JPWO2002097421A1 - 電気泳動法 - Google Patents

Abstract

β−１，３−グルカン及び／又はメチルセルロースを含有した分離用担体；それを含有した泳動用緩衝液；該緩衝液の存在下に、高分子化合物を含有した試料を泳動する、キャピラリーまたはマイクロチップ電気泳動法；電気的試料注入又は加圧によりインジェクトする、キャピラリーまたはマイクロチップ電気泳動法；並びに該電気泳動法により、高分子化合物を解析する方法。本発明によれば、迅速に、高い分離能を得ることができ、遺伝子解析、プロテオーム解析またはグライコーム解析におけるタンパク質または糖鎖のＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔスクリーニング解析に有用であり、医療診療装置への応用、および生体機能、疾患発症機構などの解明への応用が可能になる。

Description

技術分野
本発明は、高分子化合物の泳動に適し、簡便、かつ迅速に、高い分離能を得ることができ、遺伝子解析、プロテオーム解析、グライコーム解析などへの応用が可能な、電気泳動法および高分子化合物の解析方法に関する。さらに詳しくは、電気泳動において、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの高分子化合物を迅速にかつ高い分離能で分離することができる、分離用担体、泳動用緩衝液、電気泳動法ならびに該高分子化合物の解析方法に関する。
背景技術
ヒトゲノム解析に伴い、ゲノム機能の解明が期待されている。具体的には、例えば、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析、メタボローム解析、グライコーム解析などにより、塩基配列情報に基づく転写産物の発現や遺伝子産物（タンパク質）、生体内代謝産物、糖鎖などの機能を解明し、それにより、疾患発症機構を解明されることが期待される。また、前記疾患発症機構の解明により、かかる疾患の予防、治療などへの応用が期待される。
現在、例えば、プロテオーム解析に関し、２次元電気泳動によるタンパク質のプロファイリングなどが行なわれている。しかしながら、前記２次元電気泳動は、操作が煩雑であること、操作に時間を要すること、多量の試料を要することなどの欠点を有する。
また、タンパク質や糖鎖の解析のために、キャピラリー電気泳動やマイクロチップ電気泳動が用いられる場合もある。しかしながら、タンパク質を、かかるキャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動により解析する場合、該タンパク質がキャピラリーに吸着する場合があるため、展開が妨げられ、解析が困難になる場合があるという欠点を有する。
さらに、従来の電気泳動においては、分離時間の高速化に限界があり、高速化の達成のために、高電圧をかけることにより、電気泳動が行なわれるが、高電圧下での分離により、分離能が低下する場合があるという欠点を有する。
したがって、操作が簡便であり、迅速に、高い分離能を得ることが可能な、高分子化合物、具体的には、タンパク質や糖鎖のＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔスクリーニング解析のための手法の確立が望まれている。
発明の開示
本発明は、高分子化合物の泳動に適し、操作が簡便であり、迅速に、高い分離能を得ることができる、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などの高分子化合物の解析が可能な分離用担体、泳動用緩衝液および電気泳動法、ならびに該電気泳動法に基づく該高分子化合物の解析方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 β−グルカンおよびメチルセルロースからなる群より選ばれた１種の化合物を含有してなる、キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動に用いるための分離用担体、
〔２〕 β−グルカンとして、β−１，３−グルカンを含むラミナラン、β−１，３−グルカンを含むカードラン、β−１，３−グルカンを含む植物抽出物、β−１，３−グルカンを含む海藻抽出物、β−１，３−グルカンを含む酵母抽出物、β−１，３−グルカンを含む真菌抽出物、およびβ−１，３−グルカンを含む真菌の培養液からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有してなる、前記〔１〕記載の分離用担体、
〔３〕 β−グルカンとして、β−１，３−グルカンを含む海藻抽出物を含有してなる、前記〔１〕記載の分離用担体、
〔４〕 海藻抽出物が、原藻を、水抽出、酸アルカリ抽出および溶媒抽出からなる群より選ばれた１種の抽出法により処理することにより得られた抽出物である、前記〔３〕記載の分離用担体、
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の分離用担体を含有してなる、キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動に用いるための泳動用緩衝液。
〔６〕 下記（１）〜（３）：
（１）ｐＨ１．０〜１２．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
（２）ｐＨ５．０〜１１．０であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、および
（３）ｐＨ５．０〜１１．０であり、１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液
からなる群より選ばれた１種の緩衝液であって、かつメチルセルロースを０．００１〜０．５重量％の濃度で含有してなる、前記〔５〕記載の泳動用緩衝液、
〔７〕 下記（１）〜（４）：
（１）ｐＨ１．０〜１２．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
（２）ｐＨ５．０〜１１．０であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
（３）ｐＨ５．０〜１１．０であり、１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液
（４）前記（３）において、０．００１〜１．０重量％のメチルセルロースをさらに含有した緩衝液
からなる群より選ばれた１種の緩衝液であって、かつカードランを０．０００００１〜０．１重量％の濃度で含有してなる、前記〔５〕記載の泳動用緩衝液、
〔８〕 下記（１）〜（４）：
（１）ｐＨ１．０〜１２．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
（２）ｐＨ５．０〜１１．０であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
（３）ｐＨ５．０〜１１．０であり、１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液
（４）前記（３）において、０．００１〜１．０重量％のメチルセルロースをさらに含有した緩衝液
からなる群より選ばれた１種の緩衝液であって、かつ海藻抽出物を０．０００００１〜０．１重量％の濃度で含有してなる、前記〔５〕記載の泳動用緩衝液、
〔９〕 キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動において、前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の泳動用緩衝液の存在下に、高分子化合物を含有した試料を泳動することを特徴とする、電気泳動法、
〔１０〕 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、前記〔９〕記載の電気泳動法、
〔１１〕 キャピラリー電気泳動において、高分子化合物を含有した試料をキャピラリーにインジェクトし、ついで、加圧し、該試料を、高分子化合物の分離が可能な泳動電場下に泳動することを特徴とする、電気泳動法、
〔１２〕 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、前記〔１１〕記載の電気泳動法、
〔１３〕 キャピラリー電気泳動において、
（ａ）試料注入口とアウトレットとを備え、かつ泳動用緩衝液が充填されたキャピラリーの試料注入口から、加圧または電気的注入により試料をインジェクトするステップ〔ステップ（ａ）という〕、および
（ｂ）加圧し、ついで、試料を泳動するステップ〔ステップ（ｂ）という〕
を含むプロセスを行なう、前記〔１１〕または〔１２〕記載の電気泳動法、
〔１４〕 ステップ（ａ）において、キャピラリーのアウトレットに水または泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、該試料をキャピラリーにインジェクトし、ステップ（ｂ）において、水または緩衝液を加圧する、前記〔１３〕記載の電気泳動法、
〔１５〕 ステップ（ａ）において、１〜３０ｋＶ、１〜３０秒での電気的注入により、該試料をキャピラリーにインジェクトし、
ステップ（ｂ）において、２０Ｖ／ｃｍ〜１０ｋＶ／ｃｍの泳動電場下に泳動する、前記〔１３〕または〔１４〕記載の電気泳動法、
〔１６〕 ステップ（ａ）において、１〜３０ｋＶ、１〜６０秒での電気的注入により、該試料をキャピラリーにインジェクトし、ステップ（ｂ）において、２〜５０ｍｂａｒ、２〜３０秒で加圧する、前記〔１３〕または〔１４〕記載の電気泳動法。
〔１７〕 前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の泳動用緩衝液の存在下に、試料を泳動する、前記〔１１〕〜〔１６〕いずれか１項に記載の電気泳動法、
〔１８〕 マイクロチップ電気泳動において、
（Ａ）ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップを用い、
該ローディングチャネルに電圧又は圧力を負荷して、高分子化合物を含有した試料を該試料リザーバーから供給して、分離用チャネルに導入するステップ〔ステップ（Ａ）という〕、ならびに
（Ｂ）分離用チャネルを加圧し、ついで、該試料を泳動するステップ〔ステップ（Ｂ）という〕
を含むプロセスを行なうことを特徴とする、電気泳動法、
〔１９〕 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、前記〔１８〕記載の電気泳動法、
〔２０〕 ステップ（Ｂ）における加圧の際の圧力の大きさを調節することにより、分離能を調整する、前記〔１８〕または〔１９〕記載の電気泳動法、
〔２１〕 ステップ（Ａ）において、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、ローディングチャネルを電圧を負荷することにより、試料を該分離用チャネルに導入し、
ステップ（Ｂ）において、ローディングチャネルに電圧を負荷し、かつ分離用チャネルを電圧を負荷することにより、試料を泳動する、前記〔１８〕〜〔２０〕いずれか１項に記載の電気泳動法、
〔２２〕 ステップ（Ａ）において、ローディングチャネルに１０〜５００Ｖの電圧（ローディング電圧）２〜６０秒を負荷し、
ステップ（Ｂ）において、ローディングチャネルに１０〜５００Ｖの電圧（スクイージング電圧）を負荷し、かつ分離用チャネルに２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍの電場を負荷する、前記〔２１〕記載の電気泳動法、
