JPS638400A - ヒト***不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents
ヒト***不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マInfo
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野]
この発明は、ヒト***と特異的に反応するヒト単一クロ
ーン抗体及びそれを産生するハイブリトーマに関する。
ーン抗体及びそれを産生するハイブリトーマに関する。
この発明の単一クローン抗体は試薬又は避妊薬として用
いることがてきる。
いることがてきる。
[従来の技術及びその欠点]
従来より、原因不明不妊婦人の十数%に、***不動化抗
体の存在か報告されている。また、これら***不動化試
験により検出される抗体は、一種類ではなく何種類もあ
ると報告されている。
体の存在か報告されている。また、これら***不動化試
験により検出される抗体は、一種類ではなく何種類もあ
ると報告されている。
ヘルらは、精管切除した患者の末梢血リンパ球とマウス
ミエローマ細胞とを融合させることにより、抗ヒト***
単一クローン抗体を産生するハイブリトーマを確立した
(Herr、J、C,ら、”llumanantisp
erm monoclonal antibodies
constructedpos tvasec to
By″Riot、 Reprod、 12:695−7
11) 。
ミエローマ細胞とを融合させることにより、抗ヒト***
単一クローン抗体を産生するハイブリトーマを確立した
(Herr、J、C,ら、”llumanantisp
erm monoclonal antibodies
constructedpos tvasec to
By″Riot、 Reprod、 12:695−7
11) 。
しかし、ヘルらによって報告された単一クローン抗体は
、酵素免疫分析及び間接免疫蛍光分析によりヒト***に
結合することは示されたが、この単一クローン抗体の生
物学的活性は全く報告されていない。
、酵素免疫分析及び間接免疫蛍光分析によりヒト***に
結合することは示されたが、この単一クローン抗体の生
物学的活性は全く報告されていない。
〔発明か解決しようとする問題点]
この発明の目的は、高力価の***不動化及び***凝集活
性を有するヒト単一クローン抗体及びこれを産生ずるハ
イブリトーマを提供することである。
性を有するヒト単一クローン抗体及びこれを産生ずるハ
イブリトーマを提供することである。
[問題点を解決するための手段]
本願発明者らは、不妊症婦人の末梢血リンパ球とマウス
ミエローマ、細胞とを細胞融合させることにより、高力
価のヒト***不動化活性を有するヒト単一クローン抗体
を産生ずるハイブリトーマを得ることに成功した。この
発明のヒト単一クローン抗体は、λ鎖を有するヒト免疫
グロブリンMに屈し、***不動化活性が5lqoとして
約5000以上であり、***凝集価か約1:1600希
釈以上であり、ヒト******、精漿及び精嚢に対して特
異的に反応し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒト睾丸抽出液、
ヒト肝臓抽出液、ヒト肺臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト
赤血球、ヒト白血球とは反応せず、ブタ******とは弱
い交叉反応性を示すかウシ******、ヤギ******、ウ
サギ射1a***、ハムスター精巣上体***及びラット精
巣上体***とは反応しない。
ミエローマ、細胞とを細胞融合させることにより、高力
価のヒト***不動化活性を有するヒト単一クローン抗体
を産生ずるハイブリトーマを得ることに成功した。この
発明のヒト単一クローン抗体は、λ鎖を有するヒト免疫
グロブリンMに屈し、***不動化活性が5lqoとして
約5000以上であり、***凝集価か約1:1600希
釈以上であり、ヒト******、精漿及び精嚢に対して特
異的に反応し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒト睾丸抽出液、
ヒト肝臓抽出液、ヒト肺臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト
赤血球、ヒト白血球とは反応せず、ブタ******とは弱
い交叉反応性を示すかウシ******、ヤギ******、ウ
サギ射1a***、ハムスター精巣上体***及びラット精
巣上体***とは反応しない。
[発明の効果]
この発明により、***不動化活性及び***凝集活性の極
めて高いヒト単一クローン抗体か得られた。
めて高いヒト単一クローン抗体か得られた。
この発明のヒト単一クローン抗体は、これを用いて受身
免疫することによって、又はこれを性器に局所的に補体
