified liposome was incorporated. That is, the amount of KLGR / PEG-modified liposome and RLTR / PEG-modified liposome incorporated into the primary cultured cells of liver vascular endothelium was larger than that of control liposome A and PEG-modified liposome. In addition, when the fluorescence intensity was compared between the modification ratios of the RLTR peptide, it was in the order of 3 mol%> 5 mol%> 1 mol% ≈10 mol%, so the modification ratio of the RLTR peptide was 1 mol% or more and 10 mol% or less. In particular, the amount of RLTR / PEG-modified liposomes taken into the liver vascular endothelial primary cultured cells was particularly large.
（３）競合阻害の効果
［３−１］リポソームによる競合阻害
実施例１（２）［２−１］に記載の方法により、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢであって、それぞれローダミンで標識しないもの（以下、これらを「非標識リポソーム」という。）を用意した。また、実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢであって、それぞれローダミンで標識したもの（以下、これらを「標識リポソーム」という。）を用意した。本実施例３（２）に記載の方法により、標識リポソームを肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込ませて蛍光強度を測定した。ただし、標識リポソームをウェルに添加するのに先立ち、非標識リポソームを添加して３７℃で１時間インキュベートし、その後標識リポソーム２５ｎｍｏｌ／ウェル添加してさらに３７℃で３時間インキュベートした。また、非標識リポソームの添加量は標識リポソームの０倍（添加しない）、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍および５０倍量とした。以下、これらのサンプルを標識：非標識＝１：０、１：２．５、１：５、１：１０、１：２０および１：５０という。また、標識：非標識＝１：２．５、１：５、１：１０、１：２０および１：５０の蛍光強度の測定結果について、標識：非標識＝１：０の場合に対して、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により有意差検定を行った。その結果を図１１に示す。
(3) Effect of competitive inhibition [3-1] Competitive inhibition by liposome According to the method described in Example 1 (2) [2-1], a KLGR / PEG-modified liposome and RLTR peptide with a KLGR peptide modification ratio of 5 mol% RLTR / PEG-modified liposomes and control liposomes B having a modification ratio of 5 mol%, which are not labeled with rhodamine (hereinafter referred to as “unlabeled liposomes”), were prepared. In addition, according to the method described in Example 1 (2) [2-1] and [2-5], the KLGR / PEG-modified liposome having a KLGR peptide modification ratio of 5 mol% and the RLTR peptide modification ratio of 5 mol% RLTR / PEG-modified liposome and control liposome B, each labeled with rhodamine (hereinafter referred to as “labeled liposome”) were prepared. By the method described in Example 3 (2), the labeled liposome was incorporated into primary cultured cells of liver vascular endothelium, and the fluorescence intensity was measured. However, prior to adding labeled liposomes to wells, unlabeled liposomes were added and incubated at 37 ° C. for 1 hour, after which 25 nmol / well of labeled liposomes were added and further incubated at 37 ° C. for 3 hours. The amount of unlabeled liposome added was 0 times (not added), 2.5 times, 5 times, 10 times, 20 times, and 50 times that of labeled liposomes. Hereinafter, these samples are referred to as labeled: unlabeled = 1: 0, 1: 2.5, 1: 5, 1:10, 1:20 and 1:50. In addition, with respect to the measurement results of fluorescence intensity of label: unlabeled = 1: 2.5, 1: 5, 1:10, 1:20 and 1:50, Significant difference test was performed by one-way ANOVA, Dunnett test. The result is shown in FIG.
