技術分野
本発明はシステインプロテアーゼ阻害活性、とりわけカルパイン阻害活性を有する新規ヒドラゾン誘導体に関する。また、本発明は新規ヒドラゾン誘導体を含有する医薬に関する。
背景技術
生化学的研究により、システインプロテアーゼの異常亢進が種々の疾病に関与していることが判明してきた。例えば、システインプロテアーゼの一つであるカルパインは生体内に広く分布する細胞質内のタンパク分解酵素の一つであり、カルシウムイオンで活性化される。現在では、このカルパインの異常な活性化が脳卒中、クモ膜下出血、アルツハイマー病、虚血性疾患、筋ジストロフィー、白内障、血小板凝集、関節炎などの種々の疾患に関与していることが明らかとなっている〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５巻，４１２頁（１９９４年）〕。一方、カルパイン阻害剤は水晶体培養による実験的白内障モデルにおいて、水晶体の透明維持に効果があり〔Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，１０巻，６５７−６６６頁（１９９４年）〕、白内障治療剤（ＷＯ９３／２３０３２）などとして有用であることが分ってきている。これまで報告されているシステインプロテアーゼ阻害剤としては、エポキシコハク酸ペプチド誘導体〔特公平１−５４３４８（ＵＳＰ ４，３３３，８７９）、特開昭５５−１５３７７８（ＵＳＰ ４，４１８，０７５）など〕、ペプチドハロメタン誘導体（特公平６−２９２２９）、ペプチドジアゾメタン誘導体〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５３巻，７５１−７５８頁（１９８８年）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５巻，２１６−２２０頁（１９９２年）〕、ペプチジルアルデヒド誘導体〔特開平１０−１４７５６４（ＵＳＰ ６，０５７，２９０、ＵＳＰ ６，２１４，８００）など〕などが挙げられるが、これらの阻害剤には水溶性、安定性、生体への吸収、代謝に対する安定性などの問題点があり、まだ、実用化されていないのが現状である。
発明の開示
強力なシステインプロテアーゼ阻害活性、とりわけカルパイン阻害活性を有し、且つ医薬品として望まれる適度な水溶性を有する化合物を提供することである。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、強いカルパイン阻害活性を有する化合物を創製し、さらに研究を進めて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）一般式（Ｉ）
〔式中、Ｒ１は水素または低級アルキル基を示し、Ａはモルホリノ基または一般式（ＩＩ）
（式中Ｂはヒドロキシ低級アルキル基またはカルバモイル基、或いはアミノ基が置換されていてもよいグリシル基である。）である。〕で表される化合物、
（２）一般式（Ｉ）の化合物が一般式（ＩＩＩ）
〔式中、Ｒ２は低級アルキル基である。〕で表される化合物である上記（１）に記載の化合物、
（３）上記（１）又は（２）に記載の化合物を含有する医薬、
（４）上記（１）又は（２）に記載の化合物を含有するカルパイン阻害剤、
（５）カルパインが関与する疾患の予防又は治療用である上記（３）に記載の医薬、
（６）カルパインが関与する疾患が虚血性疾患、免疫疾患、アルツハイマー病、骨粗鬆症、脳組織障害による疾患、白内障、緑内障、網脈絡膜疾患、光凝固による眼球後眼部合併症、血管新生を伴う疾患である上記（５）に記載の医薬、
（７）上記（１）又は（２）に記載の化合物及び製薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物、
（８）カルパイン阻害剤である上記（７）に記載の医薬組成物、
（９）虚血性疾患、免疫疾患、アルツハイマー病、骨粗鬆症、脳組織障害による疾患、白内障、緑内障、網脈絡膜疾患及び光凝固による眼球後眼部合併症の治療用並びに血管新生の治療用である上記（８）に記載の医薬組成物、
（１０）カルパインが関与する疾患を治療する方法であって、治療を必要とする哺乳動物に有効量の上記（１）又は（２）に記載の化合物を投与することからなる方法、
（１１）カルパインが関与する疾患が虚血性疾患、免疫疾患、アルツハイマー病、骨粗鬆症、脳組織障害による疾患、白内障、緑内障、網脈絡膜疾患、光凝固による眼球後眼部合併症、血管新生を伴う疾患である上記（１０）に記載の方法、
（１２）カルパイン阻害剤を製造するための上記（１）又は（２）に記載の化合物の使用、及び、
（１３）虚血性疾患、免疫疾患、アルツハイマー病、骨粗鬆症、脳組織障害による疾患、白内障、緑内障、網脈絡膜疾患及び光凝固による眼球後眼部合併症の治療用並びに血管新生の治療用である上記（１２）に記載の方法、さらに、
（１４）医薬品として望まれる適度な水溶性を有する上記（１）に記載の化合物に関する。
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表される低級アルキル基は炭素数３〜５の直鎖状又は分枝状アルキル基をいい、例えばプロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなどが挙げられ、好ましくはＣ４アルキル基、特に好ましくはイソブチルである。
上記一般式（ＩＩ）中、Ｂで表されるヒドロキシ低級アルキル基としては、ヒドロキシＣ１−３アルキル基をいい、例えばヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなどが挙げられ、好ましくはヒドロキシエチルである。
上記一般式（ＩＩ）中、Ｂで表されるグリシル基のアミノ基が置換してもよい基としては、例えば上記一般式（ＩＩＩ）中のＲ２で表される低級アルキル基が挙げられる。該低級アルキル基は炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状アルキル基をいい、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルなどが挙げられる。好ましくはメチルである。
上記一般式（Ｉ）中、フルオロフェニル基は、例えばフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、トリル基、トリフルオロメチルフェニル基などに適宜変換することもできる。
本発明の化合物は、化合物（Ｉ）およびその塩、ならびにこれらの各種の溶媒和や結晶多形の物質をも包含する。本発明における一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては生理学的に許容される塩が好ましく、例えば無機酸との塩、有機酸との塩、または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明の化合物は例えば、下記の一般反応式
（式中、各記号は前記と同意義を有する。）により製造することができる。すなわち一般式（ＩＶ）で表される化合物を有機溶媒あるいは有機溶媒−水混液中、塩基の存在下もしくは非存在下、一般式（Ｖ）で表される化合物〔以下、化合物（Ｖ）と記載することもある。〕と反応させることにより目的とする一般式（Ｉ）で表される化合物を得ることができる。一般式（ＩＶ）で表される化合物は、例えば特開平１０−１４７５６４（ＵＳＰ ６，０５７，２９０、ＵＳＰ ６，２１４，８００）などに記載の方法で製造することができる。
有機溶媒としては、例えばジオキサン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびテトラヒドロフランなどの慣用の溶媒あるいはそれら混合溶媒が挙げられる。好ましくはジオキサン、ジオキサンとメタノールの混合溶媒および酢酸エチルである。塩基としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの酢酸塩、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン、ピリジン、ルチジン、ピコリンおよび４−ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウムなどの無機酸塩が挙げられる。好ましくは酢酸ナトリウムである。反応温度は、通常冷却下から加温下の範囲であり、好ましくは、約０℃〜約３０℃の範囲である。
本発明の化合物およびその塩は文献未載の新規化合物であり、後記試験例に示すように優れたカルパイン阻害活性を有するため、それらを有効成分として、必要により後記の担体などを組み合わせることにより、カルパイン阻害剤としての医薬として有用である。
本発明の化合物を含有する医薬は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびヒトなどの哺乳動物の虚血性疾患、免疫疾患、アルツハイマー病、骨粗鬆症、脳組織障害による疾患（例えば脳血管攣縮、脳血栓症、脳梗塞、脳閉塞症、脳内出血、クモ膜下出血、高血圧性脳症、一過性脳虚血発作、多発性梗塞性痴呆、脳動脈硬化症、ハンチントン病など）、白内障、緑内障（例えば開放隅角緑内障、低眼圧緑内障、閉塞隅角緑内障など）、網脈絡膜疾患（例えば網膜血管閉塞症、網膜静脈周囲炎、Ｅａｌｅｓ病、虚血性眼症候群および網膜細動脈瘤などの網膜血管異常、高血圧または腎疾患による網膜症、糖尿病性網膜症、網膜色素上皮症、網膜ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、網脈絡膜萎縮、網脈絡膜症、黄斑変性症、黄斑浮腫、網膜色素上皮剥離、網膜剥離、変性網膜分離症、網膜芽細胞種、網膜色素上皮腫瘍、視神経乳頭毛細血管腫など）、光凝固による眼球後眼部合併症（例えば黄斑部浮腫、網膜剥離、視神経炎、視野異常、光覚異常、色覚異常など）などの予防および治療剤として、または血管新生、網膜剥離などの予防および治療剤として有用である。
本発明の化合物を含有する医薬は全身的または局所的に投与される。全身的には経口投与の他、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など非経口的にも投与される。局所的には、皮膚、粘膜、鼻内、眼内に投与される。
本発明の化合物を含有する医薬の製剤形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、坐剤などの固形剤、およびシロップ剤、注射剤、点眼剤、点鼻剤などの液剤などが挙げられる。顆粒および錠剤として製造する場合には、例えば賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液など）などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤および錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなど）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロースなど）などで剤皮を施してもよい。
カプセル剤とする場合には、適当な賦形剤、例えば流動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、軽質無水ケイ酸など、また加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖などの他、上記崩壊剤などを適宜添加したものを均等に混和または、粒状、若しくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチンなど）にグリセリンまたはソルビトールなど加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤〔二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、エチル、プロピルエステル）など〕などを加えることができる。カプセル剤は通常のカプセルの他、腸溶コーティングカプセル、胃内抵抗性カプセル、放出制御カプセルとすることもできる。腸溶性カプセルとする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングしたリポソームを通常のカプセルに充填または、カプセル自身を腸溶性コーティング剤でコーティング、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形することができる。
坐剤とする場合には坐剤基剤（例えばカカオ脂、マクロゴールなど）を適宜選択して使用することができる。