と併せて適用することによって避妊薬として用いること
がてきる。また、この発明のヒト単一クローン抗体の対
応抗原は避妊ワクチンとしての用途を有するが、この発
明の単一クローン抗体は、その対応抗原を精製する際の
試薬としての用途をも有する。
免疫することによって、又はこれを性器に局所的に補体
と併せて適用することによって避妊薬として用いること
がてきる。また、この発明のヒト単一クローン抗体の対
応抗原は避妊ワクチンとしての用途を有するが、この発
明の単一クローン抗体は、その対応抗原を精製する際の
試薬としての用途をも有する。
[発明の詳細な説明]
この発明のヒトハイブリドーマ及びヒト単一クローン抗
体は以下の工程により製造することがてきる。
体は以下の工程により製造することがてきる。
まず、血清中に高力価の***不動化及び***凝集抗体を
有する不妊婦人からリンパ球を採取する。リンパ球は末
梢血リンパ球てよい。リンパ球の採取は、広く知られた
フイコールーコンレー密度勾配遠心により行なうことが
できる。
有する不妊婦人からリンパ球を採取する。リンパ球は末
梢血リンパ球てよい。リンパ球の採取は、広く知られた
フイコールーコンレー密度勾配遠心により行なうことが
できる。
次に採取したリンパ球を、生体外て刺激する。刺激は、
ヒト***及びPWMレクチンの存在下てリンパ球を培養
することによって行なうことかてきる。培養は、例えば
5xco□インキユベーター中で37℃で5日間行なう
ことがてきる。培養液中のリンパ球の初濃度は6 x
10’ないし7 x 10’細胞/ml 、***の初濃
度は3 x 10’ないし3.5×10’細胞/1が好
ましい。また、PWMレクチンの培養液中の最終濃度は
約1:100程度か好ましい。
ヒト***及びPWMレクチンの存在下てリンパ球を培養
することによって行なうことかてきる。培養は、例えば
5xco□インキユベーター中で37℃で5日間行なう
ことがてきる。培養液中のリンパ球の初濃度は6 x
10’ないし7 x 10’細胞/ml 、***の初濃
度は3 x 10’ないし3.5×10’細胞/1が好
ましい。また、PWMレクチンの培養液中の最終濃度は
約1:100程度か好ましい。
次にこのようにして刺激したリンパ球とミエローマ細胞
とを融合させる。この細胞融合は、ポリエチレングリコ
ールの存在下て常法に従って行なうことかてきる。
とを融合させる。この細胞融合は、ポリエチレングリコ
ールの存在下て常法に従って行なうことかてきる。
融合後は、細胞を、常法に従い、フィーダー細胞を有す
る又は有さないマイクロプレートウェル中て例えば37
℃て5xco□インキユベーター中で培養することがて
きる。培養24時間後に培地をHATi!!択培地に代
えて培養した後、培養上清を常法であるサンドイッチ酵
素免疫分析法により試験してヒト免疫グロブリンを産生
じているリンパ球を選択する。
る又は有さないマイクロプレートウェル中て例えば37
℃て5xco□インキユベーター中で培養することがて
きる。培養24時間後に培地をHATi!!択培地に代
えて培養した後、培養上清を常法であるサンドイッチ酵
素免疫分析法により試験してヒト免疫グロブリンを産生
じているリンパ球を選択する。
次に、このようにして選択されたヒト免疫グロブリン産
生リンパ球のうち、抗ヒト***抗体産生リンパ球を選択
する。この選択も酵素免疫分析によって行なうことがで
きる。マイクロプレートのウェルを洗浄したヒト***で
コーティングし、これに培養上清を加えて一定時間後に
洗浄し、抗体か結合したかどうかを酵素免疫分析により
調べる。また、抗***抗体産生の有無は、培養上清を用
いてマイクロ***不動化テスト又は***凝集テストをも
併せて行なう。
生リンパ球のうち、抗ヒト***抗体産生リンパ球を選択
する。この選択も酵素免疫分析によって行なうことがで
きる。マイクロプレートのウェルを洗浄したヒト***で
コーティングし、これに培養上清を加えて一定時間後に
洗浄し、抗体か結合したかどうかを酵素免疫分析により
調べる。また、抗***抗体産生の有無は、培養上清を用
いてマイクロ***不動化テスト又は***凝集テストをも
併せて行なう。
この酵素免疫分析並びに***不動化及び***凝集テスト
により、抗ヒト***抗体を産生するリンパ球が選択され
、これを常法に従ってクローニング操作を繰り返すこと
によってこの発明のヒトハイブリドーマが確立される。
により、抗ヒト***抗体を産生するリンパ球が選択され
、これを常法に従ってクローニング操作を繰り返すこと
によってこの発明のヒトハイブリドーマが確立される。
以下、実施例に基づき、この発明をより具体的かつ詳細
に説明する。
に説明する。
[発明の実施例]
リンパ球の採取
強い***不動化及び***凝集抗体を有する、15年以上
不妊の39歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通
