JPWO2005087784A1 - 電気化学的に活性な配列特異的二本鎖核酸分子検出用リガンド - Google Patents

電気化学的に活性な配列特異的二本鎖核酸分子検出用リガンド Download PDF

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Abstract

本発明の目的は、電気化学的検出における電気化学シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を低くすることが出来、その結果、検出感度（精度）を大きく向上させることができ、超微量の核酸分子の定量的測定を可能とする、二重鎖核酸分子の塩基配列に特異的に結合する化合物を提供することである。本発明は、一般式（Ｉ）で表されるフェロセン化合物：［化１］（Ｉ）（一般式（Ｉ）中、Ａは二価のフェロセン含有リンカー又はフェロセン−１，１’−イルであり、Ｒ２は水素原子又はアルキルを示し、ｎ及びｍは任意の自然数を示し、Ｖ及びＸの結合部分はピロール・イミダゾール・ポリアミド（ＰＩＰＡ）である）、該フェロセン化合物から成る電気化学的に活性な配列特異的二本鎖核酸分子検出用リガンド、該リガンドを使用する配列特異的二本鎖核酸分子検出方法、及び、該リガンドを含む電気化学的検出装置又は器具に係る。

Description

本発明は、配列特異的な二本鎖核酸分子検出用リガンドとして使用することが出来る、電気化学的に活性なフェロセン化合物等に関する。
ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）はスライドグラスやシリコン基盤上にＤＮＡ配列断片（プローブ）を高密度に並べたものの総称であり、近年開発された遺伝子の発現解析に用いられる分析ツールである。調整したＲＮＡ又はＤＮＡ試料（ターゲット）をハイブリダイズし、ハイブリダイズ形式の強度を指標にして、各遺伝子の転写量を測定するものである。又、このようなＤＮＡマイクロアレイは、１塩基多型（ＳＮＰ）の検出にも使用されるようになってきている。
市販されているＤＮＡチップの代表的なものとして、米国Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社が販売している「アフィメトリックス型」と、米国スタンフォード大学が開発した「スタンフォード型」が知られている。アフィメトリックス型のチップは半導体加工技術を用いて、シリコン基板上にＤＮＡプローブを高密度で合成していくものであり、１チップの上に数千〜数万種類のプローブを固定することが出来る。スタンフォード型のチップは予め用意したＤＮＡ断片をスライドに滴下して作る。これらのチップにおいて検出はターゲットに結合させた蛍光色素を用いて画像解析により行うことが一般的である。
更に、近年、蛍光色素に代わって、プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションの結果を電気化学的に測定する技術（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｒｒａｙ：ＥＣＡチップ）も開発されてきた（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｔ．Ｇ．；Ｈｉｌｌ，Ｍ．Ｇ．；Ｂａｒｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０３，２１，１１９２−１１９９）。このようなハイブリダイゼーションの電気化学的な検出は、二本鎖ＤＮＡの隣接した塩基対間に挿入する性質を有する「インターカレート剤」と呼ばれる化合物の中でも導電性を有する化合物を用いて行われる。このような導電性インターカレート剤としては、例えば、アントラキノン、ナフトキノン、ポリフィリン、フェロセン等の多くの化合物が既に知られており、フェロセン誘導体を用いた遺伝子検出の例が報告されている（Ｆａｎ，Ｃ．；Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．；Ｈｅｅｇｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，９１３４−９１３７）。更に、フェエロセン化ナフタレンジイミド誘導体等をインターカレート剤として使用したＤＮＡチップ及びそれを用いる各種方法が提案されている（特開２００３−３００公報、及び、特開２００３−８３９６８号公報）。
一方で、通常６量体又は８量体であるヘアピン型のピロール・イミダゾール・ポリアミド（ＰＩＰＡ）は、ＤＮＡ配列を部位特異的に認識することができる合成有機分子のプロトタイプとして知られており、遺伝子調節としてのＰＩＰＡ化合物の可能性も提案された（Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｍ．；Ｐａｒｋｓ，Ｍ．Ｅ．；Ｄｅｒｅｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，７９８３−７９８８）。更に、元のＰＩＰＡにおける構造修飾によってその機能と特性を変更する試みが多く報告された。例えば、いくつかの研究グループは、蛍光色素（Ｒｕｃｋｅｒ，Ｖ．Ｃ．；Ｆｏｉｓｔｅｒ，Ｓ．；Ｍｅｌａｎｄｅｒ，Ｃ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１９５−１２０２）、又はアルキル化剤（Ｗａｎｇ，Ｙ−Ｄ．；Ｄｚｉｅｇｉｅｌｅｗｓｋｉ，Ｊ．；Ｗｕｒｔｚ，Ｎ．Ｒ．；Ｄｚｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｂ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．；Ｂｅｅｒｍａｎ，Ｔ．Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３，３１，１２０８−１２１５他）により元のＰＩＰＡの構造を修飾して、それを遺伝子検出ツールおよび潜在的な抗癌剤として応用することを提案した。
そのような機能的な修飾とは別に、いくつかの研究グループは、ＤＮＡ二重鎖に対するピロールとイミダゾールの親和性と配列特異性を改善するために、それらの構造を修飾して他の複素環指揮化合物へと変化させることを報告している。その中のあるものは、配列特異性の改善に成功したことが報告されている（Ｆｏｉｓｔｅｒ，Ｓ．；Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｍ．Ａ．；Ｄｏｓｓ，Ｒ．Ｍ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３，１１，４３３３−４３４０他）。
特開２００３−３００公報 特開２００３−８３９６８号公報 Ｆａｎ，Ｃ．；Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．；Ｈｅｅｇｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，９１３４−９１３７ Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｍ．；Ｐａｒｋｓ，Ｍ．Ｅ．；Ｄｅｒｅｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，７９８３−７９８８ Ｒｕｃｋｅｒ，Ｖ．Ｃ．；Ｆｏｉｓｔｅｒ，Ｓ．；Ｍｅｌａｎｄｅｒ，Ｃ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１９５−１２０２ Ｗａｎｇ，Ｙ−Ｄ．；Ｄｚｉｅｇｉｅｌｅｗｓｋｉ，Ｊ．；Ｗｕｒｔｚ，Ｎ．Ｒ．；Ｄｚｉｅｌｅｗｓｋａ，Ｂ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．；Ｂｅｅｒｍａｎ，Ｔ．Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３，３１，１２０８−１２１５ Ｆｏｉｓｔｅｒ，Ｓ．；Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｍ．Ａ．；Ｄｏｓｓ，Ｒ．Ｍ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３，１１，４３３３−４３４０
これまでの電気化学的ＤＮＡチップに使用されてきたインターカレート剤は、二本鎖ＤＮＡのみならず一本鎖ＤＮＡ鎖にも結合して二本鎖ＤＮＡ以外に基づく電気的シグナルを発生させたり、又は、遊離のインターカレート剤が発生するノイズ電流が検出ノイズとなり、その結果、検出感度、即ち、電気化学シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が高い、という問題点があった。
更に、正統のヌクレオチドがＧ−Ｔ、Ａ−Ｇ、及びＧ−Ｇのような相当に安定したミスマッチ塩基対を形成することはよく知られており、その結果、従来のインターカレート剤を使用する電気化学的検出方法では擬陽性シグナルが生じる可能性もある。
そこで本発明者は、ピロール・イミダゾール・ポリアミド構造におけるリンカー領域を修飾することによって、二本鎖（二重鎖）核酸分子の塩基配列を特異的に認識することができる化合物を開発すべ研究の結果、ピロール・イミダゾール・ポリアミド構造におけるリンカー領域にフェロセン部分を有する化合物を合成することに成功し、上記問題点を解決することが出来た。
即ち、本発明は第一の態様として、一般式（Ｉ）で表されるフェロセン化合物：
Figure 2005087784
（一般式（Ｉ）中、Ａは二価のフェロセン含有リンカー又はフェロセン−１，１’−イルであり、Ｒ１は水素原子又はアルキルを示し、ｎ及びｍは任意の自然数を示し、Ｖ及びＸは以下の一般式（ＩＩ）又は（ＩＩ−１）であり：
Figure 2005087784
Figure 2005087784
Ｗは一般式（ＩＩＩ）であり：
Figure 2005087784
（一般式（ＩＩ）及び一般式（ＩＩＩ）中、Ｕは窒素原子、メチン、又はヒドロキシメチンを示す）；及び
Ｚは一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）であり：
Figure 2005087784
Figure 2005087784
 且つ、一般式（Ｉ）においてＶ１のフェロセン含有リンカー又はフェロセン−１，１’−イル側の結合は（−ＣＯ−ＮＲ２−）であり、それ以外の各Ｖｎ及びＸｍの両端は（−ＣＯ−ＮＨ−）結合を形成する）に係る。
上記一般式（Ｉ）で示される本発明化合物は、二価のフェロセン含有リンカー及びそれに結合する２つのピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩＰＡ）領域から構成されるものである。
従って、フェロセン含有リンカーはフェロセン基を含み、上記の機能を発揮できるような化合物（原子団）である限り、どのような構造を有するものでも良い。
ｎ及びｍは、好ましくは３〜２０、より好ましくは３〜１０の範囲の自然数であり、更に、本発明化合物のフェロセン含有リンカーの両端に連なる原子団におけるイミダゾール誘導体及びピロール誘導体の合計数が最終的に等しくなるように、ｎはｍより一つ少ない数であることが好ましい。
二価のフェロセン含有リンカー（Ａ）の好適例として、以下の一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）又は式（Ｘ）：
Figure 2005087784
Figure 2005087784
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（式中、Ｒ１及びＲ３は水素原子又はアルキルを示し、ｊ及びｋは同一又は異なる０から５までの整数を示す）を挙げることが出来る。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、例えば、メチル基のような一個ないし数個の炭素原子を有するアルキル基であることが好ましい。
上記化合物の一具体例として、下記構造式（ＶＩＩＩ又は１ａ）、（ＩＸ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（２）及び（３）で表される化合物がある。
Figure 2005087784
Figure 2005087784
Figure 2005087784
Figure 2005087784
Figure 2005087784
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 本発明化合物は、例えば、以下の実施例に示される工程で合成することが出来る。尚、本明細書に具体的に記載していない各種反応条件等は当業者が容易に選択し採用することが出来る。