シロップ剤とする場合、例えば安定剤（エデト酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロースなど）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖など）、芳香剤などを適宜選択して使用することができる。
注射剤、点眼剤または点鼻剤とする場合、医薬上許容される添加物、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、増粘剤（ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）などを適宜添加した溶液に溶解または分散することによって製造することができる。
なお、本発明の化合物は、医薬品として望まれる適度な水溶性を有するので、特に上記したシロップ剤、注射剤、点眼剤および点鼻剤などの製剤に有利に製造できる。
上記シロップ剤、注射剤、点眼剤および点鼻剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよく、等張化剤は、通常、浸透圧が約２２９〜約３４３ｍＯｓ／Ｋｇ・Ｈ２Ｏとなるよう、約０．５〜約５．０ｗ／ｖ％に添加する。また、緩衝剤は約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％程度、増粘剤は約０．０１〜約１．０ｗ／ｖ％程度、安定化剤は約０．００１〜約１．０ｗ／ｖ％程度添加する。ｐＨ調整剤は、適宜添加し、通常ｐＨ約３〜約９、好ましくはｐＨ約４〜約８に調整される。
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の投与量は対象となる疾患、症状、投与対象、投与方法などにより異なるが、例えば内服剤の場合は、成人では１日１〜４回、１回約１〜約１００ｍｇ程度投与するのがよい。注射剤の場合は、成人では１日１〜３回、１回約０．１〜約３０ｍｇ程度投与するのがよい。また、局所的使用する場合には、通常約０．００１〜約１．０ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０１〜約０．５ｗ／ｖ％に調整した点眼液を、１回２０〜５０μｌ、１日２〜６回点眼するのがよい。
本発明の具体的化合物としては、例えば
・Ｎ−（３−アザ−３−（２−（ジメチルアミノ）アセチルアミノ）−１−（２−メチルプロピル）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物１）、
・Ｎ−（３−アザ−３−モルホリン−４−イルプロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物２）、
・Ｎ−（３−アザ−３−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−１−（２−メチルプロピル）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物３）、
・Ｎ−（３−アザ−３−（２−（ジメチルアミノ）アセチルアミノ）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物４）、
・Ｎ−（３−アザ−１−（２−メチルプロピル）−３−モルホリン−４−イルプロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物５）、および
・Ｎ−（３−（アミノカルボニルアミノ）−３−アザ−１−（２−メチルプロピル）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物６）などが挙げられる。この中でも、特にＮ−（３−アザ−３−（２−（ジメチルアミノ）アセチルアミノ）−１−（２−メチルプロピル）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物１）が水溶性などに優れている。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
参考例１ Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナール
ステップ１：バリン（１１．７ｇ、１００ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）に溶解し、さらに精製水（１５０ｍＬ）とテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）を加え、氷冷下で撹拌しながら、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）と４−フルオロベンゼンスルホニルクロリド（１７．５ｇ、９０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）を同時に滴下した。この溶液を室温で約１８時間撹拌し、反応させた。反応終了後、反応液をｐＨ２〜３に調整して酢酸エチルで抽出した。抽出液を希塩酸、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで脱水した。酢酸エチルを減圧留去して、残渣をヘキサン−酢酸エチル混液（酢酸エチル１容量に対しヘキサンを約１０〜約２０容量の割合で混合した溶液、以下ヘキサン−酢酸エチル混液というときは同様である。）で洗浄し、Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリン（１５．５ｇ、５６％）を白色結晶として得た。
ステップ２：Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリン（１５．０ｇ、５５ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（７．６ｇ、６６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に溶解し、氷冷下で撹拌しながら１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１２．６ｇ、６６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２００ｍＬ）をゆっくりと加えた。この溶液を室温で約４時間撹拌し、反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去して残渣を酢酸エチルに溶解し、希塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで脱水した。酢酸エチルを減圧留去して、残渣をヘキサン−酢酸エチル混液で洗浄し、Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリンＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（１７．６ｇ、８７％）を白色結晶として得た。
ステップ３：Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリンＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（２．０ｇ、５．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、ロイシノール（０．８２ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を約２時間撹拌し、反応させた。反応終了後、希塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで脱水した。ジクロロメタンを減圧留去して、残渣をヘキサン−酢酸エチル混液で洗浄し、Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシノール（１．９ｇ、９４％）を白色結晶として得た。
ステップ４：Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシノール（１．８ｇ、４．８ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）とジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解しジイソプロピルエチルアミン（２．５ｇ、１９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で撹拌しながら三酸化硫黄ピリジン錯体（３．１ｇ、１９ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（１５ｍＬ）を加え、さらに約４０分間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルを加え、希塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を減圧留去して、残渣を酢酸エチルから再結晶を行い、Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシナール（参考化合物１）（１．１ｇ、６０％）を白色結晶として得た。
融点；１５７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），０．８０（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１４−１．４６（ｍ，３Ｈ），１．８１−１．９３（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，９．５Ｈｚ），３．８０−３．８８（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．８６（ｍ，２Ｈ），７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），８．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），９．１４（ｓ，１Ｈ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ２５ＦＮ２Ｏ４Ｓ：Ｃ，５４．８２；Ｈ，６．７７；Ｎ，７．５２．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５４．８２；Ｈ，６．７６；Ｎ，７．５７．
［α］Ｄ ２５＋８．９９°（ｃ＝０．２０，ＤＭＳＯ）．
参考例２ Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリル−グリシナール
ステップ１：Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（４．０ｇ、１１ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解し、アミノアセトアルデヒドジメチルアセタール（１．４ｇ、１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で約２４時間攪拌した。この反応液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣をヘキサンと酢酸エチルの混液で結晶化を行い、Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（３．１ｇ、８０％）を無色結晶として得た。
融点；１０６．８−１０７．９℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），０．７９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．７８（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｍ，１Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，７．２Ｈｚ），４．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．３４−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．７７−７．８４（ｍ，２Ｈ），７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．９３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２３Ｎ２Ｏ５ＳＦ：Ｃ，４９．７１；Ｈ，６．４０；Ｎ，７．７３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４９．８；Ｈ，６．４８；Ｎ，７．９７．
