JPWO2005044857A1 - ヒト化抗cd47抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] CD47に結合するヒト化抗体。
[2] CD47がヒトCD47である前記[1]に記載のヒト化抗体。
[3] ヒト化抗体のCDRがマウス抗体由来である前記[1]または[2]に記載のヒト化抗体。
[4] 以下の配列のいずれかを含む前記[1]〜[3]のいずれかに記載のヒト化抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。
[5] 以下の配列のいずれかを含む前記[1]〜[3]のいずれかに記載のヒト化抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(2)配列番号10のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(3)配列番号13のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(4)配列番号16のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(5)配列番号19のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(6)配列番号22のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(7)配列番号30のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(8)配列番号37のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(9)配列番号40のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(10)配列番号43のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(11)配列番号46のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(12)配列番号49のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(13)配列番号52のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(14)配列番号57のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(15)配列番号64のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(16)配列番号67のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)。
[6] 低分子化抗体である前記[1]〜[5]のいずれかに記載のヒト化抗体。
[7] ダイアボディ(Diabody)である請前記[6]記載のヒト化抗体。
[8] 一本鎖Diabodyである前記[7]記載のヒト化抗体。
[9] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフィド結合が存在することを特徴とする前記[7]または[8]に記載のヒト化抗体。
[10] 以下の特徴を有する前記[9]記載のヒト化抗体:
(1)配列番号90に記載のアミノ酸配列を有する抗体;又は
(2)アミノ酸配列(1)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつCD47への結合活性を有する抗体。
[11] 以下の特徴を有する前記[9]記載のヒト化抗体:
(1)配列番号92に記載のアミノ酸配列を有する抗体;又は
(2)アミノ酸配列(1)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつCD47への結合活性を有する抗体。
[12] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフィド結合が存在することを特徴とする、ヒトCD47に結合するDiabody抗体。
[13] 以下の配列のいずれかを含む前記[12]に記載のDiabody抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。
[14] 以下の配列を含むCD47に結合するヒト化抗体:
(1)配列番号30のアミノ酸番号1〜117の配列の配列を含むH鎖V領域:及び
(2)配列番号57のアミノ酸番号1〜112の配列の配列を含むL鎖V領域。
[15] 以下の配列を含むCD47に結合するヒト化抗体:
(1)配列番号64のアミノ酸番号1〜117の配列を含むH鎖V領域:及び
(2)配列番号67のアミノ酸番号1〜112の配列を含むL鎖V領域。
[16] 以下のいずれかの配列を含むCD47に結合する抗体:
(1)配列番号73のアミノ酸番号1〜234の配列
(2)配列番号74のアミノ酸番号1〜234の配列
(3)配列番号78のアミノ酸番号1〜483の配列
(4)配列番号79のアミノ酸番号1〜483の配列。
[17] 前記[1]〜[16]のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
[18] 前記[17]に記載の遺伝子を含むベクター。
[19] 前記[18]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[20] 前記[19]に記載の宿主細胞を培養する工程を含む抗体の製造方法。
[21] 前記[1]〜[16]のいずれかに記載の抗体を含む血液疾患治療薬。
[22] 血液疾患が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫(Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫)、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、及び真性多血症から選択される前記[21]記載の治療薬。
本発明で用いられるCD47は特に限定されず、どのような動物由来のCD47でもよいが、好ましくは哺乳動物由来CD47であり、さらに好ましくはヒトCD47である。ヒトCD47のアミノ酸配列・塩基配列は既に公知である(J. Cell. Biol., 123, 485-496,(1993)、Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, (1995)、GenBank:Z25521)。
ヒト化抗体
本発明は、抗CD47抗体のヒト化抗体に関するものである。
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。
(1)配列番号7のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(2)配列番号10のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(3)配列番号13のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(4)配列番号16のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(5)配列番号19のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(6)配列番号22のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(7)配列番号30のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(8)配列番号37のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(9)配列番号40のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(10)配列番号43のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(11)配列番号46のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(12)配列番号49のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(13)配列番号52のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(14)配列番号57のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(15)配列番号64のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(16)配列番号67のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)。
抗CD47抗体の作製及びCDR配列
非ヒト動物由来抗体のCDR配列は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。
FR配列
ヒト由来FR配列は既にアミノ酸配列が解明されている既知のヒト抗体の配列を使用することが可能である。例えば、Protein Data bankに登録されている天然ヒト抗体の配列を利用することが可能である。
抗体修飾物
本発明の抗体には、抗体に各種分子を結合させた抗体修飾物も含まれる。抗体の修飾物として、細胞傷害性物質やポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。細胞障害性物質としては、例えば、放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等を挙げることができる。本発明における「抗体」には、このような他の物質と結合している抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
又、抗体の細胞障害活性を増強させる目的で、抗体の糖鎖を改変する技術も知られている(例えば、WO/0061739、WO02/31140など)。
低分子化抗体
本発明の抗体は、低分子化されている低分子化抗体が好ましい。
[VH]linker(5)[VL]linker(15)[VH]linker(5)[VL]
[VL]linker(5)[VH]inker(15) [VH]linker(5)[VL]
[VH] linker(5) [VL] linker(15) [VL] linker(5) [VH]
[VH] linker(5) [VH] linker(15) [VL] linker(5) [VL]
さらに、Diabody作製と同じ原理で、Diabodyを構成するフラグメントを3つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可能である。
安定化Diabody
本発明はさらに、安定化されたDiabodyを提供する。本発明において安定化されたDiabodyとは、Diabodyを構成するフラグメント間に共有結合が存在するDiabodyのことをいう。Diabodyを構成するフラグメント間に存在する共有結合は、特に限定されずどのような共有結合でもよいが、本発明においてはジスルフィド結合を好適に用いることができる。ジスルフィド結合は当業者に公知の方法でDiabodyに導入することが可能であり、例えば、国際公開公報WO94/29350の方法で行うことが可能である。