従って、本発明は第二の態様として、フェロセンジカルボン酸メチル、アミノフェロセンカルボン酸メチル、又はフェロセンカルボン酸を出発物質とし、縮合反応を含む工程から成る、本発明化合物の製造方法に係る。その一具体例は、本明細書中の以下の化１６〜化２１の反応スキームに示され、実施例で具体的に記載された各工程から成る製造方法を挙げることが出来る。
本発明は第三の態様として、本発明のフェロセン化合物から成る二本鎖核酸分子の配列特異的検出用リガンドに係る。
更に、本発明は第四の態様として、上記リガンドのような二本鎖核酸分子の配列特異的に結合することができる化合物を使用することを特徴とする二本鎖核酸分子の電気化学的検出方法、及び、電気化学的検出装置又は器具に係る。
二重鎖核酸分子の塩基配列に特異的に結合する化合物、特に本発明の一般式（Ｉ）で示されるフェロセン化合物を利用することによって、電気化学的検出における電気化学シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を低くすることが出来、その結果、検出感度（精度）を大きく向上させることができ、超微量の核酸分子の定量的測定を可能とする。
図１は、実施例２で得られた１５量体ＤＮＡの滴定のＣＤプロフィールである。反応は、１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ ＣａＣｌ２含有１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）にて行われた。
図２は、実施例５で得られた１１量体ＤＮＡの滴定のＣＤプロフィールである。ａ）１ａ（０−１．８当量）ｂ）３（０−１．６当量）ｃ）２（０−２．０当量）によるＤＮＡ二重鎖（５μＭ）の滴定を示す。
図３は、実施例６のサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）による試験で得られた本発明化合物の電気化学的特性を示した。試験は、本発明化合物（５ｍＭ）を使用して、０．２Ｍ ＮａＣｌＯ４含有Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で測定した。レファレンス電極：ＡｇＣｌ２；カウンター電極：Ｐｔ；作動電極：Ｐｔ．。
本発明において、核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを意味し、従って、二本鎖核酸分子としては、ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡ等が含まれる。例えば、試料（ターゲット）の核酸分子としては、ｍＲＮＡ及び逆転写反応によって調製されたｃＤＮＡ又はその断片等を用いることが出来る。一方、プローブとして使用する核酸分子としては、ｃＤＮＡ又はその断片、合成オリゴヌクレオチド等を使用することが出来る。これらは、電気化学的検出方法又は装置の種類等に応じて変るものであり、当業者には周知の技術的事項である。
本発明の、電気化学的検出方法において、ハイブリダーゼーションの結果形成される検出対象である二本鎖核酸分子におけるＧ／Ｃ塩基対及びＡ／Ｔ（Ｕ）対に対して、一般式（Ｉ）中の対応する位置にあるＶ及びＸの対が、夫々、イミダゾール誘導体／ピロール誘導体及びピロール誘導体／誘導体で構成されるように本発明化合物の構造を設計することによって、高い配列特異性を達成することが出来る。
本発明の電気化学的検出方法の測定原理は核酸分子同士のハイブリダーゼーションであり、当業者に公知の任意の手段及び操作で実施することが出来る。例えば、固相におけるハイブリダイゼーションを使用する方法として、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いる方法を挙げることが出来る。このような電気化学的検出方法が行われる装置又は器具（例えば、電気化学チップ又はＥＣＡチップ）自体は当業者に公知であり、本発明においてもそのような装置又は器具を利用することが出来る。又、このような装置又は器具は当業者に周知の方法で容易に作成することが出来る。
又、検出される電気信号としては、電流、電気導電度、電位、電気容量、インダクタンス、インピーダンス等の電気的な信号が挙げられ、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）、リニアスィープボルタモグラフィーおよびポテンショスタット等の装置により測定される。
本発明の二本鎖核酸分子の配列特異的検出用リガンドを用いる配列特異的な二本鎖核酸分子の電気化学的検出方法は、一塩基多型（ＳＮＰ）等の多型解析、塩基配列の決定、遺伝子変異解析、遺伝子発現モニタリング等の核酸分子のハイブリダイゼーションに基づく各種測定に利用することが出来る。
以下、実施例に則して、本発明の一具体例を説明する。尚、当業者であれば、当該技術分野における技術常識及び本明細書の記載に基づき、本発明の技術的特徴を有するその他の各種態様を容易に想到することが可能であり、それらの各種態様も本発明の技術的範囲に属する。
実施例１：構造式（ＶＩＩＩ）の化合物に合成
本化合物は以下に示す反応スキームで合成された。
Figure 2005087784
Figure 2005087784
 尚、この化合物の構造は、出発原料の入手可能性、及び生成物と中間体の化学安定性の両方を考慮して設計された。ＰＩＰＡ領域の配列は、Ｃ型ウィルス肝炎によって感染した患者のインターフェロン耐性を決定した要因であり得るヒトゲノム中の一塩基変異をターゲットとするＣＧＣ／ＧＣＧ配列に結合することを目指して設計された。
フェロセンジカルボン酸メチル（２）は２−クロロ−１−メチルピリジニウムのヨウ化物（ＣＭＰＩ）（Ｂａｌｄ，Ｅ．；Ｓａｉｇｏ，Ｋ．；Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９７５，１１６３−１１６６）を用いて、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，３−プロパンジアミンと縮合し、８７％の収率を得た。得られた化合物（３）はアルカリ性水溶液で処理してカルボン酸（４）に変換した。これを、３−アミノプロピオン酸エチルと縮合してフェロセン結合ユニット（５）を得た（収率：６２％）。
次に、ピロール・イミダゾール部分を導入するために、上記化合物（５）のエチルエステルをアルカリ性水溶液で処理して除去し、化合物（６）を得た（収率：９３％）。化合物（６）の遊離カルボキシル基を、クロロ−１−メチルピリジニウムヨウ化物を用いる３−ニトロピロール誘導体（９）の水素化によってその場で調製した３−アミノピロール誘導体（１０）と結合し、化合物（７）を得た（収率：６２％）。この化合物（７）を更にＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＴＦＡ処理で加水分解してアミン（８）を得た（収率：７１％）。
ついで、化合物８（１８７．６ｍｇ，０．４７７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．７７ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．１６２ｍｌ，０．９４７ｍｍｏｌ）と０−（ベンゾトリアゾール−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート（３６１．８ｍｇ，０．９５４ｍｍｏｌ）を縮合剤として加え（Ｄｏｕｒｔｏｇｌｏｕ，Ｖ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｊ．−Ｃ．；Ｇｒｏｓｓ，Ｂ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９７８，１５，１２６９−１２７２他）、室温で３０分間撹拌した。つづいて、別途合成した（Ｂａｉｒｄ，Ｅ．Ｅ．，Ｄｅｒｖａｍ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，６４１４−６４１６）カルボン酸（１１）を塩化メチレン（４．８ｍｌ）に溶解させたもの（４００ｍｇ，０．４７７ｍｍｏｌ）を加え、さらに１時間撹拌させた。水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し得た（３４９ｍｇ，６１％）。この化合物の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲで確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．５９−１．６５（２Ｈ，ｍ），２．１５（６Ｈ，ｓ），２．２６−２．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５６−２．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１８−３．２２（２Ｈ，ｍ，），３．３７−３．５０（６Ｈ，ｍ），３．８１（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９４（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．２７−４．３０（４Ｈ，ｍ），４．７３（４Ｈ，ｓ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｓ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．３５−７．３６（２Ｈ，ｍ），７．４６（１Ｈ，ｓ），７．４９（１Ｈ，ｓ），７．８６−７，８７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．９１−７．９３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．９８−７．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．０５−８．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），９．７７（１Ｈ，ｓ），９．８８（１Ｈ，ｓ），１０．０３（１Ｈ，ｓ），１０．０６（１Ｈ，ｓ），１０．１９（１Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２７．２，３５．１，３５．１，３５．３，３６．０，３６．１，３６．２，３６．４，３６．５，３７．４，３８．８，３９．０，４５．３，５７．３，６９．８，７１．７，７１．８，７７．９，７８．０，７９．３，１０４．１，１０４．８，１０６．１，１１４．６，１１４．９，１１８．０，１１９．４，１１９．６，１２１．４，１２２１．７，１２２．２，１２２．３，１２２．４，１２３．５，１２６．６，１２７．２，１３４．１，１３４．４，１３６．２，１３８．９，１５５．９，１５６．３，１５８．９，１５８．９，１５９．２，１６１．２，１６８．２，１６８．６，１６９．０ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５５Ｈ６６ＦｅＮ１９０９＋ ： １１９２．４６４０３，ｆｏｕｎｄ １１９２．３７０８９．
同様に、構造式（ＩＸ）の化合物を以下に示す反応スキームで合成した。得られた化合物の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲで確認した。
Figure 2005087784