〔２３〕 ステップ（Ａ）において、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、試料リザーバーを加圧することにより、試料を該分離用チャネルに導入し、
ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルを加圧し、ついで、試料を泳動する、前記〔１８〕〜〔２０〕いずれか１項に記載の電気泳動法、
〔２４〕 ステップ（Ａ）において、試料リザーバーに１〜１５２０ｍｂａｒの圧力を加圧し、
ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルに１〜１５２０ｍｂａｒを加圧し、ついで、２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍの電場を負荷する、前記〔２３〕記載の電気泳動法、
〔２５〕 分子量９〜２０５ｋＤａのタンパク質を１５秒以内に分離する、前記〔１８〕〜〔２４〕いずれか１項に記載の電気泳動法。
〔２６〕 ２〜１００個の単糖を構成糖として有する糖を１５秒以内に分離する、前記〔１８〕〜〔２４〕いずれか１項に記載の電気泳動法、
〔２７〕 １０塩基〜１０キロ塩基の核酸を５０秒以内に分離しうる、前記〔１８〕〜〔２４〕いずれか１項に記載の電気泳動法、
〔２８〕 前記〔９〕〜〔２７〕いずれか１項に記載の電気泳動法により、高分子化合物を含有した試料を泳動して、該高分子化合物を分離し、分離された高分子化合物を検出して移動度を測定することを特徴とする、高分子化合物の解析方法、
〔２９〕 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖および核酸からなる群より選ばれた１種である、前記〔２８〕記載の高分子化合物の解析方法、ならびに
〔３０〕 ＵＶ波長光の吸収、蛍光検出、電気化学的検出および化学発光検出からなる群より選ばれた少なくとも１種により、分離された高分子化合物を検出する、前記〔２８〕または〔２９〕記載の高分子化合物の解析方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の分離用担体によれば、キャピラリー電気泳動およびマイクロチップ電気泳動において、操作を簡便にすることができ、かつ高分子化合物などの解析を高速で行なうことができ、高い分離能を得ることができる。
本明細書においては、高分子化合物としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などが挙げられる。
前記核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。
本発明の分離用担体は、キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動に用いるための分離用担体であり、かつβ−グルカンおよびメチルセルロースからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を含有することに１つの特徴がある。
本発明の分離用担体は、β−グルカンまたはメチルセルロースを含有しているため、電気泳動時に、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などが、キャピラリー電気泳動に用いられるキャピラリーの壁面またはマイクロチップ電気泳動に用いられるマイクロチップ上のチャネルの壁面に付着することを抑制することができるという優れた効果を発揮する。
前記β−グルカンは、β−グリコシド結合を含有したＤ−グルコースから構成され多糖であればよく、側鎖または直鎖内にβ−１，６結合、β−１，４結合を含有した多糖であってもよい。本発明の分離用担体は、β−グルカンとして、β−１，３−グルカンを含む化合物または混合物が挙げられ、例えば、ラミナラン、カードラン、植物抽出物、海藻抽出物、酵母抽出物、真菌抽出物もしくは培養液などが挙げられる。
かかるβ−グルカンは、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
前記β−グルカンは、高い分離能を得、高速分離を達成させる観点から、平均重合度が、２以上、好ましくは、１０以上、より好ましくは、２０以上であることが望ましく、分離に適した溶解性、粘度、付着性を得る観点から、１００００以下、好ましくは、１０００以下、より好ましくは、４０以下であることが望ましい。
なお、本明細書において、平均重合度は、分子量／モノマー分子量により求められる値を意味する。
β−グルカンの混合物としては、例えば、海藻抽出物、アガリスク、シイタケ、ヒラタケ、ヤマブシタケ、ハナビラタケ、スエヒロタケ、カワラタケなどのキノコ類の抽出物；大麦、カラス麦、オートムギなどの植物の抽出物；パン酵母、ビール酵母、マイコバクテリウム、真菌、糸状菌、クロレラ、微細藻類などの微生物の抽出物またはその培養液などが挙げられる。
前記海藻抽出物は、例えば、文献（特願２０００−２２９３６９号など）に記載の方法に従って、海藻（ワカメ、コンブ、アラメなど）から得られるものである。具体的には、前記海藻抽出物は、例えば、海藻（ワカメ、コンブ、アラメなど）を、水抽出（熱水、温水、冷水、氷冷水などによる抽出）、各種温度の酸アルカリ抽出、溶媒（エタノール、メタノール、アセトン、エーテルなど）などに供することにより得られうる。
前記海藻抽出物は、例えば、β−１，６結合が多いβ−１，３−グルカンである水溶性ラミナラン、β−１，６結合が少ないβ−１，３−グルカンである難溶性ラミナランなどの混合物である。
前記メチルセルロースは、分離に適した溶解性、粘度、付着性を得る観点から、平均重合度が、１０以上、好ましくは、１８０以上、より好ましくは、１８００以上であることが望ましく、十分な分離度を得る観点から、３００００以下、好ましくは、１００００以下、より好ましくは、３０００以下であることが望ましい。
また、前記メチルセルロースは、その誘導体であってもよく、かかる誘導体としては、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどが挙げられる。
本発明の分離用担体は、電気泳動における泳動用緩衝液に添加して用いることにより、キャピラリー電気泳動およびマイクロチップ電気泳動において、操作を簡便にすることができ、かつ高分子化合物、具体的には、タンパク質、ペプチド、糖鎖、多糖類などの解析を高速で行なうことができ、高い分離能を得ることができる。
したがって、本発明により、前記分離用担体を含有した泳動用緩衝液が提供される。
本発明の泳動用緩衝液は、キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動に用いるための泳動用緩衝液であり、前記分離用担体を含有することに１つの特徴がある。
かかる泳動用緩衝液によれば、電気泳動時に、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸などの測定試料が、キャピラリー電気泳動に用いられるキャピラリーの壁面またはマイクロチップ電気泳動に用いられるマイクロチップ上のチャネルの壁面に付着することを抑制することができる。したがって、本発明の泳動用緩衝液によれば、高分子化合物の泳動に適し、操作が簡便であり、高速かつ高い分離能を得ることができるキャピラリー電気泳動およびマイクロチップ電気泳動を可能にする。
なお、本明細書において、「測定試料」とは、試料中に含まれる測定対象の物質、すなわち、高分子化合物を意味する。また、単に「試料」と表記した場合、高分子化合物を含有した混合物などを意味する。
本発明の泳動用緩衝液は、高速かつ高い分離能を得る観点から、例えば、測定試料がペプチドである場合、ｐＨ１．０〜１２．０、好ましくは、ｐＨ２．０〜４．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは、１０ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有することが望ましい。
本発明の泳動用緩衝液におけるリン酸緩衝液の濃度は、分離能の効果を十分に発揮させる観点から、１ｍＭ以上が好ましく、１０ｍＭ以上がより好ましく、５０ｍＭ以上がさらに好ましく、７５ｍＭ以上がよりさらに好ましく、移動時間を短縮しかつ高い分離能を得る効果を十分に発揮させる観点から、０．５Ｍ以下が好ましく、０．２Ｍ以下がより好ましく、０．１Ｍ以下がさらに好ましい。
前記リン酸緩衝液のｐＨは、緩衝能、電気泳動における分離能の観点から、１．０〜１２．０が好ましく、２．０〜４．０がより好ましく、２．０〜２．８がさらに好ましく、２．５〜２．８がよりさらに好ましく、２．５が特に好ましい。
測定試料が、例えば、タンパク質である場合、本発明の泳動用緩衝液は、ｐＨ５．０〜１１．０、好ましくはｐＨ７．０〜９．６であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜０．１５Ｍの濃度で含有することが望ましい。ここで、本発明の泳動用緩衝液におけるホウ酸緩衝液の濃度は、分離能の効果を十分に発揮する観点から、１ｍＭ以上が好ましく、２．０ｍＭ以上がより好ましく、１０ｍＭ以上がさらに好ましく、２０ｍＭ以上がよりさらに好ましく、４０ｍＭ以上が特に好ましく、移動時間を短縮し、かつ高い分離能を得る効果を十分に発揮させる観点から、０．５Ｍ以下が好ましく、０．１５Ｍ以下がより好ましく、０．１Ｍ以下がさらに好ましく、７５ｍＭ以下がよりさらに好ましい。前記ホウ酸緩衝液のｐＨは、緩衝能、電気泳動における分離能の観点から、５．０〜１１．０が好ましく、７．０〜９．５がより好ましく、８．０〜９．０がさらに好ましい。
また、測定試料が、例えば、糖類、多糖の場合には、ｐＨ５．０〜１１．０、好ましくは７．０〜９．６であり、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜０．５Ｍ、より好ましくは１０ｍＭ〜０．１５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液であることが望ましい。ここで、本発明の泳動用緩衝液におけるトリス−ホウ酸緩衝液の濃度は、分離能の効果を十分に発揮する観点から、１ｍＭ以上が好ましく、１０ｍＭ以上がより好ましく、２０ｍＭ以上がさらに好ましく、４０ｍＭ以上がよりさらに好ましく、移動時間を短縮し、かつ高い分離能を得る効果を十分に発揮させる観点から、０．５Ｍ以下が好ましく、０．２５Ｍ以下がより好ましく、０．１５Ｍ以下がさらに好ましく、０．１Ｍ以下がよりさらに好ましく、７５ｍＭ以下が特に好ましい。また、前記トリス−ホウ酸緩衝液のｐＨは、緩衝能、電気泳動における分離能の観点から、５．０〜１１．０が好ましく、７．０〜９．５がより好ましく、８．０〜９．０がさらに好ましく、８．０〜９．０がよりさらに好ましい。
例えば、測定試料が、核酸の場合、前記１０ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜０．１５Ｍのトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液に０．００１〜０．７重量％、好ましくは０．０５〜０．７重量％のメチルセルロースを含有していることが望ましい。