［α］Ｄ ２５＋２５．２°（ｃ＝０．２０，ＤＭＳＯ）．
ステップ２：ステップ１で得られたＮ−（２，２−ジメトキシエチル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（３．１ｇ、８．６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を加えた。この溶液を約６０℃で約５時間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈した後、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた白色固体をヘキサンで結晶化を行い、Ｎ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）−Ｌ−バリル−グリシナール（参考化合物２）（２．１ｇ、７８％）を無色結晶として得た。
融点；１１２．８−１１３．８℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．８２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８３（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．３５−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．７８−７．８４（ｍ，２Ｈ），７．９７（ｍ，１Ｈ），８．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），９．１９（ｓ，１Ｈ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１７Ｎ２Ｏ４ＳＦ：Ｃ，４９．３６；Ｈ，５．４２；Ｎ，８．８６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４９．４８；Ｈ，５．６４；Ｎ，８．６６．
［α］Ｄ ２５＋２２．２°（ｃ＝０．２０，ＤＭＳＯ）．
実施例１ Ｎ−（３−アザ−３−（２−（ジメチルアミノ）アセチルアミノ）−１−（２−メチルプロピル）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物１）
参考化合物１（０．５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をジオキサン（２０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）の混液に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンヒドラジド塩酸塩（０．２８ｇ、１．５ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（０．５５ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で約３０分間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで脱水し、溶媒を減圧留去した。残渣の白色固体を酢酸エチルから再結晶し目的物である化合物１（０．２７ｇ、４３％）を無色結晶として得た。
融点；１６２．８−１６３．３℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．８４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），０．８８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），０．９６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．３３−１．３５（ｍ，３Ｈ），２．１５（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），３．０７（ｓ，２Ｈ），３．５８（ｍ，１Ｈ），４．５１（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｍ，１Ｈ），６．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１１−７．１８（ｍ，２Ｈ），７．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．８５−７．９０（ｍ，２Ｈ），９．９５（ｓ，１Ｈ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ３４Ｎ５Ｏ４ＳＦ・０．２Ｈ２Ｏ：Ｃ，５３．０８；Ｈ，７．３０；Ｎ，１４．７４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５２．８８；Ｈ，７．２３；Ｎ，１４．７６．
［α］Ｄ ２５＋１０．４°（ｃ＝０．２０，ＤＭＳＯ）．
実施例２ Ｎ−（３−アザ−３−モルホリン−４−イルプロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物２）
参考化合物２（０．３０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−アミノモルホリン（０．１２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で約３０分間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから結晶化を行い、化合物２（０．２０ｇ、５３％）を無色結晶として得た。
融点；１６５．７−１６６．０℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），０．８１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．８０（ｍ，１Ｈ），２．８１−２．８４（ｍ，４Ｈ），３．４５（ｍ，１Ｈ），３．５３−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．６８−３．７１（ｍ，４Ｈ），６．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），７．３５−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．８３（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ２５Ｎ４Ｏ４ＳＦ：Ｃ，５０．９９；Ｈ，６．２９；Ｎ，１３．９９．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５１．０４；Ｈ，６．４０；Ｎ，１３．３３．
［α］Ｄ ２５＋３３．２°（ｃ＝０．２０，ＤＭＳＯ）．
実施例３ Ｎ−（３−アザ−３−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−１−（２−メチルプロピル）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物３）
参考化合物１（０．８０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、ヒドラジノエタノール（０．２０ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で約３０分間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから結晶化を行い、化合物３（０．５５ｇ、６０％）を無色結晶として得た。
融点；１１２．５−１１４．９℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），０．７６−０．８２（ｍ，９Ｈ），０．９９−１．２０（ｍ，３Ｈ），１．８０（ｍ，１Ｈ），２．９０−２．９５（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．４８（ｍ，３Ｈ），４．０８（ｍ，１Ｈ），４．４９（ｍ，１Ｈ），６．３６（ｍ，１Ｈ），６．６３（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．８０−７．８４（ｍ，４Ｈ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ３１Ｎ４Ｏ４ＳＦ：Ｃ，５３．００；Ｈ，７．２６；Ｎ，１３．０１．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５２．７６；Ｈ，７．０８；Ｎ，１３．０９．
［α］Ｄ ２５−３．４（ｃ＝０．２１，ＤＭＳＯ）．
実施例４ Ｎ−（３−アザ−３−（２−（ジメチルアミノ）アセチルアミノ）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物４）
参考化合物２（０．４ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をジオキサン（２０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンヒドラジド塩酸塩（０．２６ｇ、１．４ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（１．０ｇ、１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で約３０分間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから結晶化を行い、化合物４（０．２７ｇ、５１％）を無色結晶として得た。
融点；１３１．０−１３２．７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．８７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．０３（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｓ，６Ｈ），３．１２（ｓ，２Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），３．９３−３．９７（ｍ，２Ｈ），５．８７（ｂｓ，１Ｈ），７．０９−７．１９（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．８５−７．９１（ｍ，２Ｈ），１０．０８（ｂｓ，１Ｈ）．
［α］Ｄ ２５＋２９．４°（ｃ＝０．２０，ＤＭＳＯ）．
実施例５ Ｎ−（３−アザ−１−（２−メチルプロピル）−３−モルホリン−４−イルプロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物５）
参考化合物１（１．０ｇ、２７ｍｍｏｌ）をジオキサン（２０ｍＬ）、メタノール（５．０ｍＬ）と水（５．０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−アミノモルホリン（０．３３ｇ、３．２ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（２．２ｇ、２７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で約３０分間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから結晶化を行い、化合物５（０．５０ｇ、４１％）を無色結晶として得た。
融点；１３８．４−１３８．９℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），０．７５−０．８２（ｍ，９Ｈ），１．０５−１．２２（ｍ，３Ｈ），１．８２（ｍ，１Ｈ），２．７−２．８２（ｍ，４Ｈ），３．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９，６．８Ｈｚ），３．６５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．１４（ｍ，１Ｈ），６．６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），７．３２−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．７８−７．８６（ｍ，４Ｈ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ３３Ｎ４Ｏ４ＳＦ：Ｃ，５５．２４；Ｈ，７．２９；Ｎ，１２．２７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５５．１８；Ｈ，７．０４；Ｎ，１２．０８．
