JPS6393800A - 抗人フイブリンモノクロ−ナル抗体ならびにその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ハイブリドーマから産生される新規なモノク
ローナル抗体ならびに、その使用法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、ハイブリドーマにより産生
される新規な抗人フィブリンモノクローナル抗体、特に
人フィブリンのβ鎖Ｎ　Ｈ，末端ペプチドを抗原として
認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマ、及ヒＲ１モノクローナル抗体
を用いる人フィブリンまたはフィブリン分解物、特にＢ
ａＩ２−４２ペプチドの酵素免疫測定法に関する。

〔従来の技術〕

凝固系が活性化されて生ずるトロンビンは、フィブリノ
ーゲンのＢＢ鎖ＮＨ，末端側のＡｒｇ　（β−１４）−
Ｇｕｙ（β−１５）結合を切断して、フィブリノペプチ
ドＢ　（ＦＰＢ）を遊離する。一方、線溶系が活性化さ
れて生ずるプラスミンは、フィブリノーゲンやＦＰＢの
残存するフィブリンに作用して、Ｂβ鎖Ｎ　Ｈ。

末端側のＡｒｇ　（β〜４２）−Ａｌａ（β−４３）結
合を切断してＢβ１−４２ペプチド（以下　Ｂβ１−４
２）を遊離する。

またプラスミンは、トロンビンにより、ＦＰＢの遊離し
た後のフィブリンに作用して、ＢａＩ２−４２ペプチド
（以下　ＢａＩ２−４２　）を遊離する。したがってＢ
β１−４２．　　ＢａＩ２−４２はトロンビンとプラス
ミンとの作用を直接反映して変動し、その動態は播種性
血管向凝固症候群（ＤＩＣ）をはじめとする各種血栓性
疾患、線溶亢進状態の病態解析に、きわめて重要な指標
となる。また、ヘパリンやウロキナーゼなどの抗凝固・
線溶剤の治療効果の判定にも、きわめて鋭敏な指標とし
て重視されている。

現在、ＢａＩ２−４２の測定はラジオイムノアッセイ（
以下　ＲＩＡ）が用いられているが、筒便性に問題があ
ること、用いている抗体がＢａＩ２−４２に対する抗血
清でありＢａＩ２−４２とＢβ１−４２との漏別定量は
出来ない。

一方、近年、人フィブリンのＣＮＢｒ分解物（Ａα１７
−５１．　ＢａＩ２−１１８．　　γ１−７８）　！で
あらかじめ免役したＢａ１ｂ／Ｃマウスの脾細胞とマウ
スミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８　、６５３との細胞
融合によりＢａＩ２−４２　ニ特異的なモノクローナル
抗体が作製され、この抗体を用いたＲＩＡおよび酵素免
疫測定法（以下　ＥＬＩＳＡ）が考案された（日本公開
特許公報　昭６Ｏ−１８５８００）。

この抗体は免疫グロブリンクラスがＩｇＧ＋に属し、人
フィブリノーゲン、Ｂβ１−４２を含有するペプチドフ
ラグメントとは反応せず、人フィブリン、ＢａＩ２−４
２を含有するペプチドフラグメントと結合する。さらに
は、ラビットフィブリノーゲンのトロンビン分解から生
じる産物とは反応しないことが報告されている。ＲＩＡ
は抗体結合放射能標識抗原の作製が煩雑であり、しかも
その使用はＲ１施設に限定されている為、一般的でない
。ＥＬＩＳＡは抗体と固体担体上の人フィブリンのＢａ
Ｉ２−４２を含有するペプチドフラグメントからなる競
合抗原およびマウス免疫グロブリンと結合する酵素結合
抗体の各々の既知量と接触させる方法であり、この方法
では、固体担体上のＢａＩ２−４２ペプチドフラグメン
トに結合した抗体を酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗
体で検出するという２段階の反応が必要であり、手法が
煩雑となる。

抗人フィブリンモノクローナル抗体に関しては、マツエ
ダら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２．１１２９〜１１３２．
１９８３）が、人フィブリンのＢβ鎖のＮＨ２末端類似
の合成へブタペプチドのカルボキシ末端に位置するシス
ティン残基とマレイミドベンゾイル化キーホールリンペ
ットヘモシアニンとの複合体で免疫された雌Ｂａ１ｂ／
Ｃマウスからの肺臓細胞と５Ｐ２１０マウスミエローマ
細胞との細胞融合から調製されるハイブリドーマから人
フィブリンに結合し、免疫グロブリンクラスがいずれも
ｉｇｃ、に属する３つのモノクローナル抗体を開発した
と述べられている。しかし、これら抗体がＢａＩ２−４
２の測定に特に有用な抗体であるか否かは明らかではな
い。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

