JPWO2004083847A1 - 液体クロマトグラフおよびプレヒート条件設定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、測定者が要求する最適なクロマトグラムが容易に得られる液体クロマトグラフを提供することを目的とする。具体的には、溶離液に試料を注入するインジェクタと、カラムオーブン流入前の試料溶液の温度を制御するプレヒート部と、試料を分離する分離カラムと、当該分離カラムの温度を制御するカラムオーブンと、分離後の試料を検出する検出器と、検出器から得られるデータを基にクロマトグラムを作成し、且つ各部を制御するデータ処理装置とを備えた液体クロマトグラフにおいて、前記データ処理装置は、分析開始前に、所望のクロマトグラムの条件を設定するための条件設定手段と、標準試料を複数回分析した後のクロマトグラムが、上記条件設定手段によって設定された条件に適合しているかを判断し、条件に適合しない場合は、前記プレヒート部の設定温度を変更するように制御するプレヒート部制御手段とを備えたことを特徴とする。本発明の構成によれば、再現性や対称度など、測定者の望むクロマトグラムを出力するための最適な条件設定を容易に行うことが可能となる。

Description

液体クロマトグラフに係り、特に、カラムオーブンに関する。

一般に、液体クロマトグラフのカラムオーブンは、ポンプから送液されてくる溶離液をカラムに導入する前に加熱する部分、所謂プレヒートを行う手段を備えている。これらの手段を備えたものとしては、例えば、特開平１１−２５８２２２号公報や特開２０００−１１１５３６号公報に示されている。
プレヒートの目的は、カラムに導入する前の溶離液をカラムの温度にできるだけ一致させるようにすることである。

溶離液とカラム温度を一致させることは、分離ピークの保持時間の再現性に対しては良い結果をもたらす。しかし、分離カラムのタイプによっては、この温度の一致が逆に分離ピークの形状を悪くし、ピークの分離度を損なう結果となることもある。
一般的に、プレヒート無しの分析で得られたクロマトグラムのピーク形状がリーディング気味（ピークの前に尾を引く状態）だった場合、プレヒートを行いその温度を上げていくと、得られるクロマトグラムのピーク形状がテーリング（ピークの後に尾を引く状態）の方向へと変わっていく様子が観察できる。この現象は、カラム中心部と壁面部との温度差による線流速の変化と流体に対するカラム壁面効果によるものである。即ち、この「線流速の変化」と「カラム壁面効果」が相殺した時、最もよいピーク形状になる。
また、検出結果に対する影響は、上記のようなカラム導入前の溶離液の温度以外にも、カラム通過後の溶液の温度も影響する。即ち、カラムオーブンから出た溶液が、室温に戻らないままに検出器に入ると、検出器のノイズ，ドリフトが大きくなり、検出感度の低下を招くといった問題がおこる。
したがって、オーブンから出た溶液が検出器に到達する前に、溶液の温度を室温に戻す必要がある（ポストクール）。一般的には、カラムと検出器間を結ぶ流路（チューブ）を長くすることで対応している。しかし、この方法では、チューブ内での層流によるバンドの拡がりにより、カラムの分離度を損なう結果となる。
多成分の分離分析を行う液体クロマトグラフにおいて、測定者が要求するクロマトグラムは、以下のように概ね分類される。
（１）分離ピークの形状は多少悪くとも、各分離ピークの保持時間の再現性を重視する場合。
夾雑物が少ない試料を分析する場合や、定性，定量を重視する場合に主に要求される。
（２）分離ピークの形状を重視する場合。
夾雑物が多く、クロマトグラムのピークの密集度が高い試料を分析する場合等に要求される。
本発明は、カラム前後の溶液の温度を制御することにより、測定者が要求する最適なクロマトグラムが容易に得られる液体クロマトグラフを提供することを目的としたものである。
上記目的において、本発明は、分析開始前に、所望のクロマトグラムの条件を設定するための条件設定を行い、標準試料を複数回分析した後のクロマトグラムに対して、設定された条件に適合しているかを判断し、条件に適合しない場合は、前記プレヒート部の設定温度を変更するように制御する。
また、プレヒート部は、容量の異なるプレヒート配管を複数備える。また更には、各プレヒート配管ごとに分離カラムを備える。
また、カラムオーブンと検出器間に溶離液の温度を環境温度に合わせるように温度制御するポストクール部を備える。
本発明の構成によれば、再現性や対称度など、測定者の望むクロマトグラムを出力するための最適な条件設定を容易に行うことが可能となる。
また、クロマトグラムに表れるノイズやドリフトを抑制することができる。