実施例６ Ｎ−（３−（アミノカルボニルアミノ）−３−アザ−１−（２−メチルプロピル）プロプ−２−エンイル）−２−（（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−３−メチルブタナミド（化合物６）
参考化合物１（１．０ｇ、２．７ｍｍｏｌ）をジオキサン（２０ｍＬ）、メタノール（５．０ｍＬ）と水（５．０ｍＬ）に溶解し、セミカルバジド塩酸塩（０．３３ｇ、３．２ｍｍｏｌ）と酢酸ナトリウム（２．２ｇ、２７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で約３０分間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチルから結晶化を行い、化合物６（０．８５ｇ、７４％）を無色結晶として得た。
融点；１００．４−１０２．４℃
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），０．７６−０．８１（ｍ，９Ｈ），１．００−１．２３（ｍ，３Ｈ），１．７４−１．８６（ｍ，１Ｈ），３．５４（ｍ，１Ｈ），４．１９（ｍ，１Ｈ），６．２２（ｓ，２Ｈ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），７．３２−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．７９−７．８３（ｍ，２Ｈ），７．９０−７．９３（ｍ，２Ｈ），９．８５（ｓ，１Ｈ）．
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ２８Ｎ５Ｏ４ＳＦ・０．３５Ｈ２Ｏ：Ｃ，４９．６１；Ｈ，６．６４；Ｎ，１６．０７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４９．９９；Ｈ，６．６９；Ｎ，１５．６９．
ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃａｌｃｄ ４３０．１９２，Ｆｏｕｎｄ ４３０．１８６；［Ｍ＋Ｎａ］＋ Ｃａｌｃｄ ４５２．１７４，Ｆｏｕｎｄ ４５２．１９１；［Ｍ＋Ｋ］＋ Ｃａｌｃｄ ４６８．１４８，Ｆｏｕｎｄ ４６８．１３９．
試験例１ μ−カルパイン阻害活性の測定
μ−カルパインの阻害活性は文献〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２０８，３８７−３９２（１９９３）〕に記載された方法に準じて測定した。すなわち、０．５ｍｇ／ｍＬカゼイン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭジチオスレイトール、０．０３酵素単位μ−カルパインを含む反応液２００μＬ、種々の濃度の被験薬を含むジメチルスルホキシド溶液２．５μＬ及び２０ｍＭ塩化カルシウム水溶液５０μＬを９６穴プレートに添加した。約３０℃、約６０分間反応させた後、反応液１００μＬを別の９６穴プレートに移し、精製水５０μＬと５０％クマシーブリリアントブルー溶液１００μＬを加えて室温で約１５分間放置した後、５９５ｎｍで吸光度を測定した。被験薬を含まず同様に処理した後測定したものをコントロール値、２０ｍＭ塩化カルシウム水溶液の代わりに１ｍＭ ＥＤＴＡを添加したものをブランク値とし、以下の式により阻害率を計算し、５０％阻害に必要な量（ＩＣ５０）を求めた。
阻害率＝｛１−（測定値−ブランク値）／（コントロール値−ブランク値）｝×１００
試験結果１
その結果を表１に示す。
その結果、本発明化合物には強いカルパイン阻害作用が認められた。
試験例２ 溶解度
５〜１０ｍｇの各被験化合物に２ｍＬの緩衝液（ｐＨ４、５、６及び７）を加え懸濁液とし、約２５℃で約５時間振盪後、メンブランフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。このろ液中の各被験化合物の濃度を下に示す条件下でＨＰＬＣを用い定量し、溶解度を算出した。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（４．６×１００ｍｍ）
移動相：アセトニトリル／１０ｍＭリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７）＝３０／７０
カラム温度：４０℃
検出波長：２５０ｎｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料溶液：ろ液１ｍＬを移動相で１０ｍＬとし、この溶液１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
標準溶液：約１０ｍｇの各被験化合物を精秤し、移動相で１０ｍＬとし、この溶液１０μＬをＨＰＬＣで分析した。
試験結果２
その結果を表２に示す。
なお、参考化合物１は本発明化合物と同様以上の強いカルパイン阻害作用を有するが、その溶解度はｐＨに関係なく０．１０ｍｇ／ｍＬであったが、本発明化合物は医薬品製剤として実用領域であるｐＨ４〜７において水溶性を向上することが分かった。
特に、化合物１は高いカルパイン阻害活性を有し、医薬品製剤として実用領域であるｐＨ４付近において高い水溶性を有することが明らかとなった。
製剤例１ 錠剤
化合物３ ５０ｍｇ
乳糖 ８０ｍｇ
デンプン １７ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ３ｍｇ
結晶セルロース １０ｍｇ
以上の成分を１錠分の材料として均一に混合し、常法により錠剤を成形する。必要に応じて糖衣を施してもよい。
製剤例２ 注射剤
化合物１ ０．２ｇ
塩化ナトリウム ０．９ｇ
水酸化ナトリウム／塩酸 適量（ｐＨ５．０）
注射用蒸留水 全量 １００ｍＬ
以上の成分を常法により混和溶解して注射剤とする。
製剤例３ 点眼剤
化合物１ １００ｍｇ
ホウ酸 ７００ｍｇ
ホウ砂 適量
塩化ナトリウム ５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース ５００ｍｇ
エデト酸ナトリウム ０．０５ｍｇ
塩化ベンザルコニウム ０．０００５ｍｇ
水酸化ナトリウム／塩酸 適量（ｐＨ５．０）
滅菌精製水 全量 １００ｍＬ
以上の成分を常法により無菌的に混和溶解して点眼剤とする。
産業上の利用可能性
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は優れたカルパイン阻害活性を有し、且つ医薬品として望まれる適度な水溶性を有するため、カルパインが関与する疾患が虚血性疾患、免疫疾患、アルツハイマー病、骨粗鬆症、脳組織障害による疾患、白内障、緑内障、網脈絡膜疾患、光凝固による眼球後眼部合併症、血管新生を伴う疾患に有利に使用することができる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の新規な教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で色々な修正と変更をなし得ることは可能であるので、そのような修正および変更も、全て後記の特許請求の範囲で定義される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２０００−３７７５８２号および特願２００１−１４９６８３号を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。Technical field
The present invention relates to a novel hydrazone derivative having cysteine protease inhibitory activity, especially calpain inhibitory activity. The present invention also relates to a medicament containing the novel hydrazone derivative.
Background art
Biochemical studies have revealed that abnormal enhancement of cysteine protease is involved in various diseases. For example, calpain, one of the cysteine proteases, is one of the cytoplasmic proteases widely distributed in living organisms, and is activated by calcium ions. It is now clear that this abnormal activation of calpain is involved in various diseases such as stroke, subarachnoid hemorrhage, Alzheimer's disease, ischemic disease, muscular dystrophy, cataract, platelet aggregation, and arthritis. [Trends in Pharmaceutical Sciences, 15, 412 (1994)]. On the other hand, calpain inhibitors are effective in maintaining lens transparency in an experimental cataract model by lens culture [Curr. Eye @ Res. , Pp. 657-666 (1994)], and has been found to be useful as a therapeutic agent for cataract (WO93 / 23032). Examples of cysteine protease inhibitors that have been reported include epoxy succinic acid peptide derivatives (Japanese Patent Publication No. 1-54348 (USP 4,333,879), JP-A-55-153778 (USP 4,418,075)), and the like. Peptide halomethane derivatives (JP-B-6-29229), peptide diazomethane derivatives [Biochem. J. 253, 751-758 (1988); Med. Chem. 35, 216-220 (1992)], and peptidyl aldehyde derivatives [JP-A-10-147564 (USP 6,057,290, USP 6,214,800) and the like], and the like. Have problems such as water solubility, stability, absorption into the living body, and stability against metabolism, and have not been put to practical use yet.
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide a compound having a strong cysteine protease inhibitory activity, particularly a calpain inhibitory activity, and having a suitable water solubility desired as a pharmaceutical.
The present inventors have made intensive efforts to solve the above problems, and as a result, have created a compound having a strong calpain inhibitory activity, and have further studied to complete the present invention.