 １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．５７−１．６３（２Ｈ，ｍ），２．１３（６Ｈ，ｓ），２．２２−２．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．１６−３．２０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．７６（３Ｈ，ｓ），３．７９（３Ｈ，ｓ），３．８２（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ）４．０４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），４．３５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），４．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），４．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．１９−７．２０（２Ｈ，ｍ），７．３７（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｓ），７．４９（１Ｈ，ｓ），７．５２（１Ｈ，ｓ），８．０７−８．１０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），９．１３（１Ｈ，ｓ），９．５１（１Ｈ，ｓ），９．９０（１Ｈ，ｓ），１０．１６（１Ｈ，ｓ），１０．２５（１Ｈ，ｓ），１０．３５（１Ｈ，ｓ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２７．３，３３．６，３５．１，３５．３，３６．２，３６．４，３６．５，３７．４，４５．４，５７．４，６１．９，６５．７，６９．３，７１．１，７８．３，７９．４，９６．１，１０４．１，１０５．４，１０６．１，１１４．９，１１５．０，１１８．０，１１９．７，１１９．８，１２１．３，１２１．７，１２１．８，１２２．３，１２２．４，１２３．５，１２６．６，１２７．２，１３３．９，１３４．３，１３６．２，１３６．３，１３８．９，１５５．９，１５６．３，１５６．９，１５８．９，１５８．９，１６１．２，１６５．７
ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４９Ｈ５６ＦｅＮ１７０７＋ ： １０５０．３８９８０，ｆｏｕｎｄ １０５０．４０２９７．
実施例２：構造式（ＶＩＩＩ）の化合物のリガンドとしての特性
上記化合物の二重ヘリカルＤＮＡに対するリガンドとして有用性を確認する目的で、ターゲットＤＮＡ（ＴＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧ／ＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡ：Ｔｍ＝６７．１℃）への結合をＣＤスペクトルによって検査した。その結果を図１に示した。図１は、本化合物の０，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０，１．２及び１．４当量による上記ＤＮＡの滴定のＣＤプロフィールである。副溝結合との相互作用によって、３００−３６０ｎｍにおける楕円偏光が誘起される（Ｐｉｌｃｈ，Ｄ．Ｓ．；Ｐｏｋｌａｒ，Ｎ．；Ｂａｉｒｄ，Ｅ．Ｅ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，３８，２１４３−２１５１）ことは良く知られている。従って、ターゲットＤＮＡの５．０μＭ溶液を添加することによって、濃度依存性の正のコットン効果の増加が見られ、２９２ｎｍに等吸収点があった。
以下の反応スキームに従い、更に本発明化合物を合成した。
Figure 2005087784
Figure 2005087784
Figure 2005087784
 原料合成例１：
１−Ｍｅｔｈｙｌ−４−（１−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｐｙｒｒｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（７）
文献記載の方法により化合物４（Ｂａｉｒｄ，Ｅ．Ｅ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１１８，６１４１−６１４６）と化合物５（Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，Ｅ．；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｈ．；Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８８，８，１９４５−１９５２．）より合成した化合物６（８．８ｇ，３３．６ｍｍｏｌ）をエタノール（２３４ｍＬ）に溶解し、０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１６８ｍｌ，１１０．７ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で１時間撹拌した。室温に戻した後、３Ｎ塩酸を加えｐＨ３．０とした際に生じる白色粉体を濾別し化合物９（８．１９，９７％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．８２（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．０３（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｓ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），１０．４８（１Ｈ，ｓ），１２．１９（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３５．３，３６．４，１０９．１，１１９．９，１２０．７，１２２．１，１２６．６，１２７．２，１３８．８，１５６．３，１６２．１．Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１２Ｎ４Ｏ３：Ｃ，５３．２２；Ｈ，４．８９；Ｎ，２２．５７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５２．４５；Ｈ，４．７２；Ｎ，２２．３４．
原料合成例２：
２−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ−４−｛４−（１−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）−１−ｍｅｔｈｙｐｙｒｒｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ （９）
化合物７をメタノール（９４．４ｍｌ）に溶解させ、１０％ Ｐｄ／Ｃ（１．１８９）を加え、水素雰囲気下で４時間撹拌させた。セライト濾過により反応系から１０％ Ｐｄ／Ｃを除去し、溶媒を減圧下留去した。続いて、ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）を加え、減圧留去した。再びジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解させ、文献（Ｂａｉｒｄ，Ｅ．Ｅ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１１８，６１４１−６１４６）公知の化合物８（５．９９，２３．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（９．０５ｇ，４７．２ｍｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（２８８ｍｇ，２．３６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。つづいて、クロロホルムと酢酸エチルにより再沈殿処理を行うことにより、化合物９を白色粉体で得た（５．９９，６３％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．２８−１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９３（３Ｈ，ｓ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．２５−４．２９（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），７．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．７Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３８（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｓ），７．６６（１Ｈ，ｓ），１０．３５（１Ｈ，ｓ），１０．７４（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１４．３，３５．３，３５．７，３６．５，６０．８，１０６．４，１１５．６，１１９．８，１２１．６，１２２．２，１２６．５，１２７．２，１３１．０，１３８．０，１３９．０，１５６．３，１５８．７，１５８．９：Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ１２Ｎ４Ｏ３・Ｈ２Ｏ：Ｃ，５３．２２；Ｈ，４．８９；Ｎ，２２．５７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５０．８８；Ｈ，４．８８；Ｎ，２３．１３．
原料合成例３：
Ｓｏｄｉｕｍ
１−ｍｅｔｈｙｌ−４−｛４−（１−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）−１−ｍｅｔｈｙｐｙｒｒｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ｝ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（１０）
化合物９（３．０ｇ，７．５ｍｍｏｌ）をメタノール（３７．６ｍｌ）に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（３７．６ｍｌ，７．８９ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１時間撹拌した。室温に戻した後、１Ｎ塩酸を加えｐＨ２．０とした。続いて、イソプロピルアルコールを加え、生じる白色粉体を濾別し化合物１０を得た（２．８５９，９４％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．８６（３Ｈ，ｓ），３．９２（３Ｈ，ｓ），４．０１（３Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｓ），７．２５（１Ｈ，ｓ），７．４０（１Ｈ，ｓ），７．５２（１Ｈ，ｓ），７．６１（１Ｈ，ｓ），１０．７０（１Ｈ，ｓ），１０．７１（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２５．６，３５．７，３６．５，１０６．２，１１５．３，１１９．９，１２１．３，１２２．４，１２５．１，１２６．６，１３１．９，１３７．３，１３８．１，１５４．７，１５８．８，１６０．１．ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ１８Ｎ７Ｏ４ ＋： ３７２．１４２０３，ｆｏｕｎｄ ３９４．１１７８１［Ｍ＋Ｎａ］＋．
原料合成例４：
２−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ（１２）
３−ジメチルアミノプロピルアミン（１２．６ｇ，１０１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶かし、０℃下、文献（Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，Ｅ．；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｈ．；Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８８，８，１９４５−１９５２．）公知の化合物１１（２５ｇ，９２ｍｍｏｌ）を滴下し加えた。反応液を室温まで上げ、１時間攪拌後、溶媒を留去した。残査からエタノールにより再結晶を行い化合物１２（１９．６ｇ，８４％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．１（６Ｈ，ｓ），２．２（２Ｈ，ｔ；Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）３．９（３Ｈ，ｓ），７．９（１Ｈ，ｓ），８．１（１Ｈ，ｓ），８．４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）．
原料合成例５：