分離用担体を含有した泳動用緩衝液における分離用担体の濃度は、用いる化合物の種類により、適宜設定されうるが、例えば、メチルセルロースの場合、分離能向上の観点から、０．００１〜１．０重量％が好ましく、０．７重量％がより好ましく、０．０５〜０．５重量％がさらに好ましく、０．１重量％であることが特に好ましい。
分離用担体がカードランである場合、高速分離、分離能向上、測定試料の壁面吸着防止の観点から、０．０００００１〜０．１重量％が好ましく、０．００００１〜０．０１重量％がより好ましく、０．０００１〜０．００１重量％がさらに好ましい。
分離用担体が海藻抽出物である場合、高速分離、分離能向上、測定試料の壁面吸着防止の観点から、０．０００００１〜０．１重量％が好ましく、０．００００１〜０．００１重量％がより好ましく、０．０００１重量％であることが特に好ましい。
本発明の泳動用緩衝液により、キャピラリー電気泳動およびマイクロチップ電気泳動に基づく電気泳動法であって、高分子化合物の泳動に適し、操作が簡便であり、高速かつ高い分離能を得ることができる、電気泳動法が提供される。
本発明の電気泳動法としては、具体的には、
（１）キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動において、前記泳動用緩衝液の存在下に、高分子化合物を含有した試料を泳動することを特徴とする方法；
（２）キャピラリー電気泳動において、高分子化合物を含有した試料をキャピラリーにインジェクトし、ついで、加圧し、該試料を、高分子化合物の分離が可能な泳動電場下に泳動することを特徴とする、電気泳動法；
（３）マイクロチップ電気泳動において、
（Ａ）ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップを用い、
該ローディングチャネルに電圧を負荷、または圧力を加圧して、高分子化合物を含有した試料を該試料リザーバーから供給して、分離用チャネルに導入するステップ〔ステップ（Ａ）という〕、ならびに
（Ｂ）分離用チャネルを加圧し、ついで、試料を泳動するステップ〔ステップ（Ｂ）という〕
を含むプロセスを行なうことを特徴とする方法
が挙げられる。
本発明の電気泳動法に適用される試料としては、高分子化合物を含有した試料が挙げられ、具体的には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などを含有した試料が上げられる。かかる試料は、特に限定されないが、生物由来の試料などが挙げられる。
泳動電場は、キャピラリー電気泳動の場合、良好な分離能を得、移動時間を短縮する観点から、２０Ｖ／ｃｍ〜１０ｋＶ／ｃｍであり、好ましくは、５０Ｖ／ｃｍ〜５ｋＶ／ｃｍであり、より好ましくは１００Ｖ／ｃｍ〜１ｋＶ／ｃｍであることが望ましい。
また、泳動電場は、マイクロチップ電気泳動の場合、良好な分離能を得、移動時間を短縮する観点から、２０Ｖ／ｖｍ〜５０ｋＶ／ｃｍであり、好ましくは、５０Ｖ／ｃｍ〜２０ｋＶ／ｃｍであり、より好ましくは１００Ｖ／ｃｍ〜１０ｋＶ／ｃｍであることが望ましい。
前記キャピラリー電気泳動に使用されるキャピラリーにおいて、内径、外径、全長、有効長は、特に限定されるものではなく、特に、有効長に関して、高速での解析を可能にする観点から、短い有効長のキャピラリーを用いることができる。ここで、キャピラリーの有効長とは、試料注入口から検出部の距離をいう。
前記マイクロチップ電気泳動においては、ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップが用いられうる。かかるマイクロチップの一例を第１１図に示す。第１１図中、マイクロチップ基板５上において、ローディングチャネル２と分離用チャネル４とは交差し、該ローディングチャネル２の一端に試料リザーバー１が配置され、他端にアウトレット３が配置されている。
前記マイクロチップ基板の材質としては、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガタス、ソーダガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ジメチルシロキサンなどが挙げられる。なかでも、試料の吸着が少なく、チップ加工が容易である観点から、ガラス、およびポリメタクリレートが望ましい。
前記マイクロチップの大きさは、例えば、縦１０〜１２０ｍｍ、横１０〜１２０ｍｍ、厚さ５００〜５０００μｍである。
前記マイクロチップにおけるローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれの形状は特に限定されるものではない。
前記チャネルの幅は、マイクロチップの大きさ、使用目的などにより適宜設定されうる。具体的には、前記チャネルの幅は、十分な解析感度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な解析精度を得る観点から、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下であることが望ましい。また、前記チャネルの深さは、マイクロチップの大きさ、使用目的などにより適宜設定されうるが、十分な解析感度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な解析精度を得る観点から、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下であることが望ましい。さらに、前記分離用チャネルの長さは、マイクロチップの大きさ、解析対象の化合物に応じて適宜設定することができるが、有効長を、より長くすることが望ましい。有効長は、チャネル交差部から、高分子化合物の検出点（分離用チャネル上に配置）までの距離をいう。十分な分離能を得る観点から、０．１ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上であり、高速分離の観点から、１００ｍｍ以下、好ましくは５０ｍｍ以下であることが望ましい。
また、前記リザーバーの大きさは、試料の容量に応じて適宜設定することができる。具体的には、リザーバーの大きさは、試料導入のハンドリング及び電極の太さの観点から、直径０．０５ｍｍ以上、好ましくは１ｍｍ以上であり、用いる試料量の観点から、５ｍｍ以下、好ましくは３ｍｍ以下であることが望ましい。
マイクロチップ電気泳動において、インジェクションする際の試料の量（濃度）は、良好な分離能を得る観点から、試料が、ペプチドまたはタンパク質の場合、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌであり、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは、０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであることが望ましい。前記試料が、糖または多糖の場合、インジェクションする際の試料の量（濃度）は、良好な分離能を得る観点から、０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｍｇ／ｍｌ〜５ｇ／ｍｌであり、より好ましくは、１００ｍｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌであることが望ましい。前記試料が、核酸の場合、インジェクションする際の試料の量（濃度）は、良好な分離能を得る観点から、１ｎｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、より好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであることが望ましい。
前記（１）の電気泳動法においては、電気泳動時の泳動電圧などは、解析対象の化合物〔タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）など〕により適宜設定されうる。かかる泳動電圧は、例えば、試料の分離能、用いる泳動用緩衝液の粘度、試料中に含まれる試料数などにより決定されうる。
前記（２）の電気泳動法としては、具体的には、キャピラリー電気泳動において、
（ａ）試料注入口とアウトレットとを備え、かつ泳動用緩衝液が充填されたキャピラリーの試料注入口から、電圧の負荷、または加圧により試料をインジェクトするステップ〔ステップ（ａ）という〕、および
（ｂ）水または緩衝液を用いて加圧し、ついで、試料を泳動するステップ〔ステップ（ｂ）という〕
を含むプロセスを行なう方法が挙げられる。
ここで、泳動用緩衝液としては、ｐＨ１．０〜１２．０、好ましくはｐＨ２．０〜４．０である１０ｍＭ〜０．５Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ５．０〜１１．０、好ましくは７．０〜９．５である１０ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜０．１５Ｍのホウ酸緩衝液、ｐＨ５．０〜１１．０、好ましくは７．０〜９．５である１０ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜０．１５Ｍのトリス−ホウ酸緩衝液、本発明の分離用担体を含む泳動用緩衝液などが挙げられる。解析を高速で行ない、かつ高い分離能を得る観点から、本発明の分離用担体を含む泳動用緩衝液が好ましい。
前記ステップ（ａ）においては、解析を高速で行ない、かつ高い分離能を得る観点から、キャピラリーのアウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、試料をインジェクトすることが好ましい。
前記ステップ（ａ）における電気的注入としては、試料をキャピラリーにインジェクトするに適した電場の負荷が挙げられる。
前記ステップ（ｂ）においては、みかけの有効長を短くするに適した圧力の負荷が挙げられ、試料中の高分子化合物を分離するに適した泳動電圧下に泳動する。前記ステップ（ｂ）における泳動電圧は、解析対象の化合物〔タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）など〕、試料の分離能、用いる泳動用緩衝液の粘度、試料中に含まれる試料数により決定されうる。
前記（２）の電気泳動法は、具体的には、例えば、ステップ（ａ）において、電圧１〜３０ｋＶ、好ましくは５〜１５ｋＶで１〜３０秒、好ましくは５〜１５秒でインジェクトすることにより、該試料をキャピラリーにインジェクトすること、および
ステップ（ｂ）において、水または緩衝液を２〜５０ｍｂａｒ、２〜３０秒で加圧して、２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍの泳動電場下に分離すること
により実施されうる。
また、試料注入条件、加圧条件は、装置の種類および性能、インジェクト部分の形状、サンプルバイアルの形および大きさ、サンプルキャップの材質および形状、試料粘度、濃度などに応じて適宜設定される。
前記（３）の電気泳動法としては、具体的には、
ステップ（Ａ）において、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、ローディングチャネルに電圧を負荷することにより、試料を該分離用チャネルに導入し、
ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルを加圧し、ついで、ローディングチャネルを加圧し、かつ分離用チャネルに電圧を負荷することにより、試料を泳動するプロセス〔プロセス１という〕；
または
