JPWO2004089412A1

JPWO2004089412A1 - 特異的ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダーゼ抑制剤

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Publication number: JPWO2004089412A1
Application number: JP2005505314A
Authority: JP
Inventors: 登志弘山本; 久美山田
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 2003-04-08
Filing date: 2004-04-08
Publication date: 2006-07-06
Also published as: EP1616576A4; EP1616576A1; WO2004089412A1; US20070082910A1

Abstract

白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ作用を実質的に抑制せず、かつ白血球以外の組織のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ作用を阻害する化合物を含有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用の抑制剤及びそれを含む医薬組成物。

Description

本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｏｘｉｄａｓｅ）の過剰発現又は活性化の抑制剤に関するものである。より詳細には、白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼには作用せず、かつ白血球以外の組織において過剰発現又は活性化したＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに対する抑制作用を示す化合物を有効成分とするＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用の抑制剤に関するものである。

高脂血症、高血圧、糖尿病、肥満、加齢、喫煙等のリスクファクターにより、虚血性心疾患（心筋梗塞又は狭心症等）、脳卒中（脳梗塞、脳出血又はくも膜下出血等）、動脈硬化や末梢循環障害（末梢動脈閉塞症等）等が発症したり、症状が増悪したりすることが知られており、これらの発症や症状増悪に関して、近年、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ_２ ⁻）等の活性酸素により生ずる酸化ストレスの重要性がクローズアップされている。また、酸化ストレスが、ガン増殖（Ｇｅｎｅ．２００１，２６９（１−２），１３１）、アルツハイマー病の増悪（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００，２７３（１），５）、抗ガン剤による副作用（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．１９９９Ｍａｙ３；１３４（１）：５１−６２）、さらに狭心症患者の硝酸製剤治療による薬剤耐性（Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９４，１８７−１９４）に関与することも報告されている。
従来、スーパーオキシドアニオン等の活性酸素の産生源は、白血球が主体であると考えられてきた。しかし、近年、血管細胞系や心筋細胞等の様々な細胞種においてもスーパーオキシドアニオンの産生が確認され、これらのスーパーオキシドアニオン産生酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼが注目されている（Ｃｉｒｃ−Ｒｅｓ．２０００．８６，４９４−５０１）。ところで、白血球に存在するＮＡＤＰＨオキシダーゼと血管細胞系や心筋細胞等の組織に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼとは、酵素活性や活性調節機構に差異があるため、それぞれのＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは同一ではないと考えられている（ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，３８，２５６−２６２）。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を阻害する化合物として、これまでにＤｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅｉｏｄｏｎｉｕｍ（以下「ＤＰＩ」と記す。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，２５３，２９５参照）、ａｐｏｃｙｎｉｎ（国際公開第０１／８９５１７号パンフレット）、及びＳ１７８３４（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ−Ｔｈｒｏｍｂ−Ｖａｓｃ−Ｂｉｏｌ．，２００１，２１：１５７７）等が報告されている。しかしながら、これらの化合物は白血球に存在するＮＡＤＰＨオキシダーゼのみならず、白血球以外の組織に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼにも作用するものであり、組織特異性を示さない。
白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼの遺伝的欠損症である慢性肉芽種症（Ｃｈｒｏｎｉｃｇｒａｎｕｌｍａｔｏｕｓｄｉｓｅａｓｅ）の患者では、白血球のスーパーオキシドアニオン産生能が低下しており、免疫力の低下を起こすことが知られている（Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００１，６９，１９１）。したがって、上述した非特異的ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの阻害剤を医薬として用いる際には、免疫機能の低下等に基づく副作用が生じることがある。

本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用がリスクファクターである疾患を予防し、又は症状を軽減する医薬を提供することを課題とする。
本発明者らは鋭意研究した結果、白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼには抑制作用を示さず、白血球以外の組織のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに特異的に作用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用の抑制剤により、上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は、白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ作用を実質的に抑制せず、かつ白血球以外の組織のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ作用を抑制する化合物を含有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用の抑制剤、及びそれを有効成分とするＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用に起因する疾病用の医薬組成物に存する。