第１図は、本発明の概略構成図である。
第２図は、標準試料を複数回分析した後のクロマトグラムを示すものである。
第３図は、プレヒート部５の一実施例を示す図である。
第４図は、プレヒート部５の一実施例を示す図である。
第５図は、プレヒートの条件設定を行うフローチャートである。
第６図は、プレヒートの条件設定を行う際に表示される条件設定画面である。
第７図は、対称度等を求めるための説明に用いるクロマトグラムである。
第８図は、プレヒート部５の一実施例を示す図である。
第９図は、プレヒート部５の一実施例を示す図である。
第１０図は、本発明の他の概略構成図である。

第１図は液体クロマトグラフの装置概略図である。
溶液Ａ，Ｂ（１，２）は、ポンプ３により、その混合組成を時間と共に変えながら送液される。その後、オートサンプラー４内のインジェクターにより、分析すべきサンプルが溶液中に添加される。サンプルが添加された溶液は、プレヒート部５を通過した後、分離カラム６に導入される。多成分の分離を再現良く行うために、分離カラム６は、一定温度に保たれたカラムオーブン７内に設置される。分離カラム６で分離された各成分は、検出器８により検知され、そのデータはデータ処理装置９にて処理，保存される。また、データ処理装置９は、通常、各部の制御を行う。
上記分離カラム６内では、流体の線流速は中心部の方が速くなる。したがって、中心部を流れてきた流体のほうが早く分離カラム６より溶出してくる。つまり、分離カラム６内に注入された試料の各成分は中心部を流れた部分よりも、カラムの壁面を流れてきたものが遅くカラムから溶出することになる。この状態で検出されたクロマトグラムでは、成分のピーク形状は、遅れて溶出してくる部分があるために、テーリングを起こすことになる。
次に、プレヒートを行わない状態において、試料が分離カラム６に導入された場合を考える。分離カラム６内にカラム周辺温度より低い温度で導入された溶液は、カラム壁面の部分ほど早く温められることになる。したがって、分離カラム６に導入される流体の線流速はカラム壁面のほうが早くなる現象が発生する。この場合、分離カラム６内に注入された試料の各成分はカラム壁面部を流れてきた部分が早く溶出され、カラム中心部を流れてきた部分が遅く溶出されることになる。したがって検出されたピークのピーク形状はリーディングを起こすことになる。
上記２つの現象を相殺できるようにカラムに導入される溶液の温度を適切に制御することによって、分離カラム６内における溶液の線流速をカラムの径によらず一定速度で流すことができるようになる。この時、得られる成分のピークは対称度の良いピークとなる。
プレヒートがピーク形状に与える影響を第２図に示す。尚、第２図は複数回行った分析によって得られたクロマトグラムを同一保持時間で重ねて表示したものである。
プレヒートが十分に行われた場合のピークの様子を第２図（ａ）に示す。カラム壁面部を流れてきた部分は遅れて溶出してくるためピーク形状はテーリングを示すようになる。ただし、分離カラム６に導入される溶液の温度が分離カラム６の温度と同じ温度になっているため、各クロマトグラムのずれが少なく、保持時間の再現性は良い結果を示すといえる。
プレヒートが行われていない場合の状態を第２図（ｂ）に示す。カラム壁面部を流れてきた部分が早く溶出してくるため、ピーク形状はリーディングを示すようになる。また、分離カラム６に導入される溶液の温度は分離カラム６の温度との温度差が大きいため、各クロマトグラムのずれが大きく、保持時間の再現性は劣る結果となる。