ステップ（Ａ）において、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、試料リザーバーを加圧して、高分子化合物を含有した試料を分離用チャネルに導入し、
ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルを加圧し、ついで、試料を泳動するプロセス〔プロセス２という〕
を行なう方法が挙げられる。
前記（３）の方法によれば、前記ステップを行なうため、分子量９〜２０５ｋＤａのタンパク質を１５秒以内に分離することができ、２〜１００個の単糖を構成糖として有する糖を１５秒以内に分離することができ、１０塩基〜１０キロ塩基のＤＮＡを５０秒以内に分離することができるという優れた効果が発揮される。
前記プロセス１においては、前記ステップ（Ａ）においては、導入する試料及び用いる緩衝液粘度に適した電圧（もしくは電場）により負荷する。
具体的には、ステップ（Ａ）において、ローディングチャネルに１００〜５００Ｖの電圧を負荷し、
ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルを１〜１５２０ｍｂａｒ、好ましくは１０〜７６０ｍｂａｒで加圧し、ついで、ローディングチャネルに１００〜５００Ｖの電圧を負荷し、かつ分離用チャネルに２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍの電場を負荷する。
前記ステップ（Ｂ）における加圧の際の圧力の大きさを調節することにより、分離能を調整することができる。
一方、プロセス２においては、前記ステップ（Ａ）における加圧としては、導入する試料および緩衝液の粘度に適した圧力が挙げられる。
具体的には、ステップ（Ａ）において、試料リザーバーに、圧力（１〜１５２０ｍｂａｒ、好ましくは５０〜７６０ｍｂａｒ）を加圧し、
ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルに、１〜１５２０ｍｂａｒ、好ましくは１０〜７６０ｍｂａｒの加圧し、ついで、２０Ｖ〜５０ｋＶ／ｃｍの電場を負荷する。
前記ステップ（Ｂ）における加圧の際の圧力の大きさを調節することにより、分離能を調整することができる。
したがって、本発明の電気泳動法に用いる装置には、加圧装置が備えられていることが望ましい。本発明には、本発明の電気泳動法に用いるに適した電気泳動装置も含まれる。かかる装置としては、キャピラリーもしくはマイクロチップ；該キャピラリーもしくはマイクロチップを保持する手段；該キャピラリーもしくはマイクロチップに電場または電圧を負荷する手段；該キャピラリーもしくはマイクロチップに圧力を加圧する手段；これらの手段に適した電力を供給するための電源；変圧器；電場または電圧または圧力を制御する手段（コンピュータなど）；該キャピラリーもしくはマイクロチップに試料を注入する手段などを備えた装置などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の電気泳動法により、簡便、かつ迅速に、高い分離能を得ることができ、プロテオーム解析、グライコーム解析などへの応用が可能な、高分子化合物の解析方法が提供される。かかる解析方法は、高分子化合物を含有した試料を泳動して、該高分子化合物を分離し、分離された高分子化合物を検出して移動度を測定することを１つの特徴とする。
本発明の解析方法においては、試料中の高分子化合物は、例えば、ＵＶ波長光による吸収、蛍光、レーザー、ランプ、ＬＥＤなどによる検出、電気化学的検出化学発光検出を測定することにより検出されうる。具体的には、高分子化合物が、タンパク質またはペプチドの場合、２００ｎｍにおける吸収を測定すること；ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅとタンパク質またはペプチドとを反応させ、４６０〜５５０ｎｍで励起させ、５５０〜６５０ｎｍで蛍光を測定すること、および電気化学的測定、化学発光測定などにより、タンパク質またはペプチドを検出することができる。また、高分子化合物が、糖鎖または多糖類の場合、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける吸収を測定すること；ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅと糖鎖または多糖類とを反応させ、蛍光測定、および電気化学的測定、化学発光測定などにより、糖鎖または多糖類を検出することができる。
前記キャピラリー電気泳動においては、例えば、キャピラリーのアウトレットに、ＵＶ波長光を発しうる装置と該ＵＶ波長光の検出器とを設置してもよく、あるいは蛍光波長を発しうる装置と該蛍光波長を検出可能な検出器とを設置してもよい。
前記マイクロチップ電気泳動においては、例えば、分離用チャネル上に配置された検出点にＵＶ波長光の検出器を設置してもよく、あるいは、蛍光波長を発しうる装置と該蛍光波長を検出可能な検出器とを設置してもよい。
検出の際、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）などの同定を行なう場合には、ＵＶ吸収、標品との移動時間の比較、マススペクトルの解析などにより行なうことができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
製造例１
文献［例えば、特願２０００−２２９３６９号など］に記載の方法に従い、ワカメ（胞子葉または茎または根または葉状体を含む）、コンブ、アラメなどの海藻類を熱水抽出し、抽出物を得た。
ついで、前記抽出物を、脱イオン水に溶解した。得られた溶液を、キャピラリー電気泳動に供し、抽出物の組成を解析した。
なお、キャピラリー電気泳動には、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製ＨＰ^３ＤＣＥシステムを用いた。また、キャピラリーとして、ジフェニル ジメチルポリシロキサンにより内壁がコーティングされたＤＢ−１７キャピラリー〔内径０．１ｍｍ、外径０．３６ｍｍ、全長３２．５ｃｍ、有効長２４ｃｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いた。検出は、フォトダイオードアレイにより、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで行なった。
キャピラリー電気泳動の条件は、キャピラリー温度：２５℃、電場：２００または３００Ｖ／ｃｍ、注入条件：５ｋＶで５秒である。
その結果、電場３００Ｖ／ｃｍの場合、移動時間３．５〜４分において、２６０ｎｍに最大吸収波長度を呈する画分１と、移動時間４〜６分において、２８０ｎｍに最大吸収波長度を呈する画分２とが得られた。
また、標品との比較に基づき、前記画分１は、β−１，６結合を含むβ−１，３−グルカンを主成分とした水溶性ラミナランであり、前記画分２は、ガラクトースまたはウロン酸を含有した多糖であることが示された。
実施例１
キャピラリー電気泳動における泳動条件を検討した。
バイオラッドラボラトリー社製のペプチド標品〔Ｂａｒｄｙｋｉｎｉｎ（ＭＷ：１，０６０），Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ（ＭＷ：１，０４６），α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＷ：１，６６５），Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＷ３６２），Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＷ：１，１８２），Ｂｏｍｂｅｓｉｎ（ＭＷ：１，６２９），Ｌｅｕｃｉｎｅ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ＭＷ：３９２），Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ＭＷ：５７４），Ｏｘｙｔｏｃｉｎ（ＭＷ：１，００７）〕を、最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（ＩＣＮバイオメディカルズインコーポレティド製）に溶解した。得られた溶液を、以下、ペプチド試料として用いた。
キャピラリー電気泳動には、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製ＨＰ^３ＤＣＥシステムを用いた。また、キャピラリーとして、ジフェニル ジメチル ポリシロキサンにより内壁がコーティングされたＤＢ−１７キャピラリー〔内径０．１ｍｍ、外径０．３６ｍｍ、全長３２．５ｃｍ、コーティング相の厚さ０．１μｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いた。ペプチドの検出は、２００ｎｍの吸収を指標として行なった。キャピラリー電気泳動の条件は、方法：ＣＺＥ、電極の設定：陽極−陰極、キャピラリー温度：２５℃、泳動：１０ｋＶである。また、電気泳動用緩衝液として、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた。
まず、試料注入時における条件および泳動時における泳動電圧の条件について検討した。試料注入については、５〜８ｋＶで５〜８秒で検討を行ない、泳動電圧については、５〜１５ｋＶで検討を行なった。第１図に、有効長２４ｃｍのキャピラリーにおける移動時間およびペプチドの分離に対する試料注入条件および泳動電圧の影響を調べた結果を示す。
その結果、パネルＤおよびパネルＥに示すように、８ｋＶで８秒での試料注入により、十分な強度が得られることが示された。
シャープなピークを得、良好な分離能を得、かつ移動時間を短くする観点から、８ｋＶで８秒での試料注入を行ない、１０ｋＶの泳動電圧により、電気泳動を行なう条件が、最も適していることが示唆された。
また、５ｋＶで５秒での試料注入と、６．５ｋＶの泳動電圧により、電気泳動を行なう条件、８ｋＶで８秒の試料注入と１５ｋＶの泳動電圧によっても十分な強度が得られた。
前記結果を基に、キャピラリーの有効長について、有効長２４ｃｍまたは８．５ｃｍのキャピラリーを用いて検討を行なった。第２図に、移動時間およびペプチドの分離に対するキャピラリーの有効長への影響を調べた結果を示す。
その結果、有効長８．５ｃｍのキャピラリーを用いた場合においても、２４ｃｍのキャピラリーを用いた場合の分離能を損なうことなく、移動時間を短縮できることが示された。
実施例２
試料注入後に加圧することによる、移動時間の短縮効果を調べた。具体的には、水もしくは緩衝液を試料注入口またはアウトレットにセッティングした条件下あるいは水もしくは緩衝液を試料注入口またはアウトレットにセッティングしない条件下に、試料注入を行ない、ついで、加圧した場合（１０ｍｂａｒ、８秒）、あるいは加圧しない場合における試料の移動時間および分離能を調べた。なお、試料として、前記実施例１におけるペプチド試料を用いた。結果を、第３図に示す。
パネルＡは、従来より行なわれてきた方法（試料注入後に加圧しない場合）による電気泳動のパターンを示す。パネルＢは、試料注入後に、加圧（１０ｍｂａｒ、８秒）する条件であり、試料注入を、キャピラリーのアウトレットにリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）をセッティングして行なった結果を示す。また、パネルＣは、試料注入後に、加圧（１０ｍｂａｒ、８秒）する条件であり、試料注入を、キャピラリーのアウトレットにリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）をセッティングせずに行なった結果を示す。