That is, the present invention
(1) General formula (I)
(Where B is a hydroxy lower alkyl group or a carbamoyl group, or a glycyl group optionally substituted with an amino group). A compound represented by the formula:
(2) The compound of the general formula (I) is a compound of the general formula (III)
[Wherein, R2Is a lower alkyl group. The compound according to the above (1), which is a compound represented by the formula:
(3) a medicine containing the compound according to the above (1) or (2),
(4) a calpain inhibitor comprising the compound according to (1) or (2) above,
(5) the medicament according to the above (3), which is for prevention or treatment of a disease associated with calpain;
(6) Calpain-related diseases are ischemic diseases, immunological diseases, Alzheimer's disease, osteoporosis, diseases due to brain tissue disorders, cataracts, glaucoma, retinochoroidal diseases, posterior ocular complications due to photocoagulation, and diseases involving angiogenesis. The medicine according to the above (5), which is
(7) a pharmaceutical composition comprising the compound according to (1) or (2) and a pharmaceutically acceptable carrier,
(8) the pharmaceutical composition according to the above (7), which is a calpain inhibitor;
(9) The above-mentioned for the treatment of ischemic disease, immunological disease, Alzheimer's disease, osteoporosis, disease due to brain tissue disorder, cataract, glaucoma, retinochoroidal disease and posterior ocular complications due to photocoagulation, and for the treatment of angiogenesis The pharmaceutical composition according to (8),
(10) A method for treating a disease associated with calpain, which comprises administering to a mammal in need of treatment an effective amount of the compound according to (1) or (2),
(11) Calpain-related diseases are ischemic diseases, immunological diseases, Alzheimer's disease, osteoporosis, diseases due to brain tissue disorders, cataracts, glaucoma, chorioretinal diseases, posterior ocular complications due to photocoagulation, and diseases involving angiogenesis The method according to the above (10), wherein
(12) Use of the compound according to the above (1) or (2) for producing a calpain inhibitor, and
(13) The above-mentioned is for the treatment of ischemic disease, immune disease, Alzheimer's disease, osteoporosis, disease due to brain tissue disorder, cataract, glaucoma, retinochoroidal disease and posterior segmental ocular complications due to photocoagulation, and for the treatment of angiogenesis. The method according to (12), further,
(14) The compound according to (1), which has a suitable water solubility desired as a pharmaceutical.
In the above general formula (I), R1The lower alkyl group represented by represents a linear or branched alkyl group having 3 to 5 carbon atoms, such as propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl and the like. And preferably C4Alkyl groups, particularly preferably isobutyl.
In the above general formula (II), the hydroxy lower alkyl group represented by B includes hydroxy C1-3Refers to an alkyl group, for example, hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, etc., preferably hydroxyethyl.
In the general formula (II), the group which may be substituted with the amino group of the glycyl group represented by B includes, for example, R in the general formula (III)2And a lower alkyl group represented by The lower alkyl group refers to a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, Hexyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like. Preferably it is methyl.
In the general formula (I), the fluorophenyl group can be appropriately converted to, for example, a phenyl group, a chlorophenyl group, a bromophenyl group, a tolyl group, a trifluoromethylphenyl group, and the like.
The compounds of the present invention also include compound (I) and salts thereof, and various solvates and polymorphs thereof. The salt of the compound represented by the general formula (I) in the present invention is preferably a physiologically acceptable salt, such as a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, or a salt with an acidic amino acid. . Preferable examples of the salt with an inorganic acid include, for example, salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p -Salts with toluenesulfonic acid and the like. Preferable examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, a salt with aspartic acid, glutamic acid and the like.
The compound of the present invention is, for example, the following general reaction formula
(Wherein each symbol has the same meaning as described above). That is, a compound represented by the general formula (V) [hereinafter referred to as compound (V)] in an organic solvent or an organic solvent-water mixture in the presence or absence of a base. Sometimes. And the desired compound represented by the general formula (I) can be obtained. The compound represented by the general formula (IV) can be produced, for example, by a method described in JP-A-10-147564 (USP 6,057,290, USP 6,214,800).
Examples of the organic solvent include conventional solvents such as dioxane, ethyl acetate, methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, N, N-dimethylformamide and tetrahydrofuran, or a mixed solvent thereof. Preferred are dioxane, a mixed solvent of dioxane and methanol, and ethyl acetate. As the base, acetates such as sodium acetate and potassium acetate; trialkylamines such as triethylamine and diisopropylethylamine; organic bases such as pyridine, lutidine, picoline and 4-dimethylaminopyridine; sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide And inorganic acid salts such as sodium hydride, potassium hydrogen carbonate, potassium carbonate and potassium hydroxide. Preferably it is sodium acetate. The reaction temperature is generally in a range from cooling to heating, and preferably in a range from about 0 ° C to about 30 ° C.
The compound of the present invention and salts thereof are novel compounds not described in the literature, and have excellent calpain inhibitory activity as shown in Test Examples described later.By combining them as active ingredients, if necessary, by combining the following carriers and the like, It is useful as a medicine as a calpain inhibitor.
Pharmaceuticals containing the compound of the present invention include, for example, ischemic diseases, immune diseases, Alzheimer's disease, osteoporosis, diseases caused by brain tissue disorders in mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, pigs, and humans (eg, Cerebral vasospasm, cerebral thrombosis, cerebral infarction, cerebral obstruction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, hypertensive encephalopathy, transient ischemic attack, multiple infarct dementia, cerebral arteriosclerosis, Huntington's disease, etc.) Cataract, glaucoma (eg, open-angle glaucoma, low-tension glaucoma, closed-angle glaucoma, etc.), retinochoroidal disease (eg, retinal vascular occlusion, peritoneal veinitis, Eales disease, ischemic eye syndrome, retinal arteriole, etc.) Retinal vascular abnormalities, retinopathy due to hypertension or renal disease, diabetic retinopathy, retinal pigment epitheliosis, retinal dystrophy, macular dystrophy, retinochoroid atrophy, retinochoroidosis, macular degeneration Disease, macular edema, retinal pigment epithelium detachment, retinal detachment, degenerative retinopathy, retinoblastoma, retinal pigment epithelial tumor, optic nerve capillar hemangioma, etc., posterior ocular complications due to photocoagulation (for example, macular edema) Retinal detachment, optic neuritis, visual field abnormalities, abnormal light perception, abnormal color vision, etc.) or as preventive and therapeutic agents for angiogenesis, retinal detachment, etc.
The medicament containing the compound of the present invention is administered systemically or locally. In addition to oral administration systemically, parenteral administration such as intravenous injection, subcutaneous injection, and intramuscular injection is also possible. Locally, it is administered to the skin, mucous membranes, intranasally and intraocularly.
Pharmaceutical preparations containing the compound of the present invention include solid preparations such as powders, granules, tablets, capsules and suppositories, and liquid preparations such as syrups, injections, eye drops and nasal drops. . When manufactured as granules and tablets, for example, excipients (lactose, sucrose, glucose, starch, crystalline cellulose, etc.), lubricants (magnesium stearate, talc, stearic acid, calcium stearate, etc.), disintegrants (starch, etc.) Manufacture of any dosage form by using, for example, carmellose sodium, calcium carbonate, etc.) and a binder (starch paste solution, hydroxypropylcellulose solution, carmellose solution, gum arabic solution, gelatin solution, sodium alginate solution, etc.) Can be. For granules and tablets, suitable coating agents (gelatin, sucrose, gum arabic, carnauba wax, etc.) and enteric coating agents (eg, cellulose acetate phthalate, methacrylic acid copolymer, hydroxypropylcellulose phthalate, carboxymethylethylcellulose, etc.) ) May be applied.