VH44 − VL100
VH105 − VL43
VH105 − VL42
VH44 − VL101
VH106 − VL43
VH104 − VL43
VH44 − VL99
VH45 − VL98
VH46 − VL98
VH103 − VL43
VH103 − VL44
VH103 − VL45
上記アミノ酸番号の位置はKabat and Wuにより利用される番号付け系における位置である。本発明においては、好ましい位置としてはVH44 − VL100、VH105 − VL43を挙げることができる。
リンカー
本発明において、H鎖V領域とL鎖V領域とを連結するリンカー又は一本鎖Diabodyを作製する際のDiabodyを構成するフラグメント同士を連結するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合:
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。リンカーペプチドの長さは目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
抗体の製造
前記のようにして得られた本発明の抗体をコードする遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター/エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター/エンハンサー( human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)を挙げることができる。
抗体の活性の確認
抗体の抗原結合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができる。
アポトーシス誘起活性の確認
アポトーシスを誘起するか否かの確認は、当業者に公知の方法で行うことが可能である(例えば、日本公開公報:特開平9-295999など)。具体的には、実施例に記載の方法や、ヒト白血病細胞やCD47遺伝子を導入したJurkat細胞・L1210細胞・JOK-1細胞などのCD47発現細胞を、被検抗体の存在下で培養し、MTS法やフローサイトメトリーによりアポトーシスを検出する方法などにより行うことが可能である。
血液疾患治療薬
本発明はまた、本発明の抗体を有効成分として含有する血液疾患治療薬に関する。本発明の血液疾患治療薬は、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫(Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫)、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、真性多血症などの血液疾患の治療に有用である。
マウスモノクローナル抗体のCDRがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のFRとヒト抗体のFRとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウスMABL-2抗体(WO00/53634)のL鎖およびH鎖のV領域を、Protein Data Bankを用いて構造が解明されている既知の天然ヒト抗体のV領域と比較した。
(i)1次デザイン
マウスMABL-2抗体のH鎖V領域と4クローンが75.9%の相同性を示した。このうち、CDR近辺のアミノ酸は抗原結合に大きく関与している可能性があるため、CDR1の直前の30位が保存されているヒト抗体AF216824(Miklos J.A.ら、Blood,95, 3878-3884, 2000)由来のFRを用いることとした。ヒト化MABL-2抗体H鎖(バージョン"1.1")において、FR1からFR4まではヒト抗体AF216824のFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のH鎖V領域中のCDRと同一とした。AF216824にはLeader配列の情報がなかったため、Leader配列はマウスMABL-2 VHのものを用いた。
ヒト化MABL-2抗体H鎖 バージョン"1.3" について、72位のアミノ酸の保存およびFR2のできる限りの保存を考慮し、再度相同性を検索した。このうち、72位が保存されているヒト抗体HUMIGHDJCD(Chai S. K.ら、Unpublished 1994)由来のFRを用いることとした。ヒト化MABL-2抗体H鎖バージョン"2.1"において、FR1からFR4まではヒト抗体HUMIGHDJCDのFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のH鎖V領域中のCDRと同一とした。HUMIGHDJCDにもLeader配列の情報がなかったため、Leader配列はマウスMABL-2 VHのものを用いた。
(i)1次デザイン
マウスMABL-2抗体のL鎖V領域と2クローンが83.8%の相同性を示した。このうち、CDR3のサイズが等しいヒト抗体HSJC11VJ(Kennedy M.A.、J. Exp. Med, 173 (4), 1033-1036, 1991)由来のFRを用いることとした。ヒト化MABL-2抗体L鎖(バージョン"1.1")において、FR1からFR4まではヒト抗体HSJC11VJのFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のL鎖V領域中のCDRと同一とした。Leader配列はヒト抗体HSJC11VJのものを用いた。
ヒト化MABL-2抗体L鎖について、FR2のWYLQ-PGQSP--LIYという配列の保存を考慮し、再度相同性を検索した。このうち、相同性の最も高かったヒト抗体1802359A(Pascual V.ら、J. Immunol., 146(12), 4385-4391, 1991)由来のFRを用いることとした。ヒト化huM2抗体L鎖バージョン"2.1"において、FR1からFR4まではヒト抗体1802359AのFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のL鎖V領域中のCDRと同一とした。1802359A のLeader配列の情報はなかったため、1次デザインで用いたヒト抗体HSJC11VJのものを用いた。
ヒト化抗体の各鎖の抗原結合活性を評価するため、前記発現プラスミドと陽性対照としてキメラMABL-2抗体をCOS-7細胞で一過性に発現させた。すなわちH鎖の一過性発現では、ヒト化MABL-2抗体H鎖発現ベクター(HEF-huM2H1.1#1, HEF-huM2H1.2#1, HEF-huM2H1.3#2, HEF-huM2H1.4#1, HEF-huM2H1.5#1, HEF-huM2H2.1#3)とキメラL鎖発現ベクターHEF-M2L3(WO00/53634)との組み合わせを、L鎖の一過性発現では、ヒト化MABL-2抗体L鎖発現ベクター(HEF-huM2L1.1#3, HEF-huM2L1.2#1, HEF-huM2L1.3#1, HEF-huM2L1.4#1, HEF-huM2L1.5#1、HEF-huM2L2.1#1)とキメラH鎖HEF-M2H3(WO00/53634)との組み合わせを、それぞれFugene 6 Transfection Reagent(ロシュ・ダイアグノスティックス)を用いてCOS-7細胞に同時形質導入した。1.5 x 105 細胞を10%のウシ胎児血清(GIBCO)を含むDMEM培養液(GIBCO)2 mLにて一晩培養した。そこへ室温で1時間反応させた、各プラスミド2 mgずつとFugene 6 Transfection Reagent 6 mLを含む総量100 mL のDMEM培養液を添加した。37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した後、1% HT supplement(GIBCO)を含むCHO-S-SFMII培地(GIBCO)2 mLへ培地交換を行った。37℃、5%CO2の条件下で72時間培養した後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ELISAの試料に供した。
得られた抗体の濃度測定はELISAにより行った。ELISA用96穴プレート(Maxsorp,NUNC)の各穴を固相化バッファー(0.1 mol/L NaHCO3, 0.02% NaN3 )で2 mg/mLの濃度に調製したマウス 抗ヒト Kappa Light Chain(Zymed)100 mLで固相化し、300 mLの希釈バッファー(50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L MgCl2 、0.15 mol/L NaCl、0.05% Tween20、0.02% NaN3 、1% 牛血清アルブミン(BSA)、pH8.1)でブロッキングの後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させたCOS-7細胞の培養上清を段階希釈して各穴に100 mLずつ加えた。1時間室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(Zymed)100 mLを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、1 mg/mLの基質溶液(Sigma104、p−ニトロフェニルリン酸、SIGMA)を加え、次に405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。濃度測定のスタンダードとして、ヒトIgG1, kappa(SIGMA)を用いた。
ヒト化抗体は下記の抗原結合活性および結合阻害活性にて評価を行った。
抗原結合活性測定のためのELISAプレートを、次のようにして調製した。ELISA用96穴プレートの各穴を固相化バッファーで3 μg/mLの濃度に調製した抗FLAG抗体(SIGMA)100 μLで固相化した。300 μLの希釈バッファーでブロッキングの後、1 μg/mLの濃度に調製したFLAG標識可溶型ヒトCD47(WO00/53634)を100 μL加え、室温で1時間インキュベーションした。洗浄後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させたCOS-7細胞の培養上清を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(Zymed)100 μLを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、1 mg/mLの基質溶液(Sigma104、p−ニトロフェニルリン酸、SIGMA)を加え、次に405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。