枝上の現状において各種血栓性疾患の診断、線溶先進状
態の病態解析に、及びこれらに関する研究で利用し得る
より高い特異性を有する抗体及びより簡便で特異性の高
いＢａＩ２−４２の測定法の開発が望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば、人フィブリンＢβ鎖ＮＨ，末端ペプチ
ドに対するモノクローナル抗体、殊に人フィブリノーゲ
ンとは反応せずフィブリンならびにＢβ鎖ＮＨ，末端ペ
プチドを含むフィブリン分解物に結合する高度に特異的
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマ細胞及び酵素標識した該モノクローナル
抗体を用いるＢａＩ２−４２ペプチドのＥＬＩＳＡによ
る測定方法が提供される。

本発明のハイブリドーマ細胞は、ケーラーとミルシュタ
インの方法（Ｋ３ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
、Ｎａｔｕｒｅ＋」刹、４９５〜４９７．１９７５　）
として知られた手法によって産生される。

人フィブリンβ鎖ＮＨ，末端アミノ酸配列を含む合成ペ
プチドＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓのシスティンを担体蛋白に架橋剤で
結合させた複合体でマウスを免疫した後、このマウスの
脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させ、ハイプリド
ーマ細胞を得た。

担体蛋白としては、キーホールリンペットヘモシアニン
や牛血清アルブミンのような抗原性が非常に弱い蛋白が
適当である。

合成ペプチドはシスティンを介して担体蛋白と結合させ
て方向性を持たせる必要があり、この目的に合った結合
方法であれば一般に用いられている架橋剤を用いること
ができる。Ｎ−サクシニミディイル−４−（Ｎ−マレイ
ミド）−ブチレイト（ＳＮＢｕ）やＮ−サクシニミディ
イル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）等が適している。

人フィブリノーゲンならびに人フィブリンを固定したマ
イクロタイタープレートを用いて、人フィブリンを固定
したプレートにのみ強く結合する抗体を産生ずるハイプ
リドーマ細胞が単離され、最終的に１４株がクローン化
された。

このようにして得たハイブリドーマは栄養培地中でまた
哺乳動物の腹腔内で増殖させることができ、産生じた抗
体は培養上清またはその哺乳動物の腹水または血清より
精製することができる。一般的には、遠心分離、透析、
硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥセルロースを用
いるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等のような単離および精製法が
挙げられる。

このようにして得たこの発明の抗人フィブリンモノクロ
ーナル抗体は、全て人フィブリノーゲンならびに人フィ
ブリノーゲンのプラスミン分解産物Ｂβ１−４２には結
合せず、人フィブリンならびに人フィブリンのプラスミ
ン分解物Ｂβ１５−４２に対して強い結合能を有してい
た。　また、免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ、かＩｇ
Ｇｚｂに属する抗体であり、ウサギ、ラット、マウスの
フィブリノーゲンのトロンビンによる分解物への結合性
より、異なる抗原認識部位を持つ抗体が得られた。また
、ここで得られた抗体は、酵素を標識しても、人フィブ
リンならびにＢａＩ２−４２に対する特異的結合性の低
下はわずかであった。

以上の性質を有しているので、本発明で得たモノクロー
ナル抗体に酵素を標識して使用することにより検体中の
ＢａＩ２−４２を簡便に測定することが可能になった。

即ち、被検体中のＢａＩ２−４２と酵素を標識した抗人
フィブリンモノクローナル抗体と抗原抗体反応を行なわ
せた後、残存する標識抗体を人フィブリンあるいは免疫
抗原で被覆した不溶性担体により２回目の抗原抗体反応
を行なわせる。該担体を分離し担体に結合した酵素量を
測定するか、被検体と該担体の混合液に標識抗体を添加
し一定時間後、担体を分離し担体に結合した酵素量を測
定するかのいずれかの方法を用いて測定することが出来
る。なお、酵素量の測定は通常の方法を利用することが
でき、いずれの場合もあらかじめ作成しておいた検ｆｆ
ｉ　＆ｉから被検体中のＢａＩ２−４２　ｆｆｉを算出
することができる。