図１１に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームでは、標識：非標識＝１：０と比較して、標識：非標識＝１：２．５、１：５、１：１０、１：２０および１：５０において、蛍光強度が有意に小さかった。これに対し、コントロールリポソームＢでは、標識：非標識＝１：０と比較して、標識：非標識＝１：２．５、１：５および１：１０では蛍光強度がほぼ同等であり、標識：非標識＝１：２０および１：５０では有意に小さかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの場合、先行添加したリポソームの量に関わらず蛍光強度が顕著に減少したのに対し、コントロールリポソームＢの場合、先行添加したリポソームの量が一定以下では、蛍光強度が減少しなかった。このことから、コントロールリポソームＢはランダムに肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれるのに対し、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは選択的に肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれることが明らかになった。 As shown in FIG. 11, in the KLGR / PEG modified liposome and the RLTR / PEG modified liposome, the label: unlabeled = 1: 2.5, 1: 5, 1: compared with the label: unlabeled = 1: 0. At 10, 1:20 and 1:50, the fluorescence intensity was significantly lower. On the other hand, in the case of the control liposome B, the fluorescence intensity is almost the same in the label: unlabeled = 1: 2.5, 1: 5 and 1:10 as compared with the label: unlabeled = 1: 0. : Significantly smaller at unlabeled = 1: 20 and 1:50. That is, in the case of the KLGR / PEG modified liposome and the RLTR / PEG modified liposome, the fluorescence intensity was remarkably reduced regardless of the amount of the liposome added in advance, whereas in the case of the control liposome B, the amount of the liposome added in advance was constant. In the following, the fluorescence intensity did not decrease. From this, it is clear that the control liposome B is randomly taken into the liver vascular endothelial primary cultured cells, whereas the KLGR / PEG modified liposome and the RLTR / PEG modified liposome are selectively taken into the liver vascular endothelial primary cultured cells. Became.
さらに、標識：非標識＝１：０について、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームとコントロールリポソームＢとで蛍光強度を比較すると、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの方が顕著に大きかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、コントロールリポソームＢと比較して、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれる量が多かった。 Further, when the fluorescence intensity is compared between the KLGR / PEG-modified liposome and the RLTR / PEG-modified liposome and the control liposome B with respect to the label: unlabeled = 1: 0, the KLGR / PEG-modified liposome and the RLTR / PEG-modified liposome are more prominent. It was big. That is, the amount of KLGR / PEG-modified liposome and RLTR / PEG-modified liposome taken into the liver vascular endothelial primary cultured cells was larger than that of control liposome B.
［３−２］ペプチドによる競合阻害
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意し、本実施例３（２）に記載の方法により、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込ませて蛍光強度を測定した。ただし、リポソームをウェルに添加するのに先立ち、ＫＬＧＲペプチドを０（添加しない）、１２５μｍｏｌ／Ｌおよび６２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加して、３７℃で１時間インキュベートし、その後、リポソームを２５ｎｍｏｌ／ウェルとなるよう添加してさらに３７℃で３時間インキュベートした。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＫＬＧＲペプチドの添加量が１２５および６２５μｍｏｌ／Ｌのいずれの場合も、ＫＬＧＲペプチドを添加しない場合と比較して、蛍光強度はほぼ同等であった。すなわち、リポソームの構成脂質と結合していないＫＬＧＲペプチドは肝臓血管内皮初代培養細胞にほとんど取り込まれないため、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの取り込み量に影響を与えないことが明らかになった。
[3-2] Competitive inhibition by peptide Modification of KLGR / PEG modified with rhodamine and modified with 5 mol% of KLGR peptide by the method described in Example 1 (2) [2-1] and [2-5] Liposomes were prepared and incorporated into primary cultured liver vascular endothelial cells by the method described in Example 3 (2), and the fluorescence intensity was measured. However, prior to adding liposomes to wells, KLGR peptide was added to 0 (not added), 125 μmol / L and 625 μmol / L and incubated at 37 ° C. for 1 hour, after which liposomes were added at 25 nmol / well. And further incubated at 37 ° C. for 3 hours. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 12, the fluorescence intensity was almost the same in both cases where the addition amount of KLGR peptide was 125 and 625 μmol / L, compared with the case where KLGR peptide was not added. That is, it has been clarified that the KLGR peptide that is not bound to the constituent lipids of the liposome is hardly taken into the primary cultured cells of the liver vascular endothelium, and thus does not affect the uptake amount of the KLGR / PEG-modified liposome.