その結果、試料注入を、キャピラリーのアウトレットに緩衝液をセッティングせずに行ない、試料注入後に、加圧する条件において、良好な分離能を得ることができ、かつ移動時間を短縮できることが示された。
さらに、キャピラリーのアウトレットに緩衝液をセッティングした条件下に試料注入を行ない、ついで、水もしくは緩衝液を試料注入口またはアウトレットにセッティングした条件あるいは水もしくは緩衝液を試料注入口またはアウトレットにセッティングしない条件において、１０ｍｂａｒで６〜８秒の加圧した場合における分離能および移動時間を調べた。その結果を第４図に示す。
パネルＡは、試料注入後に、加圧しない従来の条件による結果を示す。また、パネルＢ〜Ｄは、試料注入を、キャピラリーのアウトレットに緩衝液をセッティングせずに行ない、キャピラリーの試料注入口に水をセッティングした条件下に加圧した場合の結果を示す。また、パネルＥは、試料注入を、キャピラリーのアウトレットに緩衝液をセッティングせずに行ない、キャピラリーの試料注入口に緩衝液をセッティングした条件下に圧力をかけた場合の結果を示す。なお、各加圧条件を以下に示す。
パネルＢにおける条件
試料注入後、１０ｍｂａｒで６秒の加圧、試料注入口：水、アウトレット：緩衝液なし
パネルＣにおける条件
試料注入後、１０ｍｂａｒで６秒の加圧、試料注入口：水、アウトレット：水パネルＤにおける条件
試料注入後、１０ｍｂａｒで８秒の加圧、試料注入口：水、アウトレット：緩衝液
パネルＥにおける条件
試料注入後、１０ｍｂａｒで７秒の加圧、試料注入口：緩衝液、アウトレット：緩衝液
その結果、第４図のパネルＤに示すように、前記第３図のパネルＣと同じ条件において、移動時間が短縮され、良好な分離能を得ることができることが示された。
さらに、第４図のパネルＤにおける条件において、加圧時間による移動時間および分離能への影響を検討した。その結果の一部を第５図に示す。
なお、加圧条件は、パネルＡ：１０ｍｂａｒで２秒、パネルＢ：１０ｍｂａｒで６秒、パネルＤ：１０ｍｂａｒで８秒である。
第５図に示すように、６秒を超える加圧時間（７〜８秒）により、シャープなピークが得られることがわかる。
実施例３
試料注入を、有効長８．５ｃｍのキャピラリーのアウトレットにリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）をセッティングせずに行ない、ついで、加圧（１０ｍｂａｒ、８秒）する条件において、泳動用緩衝液に、β−１，３−グルカン（カードラン）を分離用担体として添加した系（終濃度０．０００１重量％）を用いて、移動時間、分離能への影響を調べた。なお、試料として、前記実施例１におけるペプチド試料を用いた。
その結果、第６図に示すように、０．０００１重量％ カードランを分離用担体として用いた場合、分離用担体を用いない場合に比べ、よりピークがシャープになり、かつ短時間での分離が可能になることがわかる。
有効長２４ｃｍのキャピラリーでは、ペプチドの解析に２５分かかるが、０．０００１重量％ カードランを分離用担体として用いる方法によれば、有効長８．５ｃｍのキャピラリーにより５分でペプチドを解析することができ、かつ良好な分離能を得ることができる。
実施例４
キャピラリー電気泳動により、タンパク質を解析するに適した電気泳動用緩衝液の検討を行なった。
電気泳動用緩衝液として、０．５〜０．１Ｍの範囲の濃度の緩衝液〔リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ５．５）またはトリス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）〕を用い、タンパク質試料の分離の至適条件を検討した。
キャピラリー電気泳動には、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製ＨＰ^３ＤＣＥシステムを用いた。また、キャピラリーとして、ジフェニル ジメチル ポリシロキサンにより内壁がコーティングされたＤＢ−１７キャピラリー〔内径０．１ｍｍ、外径０．３６ｍｍ、全長３２．５ｃｍ、有効長２４ｃｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いた。ペプチドの検出は、２００ｎｍの吸収を指標として行なった。キャピラリー電気泳動の条件は、方法：ＣＺＥ、電極の設定：陽極−陰極、キャピラリー温度：２５℃、泳動：１０ｋＶである。
試料として、実施例１に記載のペプチド試料を用いた。
その結果、０．１Ｍ以下の濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた場合、移動時間の短縮および分離能の向上が認められた。
実施例５
分離用担体として、メチルセルロース〔平均分子量：約４００，０００、シグマ社製〕、デキストラン〔平均分子量：約１００，０００〜２００，０００および平均分子量６０，０００〜９０，０００、いずれも和光純薬社製〕、カードラン〔和光純薬社製〕、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム〔ナカライテスク社製〕および前記製造例１で得られた海藻抽出物のそれぞれを用い、タンパク質、ペプチド試料の分離のための至適条件を検討した。
キャピラリー電気泳動には、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製ＨＰ^３ＤＣＥシステムを用いた。また、キャピラリーとして、ジフェニルジメチルポリシロキサンにより内壁がコーティングされたＤＢ−１７キャピラリー〔内径０．１ｍｍ、外径０．３６ｍｍ、全長３２．５ｃｍ、有効長２４ｃｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いた。ペプチドの検出は、２００ｎｍの吸収を指標として行なった。キャピラリー電気泳動の条件は、方法：ＣＺＥ、電極の設定：陽極−陰極、キャピラリー温度：２５℃、泳動：１０ｋＶである。また、電気泳動用緩衝液として、７５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いた。試料として、実施例１に記載のペプチド試料を用いた。結果を第７図〜第１０図に示す。
その結果、０．１重量％ メチルセルロースの添加（第７図のパネルＣ）、０．０００１〜０．００１重量％ カードランの添加（第８図のパネルＢおよびＣ）および０．０００１重量％ 海藻抽出物の添加（第８図のパネルＤ）により、移動時間の短縮および良好な分離能を得ることができることが示された。
実施例６
マイクロチップ電気泳動における泳動条件を検討した。
マイクロチップ電気泳動には、ＬＥＤ検出器を備えたマイクロチップ電気泳動装置〔ＳＶ１１００、日立電子工業社製〕を、マイクロチップにおけるタンパク質分離の評価に用いた。マイクロチップとして、ＤＮＡ解析用に開発されたｉ−ｃｈｉｐキットのマイクロチップ〔日立化成工業社製〕を用いた。前記マイクロチップは、ポリ（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）から製造されたものであり、幅５０μｍ、深さ３０μｍ、長さ８ｍｍのローディングチャネルと幅５０μｍ、深さ３０μｍ、長さ３０ｍｍの分離用チャネルとリザーバーとを有する〔第１１図参照のこと〕。
マイクロチップ電気泳動の手順を以下に示す。
▲１▼ＶＰ法
前記チャネルを、緩衝液および試料で満たした。ついで、アウトレット〔第１１図中、３に該当〕に泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、１０〜５００Ｖの電圧（ローディング電圧）１０〜６０秒を負荷して、試料をインジェクトした。分離用チャネルに圧力（１〜５２０ｍｂａｒ）を負荷した後、１０〜５００Ｖの電圧（スクイージング電圧）および３００〜９００Ｖの電圧（泳動電圧）（１００〜３００Ｖ／ｃｍの電場）を負荷して電気泳動を行ない、試料を分離した。
▲２▼ＰＰ法
前記ＶＰ法において、電圧による試料の分離用チャネルへのインジェクションの代わりに、圧力（１〜１５２０ｍｂａｒ）を負荷することにより、試料のインジェクションを行なった。さらに、分離用チャネルに圧力（１〜１５２０ｍｂａｒ）を負荷した後、３００〜９００Ｖの電圧（泳動電圧）（１００〜３００Ｖ／ｃｍの電場）を負荷して電気泳動を行ない、試料を分離した。
▲３▼従来のマイクロチップ電気泳動
前記チャネルおよびウェルを、緩衝液および試料で満たした。１００〜５００Ｖの電圧をローディングチャネルに２０秒負荷した。ついで、マイクロチップの交差部に１００〜５００Ｖの電圧を負荷し、分離チャネルに３００〜９００Ｖの電圧（泳動電圧）（１００〜３００Ｖ／ｃｍの電場）を負荷し、それにより試料を分離した。
（１）タンパク質の検出
タンパク質標品として、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＭＷ：１４，４００）、Ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＭＷ：２１，５００）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｉｄｏｒｏｒａｓｅ（ＭＷ：３１，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＭＷ：４５，０００）、Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＭＷ：６６，２００）、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ Ｂ（ＭＷ：９７，０００）、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＭＷ：１１６，０００）、Ｍｙｏｓｉｎ（ＭＷ：２００，０００）〔以上、バイオラッドラボラトリー社製〕を用いた。前記タンパク質標品を、それぞれ脱イオン水に溶解し、終濃度０．３μｇ〜７．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を得た。
タンパク質の電気泳動用緩衝液として、０．０５Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）を用いた。
また、マイクロチップにおいて、１μｌのＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを１０μｌのタンパク質溶液と反応させた。タンパク質は、２２０ｎｍにおける吸収により検出した。