カラム内での溶液の流速がカラムの径方向で一定になるように、プレヒートを制御した場合のピークの様子を（ｃ）に示す。この場合は、ピーク形状としては対称なピークが得られることになる。保持時間の再現性においては、プレヒートを十分に行った場合とプレヒートを行わなかった場合の間の結果が得られる。
本発明におけるプレヒート部５の一例を第３図に示す。
オートサンプラー４を経た溶液が送液されてくる配管１０は、ヒートブロック１１にはめ込まれた形になっている。ヒートブロック１１には、ヒートブロック１１の加熱又は冷却を行うための温度制御ユニット１５が接続され、温度制御ユニット１５を制御することによりヒートブロック１１の温度をカラムオーブンの温度と別個に制御する。温度制御ユニット１５には、例えばペルチェ素子を用いたものが用いられる。
また、別のプレヒート部の一例を第４図に示す。
この例においてプレヒート部５は中空構造であり、ケース１４内は、プレヒート空間１２を持つ構造になっている。オートサンプラー４を経た溶液が送液されてくる配管１０はコイル状であり、このプレヒート空間１２の部分に配置される。プレヒート部５には、プレヒート空間１２内の空気を加熱又は冷却するための温度制御ユニット１６が接続され、このプレヒート空間１２内の温度をカラムオーブンと別個に制御を行う。温度制御ユニット１６は、例えばプレヒート空間１２内の空気と外気とを入れ替える際にペルチェ素子を用いて熱交換を行うようなタイプが用いられる。
上記に示したプレヒート部５内の配管は、熱交換が容易な金属、例えばステンレス製の配管が使用される。
第５図に、プレヒートの条件を設定する際のフローチャートを示す。このフローチャートに示すプレヒート条件設定の処理は、ＣＲＴ等のディスプレイを有するデータ処理装置９において処理される。
条件設定処理が開始されると（５０１）、まずオートサンプラー４により、一定量のサンプル（標準試料）が溶離液に注入され（５０２）、分離カラム６を経て検出器８によってデータが取得され（５０３）、データ処理装置９においてクロマトグラムが作成される。データ処理装置９は、取得されたデータの回数をカウントし、あらかじめ設定された回数分取得されたかどうかを判断する（５０４）。設定される回数が多いほど信頼性は向上するが、通常は６回程度が設定される。データ取得の回数が設定回数に満たない場合は、上記５０２のステップに戻る。データ取得の回数が所定回数に達した場合は、得られたピークから目的に応じたピークが得られているか判断を行う（５０５）。
ステップ５０５における判断基準は、予め測定者によってデータ処理装置９に定義される。具体的には、判断において重視すべき基準が「保持時間の再現性」であるのか、「ピークの形状」であるのかが選択される。
第６図にデータ処理装置６の表示手段に表示される設定画面例を示す。「再現性」，「対称度」，「理論段数」の閾値となる数値が測定者によって設定できるようになっている。各項目にはチェックボックスがあり、優先する判断基準の項目を指定可能である。第６図の例では「再現性」が選択されている。「再現性」は上記の「保持時間の再現性」に対応し、「対称度」は上記の「ピークの形状」に対応する。
「再現性」は、クロマトグラムのピークトップの保持時間におけるバラツキの程度を判断するためのものであり、ＲＳＤ（相対標準偏差）で表される数値を用いる。ＲＳＤは、以下の式で表される。