In the case of capsules, suitable excipients, for example, magnesium stearate, calcium stearate, talc, light anhydrous silicic acid for improving fluidity and lubrication, and crystals for pressurized fluidity In addition to cellulose, lactose, etc., the above-mentioned disintegrating agents and the like are added as appropriate, mixed uniformly, or granulated or granulated and coated with an appropriate coating agent, or filled with a suitable capsule base. An agent (eg, gelatin) may be added to glycerin or sorbitol to form an encapsulating base with increased plasticity. If necessary, coloring agents and preservatives [sulfur dioxide, parabens (methyl, ethyl, propyl ester of parahydroxybenzoate) and the like] can be added to these capsules. Capsules can be enteric coated capsules, gastric resistant capsules, or controlled release capsules in addition to ordinary capsules. In the case of an enteric capsule, the liposome coated with an enteric coating agent can be filled in a usual capsule, or the capsule itself can be coated with an enteric coating agent, or can be formed using an enteric polymer as a base.
When used as a suppository, a suppository base (eg, cacao butter, macrogol, etc.) can be appropriately selected and used.
When used as a syrup, for example, a stabilizer (eg, sodium edetate), a suspending agent (eg, gum arabic, carmellose), a flavoring agent (eg, simple syrup, glucose), and a fragrance can be appropriately selected and used. it can.
When preparing injections, eye drops or nasal drops, pharmaceutically acceptable additives such as isotonic agents (sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, glucose, propylene glycol, etc.), buffers Agents (phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamic acid, epsilon aminocaproic acid, etc.), preservatives (paraoxybenzoate esters, chlorobutanol, benzyl) Alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, etc.), thickener (hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, etc.), stabilizer (sodium bisulfite, By dissolving or dispersing in a solution to which sodium osulphate, sodium edetate, sodium citrate, ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene, etc., pH adjusters (hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid, etc.) are appropriately added. Can be manufactured.
In addition, since the compound of the present invention has a suitable water solubility desired as a pharmaceutical, it can be advantageously produced particularly in the above-mentioned preparations such as syrups, injections, eye drops and nasal drops.
The amount of the additive in the above syrup, injection, eye drops and nasal drops depends on the type of additive to be added, application, etc., but it is sufficient to add a concentration that can achieve the purpose of the additive, etc. The tonicity agent usually has an osmotic pressure of about 229 to about 343 mOs / Kg · H.2Add about 0.5 to about 5.0% w / v so that O is obtained. The buffer is about 0.01 to about 2.0 w / v%, the thickener is about 0.01 to about 1.0 w / v%, and the stabilizer is about 0.001 to about 1.0 w / v%. / V%. The pH adjuster is appropriately added, and is usually adjusted to a pH of about 3 to about 9, preferably a pH of about 4 to about 8.
The dose of the compound represented by the general formula (I) of the present invention varies depending on the target disease, symptom, administration subject, administration method and the like. It is preferable to administer about 1 to about 100 mg at a time. In the case of an injection, for an adult, it is preferable to administer about 0.1 to about 30 mg once to once a day. In the case of topical use, the ophthalmic solution adjusted to usually about 0.001 to about 1.0 w / v%, preferably about 0.01 to about 0.5 w / v%, is administered in an amount of 20 to 50 μl at a time. It is recommended to instill 2 to 6 times a day.
Specific compounds of the present invention include, for example,
-N- (3-aza-3- (2- (dimethylamino) acetylamino) -1- (2-methylpropyl) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (compound 1),
N- (3-aza-3-morpholin-4-ylprop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (Compound 2),
-N- (3-aza-3-((2-hydroxyethyl) amino) -1- (2-methylpropyl) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino)- 3-methylbutanamide (compound 3),
N- (3-aza-3- (2- (dimethylamino) acetylamino) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (compound 4);
N- (3-aza-1- (2-methylpropyl) -3-morpholin-4-ylprop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (compound 5), and
N- (3- (aminocarbonylamino) -3-aza-1- (2-methylpropyl) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide ( Compound 6) and the like. Among them, N- (3-aza-3- (2- (dimethylamino) acetylamino) -1- (2-methylpropyl) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) ) Amino) -3-methylbutanamide (Compound 1) is excellent in water solubility and the like.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
Reference Example 1 {N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valyl-L-leucinal
Step 1: Dissolve valine (11.7 g, 100 mmol) in 1 M aqueous sodium hydroxide solution (100 mL), add purified water (150 mL) and tetrahydrofuran (100 mL), and add 1 M sodium hydroxide while stirring under ice-cooling. An aqueous solution (100 mL) and a solution of 4-fluorobenzenesulfonyl chloride (17.5 g, 90 mmol) in tetrahydrofuran (100 mL) were simultaneously added dropwise. The solution was stirred at room temperature for about 18 hours to react. After completion of the reaction, the reaction solution was adjusted to pH 2-3 and extracted with ethyl acetate. The extract was washed with dilute hydrochloric acid and saturated saline, and then dried over anhydrous magnesium sulfate. Ethyl acetate is distilled off under reduced pressure, and the residue is mixed with hexane-ethyl acetate (a solution in which hexane is mixed at a ratio of about 10 to about 20 volumes with respect to 1 volume of ethyl acetate; hereinafter, the same applies when referred to as a hexane-ethyl acetate mixed solution). ) To give N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valine (15.5 g, 56%) as white crystals.
Step 2: Dissolve N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valine (15.0 g, 55 mmol) and N-hydroxysuccinimide (7.6 g, 66 mmol) in tetrahydrofuran (200 mL) and cool with ice A solution of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (12.6 g, 66 mmol) in dichloromethane (200 mL) was added slowly with stirring underneath. The solution was stirred at room temperature for about 4 hours to react. After completion of the reaction, the solvent was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in ethyl acetate, washed with dilute hydrochloric acid, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated saline, and then dried over anhydrous magnesium sulfate. Ethyl acetate was distilled off under reduced pressure, and the residue was washed with a hexane-ethyl acetate mixed solution, and N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valine N-hydroxysuccinimide ester (17.6 g, 87%) was used. Was obtained as white crystals.
Step 3: N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valine N-hydroxysuccinimide ester (2.0 g, 5.4 mmol) was dissolved in dichloromethane (50 mL) and leucinol (0.82 g, 7 .0 mmol) was added. This solution was stirred for about 2 hours to react. After the completion of the reaction, the resultant was washed with dilute hydrochloric acid, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and saturated saline, and then dried over anhydrous magnesium sulfate. Dichloromethane was distilled off under reduced pressure, and the residue was washed with a hexane-ethyl acetate mixed solution, and N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valyl-L-leucinol (1.9 g, 94%) was obtained as white crystals. Obtained.
Step 4: N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valyl-L-leucinol (1.8 g, 4.8 mmol) is dissolved in dimethyl sulfoxide (20 mL) and dichloromethane (10 mL) and diisopropylethylamine (2. (5 g, 19 mmol). While stirring this solution at room temperature, a solution of sulfur trioxide pyridine complex (3.1 g, 19 mmol) in dimethyl sulfoxide (15 mL) was added, and the mixture was further stirred for about 40 minutes. After completion of the reaction, ethyl acetate was added, and the mixture was washed with dilute hydrochloric acid, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate and saturated saline, and then dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure, the residue was recrystallized from ethyl acetate, and N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valyl-L-leucinal (Reference compound 1) (1.1 g, 60%) Was obtained as white crystals.