結合阻害活性測定のためのプレートは以下のようにして調製した。抗原結合活性と同様、ELISA用96穴プレートの各穴を固相化バッファーで3 μg/mLの濃度に調製した抗FLAG抗体(SIGMA)100 μLで固相化した。300 μLの希釈バッファーでブロッキングの後、1 μg/mLの濃度に調製したFLAG標識可溶型ヒトCD47(WO00/53634)を100 μL加え、室温で1時間インキュベーションした。洗浄後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させたCOS-7細胞の培養上清を段階希釈したものと0.6 μg/mLのビオチン標識MABL-2を等量混合した溶液を100 μLずつ加えた。室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン(Zymed)100 μLを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、1 mg/mLの基質溶液(Sigma104、p−ニトロフェニルリン酸、SIGMA)を加え、次に405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。
(i) ヒト化H鎖の評価
ヒト化H鎖バージョン1.1、1.2、1.3とキメラL鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度のヒトCD47結合活性を示した(図1)。しかし、MABL-2による結合阻害活性ではバージョン1.1の阻害活性はバージョン1.2、1.3に比べて弱かった。また、バージョン1.3はキメラ抗体とほぼ同等の阻害活性を持ち、バージョン1.2と同等もしくは若干強い阻害活性を示した(図2)。この結果は、72位のアミノ酸残基の保存が重要であり、30位のアミノ酸残基はトレオニン(バージョン1.3)でも良いことを示す。
ヒト化L鎖バージョン1.1、1.2、1.3とキメラH鎖を組み合わせた抗体は三種ともほぼ同等のヒトCD47に対する結合活性を示したが、キメラ抗体より弱い活性を示した(図6)。さらに、MABL-2による結合阻害活性では三種いずれもキメラ抗体に比べて弱かった(図7)。この結果は、51位、92位のアミノ酸残基は特に重要ではなく、他に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
ヒト化H鎖バージョン2.1とヒト化L鎖バージョン2.1を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度もしくはそれ以上のMABL-2による結合阻害活性、すなわちhCD47に対する親和性を示した(図11)。これより、FRに関してH鎖、L鎖とも単一の天然ヒト抗体の配列を持つ、ヒト化MABL-2抗体の構築ができた。
実施例2:ヒト化MABL-1抗体の構築
マウスMABL-1抗体(WO00/53634)についてもヒト化を行った。マウスMABL-1抗体とマウスMABL-2抗体におけるCDRのアミノ酸配列はH鎖で3残基、L鎖で4残基異なるのみである。これより、マウスMABL-1抗体のヒト化抗体の構築は〔実施例1〕に示したマウスMABL-2抗体の二次デザイン(huM2Hバージョン2.1、huM2L2.1バージョン2.1)をもとに構築することとした。
ヒト化MABL-1抗体H鎖バージョン"2.1"の作製のために8個の合成オリゴDNAを使用した。合成オリゴDNA 、HuMHS(配列番号5)、M1CH1MS(配列番号58)、M1CH2GS(配列番号59)、M1CH3SS(配列番号60)はセンスDNA配列を有し、M1CH1MAS(配列番号61)、M1CH2GAS(配列番号62)、M1CH3SAS(配列番号63)、HuMHAS(配列番号6)はアンチセンスDNA配列を有する。
ヒト化MABL-1抗体L鎖バージョン"2.1"の作製のために4個の合成オリゴDNAを使用した。合成オリゴDNA、HuMLS(配列番号5)、M1CL1aS(配列番号65)はセンスDNA配列を有し、M1CL1aAS(配列番号66)、HuMLAS(配列番号6)はアンチセンスDNA配列を有する。
ヒト化MABL-1抗体H鎖発現ベクターHEF-huM1L2.1#1とヒト化MABL-1抗体L鎖発現ベクターHEF-huM1L2.1#1を用いて、上記COS-7細胞へのトランスフェクションの方法に従ってヒト化MABL-1抗体を調製した。また、抗体濃度の測定、抗体の活性測定も実施例1に示した方法に従って行った。
ヒト化H鎖バージョン2.1とヒト化L鎖バージョン2.1を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度もしくはそれ以上のMABL-1による結合阻害活性、すなわちhCD47に対する親和性を示した(図12)。これより、FRに関してH鎖、L鎖とも単一の天然ヒト抗体の配列を持つ、ヒト化MABL-1抗体の構築ができた。
実施例3:ヒト化MABL-1抗体、ヒト化MABL-2抗体のアポトーシス誘起効果
ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞を用い、ヒト化MABL-1抗体、ヒト化MABL-2抗体のアポトーシス誘起作用をAnnexin-V(ロシュ・ダイアグノスティクス)染色により検討した。細胞1 x 105個に、各ヒト抗体発現COS-7細胞培養上清を抗体濃度として300 ng/mL, 100 ng/mL, 33.3 ng/mLずつ添加し、24時間培養した。その後、Annexin-V染色を行い、FACScan装置(BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞に著しい細胞死を誘導した(図13)。
実施例4:ヒト化MABL-1抗体及びヒト化MABL-2抗体由来一本鎖Fvの作製
(1)ヒト化MABL-2抗体一本鎖Fv(HL5)の作製
5 merのペプチドリンカーを有し、N末端より[H鎖]−[L鎖]の順となるようにV領域を連結したヒト化MABL-2抗体一本鎖Fv(HL5)を次の様にして作製した。ヒト化MABL-2抗体H鎖V領域、及びヒト化MABL-2抗体L鎖V領域をそれぞれPCR法にて増幅し、連結することにより、ヒト化MABL-2抗体HL5を作製した。ヒト化MABL-2抗体HL5の作製のために4個のPCRプライマー(A〜D)を使用した。プライマーA、Cはセンス配列を有し、プライマーB、Dはアンチセンス配列を有する。
ヒト化MABL-1抗体HL5を前記ヒト化MABL-2抗体一本鎖Fv(HL5)の作製に従って作製した。第一PCRにおいては、HEF-huM2H2.1#3の代わりにヒト化MABL-1抗体H鎖V領域をコードするプラスミドHEF-huM1H2.1#1(実施例2を参照)、及びHEF-huM2L2.1#1の代わりにヒト化MABL-1抗体抗体L鎖V領域をコードするプラスミドHEF-huM1L2.1#1(実施例2を参照)を使用し、PCR生成物huM1Db-1およびhuM1Db-2を得た。これらを用いた第二PCRにより、ヒト化MABL-1抗体HL5の正しいアミノ酸配列をコードするDNA断片を含むプラスミドpCHOhuM1Dbを得た。本プラスミドpCHOhuM1Dbに含まれるヒト化MABL-1抗体HL5の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号74に示す。
実施例5:2つのH鎖V領域及び2つのL鎖V領域を含むsc(Fv)2の作製
(1)ヒト化MABL−2抗体sc(Fv)2発現プラスミドの構築
5 mer、15 mer、5 merのペプチドリンカーを有し、N末端より[H鎖]−[L鎖]−[H鎖]−[L鎖]の順となるようにV領域を連結したヒト化MABL−2抗体sc(Fv)2を発現するプラスミドを作製するため、前述のPCR生成物huM2Db-1およびhuM2Db-2を以下に示す通りPCR法により更に修飾し、得られたDNA断片をpCHO1−Igsベクターに導入した。
5 mer、15 mer、5 merのペプチドリンカーを有し、N末端より[H鎖]−[L鎖]−[H鎖]−[L鎖]の順となるようにV領域を連結したヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2を発現するプラスミドを作製するため、前記ヒト化MABL−2抗体sc(Fv)2発現プラスミドの構築に従い、行った。
前記MABL-2抗体HL5及びsc(Fv)2、MABL-1抗体HL5及びsc(Fv)2の恒常的発現CHO細胞株を樹立するため、pCHOhuM1Db、pCHOhuM1scDb、pCHOhuM2Db、pCHOhuM2scDbベクターをCHO細胞に遺伝子導入した。
前記(4)で得られた培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの3つの工程によりヒト化MABL-1とヒト化MABL-2のそれぞれHL5及びsc(Fv)2の精製(計4種類)を行った。いずれの4種類の抗体も全く同じ方法で精製をした。ヒト化MABL-1及びヒト化MABL-2の違い、HL5及びsc(Fv)2の違いにより、精製結果はほとんど変わらなかった。このため精製方法についてはまとめて記載した。図はヒト化MABL-1抗体HL5の場合の精製例のみを示した。
実施例6:ヒト化MABL-1抗体HL5及びsc(Fv)2、ヒト化MABL-2抗体HL5及びsc(Fv)2のin vitro でのアポトーシス誘起効果
ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞、MOLT4細胞(ATCC)、JOK-1細胞(林原生物化学研究所 藤崎細胞センター)を用い、ヒト化MABL-1抗体HL5およびsc(Fv)2、ヒト化MABL-2抗体HL5およびsc(Fv)2のアポトーシス誘起作用をAnnexin-V(ロシュ・ダイアグノスティクス)染色により検討した。細胞1 x 105個に、各抗体を50 nmol/Lから10倍希釈ずつ0.005 nmol/Lまで、もしくは抗体の代わりにPBS(-)を添加し、24時間培養した。その後、Annexin-V染色を行い、FACSCaribur装置(BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、いずれの細胞においても細胞死を誘導した。図20にMOLT4細胞における結果を示した。
実施例7:ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2の白血病モデル動物での薬効試験
(1)ヒト白血病マウスモデルの作製
ヒト白血病マウスモデルは以下のように作製した。SCIDマウス(日本クレア)を用いてJOK-1細胞(林原生物化学研究所 藤崎細胞センター)をRPMI1640培地(GIBCO BRL社製)で2.5×107個/mLになるように調製した。あらかじめ前日抗アシアロGM1抗体(和光純薬社製、1バイアルを5mLで溶解)100μLを皮下投与したSCIDマウス(オス、6週齢)(日本クレア)に上記JOK-1細胞懸濁液200μL(5×106個/マウス)を尾静脈より注入した。
ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2を投与当日、濾過滅菌したPBS(−)を用いて、1 mg/mL、になるように調製し、投与試料とした。
(3)抗体投与
(1)で作製したヒト白血病マウスモデルに対し、JOK-1細胞移植後3日目より、1日2回、5日間、上記(2)で調製した投与試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、濾過滅菌したPBS(−)を同様に1日2回、5日間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。いずれの群も、1群7匹で行った。
(4)抗腫瘍効果の評価
ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2のヒト白血病マウスモデルにおける抗腫瘍効果については生存期間で評価した。その結果、図21に示すとおり、ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2投与群ではPBS(−)投与群と比較して生存期間の延長が認められた。
実施例8:S-S結合導入ヒト化MABL-2 HL5の作製
(1)ヒト化MABL-2抗体HL5へのS-S結合配列導入
実施例4で構築したヒト化MABL-2抗体HL5の2ヶ所のアミノ酸をシステイン残基に変換し、DiabodyのS-S結合による安定化のための実験を行った(図22)。
Ctcgaggaattcccaccatgggatggagctgtatcatcc 5F44-100(共通)(配列番号80)
Gggggcctgtcgcagccagtgaataac 5R44-100(配列番号81)
Gggcagtcagtgtatacggccgtgtcgtcagatctgagactgctc 5R105-43(配列番号82)
Gggcaatgccttgagtggatgggatatatttatcc 3F44-100(配列番号83)
Tcattatttgatctcaagcttggtcccgcagccaaacgtgtacggaacatgtgt 3R44-100(配列番号84)
Tactattgtgctagagggggttactatacttacgacgactggggctgcgcaaccctggtcacagtctc MF105-43(配列番号85)
Gggcttctgcagataccaatgtaaataggtctttc MR105-43(配列番号86)
Gggcagtgcccaagactcctgatctacaaagtttcc 3F105-43(配列番号87)
Tcattatttgatctcaagcttggtcccctggccaaac 3R105-43(配列番号88)
PCR反応はKODポリメラーゼ(東洋紡)、鋳型としpCHOhuM2Dbを用い、94℃、1分の変性後、98℃ 30秒、65℃ 2秒、74℃ 30秒を30サイクル行った。
(i)Cys44(VH) / Cys 100(VL)用の変異の導入は、5F44-100 / 5R44-100、3F44-100 / 3R44-100のプライマーの組み合わせでPCR反応を行い、pBluescriptSK+(Stratagene社)のSmaI部位に3'側断片、5'断片の順にRapid DNA ligation kit (Roche社)を用いて逐次連結した。
(ii)Cys 105(VH) / Cys 43(VL)用の変異の導入は、5F44-100 / 5R105-43、MF105-43 / MR105-43、3F105-43 / 3R105-43のプライマーの組み合わせでPCRを行い、5F44-100 / 5R105-43、3F105-43 / 3R105-43で得たPCR断片をpBluescriptSK+のSmaI部位に逐次連結し、その後5R105-43およびMF105-43に予め保存的変異を導入してデザインしたBsT107I部位とSmaI部位を利用してMF105-43 / MR105-43断片を連結して得た。構築したそれぞれのプラスミドを大腸菌DH5a株(東洋紡社)に導入し、得られた組換え大腸菌からプラスミドを精製(QIAGEN社)し、ABI3100 Genetic Analyzerで解析を行った。
phMABL2(SS44)およびphMABL2(SS105)のそれぞれ10mgを4×106細胞のCHO細胞(DXB11)へとエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990)]により導入した。導入後細胞は50 mLのaMEM-FBSに縣濁し、95ウェルプレート(Corning社)5枚にウェルあたり100 mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、培地を100mg/mLのHygromycinBを含むaMEM-FBSに代え、さらにHygromaycinB濃度を段階的に200 mg/mL、400mg/mLに上げ、選抜を行った。
上記(2)で得られたヒト化MABL-2 HL5 SS44およびSS105の産生細胞株を100 nM MTX、400 mg/mL Hygromycin Bを含む無血清培地CHO-S-SFII(GIBCO BRL社製)で100 mLのスピナーフラスコで2週間培養し、馴化を行った。馴化した細胞は拡大培養のため、1 L(培地量700 mL、)または8 Lスピナーフラスコ(培地量6L)にそれぞれ1×107、1×108の細胞を巻き込み、3または7日間培養して、培養上清を回収した。
上記(3)で得られた培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの3つの工程によりヒト化MABL-2HL5のSS44及びSS105精製(2種類)を行った。いずれの2種類の抗体も全く同じ方法で精製をしたが、精製結果に違いはほとんど見られなかったため、区別せずに記述した。
実施例9:S-S結合導入ヒト化MABL-2抗体HL5のin vitro でのアポトーシス誘起効果
ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞、JOK-1細胞(林原生物化学研究所 藤崎細胞センター)を用い、S-S結合導入ヒト化MABL-2抗体HL5のアポトーシス誘起作用をAnnexin-V(ロシュ・ダイアグノスティクス)染色により検討した。細胞1 x 105個に、各抗体を50 nmol/Lから10倍希釈ずつ0.005 nmol/Lまで、もしくは抗体の代わりにPBS(-)を添加し、24時間培養した。その後、Annexin-V染色を行い、FACSCaribur装置(BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、いずれの細胞にも細胞死を誘導した。図25にヒト化MABL-2 HL5 SS44のヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞に対するアポトーシス誘導効果の結果を示した。
[1] CD47に結合するヒト化抗体。
[2] CD47がヒトCD47である前記[1]に記載のヒト化抗体。
[3] ヒト化抗体のCDRがマウス抗体由来である前記[1]または[2]に記載のヒト化抗体。
[4] 以下の配列のいずれかを含む前記[1]〜[3]のいずれかに記載のヒト化抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。
[5] 以下の配列のいずれかを含む前記[1]〜[3]のいずれかに記載のヒト化抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(2)配列番号10のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(3)配列番号13のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(4)配列番号16のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(5)配列番号19のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(6)配列番号22のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(7)配列番号30のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(8)配列番号37のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(9)配列番号40のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(10)配列番号43のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(11)配列番号46のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(12)配列番号49のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(13)配列番号52のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(14)配列番号57のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(15)配列番号64のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(16)配列番号67のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)。
[6] 低分子化抗体である前記[1]〜[5]のいずれかに記載のヒト化抗体。
[7] ダイアボディ(Diabody)である請前記[6]記載のヒト化抗体。
[8] 一本鎖Diabodyである前記[7]記載のヒト化抗体。
[9] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフィド結合が存在することを特徴とする前記[7]または[8]に記載のヒト化抗体。
[10] 以下の特徴を有する前記[9]記載のヒト化抗体:
(1)配列番号90に記載のアミノ酸配列を有する抗体;又は
(2)アミノ酸配列(1)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつCD47への結合活性を有する抗体。
[11] 以下の特徴を有する前記[9]記載のヒト化抗体:
(1)配列番号92に記載のアミノ酸配列を有する抗体;又は
(2)アミノ酸配列(1)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつCD47への結合活性を有する抗体。
[12] Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフィド結合が存在することを特徴とする、ヒトCD47に結合するDiabody抗体。
[13] 以下の配列のいずれかを含む前記[12]に記載のDiabody抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。
[14] 以下の配列を含むCD47に結合するヒト化抗体:
(1)配列番号30のアミノ酸番号1〜117の配列の配列を含むH鎖V領域:及び
(2)配列番号57のアミノ酸番号1〜112の配列の配列を含むL鎖V領域。
[15] 以下の配列を含むCD47に結合するヒト化抗体:
(1)配列番号64のアミノ酸番号1〜117の配列を含むH鎖V領域:及び
(2)配列番号67のアミノ酸番号1〜112の配列を含むL鎖V領域。
[16] 以下のいずれかの配列を含むCD47に結合する抗体:
(1)配列番号73のアミノ酸番号1〜234の配列
(2)配列番号74のアミノ酸番号1〜234の配列
(3)配列番号78のアミノ酸番号1〜483の配列
(4)配列番号79のアミノ酸番号1〜483の配列。
[17] 前記[1]〜[16]のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
[18] 前記[17]に記載の遺伝子を含むベクター。
[19] 前記[18]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[20] 前記[19]に記載の宿主細胞を培養する工程を含む抗体の製造方法。