１−Ｍｅｔｈｙｌ−４−（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｎｉｔｒｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）−２−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｅ（１４）
化合物１２（２．８ｇ，１０．９ｍｍｏｌ）をメタノール（４４ｍＬ）に溶解させ、１０％ Ｐｄ／Ｃ（５４５ｍｇ）を加えた。水素雰囲気下、室温で４時間攪拌させた。パラジウム触媒をろ過し溶媒を留去した。この残渣をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させ、メタノールを除去するために、体積が半分になるまで共沸した。ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させた文献公知の化合物１３（３．０ｇ，１０．９ｍｍｏｌ）を０℃下加え、その後室温まで上げた。溶媒を留去後、残った残渣を２−プロパノールで洗浄し、化合物１４を得た。（３．６８ｇ，９０％）．：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．１（６Ｈ，ｓ），２．２（２Ｈ，ｔ；Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．２（２Ｈ，ｍ），３．８（３Ｈ，ｓ），４．０（３Ｈ，ｓ），７．０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），８．１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．６（１Ｈ，ｓ），１０．８（１Ｈ，ｓ）．
原料合成例６：
１−Ｍｅｔｈｙｌ−４−｛１−ｍｅｔｈｙｌ−４−（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｎｉｔｒｏｐｙｒｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ｝−２−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｅ（１５）
化合物１４（３．６ｇ，９．６ｍｍｏｌ）をメタノール（３８ｍＬ）に溶解させ、１０％ Ｐｄ／Ｃ（４８１ｍｇ）を加えた。水素雰囲気下、室温で４時間攪拌させた。パラジウム触媒をろ過し溶媒を留去した。この残渣をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させ、メタノールを除去するために、体積が半分になるまで共沸した。ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させた化合物１１（２．６ｇ，９．６ｍｍｏｌ）を０℃下加え、その後室温まで上げた。溶媒を留去後、残った残渣を２−プロパノールで洗浄し、化合物１５を得た。（３．５９，７４％）．：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．７４−１．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），２．２７（６Ｈ，ｓ），２．４３−２．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．４９−３．５３（２Ｈ，ｍ），３．８６（３Ｈ，ｓ），４．０５（６Ｈ，ｓ），６．５７（１Ｈ，ｓ），７．１６（１Ｈ，ｓ），７．２７（１Ｈ，ｓ），７．４４（１Ｈ，ｓ），７．６１（１Ｈ，ｓ），７．６９（１Ｈ，ｓ），７．９０（１Ｈ，ｍ），８．５８（１Ｈ，ｓ），９．２５（１Ｈ，ｓ）．
原料合成例７：
２−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ−４−｛３−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ｝ｐｙｒｒｏｌｅ（１８）
文献（Ｂａｉｒｄ，Ｅ．Ｅ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１１８，６１４１−６１４６．）公知の化合物１７（５４６ｍｇ，２．７ｍｍｏｌ）をメタノール（１１ｍＬ）に溶解させ、１０％ Ｐｄ／Ｃ（１３７ｍｇ）を加えた。水素雰囲気下、室温で１．５時間攪拌させた。パラジウム触媒をろ過し溶媒を留去した。残渣を塩化メチレンに溶解させ、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−β−アラニン（５１８ｍｇ，２．７ｍｍｏｌ），１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボキシジイミド塩酸塩（５７８ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４０７ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）を加え、２時間室温下、攪拌した。酢酸エチル（５０ｍｌ）と水（５０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１１ｇ）で精製し化合物１８を得た。（５１０ｍｇ，５６％）：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１．２７−１．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３６（９Ｈ，ｓ），２．４０−２．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２ｚ），．３．１６−３．２０（２Ｈ，ｍ），３．９０（３Ｈ，ｓ），４．２３−４．２８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），６．７８（１Ｈ，ｍ），７．５１（１Ｈ，ｓ），１０．６（１Ｈ，ｓ）．
原料合成例８：
２−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ−４−｛３−（１−ｍｅｔｈｙｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ｝ｐｙｒｒｏｌｅ（１９）
化合物１８（５１０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）に１０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレン（２４ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）を加え、室温下１時間攪拌した。溶液を水（１５ｍＬ）で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後濃縮した。この残渣をＤＭＦに溶解させ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミン（１２８μｌ，０．７５ｍｍｏｌ）と化合物５（４９０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）を加え、室温下２時間攪拌した。クロロホルム（３０ｍｌ）と水（２０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮させた。残渣からクロロホルムとジイソプロピルエーテルにより、再沈殿を行い化合物１９を得た。（４７５ｍｇ，９１％）
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．２６−１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５３−２．５６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．４５−３．４９（２Ｈ，ｍ），３．８９（３Ｈ，ｓ），３．９２（３Ｈ，ｓ），４．２２−４．２６（２Ｈ，ｍ），６．９４（１Ｈ，ｓ），７．３１（１Ｈ，ｓ），７．５３（１Ｈ，ｓ），８．３４（１Ｈ，ｍ），１０．７（１Ｈ，ｓ）．
原料合成例９
：２−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ−４−｛３−（１−ｍｅｔｈｙｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ｝ｐｙｒｒｏｌｅ（２０）
化合物１９（６５ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）をエタノール（１．９ｍＬ）に溶解させ、０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１．４ｍＬ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１時間攪拌した。溶液を室温まで冷まし、１Ｍ塩酸を用いｐＨ２に調製した。沈殿した粉体を２−プロパノールで洗浄し、溶媒を留去した。残渣をＤＭＦ（１．３ｍＬ）に溶解させ、ペンタフルオロフェニルトリフルオロメチルアセテート（６８μＬ，０．３９ｍｍｏｌ）、ピリジン（３２μＬ，０．３９ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、室温で１時間攪拌した。溶液を０．１Ｍ塩酸（１０ｍｌ×３）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）と飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。残渣を減圧下、濃縮し化合物２０を得た。（８８ｍｇ，９６％）：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．５８−２．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．４９−３．５３（２Ｈ，ｍ），３．９４（３Ｈ，ｓ），３．９８（３Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），７．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ），８．３７−８．３９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１０．９（１Ｈ，ｓ）．
原料合成例１０：フェロセン誘導体２２ａ，２２ｂの一般的合成方法
化合物２１（１．０ｇ，３．４７ｍｍｏｌ）を３５ｍｌの塩化メチレンに溶解させ、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルエチレンジアミン（０．５６ｇ，３．４７ｍｍｏｌ）、ｎ−トリブチルアミン（２．０ｍＬ，８．３ｍｍｏｌ）２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（１．１ｇ，４．１６ｍｍｏｌ）を加えた。水（２０ｍＬ）と飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させ減圧下濃縮を行った。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し化合物２２ａを得た。（１．３ｇ、８７％）．
２２ａ：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３７（９Ｈ，ｓ），３．０９（２Ｈ，ｍ），３．７２（３Ｈ，ｓ），４．３８−４．８０（８Ｈ，ｓ），６．８５（１Ｈ，ｔ），７．８４（１Ｈ，ｔ）．
２２ｂの合成
２２ａと同様の手法で、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルエチレンジアミンに代えてＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルプロピレンジアミンをを用いることで、２２ｂを得た。
２２ｂ：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １．３８（９Ｈ，ｓ），１．５７−１．６３（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝６．８，７．１Ｈｚ），２．９７−３．０１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３，６．６Ｈｚ），３．１４−３．１８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．７２（３Ｈ，ｓ），４．３７−４．４４（４Ｈ，ｍ），４．７１−４．８１（４Ｈ，ｍ），６．８１−６．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．７７−７．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），