常の医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中
に高力価の***不動化及び***凝集抗体か存在すること
以外に不妊の原因は発見されなかった。彼女の血清中の
抗体力価は、***不動化値が31.。とじて45.0
(礒島と香山、Quantitative esti
mation or spermissobilizi
ng ar+Libody in the 5era
of womanwith 5terility
or unknown eLiology: t
he 5Hsperv 1m5obilixati
on unit (Slso)、 In R
ecentAdvances in 1lusan
Reproduction (fl:a+1po
s daPaz、、A、、 Drill、 V、
八、、 l1yashi、 tl、、Redrig
ues。
不妊の39歳の女性から末梢血リンパ球を採取した。通
常の医学的検査によりこの女性を調べたところ、血清中
に高力価の***不動化及び***凝集抗体か存在すること
以外に不妊の原因は発見されなかった。彼女の血清中の
抗体力価は、***不動化値が31.。とじて45.0
(礒島と香山、Quantitative esti
mation or spermissobilizi
ng ar+Libody in the 5era
of womanwith 5terility
or unknown eLiology: t
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on unit (Slso)、 In R
ecentAdvances in 1lusan
Reproduction (fl:a+1po
s daPaz、、A、、 Drill、 V、
八、、 l1yashi、 tl、、Redrig
ues。
11、 and 5chally、 八、V、
’eds)、 pplo−15,Excerpta
Medica、 As+sterdam; 1976)
、***凝集値が1=32島釈(Friberg、 J、
(1974)、 A si@ple andsen
sitive +sicromeLhod for
demonsjration orsper園−
aggluLinaLing acLivity
in serum frominfertile
men and women、 AcLa
0bsLet。
’eds)、 pplo−15,Excerpta
Medica、 As+sterdam; 1976)
、***凝集値が1=32島釈(Friberg、 J、
(1974)、 A si@ple andsen
sitive +sicromeLhod for
demonsjration orsper園−
aggluLinaLing acLivity
in serum frominfertile
men and women、 AcLa
0bsLet。
Gynecol、 5cand、 5upp1.36:
2l−29)てあった。末梢血リンパ球は、フイコール
ーコンレー密度勾配遠心により単離した。
2l−29)てあった。末梢血リンパ球は、フイコール
ーコンレー密度勾配遠心により単離した。
リンパ球の刺激
PWMレクチン(終濃度1:’100.米国ギブコ社製
)とIO!ウシ胎児血清(Fe2)とを含む15m1の
RPMI 1640培地に、採取したリンパ球1.Ox
10’個と、健常人からの洗浄した***5 x 10
’個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレート(
米国コーニング社製、コーニング−25820)の15
のウェルに分注し、 sx co、インキュベーター中
で37°Cで5日間培養した。培養後1個々のウェルか
ら採取された刺激されたリンパ球をプールし、2回洗い
、10−1のRPMl 1640培地中に懸濁した。こ
の刺激操作後、トリパンブルー染色法により調べたとこ
ろ、58zのリンパ球が生存していた。
)とIO!ウシ胎児血清(Fe2)とを含む15m1の
RPMI 1640培地に、採取したリンパ球1.Ox
10’個と、健常人からの洗浄した***5 x 10
’個とを懸濁した。この混合物をコーニングプレート(
米国コーニング社製、コーニング−25820)の15
のウェルに分注し、 sx co、インキュベーター中
で37°Cで5日間培養した。培養後1個々のウェルか
ら採取された刺激されたリンパ球をプールし、2回洗い
、10−1のRPMl 1640培地中に懸濁した。こ
の刺激操作後、トリパンブルー染色法により調べたとこ
ろ、58zのリンパ球が生存していた。
細胞融合
繁田らの方法(Sperm−i+smobilizin
g monoclonalantibody to
human 5esinal plasma
antigens。
g monoclonalantibody to
human 5esinal plasma
antigens。