[21] 前記[1]〜[16]のいずれかに記載の抗体を含む血液疾患治療薬。
[22] 血液疾患が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫(Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫)、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、及び真性多血症から選択される前記[21]記載の治療薬。
本発明で用いられるCD47は特に限定されず、どのような動物由来のCD47でもよいが、好ましくは哺乳動物由来CD47であり、さらに好ましくはヒトCD47である。ヒトCD47のアミノ酸配列・塩基配列は既に公知である(J. Cell. Biol., 123, 485-496,(1993)、Journal of Cell Science, 108, 3419-3425, (1995)、GenBank:Z25521)。
ヒト化抗体
本発明は、抗CD47抗体のヒト化抗体に関するものである。
CD47への結合活性を有する限り、本発明のヒト化抗CD47抗体のCDR、FRのアミノ酸配列は特に限定されず、どのような配列を用いてもよい。CDRとしては以下のいずれかのアミノ酸配列をもつものが好ましい:
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。
(1)配列番号7のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(2)配列番号10のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(3)配列番号13のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(4)配列番号16のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(5)配列番号19のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(6)配列番号22のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(7)配列番号30のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(8)配列番号37のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(9)配列番号40のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(10)配列番号43のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(11)配列番号46のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(12)配列番号49のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(13)配列番号52のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(14)配列番号57のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(15)配列番号64のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(16)配列番号67のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)。
抗CD47抗体の作製及びCDR配列
非ヒト動物由来抗体のCDR配列は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。
FR配列
ヒト由来FR配列は既にアミノ酸配列が解明されている既知のヒト抗体の配列を使用することが可能である。例えば、Protein Data bankに登録されている天然ヒト抗体の配列を利用することが可能である。
抗体修飾物
本発明の抗体には、抗体に各種分子を結合させた抗体修飾物も含まれる。抗体の修飾物として、細胞傷害性物質やポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。細胞障害性物質としては、例えば、放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等を挙げることができる。本発明における「抗体」には、このような他の物質と結合している抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
又、抗体の細胞障害活性を増強させる目的で、抗体の糖鎖を改変する技術も知られている(例えば、WO/0061739、WO02/31140など)。
低分子化抗体
本発明の抗体は、低分子化されている低分子化抗体が好ましい。
[VH]linker(5)[VL]linker(15)[VH]linker(5)[VL]
[VL]linker(5)[VH]inker(15) [VH]linker(5)[VL]
[VH] linker(5) [VL] linker(15) [VL] linker(5) [VH]
[VH] linker(5) [VH] linker(15) [VL] linker(5) [VL]
さらに、Diabody作製と同じ原理で、Diabodyを構成するフラグメントを3つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可能である。
安定化Diabody
本発明はさらに、安定化されたDiabodyを提供する。本発明において安定化されたDiabodyとは、Diabodyを構成するフラグメント間に共有結合が存在するDiabodyのことをいう。Diabodyを構成するフラグメント間に存在する共有結合は、特に限定されずどのような共有結合でもよいが、本発明においてはジスルフィド結合を好適に用いることができる。ジスルフィド結合は当業者に公知の方法でDiabodyに導入することが可能であり、例えば、国際公開公報WO94/29350の方法で行うことが可能である。
VH44 − VL100
VH105 − VL43
VH105 − VL42
VH44 − VL101
VH106 − VL43
VH104 − VL43
VH44 − VL99
VH45 − VL98
VH46 − VL98
VH103 − VL43
VH103 − VL44
VH103 − VL45
上記アミノ酸番号の位置はKabat and Wuにより利用される番号付け系における位置である。本発明においては、好ましい位置としてはVH44 − VL100、VH105 − VL43を挙げることができる。
リンカー
本発明において、H鎖V領域とL鎖V領域とを連結するリンカー又は一本鎖Diabodyを作製する際のDiabodyを構成するフラグメント同士を連結するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合:
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。リンカーペプチドの長さは目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
抗体の製造
前記のようにして得られた本発明の抗体をコードする遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター/エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター/エンハンサー( human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)を挙げることができる。
次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。
抗体の活性の確認
抗体の抗原結合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができる。
アポトーシス誘起活性の確認
アポトーシスを誘起するか否かの確認は、当業者に公知の方法で行うことが可能である(例えば、日本公開公報:特開平9-295999など)。具体的には、実施例に記載の方法や、ヒト白血病細胞やCD47遺伝子を導入したJurkat細胞・L1210細胞・JOK-1細胞などのCD47発現細胞を、被検抗体の存在下で培養し、MTS法やフローサイトメトリーによりアポトーシスを検出する方法などにより行うことが可能である。
血液疾患治療薬
本発明はまた、本発明の抗体を有効成分として含有する血液疾患治療薬に関する。本発明の血液疾患治療薬は、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫(Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫)、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、真性多血症などの血液疾患の治療に有用である。
本発明の治療剤は1日1〜3回、一週間に1日〜7日投与することが可能である。また、点滴注入のように持続投与することも可能であり、例えば1〜3日間投与することが可能である。
本発明の本発明の抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ(Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国)、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
マウスモノクローナル抗体のCDRがヒト抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のFRとヒト抗体のFRとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウスMABL-2抗体(WO00/53634)のL鎖およびH鎖のV領域を、Protein Data Bankを用いて構造が解明されている既知の天然ヒト抗体のV領域と比較した。
(i)1次デザイン
マウスMABL-2抗体のH鎖V領域と4クローンが75.9%の相同性を示した。このうち、CDR近辺のアミノ酸は抗原結合に大きく関与している可能性があるため、CDR1の直前の30位が保存されているヒト抗体AF216824(Miklos J.A.ら、Blood,95, 3878-3884, 2000)由来のFRを用いることとした。ヒト化MABL-2抗体H鎖(バージョン”1.1”)において、FR1からFR4まではヒト抗体AF216824のFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のH鎖V領域中のCDRと同一とした。AF216824にはLeader配列の情報がなかったため、Leader配列はマウスMABL-2 VHのものを用いた。
バージョン1.2は変異原プライマーとして72位のアルギニンがセリンに変異するように設計したHuMHbS(配列番号8)およびHuMHbAS(配列番号9)を用い、プラスミドHEF-huM2H1.1#1を鋳型DNAとして、PCR法により増幅し、プラスミドHEF-huM2H1.2#1を得た。本プラスミドHEF-huM2H1.2#1に含まれるH鎖V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号10に示す。