第１図は、Ａｃｈによる内皮依存性弛緩反応に対する化合物の効果を示した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、白血球以外の組織としては、例えば、血管細胞系、心臓、腎臓、網膜及びミクログリア等、並びに腫瘍細胞などが挙げられる。
血管細胞系としては、例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞及び泡沫化マクロファージ等が挙げられる。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、ＮＡＤＨ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）やＮＡＤＰＨ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてスーパーオキシドアニオンを産生する全ての酵素を意味する。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用とは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰発現又は活性化に基づく作用を意味し、例えば、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満、喫煙、心不全、心肥大、虚血性心疾患、血管再開通療法、臓器移植術の虚血再灌流、ガン、痴呆症、又は化学物質（例えば、抗ガン剤、硝酸製剤等）の摂取などのリスクファクターにより惹起される作用が挙げられる。
ここで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰発現とは、生体の恒常性（ホメオスタシス）にとって必要な量を超えた発現であり、同一起源の正常組織にとって必要な量を超えた発現を意味する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの発現部位としては、例えば、血管細胞系、心臓、腎臓、網膜、ミクログリア及び腫瘍細胞等の組織が挙げられるが、これらに限定されるものではない。すなわち、過剰発現したＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの阻害作用とは、過剰発現しているＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに対し、その酵素機能を発揮することができないようにする作用をいう。
また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性化とは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを構成する各サブユニットのうち、ｐ４７^ｐ ^ｈｏｘ、ｐ４０^ｐｈｏｘ又はｐ６７^ｐｈｏｘ等が細胞膜上にトランスロケーションされ、スーパーオキシドアニオン産生機能を発揮しうる状態にあるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを意味する。すなわち、活性化したＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの抑制作用とは、酵素機能を発生し得る状態のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに対し、その酵素機能を抑制する作用を意味し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを構成する各サブユニットのトランスロケーション又は／及び各構成サブユニット間の相互作用を抑制することをいう。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用に起因する疾病としては、例えば、虚血性心疾患、心不全、糖尿病性合併症、動脈硬化症、血管再開通療法後の再狭窄若しくは再閉塞、臓器移植後の障害、脳卒中、硝酸製剤耐性、抗ガン剤の副作用、痴呆症、又はガンの進展等が挙げられる。
白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ作用を実質的に抑制せず、かつ白血球以外の組織のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ作用を阻害する化合物としては、例えば、下記一般式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）で表される二環式ピリダジン化合物が挙げられる。
一般式（Ｉ）

｛式中、ＡはＣ_３〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_５〜Ｃ_７シクロアルキル又はそれぞれがＣ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ若しくはハロゲンから選ばれる１以上の置換基を有していてもよいフェニル、チエニル、フリル、チアゾリル、フェノキシ、Ｃ_７〜Ｃ_９フェニルアルキル、フェニルチオ、含窒素飽和環基、ピリジル若しくはイミダゾリルを表す。
Ｂは、−ＮＨ−Ｄ
〔Ｄは

（式中、Ｒ^１は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルを表す。Ｘはハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル又はＣ_１〜Ｃ_４アルコキシを表す。ｋは０〜３の整数を表し、ｋが２以上の整数のとき、複数のＸはそれぞれ異なっていてもよい。）

（式中、Ｒ^２は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルを表す。ＹはＣ_１〜Ｃ_４アルキル又はＣ_１〜Ｃ_４アルコキシを表す。ｍは０〜６の整数を表す。ｍが２以上のとき、複数のＹはそれぞれ異なっていてもよく、任意の２つのＹが連結して分岐していてもよいＣ_１〜Ｃ_６アルキレンを形成してもよい。）

（式中、環ＨはＣ_５〜Ｃ_７シクロアルキルを表す。Ｙ及びｍは前記と同義である。）
−ＣＨＲ^３Ｒ^４
（式中、Ｒ^３はＣ_１〜Ｃ_５アルキルを表す。Ｒ^４はＣ_５〜Ｃ_８シクロアルキル又はチエニルを表す。）
又はＣ_３〜Ｃ_８アルキルを表す。〕
又は

（式中、ＺはＣ_１〜Ｃ_４アルキル又はフェニルを表す。ｎは０〜２の整数を表し、ｎが２のときこれらのＺは異なっていてもよい。）
を表し、
Ｑはベンゼン環、フラン環又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルで置換されていてもよいチオフェン環を表す。｝
一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、特許第２７３０４２１号明細書に記載された方法に準じて製造することができる。
一般式（ＩＩ）