Melting point: 157 ° C
1H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) Δ: 0.74 (d, 3H, J = 5.9 Hz), 0.80 (d, 6H, J = 6.4 Hz), 0.85 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1. 14-1.46 (m, 3H), 1.81-1.93 (m, 1H), 3.56-3.62 (dd, 1H, J = 6.6, 9.5 Hz), 3.80 -3.88 (m, 1H), 7.33-7.42 (m, 2H), 7.79-7.86 (m, 2H), 7.96 (d, 1H, J = 9.8 Hz) , 8.27 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 9.14 (s, 1H).
Anal. Calcd for C17H25FN2O4S, C, 54.82; H, 6.77; N, 7.52. Found: C, 54.82; H, 6.76; N, 7.57.
[Α]D 25+ 8.99 ° (c = 0.20, DMSO).
Reference Example 2 {N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valyl-glycinal
Step 1: N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valine N-hydroxysuccinimide ester (4.0 g, 11 mmol) was dissolved in ethyl acetate (150 mL) and aminoacetaldehyde dimethyl acetal (1.4 g, 13 mmol) ) Was added. The solution was stirred at room temperature for about 24 hours. The reaction solution was washed with 1M hydrochloric acid, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and saturated saline, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The residue was crystallized from a mixture of hexane and ethyl acetate, and N- (2,2-dimethoxyethyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (3.1 g, 80% ) Was obtained as colorless crystals.
Melting point: 106.8-107.9 ° C
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) Δ: 0.77 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 0.79 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 1.78 (m, 1H), 2.85 (m, 1H) , 2.97 (m, 1H), 3.19 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.48 (dd, 1H, J = 9.3, 7.2 Hz), 4.10 (T, 1H, J = 5.4 Hz), 7.34-7.42 (m, 2H), 7.77-7.84 (m, 2H), 7.86 (d, 1H, J = 9. 3 Hz), 7.93 (t, 1H, J = 5.9 Hz).
Anal. Calcd for CFifteenH23N2O5SF: C, 49.71; H, 6.40; N, 7.73. Found: C, 49.8; H, 6.48; N, 7.97.
[Α]D 25+ 25.2 ° (c = 0.20, DMSO).
Step 2: N- (2,2-dimethoxyethyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (3.1 g, 8.6 mmol) obtained in Step 1 was added to tetrahydrofuran ( 20 mL) and water (10 mL), and trifluoroacetic acid (10 mL) was added. The solution was stirred at about 60 ° C. for about 5 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with 1 M hydrochloric acid, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and saturated saline, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained white solid was crystallized from hexane to give N-((4-fluorophenyl) sulfonyl) -L-valyl-glycinal (Reference Compound 2) (2.1 g, 78%) as colorless crystals.
Melting point: 112.8-113.8C
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) Δ: 0.81 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.82 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 1.83 (m, 1H), 3.55 (m, 1H) , 3.67 (d, 2H, J = 5.4 Hz), 7.35-7.41 (m, 2H), 7.78-7.84 (m, 2H), 7.97 (m, 1H). , 8.36 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 9.19 (s, 1H).
Anal. Calcd for CThirteenH17N2O4SF: C, 49.36; H, 5.42; N, 8.86. Found: C, 49.48; H, 5.64; N, 8.66.
[Α]D 25+ 22.2 ° (c = 0.20, DMSO).
Example 1 {N- (3-aza-3- (2- (dimethylamino) acetylamino) -1- (2-methylpropyl) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) Amino) -3-methylbutanamide (Compound 1)
Reference compound 1 (0.5 g, 1.3 mmol) was dissolved in a mixture of dioxane (20 mL) and water (10 mL), and N, N-dimethylglycine hydrazide hydrochloride (0.28 g, 1.5 mmol) and sodium acetate ( (0.55 g, 6.7 mmol). The solution was stirred at room temperature for about 30 minutes. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residual white solid was recrystallized from ethyl acetate to give the target compound 1 (0.27 g, 43%) as colorless crystals.
Melting point: 162.8-163.3C
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) Δ: 0.84 (d, 3H, J = 5.1 Hz), 0.85 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 0.88 (d, 3H, J = 4.8 Hz), 0. 96 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 1.33-1.35 (m, 3H), 2.15 (m, 1H), 2.32 (s, 6H), 3.07 (s, 2H), 3.58 (m, 1H), 4.51 (m, 1H), 5.63 (m, 1H), 6.59 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.11-7 .18 (m, 2H), 7.60 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.85-7.90 (m, 2H), 9.95 (s, 1H).
Anal. Calcd for C21H34N5O4SF 0.2H2O: C, 53.08; H, 7.30; N, 14.74. Found: C, 52.88; H, 7.23; N, 14.76.
[Α]D 25+ 10.4 ° (c = 0.20, DMSO).
Example 2 {N- (3-aza-3-morpholin-4-ylprop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (Compound 2)
Reference compound 2 (0.30 g, 0.94 mmol) was dissolved in ethyl acetate (20 mL), and N-aminomorpholine (0.12 g, 1.1 mmol) was added. The solution was stirred at room temperature for about 30 minutes. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained solid was crystallized from ethyl acetate to obtain Compound 2 (0.20 g, 53%) as colorless crystals.
Melting point: 165.7-166.0C
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) Δ: 0.78 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 0.81 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 1.80 (m, 1H), 2.81-2.84 ( m, 4H), 3.45 (m, 1H), 3.53-3.57 (m, 2H), 3.68-3.71 (m, 4H), 6.54 (t, 1H, J = 4.7 Hz), 7.35-7.42 (m, 2H), 7.79-7.83 (m, 2H), 7.89 (s, 1H), 8.10 (t, 1H, J = 5.4 Hz).
Anal. Calcd for C17H25N4O4SF: C, 50.99; H, 6.29; N, 13.99. Found: C, 51.04; H, 6.40; N, 13.33.
[Α]D 25+ 33.2 ° (c = 0.20, DMSO).
Example 3 {N- (3-aza-3-((2-hydroxyethyl) amino) -1- (2-methylpropyl) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino ) -3-Methylbutanamide (Compound 3)
Reference compound 1 (0.80 g, 2.1 mmol) was dissolved in ethyl acetate (20 mL), and hydrazinoethanol (0.20 g, 2.6 mmol) was added. The solution was stirred at room temperature for about 30 minutes. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained solid was crystallized from ethyl acetate to obtain Compound 3 (0.55 g, 60%) as colorless crystals.
Melting point: 112.5-114.9 ° C
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) Δ: 0.71 (d, 3H, J = 4.8 Hz), 0.76-0.82 (m, 9H), 0.99-1.20 (m, 3H), 1.80 (m, 1H), 2.90-2.95 (m, 2H), 3.40-3.48 (m, 3H), 4.08 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 6.36. (M, 1H), 6.63 (m, 1H), 7.33-7.39 (m, 2H), 7.80-7.84 (m, 4H).
Anal. Calcd for C19H31N4O4SF: C, 53.00; H, 7.26; N, 13.01. Found: C, 52.76; H, 7.08; N, 13.09.
[Α]D 25-3.4 (c = 0.21, DMSO).
Example 4 {N- (3-aza-3- (2- (dimethylamino) acetylamino) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (Compound 4) )
Reference compound 2 (0.4 g, 1.3 mmol) was dissolved in dioxane (20 mL) and water (10 mL), and N, N-dimethylglycine hydrazide hydrochloride (0.26 g, 1.4 mmol) and sodium acetate (1. (0 g, 13 mmol). The solution was stirred at room temperature for about 30 minutes. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained solid was crystallized from ethyl acetate to obtain Compound 4 (0.27 g, 51%) as colorless crystals.
Melting point: 131.0-132.7 ° C
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) Δ: 0.87 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 0.89 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 2.03 (m, 1H), 2.35 (s, 6H) , 3.12 (s, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.93-3.97 (m, 2H), 5.87 (bs, 1H), 7.09-7.19 (m , 2H), 7.24 (m, 1H), 7.40 (t, 1H, J = 3.9 Hz), 7.85-7.91 (m, 2H), 10.08 (bs, 1H).