以上の本実施例３（２）〜（３）［３−２］の結果から、ＫＬＧＲペプチドおよびＲＬＴＲペプチドは、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強すること、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体およびＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体であること、ならびに、他の構成脂質総量に対して、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドと結合した脂質の割合Ｐが１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％である場合、脂質膜構造体は、より効率的に肝臓血管内皮細胞に移行することが示された。 From the results of the above Examples 3 (2) to (3) [3-2], the KLGR peptide and the RLTR peptide impart and / or enhance the ability of the lipid membrane structure to migrate to liver vascular endothelial cells. A lipid membrane structure containing a lipid bound to the KLGR peptide as a constituent lipid and a lipid membrane structure containing a lipid bound to the RLTR peptide as a constituent lipid have a translocation ability to a liver vascular endothelial cell or a liver vascular endothelium It is a lipid membrane structure with enhanced ability to migrate to cells, and the ratio P of lipid bound to KLGR peptide or RLTR peptide is 1 mol% ≦ P ≦ 10 mol% relative to the total amount of other constituent lipids In some cases, lipid membrane structures have been shown to migrate to liver vascular endothelial cells more efficiently.
（４）内包物送達効率
［４−１］ＰＥＧを介してＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含むリポソーム
実施例１（２）［２−２］および［２−４］に記載の方法により、Ｆ７内包ＹＳＫリポソーム、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソーム、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを用意した。ただし、混合脂質溶液の組成はＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３とした。４週齢の雄性ＩＣＲマウスを２〜３匹ずつ６群に分け、そのうち２群は何も投与せず、コントロール（Ｆ７）群およびコントロール（Ｔｉｅ２）群とした。残りの４群に、各リポソームを１ｍｇ（ｓｉＲＮＡ量）／ｋｇの投与量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に肝臓を採取した。また、コントロール（Ｆ７）群およびコントロール（Ｔｉｅ２）群からも肝臓を採取した。採取した肝臓２０ｍｇをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)１ｍＬに加えて、Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ−１００Ｒ（ＴＯＭＹ社）を用いて破砕した。続いて、クロロホルム２００μＬを加えてボルテックスした後、室温に３分間静置した。４℃、１２０００ｇの条件下で１５分間遠心分離を行って水層を回収し、５００μＬのイソプロパノールを加えた。次いで、同条件で遠心分離を行い、上清を除去した。ペレットに４℃の７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍＬを加えてボルテックスした後、同条件で再度遠心分離を行って、上清を除去した。室温で２０分間風乾した後、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅの水を加えてペレットを溶解し、肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡを含む溶液とした。肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。次に、１μｇの肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。続いて、ｃＤＮＡを鋳型として下記条件によりリアルタイムＰＣＲを行って、Ｆ７遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の発現量を測定した。発現量は比較Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）法により、βアクチン（Ａｃｔｂ）遺伝子の発現量に対する相対値として表し、群ごとに平均値および標準偏差を求めた。続いて、Ｆ７遺伝子についてはコントロール（Ｆ７）群の、Ｔｉｅ２遺伝子についてはコントロール（Ｔｉｅ２）群の平均値をそれぞれ１として、各群の平均値を相対発現量として表した。その結果を図１３に示す。
(4) Inclusion delivery efficiency [4-1] Liposomes containing lipids bound to the KLGR peptide via PEG as constituent lipids According to the method described in Example 1 (2) [2-2] and [2-4] F7-encapsulated YSK liposomes, Tie2-encapsulated YSK liposomes, and KLGR / PEG-modified F7-encapsulated YSK liposomes and KLGR / PEG-modified Tie2-encapsulated YSK liposomes with a KLGR peptide modification ratio of 5 mol% were prepared. However, the composition of the mixed lipid solution was YSK05: Chol: DMG-PEG2000 = 70: 30: 3. Four-week-old male ICR mice were divided into 6 groups of 2 to 3 mice, of which 2 groups were not administered and were used as a control (F7) group and a control (Tie2) group. In the remaining 4 groups, each liposome was administered into the tail vein at a dose of 1 mg (siRNA amount) / kg, and the liver was collected 24 hours after the administration. Livers were also collected from the control (F7) group and the control (Tie2) group. The collected liver (20 mg) was added to 1 mL of Trizol reagent (Invitrogen) and crushed using Micro Smash MS-100R (TOMY). Subsequently, 200 μL of chloroform was added and vortexed, and then allowed to stand at room temperature for 3 minutes. Centrifugation was performed at 4 ° C. and 12,000 