また、抗体に標識する酵素としては、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ等が使用でき、標識方法と
しては、「単クローン抗体」（岩崎　辰夫　他著、講談
社すイエンティフィク、１９８４）、　　ｒ酵素免疫測
定法」　（第２版、石川　栄治、医学書院、１９８２）
等に記載されている如く自体公知の方法で標識抗体を得
ることができる。

以下、この発明の方法を実験の詳細をもって説明するが
、それらは例示のためのものであって限定したものでは
ない。

（１）免疫に使用される抗原の調製 合成ヘプチドＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓは■ペプチド研究所（大阪市
箕面市）より購入した。

キーホールリンペントヘモシアニン（以下　　にＬｌｌ
）３０ｍｇをリン酸媛衝生理食塩水ｐＨ７，４（以下Ｐ
ＢＳ）　２ｍｌに？岩屑させ、Ｎ−サクシニミディイル
−４−（Ｎ−マレイミド）−フ゛チレイト（ＳＭＢｕ）
　３■を？８解した０、１艷のＤＭＳＯを添加した。２
５°Ｃで４０分反応後、ＰＢＳで平衡化したセファデッ
クスＧ２Ｓカラムにかけて非結合のＳＭＢｕを除去した
。蛋白画分に上記ペプチド３■を溶解した０、１ｄのＰ
ＢＳを加え、４℃で４８時間反応させた。再びセファデ
ックスＧ２５カラムにかけて非結合のペプチドを除去し
、ペプチドとＫＬＨの複合体を３０ｍｇ得た。

（２）免疫脾細胞の調製 ６〜８週齢のＢａ１ｂ／Ｃマウスの腹腔内に実施例１の
（１）で作製した抗原１００．ｕｇと完全フロイントの
アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ　
ａｄｊｕｖａｎｔ）とのエマルジョンを投与した。３週
間後に、抗原１００尾の生理食塩溶液を静脈内投与した
。最終投与の４日後に、マウスを層殺し、肺臓を採取し
、細胞融合に用いた。

（３）ハイブリドーマの調製 肺臓をピンセットでほぐし、細胞をし一グルタミン０．
２９ｇ＃、ピルビン酸０．１１ｇ＃、硫酸カナマイシン
０．０６ｇ＃、結晶ペニシリンＧ−Ｋ　Ｏ，０６ｇ／！
及びＮａＨＣＯ：＋　１．２　ｇ　／ｌを補充したＲＰ
ＭＩ−１６４０培地（以下　ＲＰ旧−１６４０）に懸濁
し、ナイロンメツシュを通過させることにより単細胞浮
遊液を得た。

浮遊液中の赤血球を０．８３χ塩化アンモニウム溶液（
９容量）と０．１７Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸緩衝液（ｐＨ７，６，１容量）との混液
で４°Ｃで２分間処理して破壊し遠心分離により除去し
た。

１０χウシ胎仔血清加ＲＰＭＩ−１６４０（以下１０χ
ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−１６４０）中で培養した対数増殖期
のマウスミエローマ細胞５Ｐ２１０をＲＰＭＩ−１６４
０で２回洗浄した。

脾細胞とマウスミエローマ細胞とを１０＝１の比率でＲ
ＰＭＩ−１６４０に懸濁し、培地を遠心分離により除去
した。細胞を水浴中で３７°Ｃに加温した。この細胞に
、あらかじめ３７°Ｃに加温した平均分子量１５００の
５０χポリエチレングリコール？容ン夜（ベーリンガー
・マンハイム山之内社製）１＋ｌ！２を１分間かけて徐
々に加え、さらに１分間反応させた。反応混合物に４分
間かけてＲＰＭＩ−１６４０９−を滴下して細胞融合反
応を停止させた。遠心分離して上清を除去し、５　Ｘ　
１０”細胞／ｍβの濃度が得られるように１０χＦＣ３
−ＲＰ旧−１６４０に再懸濁し、次いで９６穴マイクロ
ウエルプレート上に１００μＥずつ分注した。５．５ｚ
炭酸ガス気中３７°Ｃで１日培養した後、アミノプテリ
ン（４Ｘ　１０−’Ｍ）、チミン７（１，６Ｘ　１０−
’Ｍ）およびヒボキサンチン（Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ）を
含有する１０χ−Ｆｅ２−ＲＰ旧−１６４０（以下１１
ＡＴ培地）１００μ２を各ウェルに添加した。１日後、
各ウェルから半量の培地を吸引除去しＩＩＡＴ培地を１
００ｐＩｌ添加した。その後、２日または３日毎に半量
の培地を新たなＨＡＴ培地と交換し、培養を続げた。細
胞融合１４日後にハイブリドーマ細胞の増殖がほぼ全ウ
ェルで認められた。