ヒト化MABL-2抗体H鎖 バージョン”1.3” について、72位のアミノ酸の保存およびFR2のできる限りの保存を考慮し、再度相同性を検索した。このうち、72位が保存されているヒト抗体HUMIGHDJCD(Chai S. K.ら、Unpublished 1994)由来のFRを用いることとした。ヒト化MABL-2抗体H鎖バージョン”2.1”において、FR1からFR4まではヒト抗体HUMIGHDJCDのFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のH鎖V領域中のCDRと同一とした。HUMIGHDJCDにもLeader配列の情報がなかったため、Leader配列はマウスMABL-2 VHのものを用いた。
まず、バージョン2.0はバージョン”1.3”の89位のグルタミン酸をアスパラギン酸に変異するように設計したHuMHgS (配列番号20)およびHuMHgAS(配列番号21)を用い、プラスミドHEF-huM2H1.3#2を鋳型DNAとして、PCR法により増幅し、プラスミドHEF-huM2H2.0#1を得た。本プラスミドHEF-huM2H2.0#1に含まれるH鎖V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号22に示す。
(i)1次デザイン
マウスMABL-2抗体のL鎖V領域と2クローンが83.8%の相同性を示した。このうち、CDR3のサイズが等しいヒト抗体HSJC11VJ(Kennedy M.A.、J. Exp. Med, 173 (4), 1033-1036, 1991)由来のFRを用いることとした。ヒト化MABL-2抗体L鎖(バージョン”1.1”)において、FR1からFR4まではヒト抗体HSJC11VJのFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のL鎖V領域中のCDRと同一とした。Leader配列はヒト抗体HSJC11VJのものを用いた。
バージョン1.2は変異原プライマーとして51位のアルギニンがロイシンに変異するように設計したHuMLbS(配列番号38)およびHuMLbAS(配列番号39)を用い、プラスミドHEF-huM2L1.1#3を鋳型DNAとして、PCR法により増幅し、プラスミドHEF-huM2L1.2#1を得た。本プラスミドHEF-huM2L1.2#1に含まれるL鎖V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号40に示す。
ヒト化MABL-2抗体L鎖について、FR2のWYLQ-PGQSP--LIYという配列の保存を考慮し、再度相同性を検索した。このうち、相同性の最も高かったヒト抗体1802359A(Pascual V.ら、J. Immunol., 146(12), 4385-4391, 1991)由来のFRを用いることとした。ヒト化huM2抗体L鎖バージョン”2.1”において、FR1からFR4まではヒト抗体1802359AのFR1からFR4と同一であり、そしてCDRはマウスMABL-2抗体のL鎖V領域中のCDRと同一とした。1802359A のLeader配列の情報はなかったため、1次デザインで用いたヒト抗体HSJC11VJのものを用いた。
まず、バージョン2.0は変異原プライマーとしてヒト化MABL-2抗体L鎖バージョン”1.1”のFR2がヒト抗体1802359AのFR2に変異するように設計したHuMLfS(配列番号50)およびHuMLfAS (配列番号51)を用い、プラスミドHEF-huM2L1.1#3を鋳型DNAとして、PCR法により増幅し、プラスミドHEF-huM2L2.0#1を得た。本プラスミドHEF-huM2L2.0#1に含まれるL鎖V領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号52に示す。
ヒト化抗体の各鎖の抗原結合活性を評価するため、前記発現プラスミドと陽性対照としてキメラMABL-2抗体をCOS-7細胞で一過性に発現させた。すなわちH鎖の一過性発現では、ヒト化MABL-2抗体H鎖発現ベクター(HEF-huM2H1.1#1, HEF-huM2H1.2#1, HEF-huM2H1.3#2, HEF-huM2H1.4#1, HEF-huM2H1.5#1, HEF-huM2H2.1#3)とキメラL鎖発現ベクターHEF-M2L3(WO00/53634)との組み合わせを、L鎖の一過性発現では、ヒト化MABL-2抗体L鎖発現ベクター(HEF-huM2L1.1#3, HEF-huM2L1.2#1, HEF-huM2L1.3#1, HEF-huM2L1.4#1, HEF-huM2L1.5#1、HEF-huM2L2.1#1)とキメラH鎖HEF-M2H3(WO00/53634)との組み合わせを、それぞれFugene 6 Transfection Reagent(ロシュ・ダイアグノスティックス)を用いてCOS-7細胞に同時形質導入した。1.5 x 105 細胞を10%のウシ胎児血清(GIBCO)を含むDMEM培養液(GIBCO)2 mLにて一晩培養した。そこへ室温で1時間反応させた、各プラスミド2 μgずつとFugene 6 Transfection Reagent 6 μLを含む総量100 μL のDMEM培養液を添加した。37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した後、1% HT supplement(GIBCO)を含むCHO-S-SFMII培地(GIBCO)2 mLへ培地交換を行った。37℃、5%CO2の条件下で72時間培養した後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ELISAの試料に供した。
得られた抗体の濃度測定はELISAにより行った。ELISA用96穴プレート(Maxsorp,NUNC)の各穴を固相化バッファー(0.1 mol/L NaHCO3, 0.02% NaN3 )で2 μg/mLの濃度に調製したマウス 抗ヒト Kappa Light Chain(Zymed)100 μLで固相化し、300 μLの希釈バッファー(50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L MgCl2 、0.15 mol/L NaCl、0.05% Tween20、0.02% NaN3 、1% 牛血清アルブミン(BSA)、pH8.1)でブロッキングの後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させたCOS-7細胞の培養上清を段階希釈して各穴に100 μLずつ加えた。1時間室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(Zymed)100 μLを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、1 mg/mLの基質溶液(Sigma104、p−ニトロフェニルリン酸、SIGMA)を加え、次に405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。濃度測定のスタンダードとして、ヒトIgG1, kappa(SIGMA)を用いた。
ヒト化抗体は下記の抗原結合活性および結合阻害活性にて評価を行った。
(i)抗原結合活性の測定
抗原結合活性測定のためのELISAプレートを、次のようにして調製した。ELISA用96穴プレートの各穴を固相化バッファーで3 μg/mLの濃度に調製した抗FLAG抗体(SIGMA)100 μLで固相化した。300 μLの希釈バッファーでブロッキングの後、1 μg/mLの濃度に調製したFLAG標識可溶型ヒトCD47(WO00/53634)を100 μL加え、室温で1時間インキュベーションした。洗浄後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させたCOS-7細胞の培養上清を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(Zymed)100 μLを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、1 mg/mLの基質溶液(Sigma104、p−ニトロフェニルリン酸、SIGMA)を加え、次に405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。
結合阻害活性測定のためのプレートは以下のようにして調製した。抗原結合活性と同様、ELISA用96穴プレートの各穴を固相化バッファーで3 μg/mLの濃度に調製した抗FLAG抗体(SIGMA)100 μLで固相化した。300 μLの希釈バッファーでブロッキングの後、1 μg/mLの濃度に調製したFLAG標識可溶型ヒトCD47(WO00/53634)を100 μL加え、室温で1時間インキュベーションした。洗浄後、キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させたCOS-7細胞の培養上清を段階希釈したものと0.6 μg/mLのビオチン標識MABL-2を等量混合した溶液を100 μLずつ加えた。室温にてインキュベートし洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン(Zymed)100 μLを加えた。室温にてインキュベートし洗浄の後、1 mg/mLの基質溶液(Sigma104、p−ニトロフェニルリン酸、SIGMA)を加え、次に405 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。
(i) ヒト化H鎖の評価
ヒト化H鎖バージョン1.1、1.2、1.3とキメラL鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度のヒトCD47結合活性を示した(図1)。しかし、MABL-2による結合阻害活性ではバージョン1.1の阻害活性はバージョン1.2、1.3に比べて弱かった。また、バージョン1.3はキメラ抗体とほぼ同等の阻害活性を持ち、バージョン1.2と同等もしくは若干強い阻害活性を示した(図2)。この結果は、72位のアミノ酸残基の保存が重要であり、30位のアミノ酸残基はトレオニン(バージョン1.3)でも良いことを示す。
ヒト化L鎖バージョン1.1、1.2、1.3とキメラH鎖を組み合わせた抗体は三種ともほぼ同等のヒトCD47に対する結合活性を示したが、キメラ抗体より弱い活性を示した(図6)。さらに、MABL-2による結合阻害活性では三種いずれもキメラ抗体に比べて弱かった(図7)。この結果は、51位、92位のアミノ酸残基は特に重要ではなく、他に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
ヒト化H鎖バージョン2.1とヒト化L鎖バージョン2.1を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度もしくはそれ以上のMABL-2による結合阻害活性、すなわちhCD47に対する親和性を示した(図11)。これより、FRに関してH鎖、L鎖とも単一の天然ヒト抗体の配列を持つ、ヒト化MABL-2抗体の構築ができた。