g for 15 minutes to recover the aqueous layer, and 500 μL of isopropanol was added. Subsequently, centrifugation was performed under the same conditions, and the supernatant was removed. The pellet was added with 1 mL of 70% (v / v) ethanol at 4 ° C. and vortexed, and then centrifuged again under the same conditions to remove the supernatant. After air-drying at room temperature for 20 minutes, RNase Free water was added to dissolve the pellet to obtain a solution containing liver total RNA. The concentration of liver total RNA was measured using NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Next, cDNA was prepared using 1 μg of liver total RNA as a template and using High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems) to obtain a solution containing cDNA. Subsequently, real-time PCR was performed using cDNA as a template under the following conditions, and the expression levels of the F7 gene and the Tie2 gene were measured. The expression level was expressed as a relative value with respect to the expression level of β-actin (Actb) gene by the comparative Threshold Cycle (Ct) method, and an average value and a standard deviation were obtained for each group. Subsequently, the average value of the control (F7) group for the F7 gene and the average value of the control (Tie2) group for the Tie2 gene were set to 1, and the average value of each group was expressed as a relative expression level. The result is shown in FIG.
リアルタイムＰＣＲの条件
反応液の組成；１０倍希釈したｃＤＮＡを含む溶液１２μＬ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＱＰＫ−２０１(ＴＯＹＯＢＯ社)１２．５μＬ、２０μｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマー（ＦＰ）溶液０．２５μＬ、２０μｍｏｌ／Ｌのリバースプライマー（ＲＰ）溶液０．２５μＬ（計２５μＬ）
ＰＣＲ反応システム；Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＱＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）
反応サイクル；９５℃１０分を１サイクル、続いて９５℃１５秒および６０℃１分を１サイクルとして４０サイクル
プライマー；Ｆ７遺伝子 ＦＰ：５’−ＴＣＧＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号１８）、Ｆ７遺伝子 ＲＰ：５’−ＣＣＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＣＴＡＧＧＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１９）、Ｔｉｅ２遺伝子 ＦＰ：５’−ＡＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡ−３’（配列番号２０）、Ｔｉｅ２遺伝子 ＲＰ：５’−ＣＴＴＣＣＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴ−３’（配列番号２１）、Ａｃｔｂ遺伝子 ＦＰ：５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号２２）、Ａｃｔｂ遺伝子 ＲＰ：５’−ＡＣＡＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡ−３’（配列番号２３）
Composition of reaction solution for real-time PCR; 12 μL of solution containing 10-fold diluted cDNA, SYBER Green Realtime PCR Master Mix QPK-201 (TOYOBO) 12.5 μL, 0.25 μL of 20 μmol / L forward primer (FP) solution, 0.25 μL of 20 μmol / L reverse primer (RP) solution (25 μL in total)
PCR reaction system; Mx3005P Real-time QPCR system (Agilent)
Reaction cycle; 40 cycles primer at 95 ° C. for 10 minutes for 1 cycle, followed by 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute; F7 gene FP: 5′-TCGAATCCATGTCAGAACGGAGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 18), F7 gene RP : 5'-CCGACCCTCAAAGTCTAGGAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 19), Tie2 gene FP: 5'-AGTGCTGGAGGAGAGAAGCCTTATGA-3' (SEQ ID NO: 20), Tie2 gene RP: 5'-CTCTCGTTCTCTCCAGCTCCTGTTT-3 '(cSEQ ID t21) FP: 5′-GAAGGAGATTACTGCCTCTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 22), Actb gene RP: 5′-ACACAGAGACTACTTGCGCTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 2) )