Cl1n、 Exp、 Immunol、 42:4
S8−462 (1980))に従い、分子l 100
0のポリエチレングリコールの存在下で、先に得られた
PWM刺激後、生存しているリンパ球51 x In’
個と、同数のマウスミエローマ細胞(Pl−MS−1/
1.Ag、 4: N5−1)とを融合した。
S8−462 (1980))に従い、分子l 100
0のポリエチレングリコールの存在下で、先に得られた
PWM刺激後、生存しているリンパ球51 x In’
個と、同数のマウスミエローマ細胞(Pl−MS−1/
1.Ag、 4: N5−1)とを融合した。
100.1の融合細胞を96個のウェルのそれぞれに入
れ、 5% Go□インキュベーター中て37℃て培養
した。96個のウェルのうち27個にはウェル当たりl
x In’個のリンパ球のみを収容し、他の69個の
ウェルにはウェルちたり4 x 1[1’個のリンパ球
と、支持細胞層として6 x In5個のマウス胸腺細
胞を収容した。培養24時間後に培地なHAT選択培地
に変え、培養12.19.及び230後に個々のウェル
の上清を後述するサンドイッチ酵素免疫分析法により試
験して゛ヒト免疫グロブリンを産生じているかどうか調
べた。培養23日後では、支持細胞層を用いない27ウ
エルのうち14ウエルて、支持細胞層を用いた69ウエ
ルのうち44ウエルて細胞の増殖か認められた。
れ、 5% Go□インキュベーター中て37℃て培養
した。96個のウェルのうち27個にはウェル当たりl
x In’個のリンパ球のみを収容し、他の69個の
ウェルにはウェルちたり4 x 1[1’個のリンパ球
と、支持細胞層として6 x In5個のマウス胸腺細
胞を収容した。培養24時間後に培地なHAT選択培地
に変え、培養12.19.及び230後に個々のウェル
の上清を後述するサンドイッチ酵素免疫分析法により試
験して゛ヒト免疫グロブリンを産生じているかどうか調
べた。培養23日後では、支持細胞層を用いない27ウ
エルのうち14ウエルて、支持細胞層を用いた69ウエ
ルのうち44ウエルて細胞の増殖か認められた。
酵素免疫分析によるヒト免疫グロブリンの検出サンドイ
ッチ酵素免疫分析に用いる全ての試薬は米国キャベルラ
ボラトリーズ製のものてあった、ポリビニルプレー、ト
(米国、ファルコン−3912)の96個のウェルを、
0.05M亜炭#!!l衝液(pH9,5)中ウサギ抗
ヒト免疫グロブリン(IgG+IgA◆IgM)抗血清
1gG分画(タンパク濃度0.8gg/+00 gl/
ウェル)てコーティングし、4℃で一夜培養した。プレ
ートの未結合領域は1%ウシ血清アルブミン(BSA)
と5%正常ウマ血清とを含むo、ts鷺リン酸緩衝液(
pH7,4) (ブロッキング溶液)をウェルに入れ
て室温て1時間インキュベートすることによってブロッ
クした。0.0S%のTveen20を含むリン酸緩衝
液てウェルを洗った後、50g+の培養上清を加え、室
温で2時間培養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清か
ら作られたF(ab’)2をパーオキシダーゼて標識し
たものをブロッキング溶液て1 :400Gに希釈した
もの50.1をウェルに加えた。室温で1時間インキュ
ベートした後プレートを洗い、0.000 HJzを含
む0.1Mクエン酸緩衝液(pus、口)中オルソフェ
ニレンシアミン(和光紬薬工業社製)を終濃度0.02
$となるように加えた。反応は5ouL+のIOX I
I□S04を加えることによって停止し、マイクロプレ
ート光度計(MTP 12.コロナ電機社製)で測定し
た。その結果、増殖が認められた上記58ウエルのうち
、11ウエルからヒト免疫グロブリンが検出された。
ッチ酵素免疫分析に用いる全ての試薬は米国キャベルラ
ボラトリーズ製のものてあった、ポリビニルプレー、ト
(米国、ファルコン−3912)の96個のウェルを、
0.05M亜炭#!!l衝液(pH9,5)中ウサギ抗
ヒト免疫グロブリン(IgG+IgA◆IgM)抗血清
1gG分画(タンパク濃度0.8gg/+00 gl/
ウェル)てコーティングし、4℃で一夜培養した。プレ
ートの未結合領域は1%ウシ血清アルブミン(BSA)
と5%正常ウマ血清とを含むo、ts鷺リン酸緩衝液(
pH7,4) (ブロッキング溶液)をウェルに入れ
て室温て1時間インキュベートすることによってブロッ
クした。0.0S%のTveen20を含むリン酸緩衝
液てウェルを洗った後、50g+の培養上清を加え、室
温で2時間培養した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリン血清か
ら作られたF(ab’)2をパーオキシダーゼて標識し
たものをブロッキング溶液て1 :400Gに希釈した
もの50.1をウェルに加えた。室温で1時間インキュ
ベートした後プレートを洗い、0.000 HJzを含
む0.1Mクエン酸緩衝液(pus、口)中オルソフェ