マウスMABL-1抗体(WO00/53634)についてもヒト化を行った。マウスMABL-1抗体とマウスMABL-2抗体におけるCDRのアミノ酸配列はH鎖で3残基、L鎖で4残基異なるのみである。これより、マウスMABL-1抗体のヒト化抗体の構築は〔実施例1〕に示したマウスMABL-2抗体の二次デザイン(huM2Hバージョン2.1、huM2L2.1バージョン2.1)をもとに構築することとした。
ヒト化MABL-1抗体H鎖バージョン”2.1”の作製のために8個の合成オリゴDNAを使用した。合成オリゴDNA 、HuMHS(配列番号5)、M1CH1MS(配列番号58)、M1CH2GS(配列番号59)、M1CH3SS(配列番号60)はセンスDNA配列を有し、M1CH1MAS(配列番号61)、M1CH2GAS(配列番号62)、M1CH3SAS(配列番号63)、HuMHAS(配列番号6)はアンチセンスDNA配列を有する。
ヒト化MABL-1抗体L鎖バージョン”2.1”の作製のために4個の合成オリゴDNAを使用した。合成オリゴDNA、HuMLS(配列番号5)、M1CL1aS(配列番号65)はセンスDNA配列を有し、M1CL1aAS(配列番号66)、HuMLAS(配列番号6)はアンチセンスDNA配列を有する。
ヒト化MABL-1抗体H鎖発現ベクターHEF-huM1L2.1#1とヒト化MABL-1抗体L鎖発現ベクターHEF-huM1L2.1#1を用いて、上記COS-7細胞へのトランスフェクションの方法に従ってヒト化MABL-1抗体を調製した。また、抗体濃度の測定、抗体の活性測定も実施例1に示した方法に従って行った。
ヒト化H鎖バージョン2.1とヒト化L鎖バージョン2.1を組み合わせた抗体は、キメラ抗体と同程度もしくはそれ以上のMABL-1による結合阻害活性、すなわちhCD47に対する親和性を示した(図12)。これより、FRに関してH鎖、L鎖とも単一の天然ヒト抗体の配列を持つ、ヒト化MABL-1抗体の構築ができた。
実施例3:ヒト化MABL-1抗体、ヒト化MABL-2抗体のアポトーシス誘起効果
ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞を用い、ヒト化MABL-1抗体、ヒト化MABL-2抗体のアポトーシス誘起作用をAnnexin-V(ロシュ・ダイアグノスティクス)染色により検討した。細胞1 x 105個に、各ヒト抗体発現COS-7細胞培養上清を抗体濃度として300 ng/mL, 100 ng/mL, 33.3 ng/mLずつ添加し、24時間培養した。その後、Annexin-V染色を行い、FACScan装置(BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞に著しい細胞死を誘導した(図13)。
実施例4:ヒト化MABL-1抗体及びヒト化MABL-2抗体由来一本鎖Fvの作製
(1)ヒト化MABL-2抗体一本鎖Fv(HL5)の作製
5 merのペプチドリンカーを有し、N末端より[H鎖]−[L鎖]の順となるようにV領域を連結したヒト化MABL-2抗体一本鎖Fv(HL5)を次の様にして作製した。ヒト化MABL-2抗体H鎖V領域、及びヒト化MABL-2抗体L鎖V領域をそれぞれPCR法にて増幅し、連結することにより、ヒト化MABL-2抗体HL5を作製した。ヒト化MABL-2抗体HL5の作製のために4個のPCRプライマー(A〜D)を使用した。プライマーA、Cはセンス配列を有し、プライマーB、Dはアンチセンス配列を有する。
ヒト化MABL-1抗体HL5を前記ヒト化MABL-2抗体一本鎖Fv(HL5)の作製に従って作製した。第一PCRにおいては、HEF-huM2H2.1#3の代わりにヒト化MABL-1抗体H鎖V領域をコードするプラスミドHEF-huM1H2.1#1(実施例2を参照)、及びHEF-huM2L2.1#1の代わりにヒト化MABL-1抗体抗体L鎖V領域をコードするプラスミドHEF-huM1L2.1#1(実施例2を参照)を使用し、PCR生成物huM1Db-1およびhuM1Db-2を得た。これらを用いた第二PCRにより、ヒト化MABL-1抗体HL5の正しいアミノ酸配列をコードするDNA断片を含むプラスミドpCHOhuM1Dbを得た。本プラスミドpCHOhuM1Dbに含まれるヒト化MABL-1抗体HL5の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号74に示す。
実施例5:2つのH鎖V領域及び2つのL鎖V領域を含むsc(Fv)2の作製
(1)ヒト化MABL−2抗体sc(Fv)2発現プラスミドの構築
5 mer、15 mer、5 merのペプチドリンカーを有し、N末端より[H鎖]−[L鎖]−[H鎖]−[L鎖]の順となるようにV領域を連結したヒト化MABL−2抗体sc(Fv)2を発現するプラスミドを作製するため、前述のPCR生成物huM2Db-1およびhuM2Db-2を以下に示す通りPCR法により更に修飾し、得られたDNA断片をpCHO1−Igsベクターに導入した。
5 mer、15 mer、5 merのペプチドリンカーを有し、N末端より[H鎖]−[L鎖]−[H鎖]−[L鎖]の順となるようにV領域を連結したヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2を発現するプラスミドを作製するため、前記ヒト化MABL−2抗体sc(Fv)2発現プラスミドの構築に従い、行った。
前記MABL-2抗体HL5及びsc(Fv)2、MABL-1抗体HL5及びsc(Fv)2の恒常的発現CHO細胞株を樹立するため、pCHOhuM1Db、pCHOhuM1scDb、pCHOhuM2Db、pCHOhuM2scDbベクターをCHO細胞に遺伝子導入した。
前記(4)で得られた培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの3つの工程によりヒト化MABL-1とヒト化MABL-2のそれぞれHL5及びsc(Fv)2の精製(計4種類)を行った。いずれの4種類の抗体も全く同じ方法で精製をした。ヒト化MABL-1及びヒト化MABL-2の違い、HL5及びsc(Fv)2の違いにより、精製結果はほとんど変わらなかった。このため精製方法についてはまとめて記載した。図はヒト化MABL-1抗体HL5の場合の精製例のみを示した。
実施例6:ヒト化MABL-1抗体HL5及びsc(Fv)2、ヒト化MABL-2抗体HL5及びsc(Fv)2のin vitro でのアポトーシス誘起効果
ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞、MOLT4細胞(ATCC)、JOK-1細胞(林原生物化学研究所 藤崎細胞センター)を用い、ヒト化MABL-1抗体HL5およびsc(Fv)2、ヒト化MABL-2抗体HL5およびsc(Fv)2のアポトーシス誘起作用をAnnexin-V(ロシュ・ダイアグノスティクス)染色により検討した。細胞1 x 105個に、各抗体を50 nmol/Lから10倍希釈ずつ0.005 nmol/Lまで、もしくは抗体の代わりにPBS(-)を添加し、24時間培養した。その後、Annexin-V染色を行い、FACSCaribur装置(BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、いずれの細胞においても細胞死を誘導した。図20にMOLT4細胞における結果を示した。
実施例7:ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2の白血病モデル動物での薬効試験
(1)ヒト白血病マウスモデルの作製
ヒト白血病マウスモデルは以下のように作製した。SCIDマウス(日本クレア)を用いてJOK-1細胞(林原生物化学研究所 藤崎細胞センター)をRPMI1640培地(GIBCO BRL社製)で2.5×107個/mLになるように調製した。あらかじめ前日抗アシアロGM1抗体(和光純薬社製、1バイアルを5mLで溶解)100μLを皮下投与したSCIDマウス(オス、6週齢)(日本クレア)に上記JOK-1細胞懸濁液200μL(5×106個/マウス)を尾静脈より注入した。
ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2を投与当日、濾過滅菌したPBS(−)を用いて、1 mg/mL、になるように調製し、投与試料とした。
(3)抗体投与
(1)で作製したヒト白血病マウスモデルに対し、JOK-1細胞移植後3日目より、1日2回、5日間、上記(2)で調製した投与試料を10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。陰性対照として、濾過滅菌したPBS(−)を同様に1日2回、5日間、10 mL/kgにて、尾静脈より投与した。いずれの群も、1群7匹で行った。
(4)抗腫瘍効果の評価
ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2のヒト白血病マウスモデルにおける抗腫瘍効果については生存期間で評価した。その結果、図21に示すとおり、ヒト化MABL−1抗体sc(Fv)2投与群ではPBS(−)投与群と比較して生存期間の延長が認められた。
実施例8:S-S結合導入ヒト化MABL-2 HL5の作製
(1)ヒト化MABL-2抗体HL5へのS-S結合配列導入
実施例4で構築したヒト化MABL-2抗体HL5の2ヶ所のアミノ酸をシステイン残基に変換し、DiabodyのS-S結合による安定化のための実験を行った(図22)。
ctcgaggaattcccaccatgggatggagctgtatcatcc 5F44-100(共通)(配列番号80)
gggggcctgtcgcagccagtgaataac 5R44-100(配列番号81)
gggcagtcagtgtatacggccgtgtcgtcagatctgagactgctc 5R105-43(配列番号82)
gggcaatgccttgagtggatgggatatatttatcc 3F44-100(配列番号83)
tcattatttgatctcaagcttggtcccgcagccaaacgtgtacggaacatgtgt 3R44-100(配列番号84)
tactattgtgctagagggggttactatacttacgacgactggggctgcgcaaccctggtcacagtctc MF105-43(配列番号85)
gggcttctgcagataccaatgtaaataggtctttc MR105-43(配列番号86)
gggcagtgcccaagactcctgatctacaaagtttcc 3F105-43(配列番号87)
tcattatttgatctcaagcttggtcccctggccaaac 3R105-43(配列番号88)
PCR反応はKODポリメラーゼ(東洋紡)、鋳型としpCHOhuM2Dbを用い、94℃、1分の変性後、98℃ 30秒、65℃ 2秒、74℃ 30秒を30サイクル行った。
(i)Cys44(VH) / Cys 100(VL)用の変異の導入は、5F44-100 / 5R44-100、3F44-100 / 3R44-100のプライマーの組み合わせでPCR反応を行い、pBluescriptSK+(Stratagene社)のSmaI部位に3’側断片、5’断片の順にRapid DNA ligation kit (Roche社)を用いて逐次連結した。
(ii)Cys 105(VH) / Cys 43(VL)用の変異の導入は、5F44-100 / 5R105-43、MF105-43 / MR105-43、3F105-43 / 3R105-43のプライマーの組み合わせでPCRを行い、5F44-100 / 5R105-43、3F105-43 / 3R105-43で得たPCR断片をpBluescriptSK+のSmaI部位に逐次連結し、その後5R105-43およびMF105-43に予め保存的変異を導入してデザインしたBsT107I部位とSmaI部位を利用してMF105-43 / MR105-43断片を連結して得た。構築したそれぞれのプラスミドを大腸菌DH5a株(東洋紡社)に導入し、得られた組換え大腸菌からプラスミドを精製(QIAGEN社)し、ABI3100 Genetic Analyzerで解析を行った。