上式において、ｘはピークトップの保持時間、ｎはデータ取得回数を示す。

この「再現性」が選択されている場合は、環境温度（室温）の変化に耐えるように、最初から十分な加熱が行われる。
「対称度」（非対称係数とも言う）は、文字通りピークの対称性を示す値であり、ピークトップの保持時間を中心として、その前後のピーク幅の比率を求めたものである。対称性を表す方法として、複数の計算式がある。第７図にピークの例を示すが、対称度をＳ、ピーク幅をＡ、前半のピーク幅をＢとした場合、計算式の一例として、Ｓ＝Ａ／２Ｂで表すことが出来る。この計算式の場合、対称度が１に近いほど対称性が良いといえ、１以上の数値はテーリング、１未満の数値はリーディングを示すことになる。本発明の場合は、複数回のデータ取得を行うため、ピーク幅Ａ，Ｂは、得られたデータの平均値を用いる。また、ピーク幅Ａ，Ｂを求める高さ位置ｈ′は、ピークトップの高さｈの５〜１０％付近の値を用いる。第６図の設定画面では、この対称度の数値は上限値と下限値を入力することになる。
「理論段数」は、ピークトップの保持時間ｔとピークのベースライン幅ｗとの関係によって求められるものであり、理論段数を求める式としても複数の計算式があるが、一例としてｎ＝（４ｔ／ｗ）^２で求めることができる。理論段数は、ピークの先鋭度を判断する指標として利用可能であるが、本発明においては使用しなくても良い。
ステップ５０５では、上記に示した判断基準に基づき、得られたデータの判断を行う。もし、判断基準に合わないデータであれば、ステップ５０６においてプレヒート部５の温度設定条件の変更を行い、再度ステップ５０２に戻る。判断基準に合うデータが得られた場合には、ステップ５０７へ行きプレヒート条件の設定が終了となる。
上記設定が終了すると、未知試料の分析を開始する。上記のようにプレヒート条件が設定されているため、未知試料の分析においても目的に応じたピークを得ることが可能になる。また、未知試料を繰り返し分析する場合、上記のプレヒート条件設定の処理を定期的に行えば、より確実に目的とするピーク形状を得ることが出来る。
第８図に、プレヒート部５の他の実施例を示す。
この実施例の特徴は、長さの異なるプレヒート配管８２，８３を備え、流路切替バルブ８４によって、いずれか一方の配管へ溶液を導くことが出来ることに有る。
プレヒート配管８２，８３は、ヒートブロック８１内を通過するように配置される。ヒートブロック８１には、第３図と同様の温度制御ユニットが設けられる（図示せず）。ヒートブロック８１の制御条件設定は、第５図に示したフローチャートと同様の手順で行う。本実施例では、２種類のプレヒート配管を備えていることから、より広い範囲の条件設定を行うことが出来る。
また、それぞれ容量の異なるプレヒート配管８２，８３は、例えば、標準用，セミミクロ用として使い分けることが出来、分析条件により切り替えて用いることが出来る。これにより、高流量域で使用するためにプレヒート容量を大きくする必要のある通常の分析の場合と、低流量域で使用し、デッドボリュームを最小限にしたい（プレヒート容量を最小限にしたい）セミミクロ用分析を流路切換バルブ４の切り換えにより容易に最適なプレヒート流路に切り替えることが可能となる。更に、第５図のフローチャートの条件設定を分析に先立って各配管ごとにプレヒート条件を設定することで、より最適な所望の分析結果を得ることが可能となる。
第９図に、第８図の構成を応用した他の実施例を示す。
本実施例は、第８図で示したプレヒート部５に分離カラムを組み合わせた例であり、容量の異なるプレヒート配管８２，８３のそれぞれに大きさの異なるカラム９１，９２を接続したものである。ヒートブロック８２には、第３図と同様の温度制御ユニットが設けられる（図示せず）。
本実施例では、２種類の分離カラムとその分析に適したプレヒート配管を備え、切り換えながら分析を行うことが出来る。プレヒートの条件設定は、各プレヒート配管ごとに行う。
第１０図に、カラムオーブン７の後段にポストクール部１３を備えた他の実施例を示す。
本実施例では、分離カラム６の後段にポストクール部１３を備えたことに特徴がある。ポストクール部１３は、カラムオーブン７とは熱的に分離されて配置され、その構成は、第３図や第４図で示したプレヒート部５と同様のもので良い。
ポストクール部１３は、カラムオーブン７によって設定温度に恒温化された液温を環境温度（室温）付近に戻すように温度を制御する。
本実施例では、ポストクール部１３により、検出器８におけるノイズ，ドリフトを抑えることが出来る。
以上説明したように、本発明の構成によれば、再現性や対称度など、測定者の望むクロマトグラムを出力するための最適な条件設定を容易に行うことが可能となる。
また、クロマトグラムに表れるノイズやドリフトを抑制することができる。

Claims (12)