（４）抗人フィブリンモノクローナル抗体のアッセイ ハイプリドーマ培養上清中の大フィブリンと結合し、人
フィブリノーゲンとは結合しない抗人フィブリンモノク
ローナル抗体のスクリーニングは人フィブリンあるいは
人フィブリノーゲンを固定したマイクロプレートを用い
て酵素免疫定量法により行なった。

大フィブリンの固定は９６穴イムノマイクロプレート（
ヌンク社製）の各ウェルに１００戸／ｍｆｆ１となるよ
う生理食塩水に溶解した人フィブリノーゲン溶液５０μ
２を添加し、室温１時間吸着させ、次にＣａＣｌ　ｚを
２０ｍＭとなるように添加した生理食塩水に溶解したト
ロンビン２０／ｍｆを各ウェルのフィブリン溶液に５０
μｉ添加し、室温１時間反応させフィブリノーゲンをフ
ィブリンに変換させることにより行なった。

ＥＤＴＡを５ｍＭとなるように添加したＰＢＳ溶液（以
下　ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）に１００厚／ｄとなるように溶
解した人フィブリノーゲン液５０μＥをイムノマイクロ
プレートの各ウェルに添加し、室温２時間静置し、ウェ
ルに人フィブリノーゲンを吸着させた。両プレートはＥ
ＤＴＡ−ＰＢＳで３回洗浄後、０．２χウシ血清アルブ
ミンＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液を加え、ウェルを完全にブロ
ックした。各ウェルに上記で得たハイプリドーマ培養上
清５０μ２を添加し、室温で１時間インキエベートした
。

結合した抗体の検出はベクタスティンＡＢＣキント（ベ
クターラボラトリーズ社製）を用いた。即ち、プレート
を０．０５Ｘ−Ｔｗｅｅｎ２０を含むＥＤＴＡ−ＰＢＳ
（以下Ｔｗｅｅｎ２０−ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄
後、ビオチン化ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗血清を
５０μ！添加し、１時間反応させた。

Ｔｗｅｅｎ２０−ＥＤＴＡ−ＰＢＳで洗浄後、５０ｐｌ
のアビジン化パーオキシダーゼを添加し、２０分間反応
させた。

０．０５χ−Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ　（以下　Ｔｗ
ｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で３回洗浄後、各ウェルに０．０
３χＨ２０□と０．８■／ＩＭＩｌオルトフェニレンジ
アミンの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）との
等置部合液を１００μ２加え室温でインキュベートした
。２Ｎ〜硫酸を１００μ！加えて反応を停止して、八４
．。の吸光度を測定した。

大フィブリノーゲンに対して結合能を示さず、人フィブ
リンに対して結合能を示す培養液を抗人フィブリン抗体
を産生ずる培養液として選んだ。

人フィブリンと人フィブリノーゲンに対して種々の結合
を示す抗体が認められたが、人フィブリノーゲンとは結
合せず人フィブリンに結合する抗人フィブリン抗体は７
２５培養液中１８培養液で検出された。

（５）抗人フィブリンモノクローナル抗体産生バイプリ
ドーマのクローニング 抗フィブリン抗体活性をもつハイブリドーマ培養液を、
Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの胸腺細胞をフィーダ一層（Ｌ　Ｘ
　１０’細胞／ｍ２）として用い、２４穴平底マイクロ
プレートに移した。増殖してきたハイブリドーマはＢａ
１ｂ／Ｃマウスの胸腺細胞をフィーダーＦＩ（ＩＸ１０
７細胞７ｍ１）として用い、９６六マイクロプレートを
用いて限界希釈法によりクローニングした。