その結果を第１２図に示す。第１２図において、パネルＡは、従来のマイクロチップ電気泳動において、低ローディング電圧（１００〜３００Ｖ）１０〜２０秒および低スクイージング電圧（１００〜４００Ｖ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＢは、高ローディング電圧（５００Ｖ）１０〜２０秒および高スクイージング電圧（５００Ｖ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＣは、前記ＶＰ法に準じて、ローディング電圧およびスクイージング電圧として、共に、１００Ｖを負荷し、泳動前に分離チャネルに５０ｍｂａｒで加圧した場合の結果を示す。パネルＤは、前記ＶＰ法に準じて、８種類のタンパク質の混合物について解析した結果である。具体的には、パネルＤは、１５０ｍｂａｒの加圧でローディングチャネルに試料注入した後、分離チャネルに１００ｍｂａｒで加圧し、スクイージング電圧（１００Ｖ）を負荷した場合の結果を示す。かかるパネルＤにおいて、各ピークは以下の通りである。１：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、２：Ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、３：Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ、４：Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、５：Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、６：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、７：β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、８：Ｍｙｏｓｉｎ。パネルＥは、前記ＰＰ法に準じて、１５０ｍｂａｒの加圧でローディングチャネルに試料注入した後、分離チャネルに１５０ｍｂａｒで加圧し、スクイージング電圧（１００Ｖ）を負荷した場合の結果を示す。なお、それぞれ、泳動電圧は、８００Ｖ（２６７Ｖ／ｃｍの電場）とした。
その結果、従来のマイクロチップ電気泳動においては、タンパク質のピークを分離することができなかったが、前記ＶＰ法およびＰＰ法によれば、良好な分離能を得ることができた。
特に、パネルＤに示すＰＰ法によれば、分離能を自在に変えることができるため、ピーク数が多い場合にも良好に検出できた。
さらに、パネルＥに示すＰＰ法によれば、９〜２０５ｋＤａのタンパク質を分離することができ、１５秒以内に分離することができた。
また、キャピラリー電気泳動により、同じ試料を分離した場合〔第１３図を参照のこと〕〕に比べ、前記ＶＰ法およびＰＰ法によれば、操作に要する時間を短縮することができた。
なお、かかるキャピラリー電気泳動には、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社製ＨＰ^３ＤＣＥシステムを用い、キャピラリーとして、ジフェニルジメチルポリシロキサンにより内壁がコーティングされたＤＢ−１７キャピラリー〔内径０．１ｍｍ、外径０．３６ｍｍ、全長３２．５ｃｍ、有効長２４ｃｍ；Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用い、ペプチドの検出は、２００ｎｍの吸収を指標として行なった。キャピラリー電気泳動の条件は、方法：ＣＺＥ、電極の設定：陽極−陰極、キャピラリー温度：２５℃、泳動：１０ｋＶである。
（２）マイクロチップ電気泳動の分離工程における２種のタンパク質間の相互作用への影響
Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎ（ＭＷ：５７３３．５）とＭｙｏｇｒｏｂｉｎ（ＭＷ：１６９５０．９）と〔共にシグマ社製〕を用い、前記ＶＰ法に準じて、アウトレット〔第１１図中３〕に泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、１００〜５００Ｖの電場（ローディング電圧）を負荷して、試料をインジェクトし、マイクロチップ電気泳動を行なった。その結果を第１４図に示す。
かかる条件下では、パネルＡおよびＢにおけるＢｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎおよびＭｙｏｇｒｏｂｉｎそれぞれの移動度と、パネルＣに示す２種のタンパク質のそれぞれの移動度とが同一であることがわかる。これにより、前記条件下には、タンパク質間の相互作用によった移動度変化は認められないことが示される。
（３）ＶＰ法における電気泳動前の加圧による移動時間の短縮効果
前記ＶＰ法における工程において、電気泳動前の加圧時における圧力〔加圧なし、低い加圧、より強い加圧〕の影響を調べた。結果を第１５図に示す。
パネルＡは、従来のマイクロチップ電気泳動と同様に加圧を行なわなかった場合の結果を示す。また、パネルＢは、低い加圧（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示し、パネルＣは、より強い加圧（１５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
その結果、加圧により、移動時間が短縮できることが示された。また、より強い加圧（１５０ｍｂａｒ）を負荷した場合、ベースラインの乱れが低減することが示された。
（４）２種のタンパク質の分離
前記ＶＰ法により、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎとＭｙｏｓｉｎとを電気泳動した。結果を第１６図に示す。
パネルＡおよびパネルＢは、従来のマイクロチップ電気泳動により、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎおよびＭｙｏｓｉｎそれぞれを分離した結果を示す。また、パネルＣは、前記ＶＰ法により、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎとＭｙｏｓｉｎとを分離した結果を示す。
かかる結果および前記第１４図において、ＶＰ法によりタンパク質間の相互作用による移動度変化がないことにより、前記ＶＰ法により、両方のタンパク質の移動時間が短縮できることが示された。
（５）多糖類の検出
以下、多糖標品として、α−Ｄ（＋）−Ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｈｙｄｏｒａｔｅ、β−１，３−Ｇｌｕｃａｎ（カードラン）〔以上、和光純薬社製〕、Ｄ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ〔ナカライテスク社製〕を用いた。また、前記製造例１により得られた海藻抽出物を多糖類の天然試料として用いた。前記多糖を、それぞれ脱イオン水に溶解し、１〜２Ｍ多糖溶液を得た。
多糖類の電気泳動用緩衝液として、０．１Ｍ トリス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた。また、マイクロチップ中において、また、１μｌのＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを２０μｌの多糖溶液と反応させた。多糖は、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍの吸収により検出した。
前記ＶＰ法およびＰＰ法のそれぞれについて、前記多糖類の検出における条件を検討した。なお、対照として、従来のマイクロチップ電気泳動により多糖類の検出を行なった。結果を第１７図に示す。
パネルＡは、従来のマイクロチップ電気泳動において、５００Ｖで２０秒の電圧（ローディング電圧）を負荷した条件により行なった結果を示す。パネルＢは、従来のマイクロチップ電気泳動において、３００Ｖで１０秒の電圧（ローディング電圧）を負荷して行なった結果を示す。これらのように、従来の方法によれば、ピークを検出できなかった。
パネルＣは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、５００Ｖの電圧（ローディング電圧）２０秒を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに低い圧力（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
パネルＤは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、３００Ｖの電圧（ローディング電圧）２０秒を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに低圧力（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
パネルＥは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、３００Ｖの電圧（ローディング電圧）２０秒を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに中程度の圧力（１００ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
パネルＦは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、３００Ｖの電圧（ローディング電圧）２０秒を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに高圧力（１５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
パネルＧは、ＰＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、圧力（１５０ｍｂａｒ）を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに低圧力（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
パネルＨは、ＰＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、圧力（１５０ｍｂａｒ）を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに高圧力（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
それぞれの泳動電圧は、８００Ｖ（２６７Ｖ／ｃｍの電場）とした。その結果、パネルＨにおける条件下において、より移動時間を短縮することができ、かつ良好な分離能を得ることができることが示された。
（６）ＤＮＡの検出
０．１μｇ〜５００μｇ／μｌのＤＮＡ〔大きさ１０ｋｂのラダー（フナコシ社製）〕溶液を試料とした。１０ｍＭ〜０．１５Ｍのトリス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．０〜１０．０）を含有した緩衝液に０．０１〜１．０重量％のメチルセルロースを含有した溶液を泳動用緩衝液として用い、前記（５）におけるＶＰ法、ＰＰ法に準じて、マイクロチップ電気泳動を行なった。
その結果、従来のマイクロチップ電気泳動では、移動時間が１０キロ塩基に対し、最短で１７０秒であるのに対し、ＶＰ法およびＰＰ法によれば、約５０秒であり、より移動時間を短縮することができ、かつ良好な分離能を得ることができることが示された。
産業上の利用可能性