［式中、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。Ｘ’は−ＣＯＯＲ^７（Ｒ^７は水素又は置換されていてもよいＣ_１〜Ｃ_６アルキルを表す。）、−ＣＯＮＨ_２、−ＣＮ、−ＣＯＲ^８（Ｒ^８は置換されていてもよいＣ_１〜Ｃ_６アルキル又は置換されていてもよいアリールを表す。）、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２又は−ＯＲ^７（Ｒ^７は前記と同義である。）を表す。］
一般式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９７４，７５２；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１９８３，５２；欧州特許公開第１９７２２６号明細書；米国特許第４７２９７８２号明細書；国際公開第９３／０９０９８号パンフレット等に記載された方法に準じて製造することができる。
一般式（ＩＩＩ）

（式中、Ｒ^９、Ｒ^１０はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。）、
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物は、例えば、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３７，１９９６，２４，４１４５等に記載された方法に準じて製造することができる。
一般式（ＩＶ）及び（Ｖ）

［式中、Ｒ^１１及びＲ^１２は、それぞれ独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。Ｘ’’は−ＯＲ^１３（Ｒ^１３は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル又はアリールを表す。）又は−ＮＲ^１４Ｒ^１５（Ｒ^１４及びＲ^１５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル又はアリールを表す。）］
一般式（ＩＶ）で表される化合物は、例えば、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ（１９８１），１６（１），２５−３０等に記載された方法に準じて製造することができる。
一般式（Ｖ）で表される化合物は、ＳｈｅｎｙａｎｇＹａｏｋｅＤａｘｕｅＸｕｅｂａｏ（２００１），１８（２），１０６−１０９；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８０），２８（９），２７６３−９；Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ（１９８１），１６（１），２５−３０等の文献に記載された方法に準じて合成することができる。
一般式（ＶＩ），（ＶＩＩ），（ＶＩＩＩ）

（式中、Ｒ^１６及びＲ^１７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。Ｒ^１ ^８及びＲ^１９は、それぞれ独立して、水素又はＣ_１〜Ｃ_６アルキルを表す。Ｙ’は酸素又は硫黄を表す。）
一般式（ＶＩ）で表される化合物は、例えば、特開２００１−３３５４７６号公報等に記載された方法に準じて製造することができる。
一般式（ＶＩＩ）で表される化合物は、例えば、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．（１９８６），２７（７），８６９−８７２等に記された方法に準じて製造することができる。
一般式（ＶＩＩＩ）で表される化合物は、例えば、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，４６，２，１９９１，１０５−８等に記載された方法に準じて製造することができる。
これらのうち、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）で表される二環式ピリダジン化合物、特にペリ位に置換基を有していてもよいフェニル基が結合し、かつそのｐ位に窒素原子又は酸素原子が結合した二環式ピリダジン化合物が好ましい。
一般式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）で表される化合物の薬理学上許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸等の鉱酸塩；メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸等のスルホン酸塩；酢酸、シュウ酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸塩等のカルボン酸塩などの酸付加塩：ナトリウム、カリウム、マグネシウム等の金属塩；アンモニウム塩；エタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等の有機アミン塩などの塩基付加塩を用いることができる。
本発明に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用の抑制剤（以下「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ抑制剤」と記すことがある。）は、白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ及び白血球以外の正常な状態のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼには作用しないので、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用に起因する疾患、例えば、虚血性心疾患、動脈硬化性疾患、脳卒中、糖尿病性合併症等の又は症状の軽減、特に免疫機能が低下している前記疾患の予防又は症状の軽減に極めて有効である。
本発明に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ抑制剤を含む医薬組成物は、白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ作用を実質的に抑制せず、かつ白血球以外の組織のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ作用を抑制する化合物と慣用の製剤担体とを、適当な比率で混合した後、常法により処理することにより調製することができる。また、剤形は、投与方法に応じて、適宜、選択すればよく、例えば、経口投与用製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤及びエリキシル剤等が挙げられ、非経口用製剤としては、注射剤、貼付剤及び坐剤等が挙げられる。
また、本発明に係る医薬組成物は、種々のリスクファクターにより惹起される疾患を予防し、又は症状を軽減するので、脂質低下剤、降圧剤、血糖低下剤、血管拡張剤、抗血小板剤、抗凝固剤、脳保護薬、抗ガン剤、利尿剤、強心薬、鎮痛薬、抗浮腫薬、血栓溶解剤、免疫抑制剤、ステロイド、ビタミン剤又は抗酸化剤と、同時に若しくは別々に、又は逐次的に投与する形態で用いることができる。
本発明に係る医薬組成物中に含まれるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ抑制剤は、患者の年齢や状態などの条件に応じて、適宜、定めればよい。一般的には、成人に対して０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を非経口的に投与するか、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を経口的に投与する量を含むのが好ましい。