クローニング操作は２度行なった。かくして、１４株の
ハイブリドーマを得た。

（６）抗人フィブリンモノクローナル抗体の精製（５）
で得たハイブリドーマ２〜５　Ｘ　１０６細胞を、１０
日前および３日前に各々０．５艷のプリスタンを腹腔内
に投与したＢａ１ｂ／Ｃの腹腔内に移植した。約１週間
後、マウスの腹腔より腹水を採取し、その腹水から抗人
フィブリンモノクローナル抗体を５０χ飽和硫酸アンモ
ニウム溶液により単離した。さらに、少量のＰＢＳに溶
解した硫酸アンモニウム沈殿残渣はアフィゲルプロティ
ンＡ−ＭＡＰＳキット（バイオラッド社製）を用いて精
製した。最終的に、ＰＢＳに透析して、４°Ｃあるいは
凍結保存した。腹水１ｍ！あたり０．５〜６■の精製抗
体を得た。

（７）抗人フィブリンモノクローナル抗体の特異性精製
した抗人フィブリンモノクローナル抗体を（４）で示し
た方法に準じて人フィブリンならびに人フィブリノーゲ
ンを固定したマイクロプレートへの結合性につき検討し
た。抗体は０．２χＢＳＡ、０．０５χＴｗｅｅｎ２０
を添加したＰＢＳで段階希釈し、５０μｌをマイクロプ
レートのウェルに加えた。ＦｂＭｏＡｂ−１２を用いた
結果の一例を第１図に示す。

抗体が高濃度存在下でもプレートに固定したフィブリノ
ーゲンへの結合はみられず、ＦｂＭｏＡｂ−１２は人フ
ィブリンに高度に特異的に結合する抗体である。

ＦｂＭｏＡｂ−１２以外の抗体もほぼ同様の結合特異性
を示した。

この実験系では、抗人フィブリノーゲン抗体または抗人
フィブリノーゲン血清を用いた場合は、人フィブリン、
人フィブリノーゲンで同程度の結合がみられた。

（８）抗体の免疫グロブリンクラスの同定精製した抗人
フィブリンモノクローナル抗体の免疫グロブリンのクラ
スを羊マウスイムノグロブリンクラス特異的抗血清（メ
ロイラボラトリー社製）を用いてオクタローニー法で同
定した。その結果を表１に示した。１４種の抗体のうち
１１種はｒｇ６１．３種はＩｇＧｔｂであった。特に現
在までＩｇＧｚｂクラスの抗人フィブリンモノクローナ
ル抗体は知られていない。

（以下余白） 表１ ＦｂＭｏＡｂ　１　　　　　　１ｇＧ＋ＦｂＭｏＡｂ　
２　　　　　　１ｇＧ＋ＦｂＭｏＡｂ　３　　　　　　
１ｇＧ＋ＦｂＭｏＡｂ　４　　　　　　１ｇＧｚｂＦｂ
ＭｏＡｂ　５　　　　　　１ｇＧ＋ＦｂＭｏＡｂ　６　
　　　　　１ｇＧ＋ＦｂＭｏＡｂ　７　　　　　　１ｇ
ＧｚｂＦｂＭｏＡｂ　８　　　　　　１ｇＧ＋ＦｂＭｏ
Ａｂ　９　　　　　　１ｇＧ＋ＦｂＭｏＡｂ　１０　　
　　　　１ｇＧ＋ＦｂＭｏＡｂ　１１　　　　　　　Ｉ
ｇＧｚｂＦｂＭｏＡｂ　１２　　　　　　１ｇＧ＋Ｆｂ
ＭｏＡｂ　１３　　　　　　１ｇＧ＋（９）抗人フィブ
リンモノクローナル抗体の種特異性 得られた抗体１０種につき、ウシ、ブタ、イヌ。

ウサギ、モルモット、ラットマウスのフィブリン、フィ
ブリノーゲンへの結合性を人フィブリンへの結合性と比
較した。方法は実施例１の（３）に示した方法に準じ、
各種動物のフィブリン、フィブリノーゲンを固定したプ
レートを用いる６＃−素免疫定量法によりおこなった。

ウシ、ブタ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットのフィ
ブリノーゲンはＳｉｇｍａ社より購入した。マウスのフ
ィブリノーゲンはｄｄＹマウスより採取したクエン酸加
血漿より、クリオプレシピテーシジン、冷エタノール分
画。