本発明の電気泳動法および高分子化合物の解析方法によれば、迅速に、高い分離能を得ることができるため、遺伝子の解析、プロテオーム解析またはグライコーム解析におけるタンパク質または糖鎖のＨｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔスクリーニング解析に有用であり、医療診療装置への応用、および生体機能、疾患発症機構などの解明への応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、キャピラリー電気泳動において、試料注入時における至適条件および泳動時における泳動電圧の至適条件を検討した結果を示す図である。図中、各パネルは、以下の通りである：パネルＡ、試料注入時５ｋＶで５秒、泳動電圧３．７５ｋＶ；パネルＢ、試料注入時５ｋＶで５秒、泳動電圧６．５ｋＶ；パネルＣ、試料注入時５ｋＶで５秒、泳動電圧１５ｋＶ；パネルＤ、試料注入時８ｋＶで８秒、泳動電圧１０ｋＶ；パネルＥ、試料注入時８ｋＶで８秒、泳動電圧１５ｋＶ。また、各ピークは、以下の通りである：１、Ｂａｒｄｙｋｉｎｉｎ（ＭＷ：１，０６０）；２、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ（ＭＷ：１，０４６）；３、α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＷ：１，６６５）；４、Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＷ：３６２）；５、Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＷ：１，１８２）；６、Ｌｅｕｃｉｎｅ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ＭＷ：３９２）；７、Ｂｏｍｂｅｓｉｎ（ＭＷ：１，６２０）；８、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ＭＷ：５７４）；９、Ｏｘｙｔｏｃｉｎ（ＭＷ：１，００７）。
第２図は、有効長２４ｃｍのキャピラリーと有効長８．５ｃｍのキャピラリーとによる移動時間および分離能への影響を比較した結果を示す図である。
第３図は、試料注入後で、かつ泳動前の加圧による移動時間への影響を調べた結果を示す図である。各加圧条件は、以下の通りである：パネルＡ、試料注入後に加圧なし；パネルＢ、試料注入後に加圧、加圧は、緩衝液をアウトレットにセッティングした条件下に行なった；パネルＣ、試料注入後に加圧、加圧は、緩衝液をアウトレットにセッティングしない条件下に行なった。
第４図は、試料注入条件を検討した結果を示す図である。なお、試料は、アウトレットに緩衝液をセッティングせずに注入された。各試料注入条件について、パネルＡは、試料注入後、加圧なし；パネルＢは、試料注入後、１０ｍｂａｒで６秒加圧、試料注入口：水、アウトレット：緩衝液なし；パネルＣは、試料注入後、１０ｍｂａｒで６秒加圧、試料注入口：水、アウトレット：水；パネルＤは、試料注入後、１０ｍｂａｒで８秒加圧、試料注入口：水、アウトレット：緩衝液；パネルＥは、試料注入後、１０ｍｂａｒで７秒加圧、試料注入口：緩衝液、アウトレット：緩衝液である。
第５図は、第４図のパネルＤにおける条件において、加圧時間による移動時間および分離能への影響を検討した結果を示す図である。各加圧時間について、パネルＡは、１０ｍｂａｒで２秒、パネルＢは、１０ｍｂａｒで６秒、パネルＣは、１０ｍｂａｒで８秒である。
第６図は、β−１，３−グルカン（カードラン）を分離用担体として添加した系（終濃度０．０００１重量％）を用いて、移動時間、分離能への影響を調べた結果を示す図である。パネルＡは、カードランを添加しない条件、パネルＡ’は、カードランを添加した条件を示す。
第７図は、メチルセルロースの添加によるペプチドの移動時間および分解能への影響を示す図である。パネルＡは、無添加、パネルＢは、０．５％メチルセルロース添加、パネルＣは、０．１％メチルセルロース添加を示す。
第８図は、多糖類の添加によるペプチドの移動時間および分解能への影響を示す図である。パネルＡは、無添加、パネルＢは、０．００１％カードラン添加、パネルＣは、０．０００１％カードラン添加、パネルＤは、０．０００１％海藻抽出物添加を示す。
第９図は、デキストランの添加によるペプチドの移動時間および分解能への影響を示す図である。パネルＡは、無添加、パネルＢは、０．５％デキストラン添加、パネルＣは、１％デキストラン添加、パネルＤは、５％デキストラン添加、パネルＥは、１０％デキストラン添加、パネルＦは、５％デキストラン添加を示す。パネルＡ〜Ｅのデキストランは、平均分子量約１００，０００〜２００，０００であり、パネルＦのデキストランは、平均分子量約６０，０００〜９０，０００である。
第１０図は、ＳＤＳの添加によるペプチドの移動時間および分解能への影響を示す図である。パネルＡは、無添加、パネルＢは、０．０１％ ＳＤＳ添加、パネルＣは、０．０５％ ＳＤＳ添加、パネルＤは、０．１％ ＳＤＳ添加、パネルＥは、１％ ＳＤＳ添加、パネルＦは、５％ ＳＤＳ添加を示す。
第１１図は、マイクロチップ電気泳動に用いたマイクロチップの１例を示す図である。１：試料リザーバー、２：ローディングチャネル、３：アウトレット、４：分離用チャネル、５：マイクロチップ基板。
第１２図は、マイクロチップ電気泳動におけるローディング条件およびスクイージング条件を検討した結果を示す図である。パネルＡは、従来のマイクロチップ電気泳動において、低ローディング電圧（１００〜３００Ｖ）１０〜２０秒および低スクイージング電圧（１００〜４００Ｖ）を負荷した場合の結果の結果を示す。パネルＢは、高ローディング電圧（５００Ｖ）１０〜２０秒および高スクイージング電圧（５００Ｖ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＣは、前記ＶＰ法に準じて、ローディング電圧およびスクイージング電圧として、共に、１００Ｖを負荷し、泳動前に分離チャネルに５０ｍｂａｒで加圧した場合の結果を示す。パネルＤは、前記ＰＰ法に準じて、１５０ｍｂａｒの加圧でローディングチャネルに試料注入した後、分離チャネルに１００ｍｂａｒで加圧し、スクイージング電圧（１００Ｖ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＥは、前記ＰＰ法に準じて１５０ｍｂａｒの加圧でローディングチャネルに試料注入した後、分離チャネルに１５０ｍｂａｒで加圧し、スクイージング電圧（１００Ｖ）を負荷した場合の結果を示す。なお、それぞれ、泳動電場は、２６７Ｖ／ｃｍとした。
第１３図は、通常のキャピラリーを用いたキャピラリー電気泳動による電気泳動パターンを示す図である。
第１４図は、ＶＰ法に準じて、２種のタンパク質についてマイクロチップ電気泳動を行なった結果を示す図である。パネルＡは、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎ（ＭＷ：５７３３．５）のみを電気泳動した結果、パネルＢは、Ｍｙｏｇｒｏｂｉｎ（ＭＷ：１６９５０．９）のみを電気泳動した結果、パネルＣは、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎ（ＭＷ：５７３３．５）とＭｙｏｇｒｏｂｉｎ（ＭＷ：１６９５０．９）との両方を電気泳動した結果を示す。
第１５図は、ＶＰ法における工程において、マイクロチップ電気泳動前の加圧時における圧力の影響を調べた結果を示す図である。パネルＡは、従来のマイクロチップ電気泳動と同様に加圧を行なわなかった場合の結果、パネルＢは、低い加圧（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果、パネルＣは、高い加圧（１５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。
第１６図は、ＶＰ法により、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎとＭｙｏｓｉｎとをマイクロチップ電気泳動した結果を示す図である。パネルＡおよびパネルＢは、従来のマイクロチップ電気泳動により、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎおよびＭｙｏｓｉｎそれぞれを分離した結果、パネルＣは、ＶＰ法により、Ｂｏｖｉｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎとＭｙｏｓｉｎとを分離した結果を示す。
第１７図は、ＶＰ法およびＰＰ法のそれぞれについて、多糖類［α−Ｄ（＋）−Ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｒａｔｅ、β−１，３−Ｇｌｕｃａｎ、Ｄ−Ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ及び海藻抽出物］の検出における条件を検討した結果を示す図である。パネルＡは、従来のマイクロチップ電気泳動において、５００Ｖで２０秒の電圧（ローディング電圧）を負荷した結果を示す。パネルＢは、従来のマイクロチップ電気泳動において、３００Ｖで１０秒の電圧（ローディング電圧）を負荷して行なった結果を示す。パネルＣは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、５００Ｖの電場（ローディング電圧）を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに低い圧力（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＤは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、３００Ｖの電圧（ローディング電圧）を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに低い圧力（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＥは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、３００Ｖの電圧（ローディング電圧）を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに中程度の圧力（１００ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＦは、ＶＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、３００Ｖの電圧（ローディング電圧）を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに高い圧力（１５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＧは、ＰＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、圧力（１５０ｍｂａｒ）を負荷して、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに低い圧力（５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す。パネルＨは、ＰＰ法において、アウトレットに泳動用緩衝液がない条件下に、ローディングチャネルに、圧力（１５０ｍｂａｒ）を負荷し、試料をインジェクトし、ついで、分離用チャネルに高い圧力（１５０ｍｂａｒ）を負荷した場合の結果を示す

【０００４】
０１〜０．１重量％の濃度で含有してなる、前記〔５〕記載の泳動用緩衝液、
〔８〕 下記（１）〜（４）：
（１）ｐＨ１．０〜１２．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
（２）ｐＨ５．０〜１１．０であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