原料合成例１１：フェロセン誘導体２３ａ，２３ｂ及び２３ｃの一般的合成方法
化合物２２ａ（１０．５ｇ，２０ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍｌ）に溶解し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍｌ，４０ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１２時間撹拌した後、室温に戻した。つづいて、クエン酸を加えｐＨ３．０とした後、水で洗浄し、有機層を回収後無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。この残渣を塩化メチレン（２２０ｍｌ）に溶解させ、β−アラニンエチルエステル塩酸塩（３．５ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１０．８ｍｌ，７７．５ｍｍｏｌ）と２−クロロ−１−メチルヨージド（６．７ｇ，２７．４ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下に加えた。室温で２時間撹拌後、水で洗浄し、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し化合物２３ａ得た（８．７ｇ，８５％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．１８−１．２１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）１．３２（９Ｈ，ｓ），２．５９−２．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．３２（２Ｈ，ｍ），３．４２−３．４５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．５７−３．６０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．０７−４．１２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），４．２９−４．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）４．４６（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），５．８９（１Ｈ，ｍ），７．３４−７．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．５５−７．５７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１４．０，２８．２，３３．９，３５．３，４０．２，４０．５，６０．４，７０．４，７０．５，７０．９，７１．０，７７．６，７８．０，７８．９，１５６．５，１７０．４，１７０．５，１７２．２ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ３４ＦｅＮ３Ｏ６ ＋：５１６．１７９７０，ｆｏｕｎｄ ５１６．２３２０３．
化合物２３ｂと２３ｃは上記の一般的合成法に従い、２２ａと２２ｂを適当なアミノ酸エステルと反応させることで得た。
２３ｂ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．１６−１．１９（３Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３８（９Ｈ，ｓ），１．７５−１．７８（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．３５−２．３８（２Ｈ，ｍ），３．０９−３．１１（２Ｈ，ｍ，ｊ＝５．９，６．１Ｈｚ），３．１８−３．２３（２Ｈ，ｑ，ｊ＝５．９，６．１，６．６Ｈｚ），４．０３−４．０８（２Ｈ，ｑ，ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２９−４．３１（４Ｈ，ｍ），４．６９−４．７２（４Ｈ，ｍ），６．９０（１Ｈ，ｔ），７．８６−７．８８（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．６Ｈｚ），７．９０−７．９２（１Ｈ，ｔ．ｊ＝５．６Ｈｚ）
２３ｃ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．１８−１．２１（３Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３８（９Ｈ，ｓ），１．５９−１．６２（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５６−２．５９（２Ｈ，ｔ，ｊ＝６．８Ｈｚ），２．９７−３．０１（２Ｈ，ｑ，ｊ＝６．６Ｈｚ），３．１５−３．１９（２Ｈ，ｑ，ｊ＝６．６，６．８Ｈｚ），３．３９−３．４３（２Ｈ，ｑ，ｊ＝６．６，７．１Ｈｚ），４．０７−４．１１（２Ｈ ｑ，ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２８−４．３０（４Ｈ，ｍ，），４．６９−４．７０（４Ｈ，ｍ），６．８１−６．８３（１Ｈ，ｔ），７．８２−７．８５（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．９Ｈｚ），７．９６−７．９８（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．８Ｈｚ）
原料合成例１２：フェロセン誘導体２４ａ，２４ｂ及び２４ｃの一般的合成方法
化合物２３ａ（２．０ｇ，３．８８ｍｍｏｌ）をメタノール（３９ｍｌ）に溶解し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（４１ｍｌ，４．０７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。室温に戻した後、１Ｎ塩酸を加えｐＨ３．０とした。水で洗浄し、有機層を回収後無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し２４ａ得た（１．８４ｇ，９７％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３７（９Ｈ，ｓ），２．４９−２．５３（２Ｈ，ｍ），３．０７−３．１０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．１９−３．２２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．３６−３．４０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．２８−４．２９（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），４．６９−４．７１（４Ｈ，ｍ），６．９１−６．９４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．８３−７．８６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），７．９３−７．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），１２．２５（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２８．５，３４．３，３５．５，３８．８，６９．８，７１．７，７１．８，７２．２，７７．８，７７．８，７７．９，７９．４，１５５．９，１６８．７，１６８．８，１７３．３．ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３０ＦｅＮ３Ｏ６ ＋：４８８．１４８４０，ｆｏｕｎｄ ４８８．２２５８４．
化合物２４ｂと２４ｃは上記一般的合成に従い、化合物を２３ｂと２３ｃを原料に用いることで得た。
２４ｂ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．３８（９Ｈ，ｓ），１．７２−１．７７（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝７．１，７．３Ｈｚ），２．２８−２．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．０８−３．１１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．１８−３．２４（４Ｈ，ｍ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．２９−４．３０（４Ｈ，ｓ），４．６９−４．７２（４Ｈ，ｍ），６．９１−６．９３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．８７−７．９２（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝５．６，５．８Ｈｚ），１２．１（１Ｈ，ｓ）．
２４ｃ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．３８（９Ｈ，ｓ），１．５９−１．６３（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．９７−３．０１（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．１５−３．１９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６，６．８Ｈｚ），３．３６−３．４０（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）４．２８−４．２９（４Ｈ，ｔ），４．７０−４．７２（４Ｈ，ｍ），６．８１−６．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．８１−７．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），７．９２−７．９４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），１２．２（１Ｈ，ｓ）．
原料合成例１３：フェロセン誘導体２５ａ，２５ｂ及び２５ｃの一般的合成方法
化合物１５（１．６４ｇ，３．２８ｍｍｏｌ）をメタノール（１３．１ｍｌ）に溶解させ、１０％ Ｐｄ／Ｃを（１６４ｍｇ）加え、水素雰囲気下で４時間撹拌させた。セライト濾過により反応系から１０％ Ｐｄ／Ｃを除去し、溶媒を減圧下留去した。続いて、塩化メチレン（３２．８ｍｌ）に溶解させ化合物２４ａ（１．６０ｇ，３．２８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（７４４ｍｇ，３．６１ｍｍｏｌ）とヒドロキシベンゾトリアゾール（４８８ｍｇ，３．６１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。系内に析出した白色粉体を濾別し、水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し２５ａを得た（２．５２ｇ，８２％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３７（９Ｈ，ｓ），１．７０−１．７３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．４２（６Ｈ，ｓ），２．５５−２．６１（４Ｈ，ｍ），３．０９−３．４７（１６Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．９５（３Ｈ，ｓ），４．２８−４．２９（４Ｈ，ｍ），４．７１−４．７３（４Ｈ，ｍ），６．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．５１（１Ｈ，ｓ），７．８８−７．９１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．００−８．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．１４−８．１６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｓ），９．９５（１Ｈ，ｓ），１０．２３（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ２６．１，２８．４，３５．０，３６．０，３６．０，３６．２，３６．４，３６．６，４３．９，５６．２，６９．８，７１．７，７７．８，７７．９，７９．３，１０４．３，１０４．８，１１４．９，１１８．１，１１９．３，１２１．４，１２２．０，１２２．３，１２３．３，１３４．３，１３６．２，１５５．９，１５８．８，１６１．４，１６８．１，１６８．７，１６８．８．ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４４Ｈ５９ＦｅＮ１２Ｏ８ ＋：９３９．３９２８２，ｆｏｕｎｄ ９３９．２５２３．