図１３に示すように、Ｆ７遺伝子の発現量は、コントロール群と比較して、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームを投与した群では小さかったのに対して、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームを投与した群では同等であった。これに対し、Ｔｉｅ２遺伝子の発現量は、コントロール群と比較して、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群およびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群のいずれにおいても小さかった。すなわち、リポソームがその内包物を細胞内へ送達して、細胞内で内包物の機能を発揮させる効率は、ＹＳＫリポソームでは、肝実質細胞および肝臓血管内皮細胞のいずれに対しても同等であったのに対し、ＫＬＧＲペプチドを修飾したＹＳＫリポソームでは、肝実質細胞に対しては小さく、肝臓血管内皮細胞に対しては大きかった。この結果から、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、選択的に肝臓血管内皮細胞へ移行して、内包物を送達できることが示された。 As shown in FIG. 13, the expression level of the F7 gene was smaller in the group administered with the F7-encapsulated YSK liposome than in the control group, whereas in the group administered with the KLGR / PEG-modified F7-encapsulated YSK liposome. It was equivalent. In contrast, the expression level of the Tie2 gene was smaller in both the group administered with the TIE2-encapsulated YSK liposome and the group administered with the KLGR / PEG-modified Tie2-encapsulated YSK liposome compared with the control group. That is, the efficiency with which the liposome delivers its inclusion into the cell and exerts the function of the inclusion within the cell was the same for both hepatocytes and liver vascular endothelial cells in the YSK liposome. In contrast, YSK liposomes modified with the KLGR peptide were small for liver parenchymal cells and large for liver vascular endothelial cells. From this result, it was shown that a lipid membrane structure containing a lipid bound to a KLGR peptide as a constituent lipid can selectively migrate to liver vascular endothelial cells and deliver inclusions.
［４−２］ＰＥＧを介さずにＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含むリポソーム
実施例１（２）［２−２］および［２−４］に記載の方法により、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソーム、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１〜７ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを用意した。ただし、混合脂質溶液の組成はＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３とした。週齢の雄性ＩＣＲマウスを４匹ずつ１０群に分け、本実施例３（４）［４−１］に記載の方法により、これらのリポソームをマウスに投与して、肝臓におけるＴｉｅ２遺伝子の発現量を測定した。その結果を図１４に示す。
[4-2] Liposomes containing lipids bound to KLGR peptides without PEG as constituent lipids In accordance with the method described in Example 1 (2) [2-2] and [2-4], TIE2-encapsulated YSK liposomes, In addition, KLGR / PEG-modified Tie2-encapsulated YSK liposomes and KLGR-modified Tie2-encapsulated YSK liposomes having a modification ratio of KLGR peptide of 1 to 7 mol% were prepared. However, the composition of the mixed lipid solution was YSK05: Chol: DMG-PEG2000 = 70: 30: 3. Weekly male ICR mice are divided into 10 groups of 4 mice, and these liposomes are administered to the mice by the method described in Example 3 (4) [4-1], and the expression level of Tie2 gene in the liver Was measured. The result is shown in FIG.
図１４に示すように、発現量は、コントロール群と比較して、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソーム、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群のいずれにおいても小さかった。この結果から、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、肝臓血管内皮細胞へ内包物を送達できることが示された。また、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１、３および５ｍｏｌ％では、コントロール群ならびにＴｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群と比較して、ＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群の発現量が特に小さかった。この結果から、ＰＥＧを介さずにＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、より効率的に肝臓血管内皮細胞へ移行して内包物を送達できることが示唆された。 As shown in FIG. 14, the expression level was small in all of the groups administered with the TIE2-encapsulated YSK liposome, the KLGR / PEG-modified Tie2-encapsulated YSK liposome, and the KLGR-modified Tie2-encapsulated YSK liposome as compared with the control group. From this result, it was shown that a lipid membrane structure containing a lipid bound to a KLGR peptide as a constituent lipid can deliver inclusions to liver vascular endothelial cells. In addition, when the modification ratio of the KLGR peptide was 1, 3 and 5 mol%, the SKGR-modified Tie2-encapsulated YSK liposome was administered as compared with the control group and the group administered with the TIE2-encapsulated YSK liposome and the KLGR / PEG-modified Tie2-encapsulated YSK liposome. The expression level of the group was particularly small. From these results, it was suggested that a lipid membrane structure containing a lipid bound to a KLGR peptide without using PEG as a constituent lipid can more efficiently migrate to liver vascular endothelial cells and deliver inclusions.
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