（３）ｐＨ５．０〜１１．０であり、１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液
（４）前記（３）において、０．００１〜１．０重量％のメチルセルロースをさらに含有した緩衝液
からなる群より選ばれた１種の緩衝液であって、かつ海藻抽出物を０．０００００１〜０．１重量％の濃度で含有してなる、前記〔５〕記載の泳動用緩衝液、
〔９〕 キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動において、前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の泳動用緩衝液の存在下に、高分子化合物を含有した試料を泳動することを特徴とする、電気泳動法、
〔１０〕 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、前記〔９〕記載の電気泳動法、
〔１１〕 キャピラリー電気泳動において、高分子化合物を含有した試料をキャピラリーにインジェクトし、ついで、加圧し、ついで、該試料を、高分子化合物の分離が可能な泳動電場下に泳動することを特徴とする、電気泳動法、
〔１２〕 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、前記〔１１〕記載の電気泳動法、
〔１３〕 キャピラリー電気泳動において、
（ａ）試料注入口とアウトレットとを備え、かつ泳動用緩衝液が充填されたキャピラリーの試料注入口から、加圧または電気的注入により試料をインジェクトするステップ〔ステップ（ａ）という〕、および

Claims (30)

1. β−グルカンおよびメチルセルロースからなる群より選ばれた１種の化合物を含有してなる、キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動に用いるための分離用担体。
2. β−グルカンとして、β−１，３−グルカンを含むラミナラン、β−１，３−グルカンを含むカードラン、β−１，３−グルカンを含む植物抽出物、β−１，３−グルカンを含む海藻抽出物、β−１，３−グルカンを含む酵母抽出物、β−１，３−グルカンを含む真菌抽出物およびβ−１，３−グルカンを含む真菌培養液からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有してなる、請求項１記載の分離用担体。
3. β−グルカンとして、β−１，３−を含むグルカン海藻抽出物を含有してなる、請求項１記載の分離用担体。
4. 海藻抽出物が、原藻を、水抽出、酸アルカリ抽出および溶媒抽出からなる群より選ばれた１種の抽出法により処理することにより得られた抽出物である、請求項３記載の分離用担体。
5. 請求項１〜４いずれか１項に記載の分離用担体を含有してなる、キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動に用いるための泳動用緩衝液。
6. 下記（１）〜（３）：
   下記（１）〜（３）：
   （１）ｐＨ１．０〜１２．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
   （２）ｐＨ５．０〜１１．０であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、および
   （３）ｐＨ５．０〜１１．０であり、１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液
   からなる群より選ばれた１種の緩衝液であって、かつメチルセルロースを０．００１〜０．５重量％の濃度で含有してなる、請求項５記載の泳動用緩衝液。
7. 下記（１）〜（４）：
   （１）ｐＨ１．０〜１２．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
   （２）ｐＨ５．０〜１１．０であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
   （３）ｐＨ５．０〜１１．０であり、１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液
   （４）前記（３）において、０．００１〜１．０重量％のメチルセルロースをさらに含有した緩衝液
   からなる群より選ばれた１種の緩衝液であって、かつカードランを０．０００００１〜０．１重量％の濃度で含有してなる、請求項５記載の泳動用緩衝液。
8. 下記（１）〜（４）：
   （１）ｐＨ１．０〜１２．０であるリン酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
   （２）ｐＨ５．０〜１１．０であるホウ酸緩衝液を１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で含有した緩衝液、
   （３）ｐＨ５．０〜１１．０であり、１ｍＭ〜０．５Ｍの濃度でトリス−ホウ酸緩衝液を含有した緩衝液
   （４）前記（３）において、０．００１〜１．０重量％のメチルセルロースをさらに含有した緩衝液
   からなる群より選ばれた１種の緩衝液であって、かつ海藻抽出物を０．０００００１〜０．１重量％の濃度で含有してなる、請求項５記載の泳動用緩衝液。
9. キャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動において、請求項５〜８いずれか１項に記載の泳動用緩衝液の存在下に、高分子化合物を含有した試料を泳動することを特徴とする、電気泳動法。
10. 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、請求項９記載の電気泳動法。
11. キャピラリー電気泳動において、高分子化合物を含有した試料をキャピラリーにインジェクトし、ついで、加圧し、該試料を、高分子化合物の分離が可能な泳動電場下に泳動することを特徴とする、電気泳動法。
12. 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、請求項１１記載の電気泳動法。
13. キャピラリー電気泳動において、
    （ａ）試料注入口とアウトレットとを備え、かつ泳動用緩衝液が充填されたキャピラリーの試料注入口から、加圧または電気的注入により試料をインジェクトするステップ〔ステップ（ａ）という〕、および
    （ｂ）加圧し、ついで、試料を泳動するステップ〔ステップ（ｂ）という〕
    を含むプロセスを行なう、請求項１１または１２記載の電気泳動法。
14. ステップ（ａ）において、キャピラリーのアウトレットに水または泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、該試料をキャピラリーにインジェクトし、ステップ（ｂ）において水または緩衝液を加圧する、請求項１３記載の電気泳動法。
15. ステップ（ａ）において、１〜３０ｋＶ、１〜３０秒での電気的注入により、該試料をキャピラリーにインジェクトし、
    ステップ（ｂ）において、２０Ｖ／ｃｍ〜１０ｋＶ／ｃｍの泳動電場下に泳動する、請求項１３または１４記載の電気泳動法。
16. ステップ（ａ）において、１〜３０ｋＶ、１〜６０秒での電気的注入により、該試料をキャピラリーにインジェクトし、ステップ（ｂ）において、２〜５０ｍｂａｒ、２〜３０秒で加圧する、請求項１３または１４記載の電気泳動法。
17. 請求項５〜８いずれか１項に記載の泳動用緩衝液の存在下に、試料を泳動する、請求項１１〜１６いずれか１項に記載の電気泳動法。
18. マイクロチップ電気泳動において、
    （Ａ）ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップを用い、
    該ローディングチャネルに電圧又は圧力を負荷して、高分子化合物を含有した試料を該試料リザーバーから供給して、分離用チャネルに導入するステップ〔ステップ（Ａ）という〕、ならびに
    （Ｂ）分離用チャネルを加圧し、ついで、該試料を泳動するステップ〔ステップ（Ｂ）という〕
    を含むプロセスを行なうことを特徴とする、電気泳動法。
19. 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖類および核酸からなる群より選ばれた１種である、請求項１８記載の電気泳動法。
20. ステップ（Ｂ）における加圧の際の圧力の大きさを調節することにより、分離能を調整する、請求項１８または１９記載の電気泳動法。
21. ステップ（Ａ）において、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、ローディングチャネルを電圧を負荷することにより、試料を該分離用チャネルに導入し、
    ステップ（Ｂ）において、ローディングチャネルに電圧を負荷し、かつ分離用チャネルを電圧を負荷することにより、試料を泳動する、請求項１８〜２０いずれか１項に記載の電気泳動法。
22. ステップ（Ａ）において、ローディングチャネルに１０〜５００Ｖの電圧（ローディング電圧）２〜６０秒）を負荷し、
    ステップ（Ｂ）において、ローディングチャネルに１０〜５００Ｖの電圧（スクイージング電圧）を負荷し、かつ分離用チャネルに２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍの電場を負荷する、請求項２１記載の電気泳動法。
23. ステップ（Ａ）において、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下に、試料リザーバーを加圧することにより、試料を該分離用チャネルに導入し、
    ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルを加圧し、ついで、試料を泳動する、請求項１８〜２０いずれか１項に記載の電気泳動法。
24. ステップ（Ａ）において、試料リザーバーに１〜１５２０ｍｂａｒの圧力を加圧し、
    ステップ（Ｂ）において、分離用チャネルに１〜１５２０ｍｂａｒの加圧後、２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍの電場を負荷する、請求項２３記載の電気泳動法。
25. 分子量９〜２０５ｋＤａのタンパク質を１５秒以内に分離する、請求項１８〜２４いずれか１項に記載の電気泳動法。
26. ２〜１００個の単糖を構成糖として有する糖を１５秒以内に分離する、請求項１８〜２４いずれか１項に記載の電気泳動法。
27. １０塩基〜１０キロ塩基の核酸を５０秒以内に分離しうる、請求項１８〜２４いずれか１項に記載の電気泳動法。
28. 請求項９〜２７いずれか１項に記載の電気泳動法により、高分子化合物を含有した試料を泳動して、該高分子化合物を分離し、分離された高分子化合物を検出して移動度を測定することを特徴とする、高分子化合物の解析方法。
29. 高分子化合物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖鎖、多糖および核酸からなる群より選ばれた１種である、請求項２８記載の高分子化合物の解析方法。
30. ＵＶ波長光の吸収、蛍光検出、電気化学的検出および化学発光検出からなる群より選ばれた少なくとも１種により、分離された高分子化合物を検出する、請求項２８または２９記載の高分子化合物の解析方法。

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