以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
以下の各試験に使用した化合物の構造式を以下に示す。なお、化合物Ａ及び化合物Ｂは一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、化合物Ｃ〜化合物Ｇは一般式（ＩＩ）で表される化合物、化合物Ｈは一般式（ＶＩＩＩ）で表される化合物である。

試験例１ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ抑制作用
（方法）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕｍａｎＵｍｂｉｌｉｃａｌＶｅｉｎＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社。以下「ＨＵＶＥＣ」と記す。）に４４ｍＭグルコースを添加し、８日間培養した。次いで、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ−ＸＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を含むＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを添加し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼにより産生したｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ中のインターロイキン−８（以下「ＩＬ−８」と記す。）を固相酵素免疫検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔａｓｓａｙ）で測定した。被験化合物はグルコース添加の１日前に添加した。
被験化合物を添加し４４ｍＭグルコース存在下で培養した細胞のＩＬ−８産生をＡ、被験化合物を添加せず４４ｍＭグルコース存在下で培養した細胞のＩＬ−８産生をＢ、被験化合物及び４４ｍＭグルコースをともに添加せずに培養した細胞のＩＬ−８産生をＣとし、以下の式により抑制率を算出した。
抑制率（％）＝１００−〔（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）〕×１００
ＩＣ_５０値は、得られた抑制率をもとに最小二乗法により求めた用量作用直線から算出した。結果を表１に示す。

試験例２ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ抑制作用
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本ＳＬＣ）の尾静脈から０．０５Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）に溶解したストレプトゾトシン４０ｍｇ／ｋｇを投与し、糖尿病ラットを作製した。ストレプトゾトシン静注１週間〜８週間後に、ヘパリン処理したキャピラリーを用いて尾静脈から採血し、直ちに氷冷後、３０００ｒｐｍ，１５分，４℃で遠心分離して血清を得た。グルコース測定用キット“ＧＬＵネオシノテスト”（シノテスト社）により、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社）を用いて酵素法で血糖値を測定した。
糖尿病ラットに３日間被験化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回経口投薬した。試験開始４日目に、大動脈のスーパーオキシドアニオン産生を指標とし、Ｄａｖｉｄ．Ｇ．Ｈａｒｒｉｓｏｎらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１，２５４６−２５５１，１９９３）を改良した以下の方法により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を測定した。
すなわち、上記処置を施していない正常ラット又は糖尿病ラットを腹部大動脈から放血させた後、胸部大動脈を摘出した。摘出した胸部大動脈をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒ中に浸し、周辺組織を除き、約５ｍｍのリング標本を作製した。このリング標本をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒ中、３７℃で１０分間プレインキュベートした後、０．２５ｍＭｌｕｃｉｇｅｎｉｎ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒ中に移した。５００μＭのＮＡＤＨを添加し、ルミノメーター（ＭＵＬＴＩ−ＢＩＯＬＵＭＡＴＬＢ９５０５Ｃ，ワラック・ベルトールド社）を用い、３７℃で１０分間化学発光数（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：単位ＲＬＵ：ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｕｎｉｔｓ）を測定した。測定時間（横軸）に対し化学発光数（縦軸）をプロットした曲線の曲線下面積（以下「ＡＵＣ」という。）により、総化学発光数を算出した。測定した総化学発光数を、血管リング標本の湿重量で割付け、大動脈単位重量当たりのスーパーオキシドアニオン産生量に標準化した。
被験化合物を投与した糖尿病ラットの標準化した化学発光数をＡ、被験化合物を投与していない糖尿病ラットの標準化した化学発光数をＢ、被験化合物を投与していない正常ラットの標準化した化学発光数をＣとし、下記式により抑制率（％）を算出した。
抑制率（％）＝１００−〔（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）〕×１００
結果を表２及び表３に示す。

表１〜３に示したとおり、４４ｍＭグルコース存在下で培養した内皮細胞及び糖尿病ラット大動脈のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性は正常よりも高く、化合物Ａ〜ＨはいずれもＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害作用を示した。
試験例３正常ラットＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼへの作用
正常Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本ＳＬＣ）に３日間被験化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、試験例２と同様の方法で、大動脈のスーパーオキシドアニオン産生量を測定した。
被験化合物を投与したラットの標準化した化学発光数をＡ、被験化合物を投与していないラット（対照群）の標準化した化学発光数をＢとし、下式により抑制率（％）を算出した。
抑制率（％）＝１００−（Ａ／Ｂ）×１００
結果を表４に示す。