化合物２５ｂと２５ｃは上記一般的合成に従い、化合物を２４ｂと２４ｃを原料に用いることで得た。
２５ｂ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．３８（９Ｈ，ｓ），１．５９−１．６３（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．１Ｈｚ），１．８１−１．８４（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２３−２．２６（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．３１−２．３４（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．３Ｈｚ），３．０９−３．１２（２Ｈ，ｍ，ｊ＝５．９Ｈｚ），３．１７−３．２５（６Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．３２（４Ｈ，ｓ），４．７０−４．７３（４Ｈ，ｍ），６．８９−６．９３（３Ｈ，ｍ，ｊ＝１．７，１．９Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．２８（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｓ），７．８９−７．９４（２Ｈ，ｍ，ｊ＝５．６，５．９Ｈｚ），８．０９−８．１１（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．６Ｈｚ）９．８８（１Ｈ，ｓ），９．９５（１Ｈ，ｓ），１０．２２（１Ｈ，ｓ）
２５ｃ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．３８（９Ｈ，ｓ），１．５８−１．６４（４Ｈ，ｍ，ｊ＝６．８，７，１Ｈｚ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２３−２．２６（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５６−２．５８（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．９８−３．０２（２Ｈ，ｍ，ｊ＝６．３，６．６Ｈｚ），３．１６−３．２１（４Ｈ，ｍ，ｊ＝６．３，６．６Ｈｚ），３．４３−３．４７（２Ｈ，ｍ，ｊ＝６．６，６．８Ｈｚ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．２８−４．２９（４Ｈ，ｍ），４．７１−４．７３（４Ｈ，ｍ）６．８１−６．８３（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．６Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｄ，ｊ＝２．０Ｈｚ），６．９３（１Ｈ，ｄ，ｊ＝２．０Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．５２（１Ｈ，ｓ）７．８３−７．８５（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．９Ｈｚ），７．９６−７．９７（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．６Ｈｚ），８．０８−８．１１（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．６Ｈｚ），９．９５（１Ｈ，ｓ），９．９７（１Ｈ，ｓ），１０．２３（１Ｈ，ｓ）．
原料合成例１４：フェロセン誘導体２６ａ，２６ｂ及び２６ｃの一般的合成方法
化合物２５ａ（１．５ｇ，１．６ｍｍｏｌ）を１０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレン（２５．３ｍｌ，３２ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温で５時間撹拌させた。水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し２６ａを得た（１．０４ｇ，７８％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．６６−１．７１（２Ｈ，ｍ），２．２０（６Ｈ，ｓ），２．３５−２．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝Ｈｚ），２．７４（２Ｈ，ｓ），２．９７（２Ｈ，ｍ），３．３９−３．４０（２Ｈ，ｍ），３．４７（２Ｈ，ｍ），３．６９（２Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．８７（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．２７（２Ｈ，ｓ），４．３１（２Ｈ，ｓ），４．５８−４．６０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝），６．７０（１Ｈ，ｓ），６．９０（１Ｈ，ｓ），７．２０（１Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｓ），７．４５−７．４６（１Ｈ，ｍ），７．７６（２Ｈ，ｍ），７．８３（１Ｈ，ｍ），９．０７（１Ｈ，ｂｒ），９．２１（１Ｈ，ｂｒ），９．８８（１Ｈ，ｓ）；ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒＣ３９Ｈ５１ＦｅＮ１２Ｏ６ ＋ ：８３９．３４０３９，ｆｏｕｎｄ ８３９．３３８３１．
化合物２６ｂと２６ｃは上記一般的合成に従い、化合物を２５ｂと２５ｃを原料に用いることで得た。
２６ｂ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．５８−１．６４（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．１Ｈｚ），１．８０−１．８５（２Ｈ，ｍ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２３−２．２７（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．３１−２．３６（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．６９−２．７２（２Ｈ，ｔ，ｊ＝６．６Ｈｚ），３．１７−３．２３（６Ｈ，ｍ），３．８１（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．２９−４．３３（４Ｈ，ｍ），４．７０−４．７３（４Ｈ，ｍ）６．８８（１Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｓ），７．２２（１Ｈ，ｓ），７．２９（１Ｈ，ｍ），７．５３（１Ｈ，ｓ），７．８６−７．８８（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．６Ｈｚ），７．９２−７．９７（２Ｈ，ｍ），８．１０−８．１２（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．６Ｈｚ），９．９０−９．９１（１Ｈ，ｄ），９．９７（１Ｈ，ｓ）．
２６ｃ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．５９−１．６２（４Ｈ，ｍ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２３−２．２６（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５７−２．５９（２Ｈ，ｔ），３．１９−３．２０（２Ｈ，ｍ），３．２４−３．２５（２Ｈ，ｍ），３．４５−３．４７（２Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），４．２９（４Ｈ，ｓ），４．７１（４Ｈ，ｄ）６．８９（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．５Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｓ），７．２２（１Ｈ，ｓ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．５３（１Ｈ，ｓ），７．９３−７．９５（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．４Ｈｚ）７．９９−８．１０（２Ｈ，ｍ，ｊ＝５．１Ｈｚ），９．９９−１０．０２（１Ｈ，ｍ，ｊ＝５．１Ｈｚ）．
原料合成例１５：Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（２８）
化合物１５（８０６ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）をメタノール（６．５ｍｌ）に溶解させ、１０％ Ｐｄ／Ｃ（８０．５ｍｇ）を加え、水素雰囲気下で４時間撹拌させた。セライト濾過により反応系から１０％ Ｐｄ／Ｃを除去し、溶媒を減圧下留去した。続いて、塩化メチレン（１６ｍｌ）に溶解させ２−Ｎ−Ｂｏｃ−４−Ｎ−Ｆｍｏｃ−２，４−ジアミノ酪酸（７１０ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（３３２．２ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）とヒドロキシベンゾトリアゾール（２１７．５ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。系内に析出した白色粉体を濾別し、つづいて５％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（２７．７ｍｌ，１６．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し化合物２８を得た（４５３ｍｇ，４２％）。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．４４（９Ｈ，ｓ），１．７１−１．７６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．９１−１．９８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．２６（６Ｈ，ｓ），２．４１−２．４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．９０−２．９５（２Ｈ，ｍ），３．４４−３．４７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．９１（３Ｈ，ｓ），４．０１（３Ｈ，ｓ），４．５２（１Ｈ，ｓ），６．４６（１Ｈ，ｓ），６．６３（１Ｈ，ｓ），６．６７（１Ｈ，ｓ），７．１５（１Ｈ，ｓ），７．２６（１Ｈ，ｓ），７．３７（１Ｈ，ｓ），７．７７（１Ｈ，ｓ），８．２４（１Ｈ，ｓ），９．１０（１Ｈ，ｓ），９．６４（１Ｈ，ｓ）．ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３１Ｈ４８Ｎ１１Ｏ６ ＋ ：６７０．３７８９０，ｆｏｕｎｄ ６７０．３３８８３．