1. 溶離液に試料を注入するインジェクタと、カラムオーブン流入前の試料溶液の温度を制御するプレヒート部と、試料を分離する分離カラムと、当該分離カラムの温度を制御するカラムオーブンと、分離後の試料を検出する検出器と、検出器から得られるデータを基にクロマトグラムを作成し、且つ各部を制御するデータ処理装置とを備えた液体クロマトグラフにおいて、
   前記データ処理装置は、
   分析開始前に、所望のクロマトグラムの条件を設定するための条件設定手段と、
   標準試料を複数回分析した後のクロマトグラムが、上記条件設定手段によって設定された条件に適合しているかを判断し、条件に適合しない場合は、前記プレヒート部の設定温度を変更するように制御するプレヒート部制御手段とを備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ。
2. 請求項１において、
   前記条件設定手段は、少なくともクロマトグラムピークの再現性、あるいはクロマトグラムピークの対称度の許容範囲の値を入力する手段、及び条件設定判断時に、前記再現性か前記対称度のいずれかを優先すべきかを指定する手段を有すことを特徴とする液体クロマトグラフ。
3. 請求項２において、
   前記条件設定手段は、理論段数の許容範囲の値を入力する手段を有することを特徴とする液体クロマトグラフ。
4. 請求項１において、
   前記プレヒート部は、溶離液が流れる配管が配置される経路空間を有したヒートブロックと、当該ヒートブロックの温度を制御するための温度制御ユニットからなることを特徴とする液体クロマトグラフ。
5. 請求項１において、
   前記プレヒート部は、溶離液が流れる配管が配置される空間を有したケースと、当該空間内の空気の温度を制御するための温度制御ユニットからなることを特徴とする液体クロマトグラフ。
6. 請求項１において、
   前記プレヒート部は、第１のプレヒート配管と、第２のプレヒート配管と、当該第１及び第２のプレヒート配管が接続され、且つ導入された試料溶液を当該第１及び第２のプレヒート配管の何れかに送液する流路切換バルブと、前記第１及び第２のプレヒート配管が配置される経路空間を有したヒートブロックとを備え、
   前記第１及び第２のプレヒート配管は、容量が異なることを特徴とする液体クロマトグラフ。
7. 溶離液に試料を注入するインジェクタと、試料を分離する分離カラムを有する分離部と、分離後の試料を検出する検出器と、検出器から得られるデータを基にクロマトグラムを作成し、且つ各部を制御するデータ処理装置とを備えた液体クロマトグラフであって、
   前記分離部は、
   第１のプレヒート配管と、当該第１のプレヒート配管に接続された第１の分離カラムと、第２のプレヒート配管と、当該第２のプレヒート配管に接続された第２の分離カラムと、当該第１及び第２のプレヒート配管が接続され、且つ導入された試料溶液を当該第１及び第２のプレヒート配管の何れかに送液する流路切換バルブと、前記第１及び第２のプレヒート配管が配置される経路空間を有したヒートブロックとを備え、
   前記第１及び第２のプレヒート配管は、容量が異なることを特徴とする液体クロマトグラフ。
8. 請求項７において、
   前記データ処理装置は、
   分析開始前に、所望のクロマトグラムの条件を設定するための条件設定手段と、標準試料を複数回分析した後のクロマトグラムが、上記条件設定手段によって設定された条件に適合しているかを判断し、条件に適合しない場合は、前記ヒートブロックの設定温度を変更するように制御するプレヒート部制御手段とを備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ。
9. 溶離液に試料を注入するインジェクタと、カラムオーブン流入前の試料溶液の温度を制御するプレヒート部と、試料を分離する分離カラムと、当該分離カラムの温度を制御するカラムオーブンと、分離後の試料を検出する検出器と、検出器から得られるデータを基にクロマトグラムを作成し、且つ各部を制御するデータ処理装置とを備えた液体クロマトグラフであって、
   前記カラムオーブンと前記検出器間に、カラムオーブンから排出された溶離液の温度を制御するポストクール部を備えたことを特徴とする液体クロマトグラフ。
10. 請求項９において、
    前記ポストクール部は、溶離液が流れる配管が配置される経路空間を有したヒートブロックと、当該ヒートブロックの温度を制御するための温度制御ユニットからなることを特徴とする液体クロマトグラフ。
11. 溶離液に試料を注入するインジェクタと、カラムオーブン流入前の試料溶液の温度を制御するプレヒート部と、試料を分離する分離カラムと、当該分離カラムの温度を制御するカラムオーブンと、分離後の試料を検出する検出器と、検出器から得られるデータを基にクロマトグラムを作成し、且つ各部を制御するデータ処理装置とを備えた液体クロマトグラフにおける前記プレヒート部のプレヒート条件設定方法において、
    分析開始前に、所望のクロマトグラムの条件を設定するステップと、
    標準試料を複数回分析するステップと、
    前記標準試料を複数回分析した後のクロマトグラムが、上記設定された条件に適合しているかを判断し、条件に適合しない場合は、前記プレヒート部の設定温度を変更するように制御するステップとを備えたことを特徴とするプレヒート条件設定方法。
12. 請求項１１において、
    分析前に設定される前記条件は、少なくともクロマトグラムピークの再現性、あるいはクロマトグラムピークの対称度の許容範囲であり、且つ分析後の判断時に、前記再現性か前記対称度のいずれかを優先すべきかを指定することを特徴とするプレヒート条件設定方法。

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