化合物Ａ及びＢは、いずれも正常ラットのスーパーオキシドアニオン産生に影響を与えなかった。
試験例４大動脈ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害作用
試験例２と同様の方法で摘出した腹部大動脈をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒ中に浸し、周辺組織を除き、約５ｍｍのリング標本を作成した。このリング標本を、被験化合物（化合物Ａ、化合物Ｂ又はＤＰＩ（ＳＩＧＭＡ社））を添加したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒ中、３７℃、１０分間プレインキュベートした後、リング標本を０．２５ｍＭｌｕｃｉｇｅｎｉｎを含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒ中に移した。５００μＭのＮＡＤＨと被験化合物を添加し、化学発光数を３７℃で１０分間測定した。
測定時間（横軸）に対し、化学発光数（縦軸）をプロットした曲線のＡＵＣにより、総化学発光数を算出した。得られた化学発光数値を、血管リング標本の湿重量で割付け、大動脈単位重量当たりのスーパーオキシドアニオン産生量に標準化した。
被験化合物を添加したリング標本の標準化した化学発光数をＡ、被験化合物を添加しなかったリング標本（対照）の標準化した化学発光数をＢとし、下式により阻害率（％）を算出した。
阻害率（％）＝１００−（Ａ／Ｂ）×１００
結果を表５に記す。

化合物ＡはＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害作用を示さなかったが、非特異的ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるＤＰＩはＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害作用を示した。
試験例５白血球ＮＡＤＰＨオキシダーゼに対する作用
正常Ｗｉｓｔｅｒ雄性ラット（日本ＳＬＣ）の腹部大動脈から採血し、直ちに血液３ｍＬに対し４２ｍＬの氷冷Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒと混和した。５分後、４℃、１１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈渣を氷冷Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒに懸濁し、再び４℃、１１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この操作を３回繰り返すことにより、白血球を得た。得られた白血球をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒで懸濁して細胞数を１×１０^６個／ｍｌに調整した。０．２５ｍＭｌｕｃｉｇｅｎｉｎ及び被験薬を添加し、さらにＰｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ（以下「ＰＭＡ」と記す。ＳＩＧＭＡ社。）を添加した後、化学発光数を３７℃で１０分間測定した。
被験化合物を添加した白血球懸濁液の総化学発光数をＡ、被験化合物を添加しなかった白血球懸濁液（対照）の総化学発光数をＢとしＰＭＡで刺激しなかった白血球懸濁液の総化学発光数をＣとし、下式により抑制率（％）を算出した。
抑制率（％）＝１００−〔（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）〕×１００
結果を下記表６に示した。

化合物Ａ、Ｂは、白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼに対する抑制作用を示さなかったが、非特異的ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるＤＰＩは白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼに対する抑制作用を示した。
試験例１〜５の結果から、一般式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）で表される二環式ピリダジン化合物は、白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼには抑制作用を示さず、白血球以外の組織におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用に対する抑制作用を有することが明らかとなった。
試験例６酸化低密度リポタンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＬＤＬ」と記す。）によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ発現抑制に対する作用
ＨＵＶＥＣを２４穴コラーゲンコートプレートに播種した。化合物Ａを添加し、２４時間後に健常人ボランティア血液より調製した酸化ＬＤＬを１００μｇ／ｍＬ添加した。
酸化ＬＤＬ添加２４時間後に、ＭｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩ処理（日本ｇｅｎｅ）を行った。
この一部を分取し、吸光度（ＯＤ_２６０）を測定することにより、ｔｏｔａｌＲＮＡの濃度を算出した。
得られたｔｏｔａｌＲＮＡ１００ｎｇを用いてＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）反応（ＡＢＩ社）を行い、ｃＤＮＡを合成した。
合成したｃＤＮＡ１０μＬを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い（ＡＢＩ社）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ主要構成成分であるｐ２２^ｐｈｏｘ、内在コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現量を測定した。
ｐ２２^ｐｈｏｘの発現量をβ−ａｃｔｉｎの発現量で標準化し、正常の（ｐ２２^ｐｈｏｘ）／（β−ａｃｔｉｎ）の発現量を１００％として表した。