原料合成例１６：Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（２９）
事前に化合物１０（３０３．６ｍｇ，０．７７２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（７．０ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．２３９ｍｌ，１．４０４ｍｍｏｌ）とＯ−（ベンゾトリアゾール−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート（５３２．５ｍｇ，１．４０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。つづいて、塩化メチレン（７．０ｍｌ）に溶解させた化合物１９（４７０ｍｇ，０．７０２ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌させた。水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をクロロホルムとジエチルエーテルにより再沈殿処理を行うことで化合物２９を得た（６７３ｍｇ，９４％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３４（９Ｈ，ｓ），１．７０−１．７３（２Ｈ，ｔ，）１．７５−１９３（２Ｈ，ｍ），２．４１（６Ｈ，ｓ），２．６１（２Ｈ．ｍ），３．１９−３．２２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），３．２７−３．３７（２Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９２（３Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．０８−４．１３（１Ｈ，ｍ）６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），６．９７（１Ｈ，ｓ），７．０２（１Ｈ，ｓ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｓ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），７．３７（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．４９（１Ｈ，ｓ），７．５３（１Ｈ，ｓ），７．９７−７．８０（１Ｈ，，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．１５−８．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），９．９４（１Ｈ，ｓ），９．９９（１Ｈ，ｓ），１０．２７（１Ｈ，ｓ），１０．３４（１Ｈ，ｓ），１０．３６（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２６．１，２８．４，３２．２，３５．１，３５．３，３５．７，３６．３，３６．４，３６．５，３６．６，３８．４，４３．９，５２．６，５６．１，７８．４，７９．４，１０４．４，１０５．０，１０６．１，１１４．５，１１５．０，１１８．２，１１９．５，１１９．７，１２１．４，１２１．７，１２１．９，１２２．１，１２２．４，１２３．３，１２６．６，１２７．２，１３４．２，１３４．４，１３６．２，１３６．２，１３８．９，１５５．６，１５５．９，１５６．３，１５８．９，１５８．９，１６１．４，１６９．４．ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ６３Ｎ１８Ｏ９ ＋： １０２３．５０２５４，ｆｏｕｎｄ １０２３．４９８２１．
実施例３：化合物１ａ，１ｂ，１ｃ及び２を合成する一般的方法
化合物１ａの合成
化合物２６ａ（１８７．６ｍｇ，０．４７７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．７７ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．１６２ｍｌ，０．９４７ｍｍｏｌ）とＯ−（ベンゾトリアゾール−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート（３６１．８ｍｇ，０．９５４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。つづいて、塩化メチレン（４．８ｍｌ）に溶解させた化合物１０（４００ｍｇ，０．４７７ｍｍｏｌ）を加えさらに１時間撹拌させた。水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し化合物１ａを得た（３４９ｍｇ，６１％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．５９−１．６５（２Ｈ，ｍ），２．１５（６Ｈ，ｓ），２．２６−２．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５６−２．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１８−３．２２（２Ｈ，ｍ，），３．３７−３．５０（６Ｈ，ｍ），３．８１（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９４（３Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．２７−４．３０（４Ｈ，ｍ），４．７３（４Ｈ，ｓ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｓ），７．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．３５−７．３６（２Ｈ，ｍ），７．４６（１Ｈ，ｓ），７．４９（１Ｈ，ｓ），７．８６−７，８７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．９１−７．９３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．９８−７．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），８．０５−８．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），９．７７（１Ｈ，ｓ），９．８８（１Ｈ，ｓ），１０．０３（１Ｈ，ｓ），１０．０６（１Ｈ，ｓ），１０．１９（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ２７．２，３５．１，３５．１，３５．３，３６．０，３６．１，３６．２，３６．４，３６．５，３７．４，３８．８，３９．０，４５．３，５７．３，６９．８，７１．７，７１．８，７７．９，７８．０，７９．３，１０４．１，１０４．８，１０６．１，１１４．６，１１４．９，１１８．０，１１９．４，１１９．６，１２１．４，１２２１．７，１２２．２，１２２．３，１２２．４，１２３．５，１２６．６，１２７．２，１３４．１，１３４．４，１３６．２，１３８．９，１５５．９，１５６．３，１５８．９，１５８．９，１５９．２，１６１．２，１６８．２，１６８．６，１６９．０．ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒＣ５５Ｈ６６ＦｅＮ１９Ｏ９ ＋：１１９２．４６４０３，ｆｏｕｎｄ １１９２．３７０８９．
化合物１ｂと１ｃは上記一般的合成に従い、化合物２６ａの代わりに化合物２６ｂと２６ｃを原料に用いることで得た。化合物２は上記一般的合成に従い、化合物を２６ａと２０を原料に用いることで得た。
１ｂ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．５９−１．６３（２Ｈ，ｍ），１．８０−１．８３（２Ｈ，ｍ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２３−２．２６（２Ｈ，ｔ，ｊ＝６．８Ｈｚ），２．３１−２．３４（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．２Ｈｚ），３．１８−３．２３（４Ｈ，ｍ），３．４４−３．５０（４Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９４（３Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．２９−４．３２（４Ｈ，ｄ），４．７４（４Ｈ，ｓ）６．９０（１Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｓ），７．０４（１Ｈ，ｓ），７．１６（１Ｈ，ｓ），７．２２（１Ｈ，ｓ），７．２８（１Ｈ，ｓ）７．３９（１Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｓ），７．５３（１Ｈ，ｓ），７．９１−７．９３（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．０Ｈｚ），８．０４（１Ｈ，ｔ），８．１１−８．１２（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．１Ｈｚ），８．１４−８．１６（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．３Ｈｚ），９．８９（１Ｈ，ｓ），９．９８（１Ｈ，ｓ），１０．２３（１Ｈ，ｓ），１０．２４（１Ｈ，ｓ），１０．３８（１Ｈ，ｓ）．
１ｃ：
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．５８−１．６３（２Ｈ，ｍ，ｊ＝７．１Ｈｚ），１．７２−１．７５（２Ｈ，ｍ，ｊ＝６．７Ｈｚ），２．１３（６Ｈ，ｓ），２．２２−２．２５（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．１Ｈｚ），２．５６−２．５８（２Ｈ，ｔ，ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１７−３．２１（２Ｈ，ｑ，ｊ＝６．１，６．６Ｈｚ），３．２２−３．２６（２Ｈ，ｑ，ｊ＝６．１，６．６Ｈｚ），３．４４−３．４８（２Ｈ，ｑ，ｊ＝６．１，６．８Ｈｚ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９４（３Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．３０−４．３２（４Ｈ，ｍ），４．７２−４．７５（４Ｈ，ｍ），６．８９（１Ｈ，ｄ，ｊ＝２．０Ｈｚ），６．９２（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．０３（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．２１（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，ｊ＝１．７Ｈｚ）７．３９（２Ｈ，ｄ，ｊ＝２．２Ｈｚ），７．５０（１Ｈ，ｓ），７．５２（１Ｈ，ｓ），７．９３−７．９５（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．９Ｈｚ），７．９９−８．０１（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．９Ｈｚ，８．１４−８．１６（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．９Ｈｚ），９．９７（１Ｈ，ｓ），９．９９（１Ｈ，ｓ），１０．２４（１Ｈ，ｓ），１０．２７（１Ｈ，ｓ），１０．３８（１Ｈ，ｓ）．
化合物２