リジンセファロースによるプラスミノーゲンの除去、２
０χ飽和硫酸アンモニウムによる塩析を組み合わせて精
製したものを用いた。いずれの抗体も各種動物のフィブ
リノーゲンに対する結合は認められなかった。フィブリ
ンに対する結合性を表２に示す。人のフィブリンに対す
ると同様に強く結合する抗体は＋、大のフィブリンに較
べて結合性が弱い抗体は士、結合性が非常に弱いか全く
結合しない抗体は−で示した。

表２ ＦｂＭｏＡｂ　　　１　　−　　−　　　＋　　　−十
　　　　−−ＦｂＭｏＡｂ４　　−　　＋　　−＋　　
　−−ＦｂＭｏＡｂ３　　−　　−　　　十　　＋　　
　　　＋　　　　　−−ＦｂＭｏＡｂ５　　−＋＋　　
　＋　　　−−ＦｂＭｏＡｂ６　−　−　　＋　　＋　
　　＋　　　−−ＦｂＭｏＡｂ７　　−　　−　　　＋
　　　＋　　　　　十　　　　−−ＦｂＭｏＡｂ　　８
　　−　　＋　　＋　　　＋　　　−±ＦｂＭｏＡｂ１
２　−　−　　＋　　＋　　　十　　士　　士ＦｂＭｏ
Ａｂ１３　　−　−　　　＋　　　＋　　　　　十　　
　　士　　　　士ＦｂＭｏＡｂ１４　　−　　−　　　
＋　　　＋　　　　　十　　　　士　　　　士抗人フィ
ブリンモノクローナル抗体はａ）ウサギ、ラット、マウ
スのフィブリンとは結合しない抗体、　ｂ）ウサギのフ
ィブリンとは結合するがラントおよびマウスのフィブリ
ンとは結合しない抗体。

Ｃ）ウサギのフィブリンならびに結合性は弱いが、ラッ
トおよびマうスのフィブリンと結合する抗体の３種類に
大別することが出来た。イヌ、ウサギ。

モルモットならびに結合性は弱いながらもラット。

マウスのフィブリンに結合することは、これら抗体が、
大以外の動物のフィブリンならびにフィブリンのプラス
ミンによる分解物の定量に応用できることを示唆するも
のである。また、抗人フィブリンモノクローナル抗体の
応用として考えられる抗人フィブリンモノクローナル抗
体を用いる診断。

治療薬の開発において、イヌ、ウサギ、モルモット、ラ
ット、マウス等を用いて動物実験が可能となり、非常に
有用な抗体となることが明らかとされた。

（１）西洋ワサビ・パーオキシダーゼによる標識抗人フ
ィブリンモノクローナル抗体ＦｂＭｏＡｂ　ＬＦｂＭｏ
八ｂ　へ、ＦｂＭｏＡｂ　１２に、過よう素酸酸化法（
単りローン抗体、岩崎　辰夫　他著、講談社すイエンテ
ィフィク、１９８４）を用いて西洋ワサビ・パーオキシ
ダーゼ（以下１（ＲＰ）を標識した。１ｍｇの蒸留水に
溶かした４ｍｇのＨＲＰ　（シグマ社製）溶液に２００
μｐの０．１回過よう素酸ナトリウムを加え、２０分室
温で反応させた。１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４
，４）に対して４°Ｃ１−晩透析をおこなった。透析内
液に０．２Ｍ炭酸ナトリウム２０μ２を加えｐＩｉを９
．０にした。３　ｍｇ　／　ｒｒｄｌに０．０１Ｍ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋９．５）で調製した抗体１ｍ
ｌを直ちに加え、室温で２時間撹拌した。反応液を氷で
冷やし、０．１ｍｇのＮａＢＩＩ＝液を加え、４°Ｃで
２時間反応させた。

ＰＢＳに対して４°Ｃで１晩透析し、ＰＢＳで平衡化し
た七フアクリルＳ−３００カラムでゲル濾過を行い、未
反応のＨＲＰと抗体を標識抗体と分離した。２８０ｎｍ
と４０３ｎｍの吸光度を測定し、標識抗体画分を得た。