酸化ＬＤＬ添加によりＨＵＶＥＣのｐ２２^ｐｈｏｘ発現が、約１．６倍上昇した。一方、化合物Ａ添加群のｐ２２^ｐｈｏｘ発現は、正常群の１．２倍にすぎず、化合物Ａが酸化ＬＤＬ添加によるｐ２２^ｐｈｏｘ発現上昇を抑制したことがわかる。
試験例７動脈硬化阻害作用
雄性ＮＺＷウサギ（日本ＳＬＣ）に、１２週間０．６７％コレステロール含有飼料を４０ｇ／ｋｇ／ｄａｙ及び化合物Ａを与えた。耳介静脈からヘパリン処理したキャピラリーを用いて採血し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた血漿中のトータルコレステロール（以下「ＴＣ」と記す。）値を、測定キットを用い酵素法で測定した。
結果を表９に示す。
１２週間後、ペントバルビタール麻酔下で頸動脈を剥離・摘出した後、脱血し、大動脈を摘出した。得られた頸動脈を、直ちにＫｒｅｂｓ緩衝液に浸し、慎重に周囲の組織を除去し、内皮細胞に損傷を与えないようにして、リング標本を作成した。次いで、リング標本を９５％Ｏ_２−５％ＣＯ_２混合ガスの通気下で、３７℃のＫｒｅｂｓ緩衝液を満たしたマグヌス槽中に懸垂し、２ｇの張力負荷により定常状態となった後、実験を行った。
弛緩反応を測定する際には、ノルエピネフリンであらかじめ標本を収縮させておき、収縮が一定になった時点でアセチルコリンを累積的に添加した。１０μＭのノルエピネフリンにより引き起こされた収縮を１００％として血管の弛緩率を求めた。
トランスジューサー（日本光電）を用いて、等尺性に張力を測定した。対照群に対する二元配置分散分析（Ｄｕｎｎｅｔｔ法）により有意差検定を行った。
摘出した大動脈を弓部・胸部・腹部大動脈に分割し、１０％ホルマリン緩衝液で固定後、写真撮影を行い、大動脈に沈着した脂質面積を測定し、大動脈面積に対する脂質沈着部の面積の割合を求めた。
結果を表８に示す。

０．６７％コレステロール含有飼料投与で対照群の血漿中のＴＣ値は約２０００ｍｇ／ｄＬに上昇した。血漿中のＴＣ値は対照群と比較して有意な低下作用を示さなかった。
頸動脈の内皮依存性血管弛緩反応について、アセチルコリン（以下「Ａｃｈ」と記す。）１０^−８〜１０^−５Ｍの濃度反応曲線を図１に示した。
対照群のＡｃｈによる弛緩反応は、正常食群に対して有意に減弱した。一方、化合物Ａ投与群のＡｃｈによる弛緩反応は、対象群と比較して、有意に改善された。
化合物Ａは動脈硬化のリスクファクターである高脂血症の改善作用なしに、胸部、腹部大動脈への脂質沈着を有意に阻害した。この結果は、血漿中に高濃度の脂質が存在している状態においても、化合物Ａが組織への脂質沈着を阻害し、血管内皮依存性弛緩反応を改善することを示している。
試験例８ラット左冠動脈結紮心筋梗塞モデルに対する作用
ＳＤ系雄性ラット（日本ＳＬＣ）をエーテル麻酔下で背位固定し、ＳｅｌｙｅＨ．らの方法（Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ，１９６０，１１，３９８）に従い、胸骨左線に沿って縦切開を加え開胸し、心臓を露出させた。左冠動脈を起始部から１−２ｍｍの部位を４号シルク糸により結紮し、心臓を元に戻し、すばやく脱気した後、閉胸した。心電計（日本光電）により心筋梗塞の状態であることを確認した。結紮２４時間後に腹部大動脈から放血致死させ心臓を取り出し、中央部の横断輪状切片を、０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した１％塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（以下「ＴＴＣ」と記す。）溶液中、遮光下で２０分インキュベートした。その後、切片をホルマリン緩衝液で固定し、切片をトレースし、梗塞部（ＴＴＣ非染色部）面積、左心室面積を算出した。冠動脈結紮直後、化合物Ａを１％ＣＭＣ溶液に懸濁し、経口投与した。
抑制率は次式で算出した。

また、化合物Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）を結紮１５分、１時間、３時間後に経口投与し、梗塞抑制作用を検討した。結果を下表に示す。