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．５９−１．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．１４（６Ｈ，ｓ），２．２３−２．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．５５−２．６０（４Ｈ，ｍ），３．１７−３．２１（２Ｈ，ｍ），３．３５−３．３７（２Ｈ，ｍ），３．４２−３．５０（６Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ．ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．９１（３Ｈ，ｓ），３．９３（３Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），４．２５−４．２６（２Ｈ，ｍ），４．２９（２Ｈ，ｍ），４．７２−４．７３（２Ｈ，ｍ），４．７４−４．７５（２Ｈ，ｍ），６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），６．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．９５（１Ｈ，ｓ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ） ７．３２（１Ｈ，ｓ） ７．４１（１Ｈ，ｓ） ７．５２（１Ｈ，ｓ） ７．９９−８．０１（２Ｈ ｍ） ８．１０−８．１２（２Ｈ，ｍ） ８．３４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ） ９．９５（１Ｈ，ｓ） １０．０（１Ｈ ｓ） １０．２（１Ｈ，ｓ） １０．２（１Ｈ，ｓ） １０．３（１Ｈ，ｓ）．
実施例４：Ｆｃ−ＰＩＡ ３（化合物３）の合成法
化合物２９（３００ｍｇ，０．２９３ｍｍｏｌ）を２０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレン（１．１６ｍｌ，２．９３ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温で１時間撹拌させた。水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。つづいて、塩化メチレン（２．９ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルアミン（０．１０ｍｌ，０．５８６ｍｍｏｌ）、フェロセンカルボン酸（６７．４ｍｇ，０．２９３ｍｍｏｌ）とＯ−（ベンゾトリアゾール−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート（１１１．１ｍｇ，０．２９３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０時間撹拌した。水で洗浄し、有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し化合物３を得た（２０４ｍｇ，６１％）。
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．５７−１．６２（２Ｈ，ｍ），２．１２（６Ｈ，ｓ），２．２２−２．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１６−３．２０（２Ｈ，ｍ），３．３７−３．４３（２Ｈ，ｍ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．９３（３Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．２２（５Ｈ，ｓ），４．３６−４．３７（２Ｈ，ｍ），４．８５（２Ｈ，ｍ），４．９４（２Ｈ，ｍ），６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．３７（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．４９（１Ｈ，ｓ），７．５２（１Ｈ，ｓ），７．８６−７．８７（１Ｈ，，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），８．０５−８．１０（２Ｈ，ｍ），９．９５（１Ｈ，ｓ），１０．０４（１Ｈ，ｓ），１０．２４（１Ｈ，ｓ），１０．２５（１Ｈ，ｓ），１０．２７（１Ｈ，ｓ），１０．３６（１Ｈ，ｓ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ２７．２，３５．１，３５．１，３５．３，３６．０，３６．１，３６．２，３６．４，３６．５，３７．４，３８．８，３９．０，４５．３，５７．３，６９．８，７１．７，７１．８，７７．９，７８．０，７９．４，１０４．１，１０４．８，１０６．１，１１４．６，１１４．９，１１８．０，１１９．４，１１９．６，１２１．４，１２１．７，１２２．０，１２２．３，１２２．４，１２３．５，１２６．６，１２７．２，１３４．１，１３４．４，１３６．２，１３８．９，１５５．９，１５６．３，１５８．９，１５８．９，１５９．２，１６１．２，１６８．２，１６８．６，１６９．０．ＭＳ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５３Ｈ６３ＦｅＮ１８Ｏ８ ＋ ： １１３５．４４２５７，ｆｏｕｎｄ １１３５，４３８８９．
実施例５：化合物１ａ、２、及び３のリガンドとしての特性
実施例２と同様に、上記化合物の二重鎖ＤＮＡに対するリガンドとしての有用性を確認する目的でターゲットＤＮＡ（５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＧＧ３’／３’ＣＴＧＡＣＧＣＡＴＣＣ５’）への結合をＣＤスペクトルによって検査した。その結果を図２に示した。本化合物による上記ＤＮＡの滴定のＣＤプロフィールである。副溝結合によって３００−３６０ｎｍにおける楕円偏光が誘起される。（Ｐｉｌｃｈ，Ｄ．Ｓ．；Ｐｏｋｌａｒ，Ｎ．；Ｂａｉｒｄ，Ｅ．Ｅ．；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９，３８，２１４３−２１５１．）ことはよく知られている。従ってターゲットＤＮＡの５μＭ溶液（緩衝液の組成は上記文献に従った）に添加することによって濃度依存性の正のコットン効果の増加が見られた。
実施例６：サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）による電気化学的特性の測定
ＣＶの使用によって上記化合物（１ａと３）の電気化学的特性を検討したその結果を図３に示す。この結果から本化合物がフェロセン部分の酸化に起因した電気化学反応の活性を有していることが示された。
本発明は、創薬、臨床検査、医薬品のスクリーニング、化学物質の安全性検査、食品検査、検疫、法医学的検査、醸造、農業、林業、水産業、及び、畜産等の幅広い産業分野で適用することが出来る。

Claims (25)

  1. 一般式（Ｉ）で表されるフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
    （一般式（Ｉ）中、Ａは二価のフェロセン含有リンカー又はフェロセン−１，１’−イルであり、Ｒ２は水素原子又はアルキルを示し、ｎ及びｍは任意の自然数を示し、Ｖ及びＸは以下の一般式（ＩＩ）又は式（ＩＩ−１）であり：
    Figure 2005087784
    Figure 2005087784
    Ｗは一般式（ＩＩＩ）であり：
    Figure 2005087784
    （一般式（ＩＩ）及び一般式（ＩＩＩ）中、Ｕは窒素原子、メチン、又はヒドロキシメチンを示す）；及び
    Ｚは一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）であり：
    Figure 2005087784
    Figure 2005087784
    且つ、一般式（Ｉ）において、Ｖ１のフェロセン含有リンカー又はフェロセン−１，１’−イル側の結合は（−ＣＯ−ＮＲ２−）であり、それ以外の各Ｖｎ及びＸｍの両端は（−ＣＯ−ＮＨ−）結合を形成する）。
  2. ｎ及びｍが、３〜２０の範囲の自然数であることを特徴とする、請求項１記載のフェロセン化合物。
  3. ｎはｍより一つ少ない数である、請求項１又は２に記載のフェロセン化合物。
  4. フェロセン含有リンカーが以下の一般式（ＶＩ）で表される請求項１〜３のいずれか一項に記載のフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
    （式中、Ｒ１及びＲ３は水素原子又はアルキルを示し、ｊ及びｋは同一又は異なる０から５までの整数を示す）。
  5. フェロセン含有リンカーが以下の一般式（ＶＩＩ）で表される請求項１〜３のいずれか一項に記載のフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
    （式中、Ｒ１及びＲ３は水素原子又はアルキルを示し、ｊ及びｋは同一又は異なる０から５までの整数を示す）。
  6. ｊ及びｋが１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
  7. Ｒ１及びＲ３は水素原子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
  8. フェロセン含有リンカーが以下の一般式（Ｘ）で表される請求項１〜３のいずれか一項に記載のフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
  9. Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が１個ないし数個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
  10. 下記構造式（ＶＩＩＩ）で表されるフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
  11. 下記構造式（ＩＸ）で表されるフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
  12. 下記構造式（１ｂ）で表されるフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
  13. 下記構造式（１ｃ）で表されるフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
  14. 下記構造式（２）で表されるフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
  15. 下記構造式（３）で表されるフェロセン化合物：
    Figure 2005087784
  16. フェロセンジカルボン酸メチル、アミノフェロセンカルボン酸メチル、又は、フェロセンカルボン酸を出発物質とし、縮合反応を含む工程から成る、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のフェロセン化合物の製造方法。
  17. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のフェロセン化合物から成る二本鎖核酸分子の配列特異的検出用リガンド。
  18. 二本鎖核酸分子の配列特異的に結合することができる化合物を使用することを特徴とする二本鎖核酸分子の電気化学的検出方法。
  19. 請求項１７記載のリガンドを使用することを特徴とする、請求項１８記載の配列特異的な二本鎖核酸分子の電気化学的検出方法。
  20. 検出対象である二本鎖核酸分子におけるＧ／Ｃ塩基対及びＡ／Ｔ（Ｕ）対に対して、一般式（Ｉ）中の対応する位置にあるＶ及びＸの対が、夫々、イミダゾール誘導体／ピロール誘導体及びピロール誘導体／誘導体で構成される請求項１７記載のリガンドを使用することを特徴とする、請求項１６記載の方法。
  21. 二本鎖核酸分子の形成が固相上で行われることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸分子の電気化学的検出方法。
  22. ＤＮＡマイクロアレイを用いることを特徴とする、請求項２１記載の核酸分子の電気化学的検出方法。
  23. 請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の核酸分子の電気化学的検出方法を用いる１塩基多型（ＳＮＰ）の検出方法。
  24. 請求項１７記載の配列特異的二本鎖核酸分子検出用リガンドを含む電気化学的検出装置又は器具。
  25. ＤＮＡマイクロアレイである、請求項２４記載の電気化学的検出装置又は器具。
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