phMABL2(SS44)およびphMABL2(SS105)のそれぞれ10μgを4×106細胞のCHO細胞(DXB11)へとエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990)]により導入した。導入後細胞は50 mLのα-MEM-FBSに縣濁し、96ウェルプレート(Corning社)5枚にウェルあたり100 μLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、培地を100μg/mLのHygromycinBを含むα-MEM-FBSに代え、さらにHygromaycinB濃度を段階的に200 μg/mL、400μg/mLに上げ、選抜を行った。
上記(2)で得られたヒト化MABL-2 HL5 SS44およびSS105の産生細胞株を100 nM MTX、400 μg/mL Hygromycin Bを含む無血清培地CHO-S-SFII(GIBCO BRL社製)で100 mLのスピナーフラスコで2週間培養し、馴化を行った。馴化した細胞は拡大培養のため、1 L(培地量700 mL、)または8 Lスピナーフラスコ(培地量6L)にそれぞれ1×107、1×108の細胞を巻き込み、3または7日間培養して、培養上清を回収した。
上記(3)で得られた培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの3つの工程によりヒト化MABL-2HL5のSS44及びSS105精製(2種類)を行った。いずれの2種類の抗体も全く同じ方法で精製をしたが、精製結果に違いはほとんど見られなかったため、区別せずに記述した。
実施例9:S-S結合導入ヒト化MABL-2抗体HL5のin vitro でのアポトーシス誘起効果
ヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞、JOK-1細胞(林原生物化学研究所 藤崎細胞センター)を用い、S-S結合導入ヒト化MABL-2抗体HL5のアポトーシス誘起作用をAnnexin-V(ロシュ・ダイアグノスティクス)染色により検討した。細胞1 x 105個に、各抗体を50 nmol/Lから10倍希釈ずつ0.005 nmol/Lまで、もしくは抗体の代わりにPBS(-)を添加し、24時間培養した。その後、Annexin-V染色を行い、FACSCaribur装置(BECTON DICKINSON)にて蛍光強度を測定した。その結果、いずれの細胞にも細胞死を誘導した。図25にヒト化MABL-2 HL5 SS44のヒトCD47遺伝子を導入したL1210細胞に対するアポトーシス誘導効果の結果を示した。
Claims (22)
- CD47に結合するヒト化抗体。
- CD47がヒトCD47である請求項1に記載のヒト化抗体。
- ヒト化抗体のCDRがマウス抗体由来である請求項1または2に記載のヒト化抗体。
- 以下の配列のいずれかを含む請求項1〜3のいずれかに記載のヒト化抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。 - 以下の配列のいずれかを含む請求項1〜3のいずれかに記載のヒト化抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(2)配列番号10のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(3)配列番号13のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(4)配列番号16のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(5)配列番号19のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(6)配列番号22のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(7)配列番号30のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(8)配列番号37のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(9)配列番号40のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(10)配列番号43のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(11)配列番号46のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(12)配列番号49のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(13)配列番号52のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(14)配列番号57のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)
(15)配列番号64のアミノ酸番号1〜30の配列(FR1)、アミノ酸番号36〜49の配列(FR2)、アミノ酸番号67〜98の配列(FR3)、アミノ酸番号107〜117の配列(FR4)
(16)配列番号67のアミノ酸番号1〜23の配列(FR1)、アミノ酸番号40〜54の配列(FR2)、アミノ酸番号62〜93の配列(FR3)、アミノ酸番号103〜112の配列(FR4)。 - 低分子化抗体である請求項1〜5のいずれかに記載のヒト化抗体。
- ダイアボディ(Diabody)である請求項6記載のヒト化抗体。
- 一本鎖Diabodyである請求項7記載のヒト化抗体。
- Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフィド結合が存在することを特徴とする請求項7または8に記載のヒト化抗体。
- 以下の特徴を有する請求項9記載のヒト化抗体:
(1)配列番号90に記載のアミノ酸配列を有する抗体;又は
(2)アミノ酸配列(1)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつCD47への結合活性を有する抗体。 - 以下の特徴を有する請求項9記載のヒト化抗体:
(1)配列番号92に記載のアミノ酸配列を有する抗体;又は
(2)アミノ酸配列(1)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したアミノ酸配列を有し、かつCD47への結合活性を有する抗体。 - Diabodyを構成するフラグメント間にジスルフィド結合が存在することを特徴とする、ヒトCD47に結合するDiabody抗体。
- 以下の配列のいずれかを含む請求項12に記載のDiabody抗体:
(1)配列番号7のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(2)配列番号10のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(3)配列番号13のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(4)配列番号16のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(5)配列番号19のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(6)配列番号22のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(7)配列番号30のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(8)配列番号37のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(9)配列番号40のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(10)配列番号43のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(11)配列番号46のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(12)配列番号49のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(13)配列番号52のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(14)配列番号57のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)
(15)配列番号64のアミノ酸番号31〜35の配列(CDR1)、アミノ酸番号50〜66の配列(CDR2)、アミノ酸番号99〜106の配列(CDR3)
(16)配列番号67のアミノ酸番号24〜39の配列(CDR1)、アミノ酸番号55〜61の配列(CDR2)、アミノ酸番号94〜102の配列(CDR3)。 - 以下の配列を含むCD47に結合するヒト化抗体:
(1)配列番号30のアミノ酸番号1〜117の配列の配列を含むH鎖V領域:及び
(2)配列番号57のアミノ酸番号1〜112の配列の配列を含むL鎖V領域。 - 以下の配列を含むCD47に結合するヒト化抗体:
(1)配列番号64のアミノ酸番号1〜117の配列を含むH鎖V領域:及び
(2)配列番号67のアミノ酸番号1〜112の配列を含むL鎖V領域。 - 以下のいずれかの配列を含むCD47に結合する抗体:
(1)配列番号73のアミノ酸番号1〜234の配列
(2)配列番号74のアミノ酸番号1〜234の配列
(3)配列番号78のアミノ酸番号1〜483の配列
(4)配列番号79のアミノ酸番号1〜483の配列。 - 請求項1〜16のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
- 請求項17に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項18に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項19に記載の宿主細胞を培養する工程を含む抗体の製造方法。
- 請求項1〜16のいずれかに記載の抗体を含む血液疾患治療薬。
- 血液疾患が急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、Mixed Leukemia、Hairy cell Leukemia等の白血病、悪性リンパ腫(Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫)、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、及び真性多血症から選択される請求項21記載の治療薬。
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