化合物非投与群において、左心室に対する梗塞率は約４０％であったのに対し、化合物Ａ投与群は、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ投与群で有意な梗塞率の抑制作用があった。
試験例９ウサギ虚血再灌流心筋梗塞モデルに対する作用
雄性ＮＺＷウサギ（日本ＳＬＣ）を背位固定後、ペントバルビタール麻酔し開胸した後、左冠動脈基始部に４号シルク糸をかけ、さらに長さ１ｃｍのポリエチレンチューブをあてて糸で左冠動脈を結紮した。結紮２時間後にポリエチレンチューブ上の糸を切断し、血流を再開させた。再灌流４時間後に、４号シルク糸で冠動脈基始部を結紮し、３％エバンスブルー液を１ｍＬ／ｋｇ静脈内投与した。５分後に過剰量のペントバルビタールを投与し心臓及び大動脈を摘出した。心臓を幅３ｍｍの輪状に切断し、左心室面積、虚血領域（エバンスブルー非染色部）をトレースした。
さらに１％ＴＴＣ溶液中で３０分インキュベートした後、梗塞巣（ＴＴＣ非染色部）をトレースした。化合物Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）は結紮１時間前に投与した。
左心室面積に対する虚血域、梗塞巣の割合を算出した。
心臓の一部を液体窒素で凍結し、クラッシャーにより粉砕、リン酸緩衝液でホモジネートした。この懸濁液を３０００ｒｐｍで１０分、さらに上清８ｍＬを１５０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、得られた上清をｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを含むリン酸緩衝液と混合し、２５℃、３０分静置した後、吸光度（ＯＤ_４６０）を測定し、ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を求めた。ＭＰＯ活性は正常群の値を１００％として表した。結果を表１２に示す。

対照群では、虚血域に対する梗塞巣の割合は５８％であった。それに対し化合物Ａ投与群では、この割合は１４％となり、有意な抑制作用が認められた。また、心筋内への白血球浸潤の指標となるＭＰＯ活性は、対照群（梗塞心臓）で正常群に対して有意に増加したが、化合物Ａ投与群では対照群に対して有意に抑制された。
試験例１０ウサギ慢性心筋梗塞（心不全）モデルに対する作用
雄性ＮＺＷウサギ（日本ＳＬＣ）を背位固定後、ペントバルビタール麻酔し開胸した後、左冠動脈基始部に４号シルク糸をかけ、さらに長さ１ｃｍのポリエチレンチューブをあてて糸で左冠動脈を結紮した。結紮２時間後にポリエチレンチューブ上の糸を切断し、血流を再開させた。再開通２時間後に化合物Ａ（１ｍｇ／ｋｇ）を１回投与し、その後、１日１回１２週間にわたり投与した。１２週間後に過剰量のペントバルビタールを投与した後、心臓を摘出し、その重量及び左心室中央の壁の厚さを測定した。結果を以下に示す。
致死率と心重量、左心室厚により化合物を評価した。

ウサギ虚血再灌流心筋梗塞後、１２週間で被験化合物非投与群は、心重量の増加及び左心室厚の薄弱化が認められ、心筋梗塞後の心不全への移行時にみられる心臓の膨化・腫大を示した。化合物Ａ投与群では、心重量の増加及び左心室厚の薄弱化が抑制された。
試験例１１脳梗塞モデルに対する作用（虚血性脳障害モデル）
ＩＣＲ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）をエーテル麻酔し、背位に固定し、両総頸動脈を糸で結紮した。すばやく傷をふさぎ、直ちにマウスをケージ内に解放、３０分毎に２４０分までの死亡の有無を確認し、各群の累積死亡率を求めた。総頸動脈結紮１時間前に化合物Ｂを経口投与した。

化合物Ｂ投与群では、両頸動脈結紮による脳虚血モデルに対して、死亡率の改善効果がみられた。

本発明に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを含む医薬組成物は、種々のリスクファクターにより起こる疾患の予防や症状の軽減に用いることができ、しかも免疫機能に与える影響が小さいので、副作用が少なく、極めて有用なものである。
なお、本出願は、日本特許出願特願２００３−１０３５７６号を優先権主張して出願されたものである。