[Α]D 25+ 29.4 ° (c = 0.20, DMSO).
Example 5 {N- (3-aza-1- (2-methylpropyl) -3-morpholin-4-ylprop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3-methylbutanamide (Compound 5)
Reference compound 1 (1.0 g, 27 mmol) was dissolved in dioxane (20 mL), methanol (5.0 mL) and water (5.0 mL), and N-aminomorpholine (0.33 g, 3.2 mmol) and sodium acetate ( (2.2 g, 27 mmol). The solution was stirred at room temperature for about 30 minutes. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained solid was crystallized from ethyl acetate to obtain Compound 5 (0.50 g, 41%) as colorless crystals.
Melting point: 138.4-138.9 ° C
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) Δ: 0.70 (d, 3H, J = 5.4 Hz), 0.75-0.82 (m, 9H), 1.05-1.22 (m, 3H), 1.82 (m, 1H), 2.7-2.82 (m, 4H), 3.48 (dd, 1H, J = 8.9, 6.8 Hz), 3.65 (t, 4H, J = 4.8 Hz), 4.14 (m, 1H), 6.6 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 7.32-7.38 (m, 2H), 7.78-7.86 (m, 4H).
Anal. Calcd for C21H33N4O4SF: C, 55.24; H, 7.29; N, 12.27. Found: C, 55.18; H, 7.04; N, 12.08.
Example 6 {N- (3- (aminocarbonylamino) -3-aza-1- (2-methylpropyl) prop-2-enyl) -2-(((4-fluorophenyl) sulfonyl) amino) -3- Methylbutanamide (compound 6)
Reference compound 1 (1.0 g, 2.7 mmol) was dissolved in dioxane (20 mL), methanol (5.0 mL) and water (5.0 mL), and semicarbazide hydrochloride (0.33 g, 3.2 mmol) and sodium acetate were dissolved. (2.2 g, 27 mmol) was added. The solution was stirred at room temperature for about 30 minutes. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate and brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained solid was crystallized from ethyl acetate to obtain Compound 6 (0.85 g, 74%) as colorless crystals.
Melting point: 100.4-102.4 ° C
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) Δ: 0.70 (d, 3H, J = 8.4 Hz), 0.76-0.81 (m, 9H), 1.00-1.23 (m, 3H), 1.74-1. 86 (m, 1H), 3.54 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 6.22 (s, 2H), 6.99 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 7 .32-7.38 (m, 2H), 7.79-7.83 (m, 2H), 7.90-7.93 (m, 2H), 9.85 (s, 1H).
Anal. Calcd for C18H28N5O4SF ・ 0.35H2O: C, 49.61; H, 6.64; N, 16.07. Found: C, 49.99; H, 6.69; N, 15.69.
MALDITOF-MS [M + H]+Calcd 430.192, Found 430.186; [M + Na]+Calcd 452.174, Found 452.191; [M + K]+Calcd 468.148, Found 468.139.
Test Example 1 Measurement of μ-calpain inhibitory activity
The inhibitory activity of μ-calpain was reported in the literature [Anal. Biochem. vol. 208, 387-392 (1993)]. That is, 200 μL of a reaction solution containing 0.5 mg / mL casein, 50 mM ΔTris-HCl (pH 7.4), 20 mM dithiothreitol, and 0.03 enzyme unit μ-calpain, a dimethyl sulfoxide solution 2 containing various concentrations of a test drug 0.5 μL and 50 μL of a 20 mM calcium chloride aqueous solution were added to a 96-well plate. After reacting at about 30 ° C. for about 60 minutes, 100 μL of the reaction solution was transferred to another 96-well plate, 50 μL of purified water and 100 μL of a 50% Coomassie brilliant blue solution were added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for about 15 minutes, followed by absorbance at 595 nm. Was measured. A control value was determined after treatment in the same manner without the test drug, and a blank value was obtained by adding 1 mM EDTA instead of a 20 mM calcium chloride aqueous solution. Amount (IC50).
Inhibition rate = {1− (measured value−blank value) / (control value−blank value)} × 100
Test result 1
Table 1 shows the results.
As a result, a strong calpain inhibitory action was observed for the compound of the present invention.
Test Example 2 Solubility
To 5 to 10 mg of each test compound, 2 mL of a buffer solution (pH 4, 5, 6, and 7) was added to form a suspension. After shaking at about 25 ° C. for about 5 hours, the suspension was filtered through a membrane filter (0.45 μm). The concentration of each test compound in the filtrate was quantified using HPLC under the conditions shown below, and the solubility was calculated.
HPLC conditions
Column: SHISEIDO / CAPCELL / PAK / C18 / UG120 (4.6 x 100 mm)
Mobile phase: acetonitrile / 10 mM phosphate buffer aqueous solution (pH 7) = 30/70
Column temperature: 40 ° C
Detection wavelength: 250 nm
Flow rate: 1.0 mL / min
Sample solution: 1 mL of the filtrate was made up to 10 mL with the mobile phase, and 10 μL of this solution was analyzed by HPLC.
Standard solution: About 10 mg of each test compound was precisely weighed and made up to 10 mL with the mobile phase, and 10 μL of this solution was analyzed by HPLC.
Test result 2
Table 2 shows the results.
Reference compound 1 has a stronger calpain inhibitory activity than that of the compound of the present invention, but its solubility was 0.10 mg / mL irrespective of the pH. -7, it was found that the water solubility was improved.
In particular, it has been clarified that Compound 1 has high calpain inhibitory activity and high water solubility at around pH 4, which is a practical area for pharmaceutical preparations.
Formulation Example 1 Tablet
Compound 3 50mg
Lactose 80mg
Starch 17mg
Magnesium stearate 3mg
Microcrystalline cellulose 10mg
The above components are uniformly mixed as a material for one tablet, and a tablet is formed by a conventional method. Sugar coating may be applied as necessary.
Formulation Example 2 Injection
Compound 1 0.2g
Sodium chloride 0.9g
Sodium hydroxide / hydrochloric acid appropriate amount (pH 5.0)
Distilled water for injection Total volume 100mL
The above components are mixed and dissolved by a conventional method to prepare an injection.
Formulation Example 3 ophthalmic solution
Compound 1 100mg
Boric acid 700mg
Borax appropriate amount
Sodium chloride 500mg
Hydroxymethyl cellulose 500mg
Sodium edetate 0.05mg
Benzalkonium chloride 0.0005mg
Sodium hydroxide / hydrochloric acid appropriate amount (pH 5.0)
Sterile purified water total volume 100 mL
The above components are aseptically mixed and dissolved by an ordinary method to prepare eye drops.
Industrial applicability
Since the compound represented by the formula (I) of the present invention has an excellent calpain inhibitory activity and has an appropriate water solubility desired as a pharmaceutical, diseases involving calpain include ischemic disease, immune disease, and Alzheimer's disease. , Osteoporosis, diseases due to brain tissue disorders, cataracts, glaucoma, chorioretinal diseases, posterior segment ocular complications due to photocoagulation, and diseases associated with angiogenesis.
While certain embodiments of the invention have been described in detail, those skilled in the art will appreciate that the particular embodiments illustrated have various modifications without departing substantially from the novel teachings and advantages of the invention. Since such modifications and changes are possible, all such modifications and changes are intended to be included in the spirit and scope of the present invention as defined in the following claims.
This application is based on Japanese Patent Application Nos. 2000-377852 and 2001-149683 filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.