いずれの抗体も同様に標識され、人フィブリンに対する
結合活性は維持されていた。

（２）不溶性担体に吸着させる抗原の調製ならびに不溶
性担体への吸着 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　３０ｍｇをＰＢ３２ｍＮ
に溶解させ、Ｎ−サクシニミディイル−４−（Ｎ−マレ
イミド）−フ゛チレイト　（ＳＭＢｕ）　３ｍｇを？容
解した０、１ｍｇのＤＭＳＯを添加した。２５°Ｃで４
０分反応後、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２５
カラムにかけ非結合のＳＭＢｕを除去した。蛋白画分に
実施例１−（１）で用いた合成ペプチドＧｌｙ−ｔｌｉ
ｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ
　３ｍｇを溶解したＯＡｍｌのＰＢＳを加え、４°Ｃで
４８時間反応させた。再びセファデックスＧ２５カラム
にかけて非結合のペプチドを除去し、ペプチドとＢＳＡ
の複合体（以下　β−ＢＳＡ）を３０■得た。

β−ＢＳＡを２　ｙ　／　ｍｌの濃度になる様に５０ｍ
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１９，０）で希釈し、９
６穴平底イムノマイクロプレート（ヌンク社製）に１０
０μ２づつ分注した。４°Ｃで一晩吸着させ、未吸若蛋
白は１０ｍＭｌ−リスＮｌ　ｉＪｉ液ｐＨ７，４−１５
０ｍＭ塩化ナトリウム（以下ＴＢＳ）で３回洗った。プ
レートの未反応表面は０．２ＺＢＳＡを含むＴＢＳで室
温１時間吸着させた。

（３）ＢａＩ２−４２の測定 試験管に被検体として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．
２ＸＢＳＡを含むＴＢＳ　（以下　Ｔｉｙｅｅｎ２０−
ＢＳＡ−ＴＢＳ）で段階希釈したＢａＩ２−４２標阜品
（イムコ社）１５０μ２と（１）で調製したｌＩｌ？Ｐ
標識抗体のＴｗｅｅｎ２０−ＢＳＡ−ＴＢＳによる希釈
液１５０μ！を加え室温で１時間反応させた。　　ＨＲ
Ｐで標識したＦｂＭｏＡｂ　１．ＦｂＭｏＡｂ　１２を
それぞれ１５００倍、　３０００倍の濃度で用いた。反
応液を（２）のマイクロプレートのウェルに１００μβ
添加した。室温で１時間反応させた後、０．０５χＴｗ
ｅｅｎ２０添加ＴＢＳで３回洗浄した。１００／７ｆｆ
の基質液（０，０３％Ｉ□Ｏ，と０　、８　ｍｇ　／　
ｍ／ｌオルトフェニレンジアミンの１００ｍＭクエン酸
Ｙ’ｆｊ−ｊｓｉ液（ｐＨ５，０）　との等壁温合液）
を加え、室温で１５分反応させた。１００μ！の２Ｎ硫
酸を加えて反応を停止させ、イムノリーダーＮＪ−２０
００（日本インターメント社）を用いて４９０ｎｍの吸
光度を測定した。結果を第２図に示す。

上記測定条件ではいずれも検体中のＢａＩ２−４２の測
定可能範囲は０．４ｎ　ｇ　７ｍβ〜１５０ｎｇ／ｍｆ
であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１の抗人フィブリンモノクローナル抗
体のフィブリンへの特異結合性を示すグラフ、第２図は
、実施例２のＩＩＲＰで標識した抗人フィブリンモノク
ローナル抗体を用いたＢａＩ２−４２のＪす定結果を示
すグラフである。 特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者長野　和書

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体蛋白質に架橋剤で結合させた人フィブリンβ
   鎖ＮＨ＿２末端アミノ酸配列を含むペプチドＧｌｙ−Ｈ
   ｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙ
   ｓであらかじめ免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫
   細胞ラインからの細胞との細胞融合で得られたハイブリ
   ドーマによって産生され、人フィブリノーゲンとは反応
   せず人フィブリンを特異的に認識する抗人フィブリンモ
   ノクローナル抗体。
2. （２）抗人フィブリンモノクローナル抗体を産生するハ
   イブリドーマ。
3. （３）人フィブリンまたは人フィブリンβ鎖ＮＨ＿２末
   端ペプチドＢβ１５−４２を含むフィブリン分解物を測
   定するためのエンザイム・リンクト・イムノアドソルベ
   ント・アッセイ（酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ）。
4. （４）特許請求の範囲第（１）項に記載の抗人フィブリ
   ンモノクローナル抗体に酵素標識を行ない、該酵素標識
   抗体と抗原を吸着させた不溶性担体と被検体とを免疫反
   応させた後に酵素量を測定することを特徴とする特許請
   求の範囲第（３）項記載の測定方法。