Claims

白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ作用を実質的に阻害せず、かつ白血球以外の組織のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ作用を抑制する化合物を含有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用の抑制剤。
白血球以外の組織が、血管細胞系、心臓、腎臓、網膜、ミクログリア又は腫瘍細胞の組織であることを特徴とする請求項１記載の抑制剤。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用が、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満、喫煙、心不全、心肥大、虚血性心疾患、又は血管再開通療法若しくは臓器移植術の虚血再灌流により生じたものであることを特徴とする請求項１又は２記載の抑制剤。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用が、ガン又は痴呆症により生じたものであることを特徴とする請求項１又は２記載の抑制剤。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用が、化学物質の摂取により生じたものであることを特徴とする請求項１又は２記載の抑制剤。
白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼには実質的に作用せず、かつ白血球以外の組織のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用を抑制する化合物が、下記一般式（Ｉ）から（ＶＩＩＩ）で表される二環式ピリダジン化合物又はその薬理学上許容される塩であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の抑制剤。
一般式（Ｉ）

｛式中、ＡはＣ_３〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_５〜Ｃ_７シクロアルキル又はそれぞれがＣ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ若しくはハロゲンから選ばれる１以上の置換基を有していてもよいフェニル、チエニル、フリル、チアゾリル、フェノキシ、Ｃ_７〜Ｃ_９フェニルアルキル、フェニルチオ、含窒素飽和環基、ピリジル若しくはイミダゾリルを表す。
Ｂは、−ＮＨ−Ｄ
〔Ｄは

（式中、Ｒ^１は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルを表す。Ｘはハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル又はＣ_１〜Ｃ_４アルコキシを表す。ｋは０〜３の整数を表し、ｋが２以上の整数のとき、複数のＸはそれぞれ異なっていてもよい。）

（式中、Ｒ^２は水素又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルを表す。ＹはＣ_１〜Ｃ_４アルキル又はＣ_１〜Ｃ_４アルコキシを表す。ｍは０〜６の整数を表す。ｍが２以上のとき、複数のＹはそれぞれ異なっていてもよく、任意の２つのＹが連結して分岐していてもよいＣ_１〜Ｃ_６アルキレンを形成してもよい。）

（式中、環ＨはＣ_５〜Ｃ_７シクロアルキルを表す。Ｙ及びｍは前記と同義である。）
−ＣＨＲ^３Ｒ^４（式中、Ｒ^３はＣ_１〜Ｃ_５アルキルを表す。Ｒ^４はＣ_５〜Ｃ_８シクロアルキル又はチエニルを表す。）
又はＣ_３〜Ｃ_８アルキルを表す。〕
又は

（式中、ＺはＣ_１〜Ｃ_４アルキル又はフェニルを表す。ｎは０〜２の整数を表し、ｎが２のときこれらのＺは異なっていてもよい。）
を表し、
Ｑはベンゼン環、フラン環又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルで置換されていてもよいチオフェン環を表す。｝
一般式（ＩＩ）

［式中、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。Ｘ’は−ＣＯＯＲ^７（Ｒ^７は水素又は置換されていてもよいＣ_１〜Ｃ_６アルキルを表す。）、−ＣＯＮＨ_２、−ＣＮ、−ＣＯＲ^８（Ｒ^８は置換されていてもよいＣ_１〜Ｃ_６アルキル又は置換されていてもよいアリールを表す。）、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２又は−ＯＲ^７（Ｒ^７は前記と同義である。）を表す。］
一般式（ＩＩＩ）

（式中、Ｒ^９、Ｒ^１０はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。）、
一般式（ＩＶ）及び（Ｖ）

［式中、Ｒ^１１及びＲ^１２は、それぞれ独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。Ｘ’’は−ＯＲ^１３（Ｒ^１３は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル又はアリールを表す。）又は−ＮＲ^１４Ｒ^１５（Ｒ^１４及びＲ^１５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル又はアリールを表す。）］
一般式（ＶＩ），（ＶＩＩ），（ＶＩＩＩ）

（式中、Ｒ^１６及びＲ^１７は、それぞれ独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルコキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル又はカルボキシルを表す。Ｒ^１ ^８及びＲ^１９は、それぞれ独立して、水素又はＣ_１〜Ｃ_６アルキルを表す。Ｙ’は酸素又は硫黄を表す。）
請求項１乃至６のいずれかに記載の抑制剤を有効成分とするＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰作用に起因する疾病用の医薬組成物。
脂質低下剤、降圧剤、血糖低下剤、血管拡張剤、抗血小板剤、抗凝固剤、脳保護薬、抗ガン剤、利尿剤、強心薬、鎮痛薬、抗浮腫薬、血栓溶解剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ビタミン剤又は抗酸化剤と、同時に若しくは別々に、又は逐次的に投与する形態であることを特徴とする請求項７記載の医薬組成物。