ニレンシアミン(和光紬薬工業社製)を終濃度0.02
$となるように加えた。反応は5ouL+のIOX I
I□S04を加えることによって停止し、マイクロプレ
ート光度計(MTP 12.コロナ電機社製)で測定し
た。その結果、増殖が認められた上記58ウエルのうち
、11ウエルからヒト免疫グロブリンが検出された。
酵素免疫分析による抗***抗体の検出
96ウエルのポリビニルプレート(ファルコン−:19
12)を洗浄したヒト***てコーティングした。
12)を洗浄したヒト***てコーティングした。
コーティングは、50ル1の***懸濁液(5x10’/
ml)を個々のウェルに加え、室温て空気乾燥すること
によって行なった。プレートは使用時まて4℃で貯蔵し
た。 +! BSAと2χ正常ウマ血清とを含むリンm
緩衝液を個々のウェルに加え、室温て1時間保持してウ
ェルのタンパク結合領域をブロックした。リン酸緩衝液
で洗った後、50ル1の培養上清を***てコートされた
ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。その
後、先に述べた免疫グロブリンの検出と全く同様にして
抗ヒト***抗体を検出した。その結果、ヒト免疫グロブ
リンが検出された11ウエルのうち1つのウェルから抗
ヒト***抗体が検出された。
ml)を個々のウェルに加え、室温て空気乾燥すること
によって行なった。プレートは使用時まて4℃で貯蔵し
た。 +! BSAと2χ正常ウマ血清とを含むリンm
緩衝液を個々のウェルに加え、室温て1時間保持してウ
ェルのタンパク結合領域をブロックした。リン酸緩衝液
で洗った後、50ル1の培養上清を***てコートされた
ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。その
後、先に述べた免疫グロブリンの検出と全く同様にして
抗ヒト***抗体を検出した。その結果、ヒト免疫グロブ
リンが検出された11ウエルのうち1つのウェルから抗
ヒト***抗体が検出された。
−ヒト 1 細 のクローニング抗ヒト***抗体
か検出されたウェル中のハイi!JF−vを、151
Fe2を含むRPMI 1540培地中て6 x 10
’/ウエルのマウス胸醗細胞と共に37℃てsz co
2インキュベート中て培養した。培養は。
か検出されたウェル中のハイi!JF−vを、151
Fe2を含むRPMI 1540培地中て6 x 10
’/ウエルのマウス胸醗細胞と共に37℃てsz co
2インキュベート中て培養した。培養は。
96ウエルコーニングプラスチツクプレートの第1列の
8つのウェルに約1 x 10”ハイブリトーマ/ウェ
ルの濃度に上記培養液を入れ、1列ごとに1:2に段階
希釈して行なった。従って最後の列はt、2zに希釈さ
れた。培養17日後、96ウエルのうち4つのウェルて
細胞の増殖か認められ。
8つのウェルに約1 x 10”ハイブリトーマ/ウェ
ルの濃度に上記培養液を入れ、1列ごとに1:2に段階
希釈して行なった。従って最後の列はt、2zに希釈さ
れた。培養17日後、96ウエルのうち4つのウェルて
細胞の増殖か認められ。
そのうちの2って強い抗ヒト***抗体か検出された。そ
のうちの1つのウェルからハイブリドーマを採取し、先
に行なったのと全く同様にして第2回目のクローニング
を行なった。その結果、96のウェルのうち46のウェ
ルて細胞の増殖が認められ、そのうちの42のウェルて
抗ヒト***抗体の産生か認められた。42のウェルのう
ち、抗ヒト***抗体価の最も高かったウェルからハイブ
リトーマを採取し、第3回目のクローニングを同様にし
て行なった。その結果、96のウェルのうち56のウェ
ルで細胞の増殖が認められ、5′6のウェルの全てで強
い抗ヒト***抗体か検出された。これらのウェルのうち
の1つを取り、以下の実験に用いた。
のうちの1つのウェルからハイブリドーマを採取し、先
に行なったのと全く同様にして第2回目のクローニング
を行なった。その結果、96のウェルのうち46のウェ
ルて細胞の増殖が認められ、そのうちの42のウェルて
抗ヒト***抗体の産生か認められた。42のウェルのう
ち、抗ヒト***抗体価の最も高かったウェルからハイブ
リトーマを採取し、第3回目のクローニングを同様にし
て行なった。その結果、96のウェルのうち56のウェ
ルで細胞の増殖が認められ、5′6のウェルの全てで強
い抗ヒト***抗体か検出された。これらのウェルのうち
の1つを取り、以下の実験に用いた。
このバイブリトーマを24ウエルのプラスチックプレー
ト(コーニング−25820)に移し37℃で5χCO
2インキユベート中て培養した。細胞か増殖した後、培
養物を組織培養フラスコ(コーニング−25100と2
5110)に広げて培養した。
ト(コーニング−25820)に移し37℃で5χCO
2インキユベート中て培養した。細胞か増殖した後、培
養物を組織培養フラスコ(コーニング−25100と2
5110)に広げて培養した。
***不動化及び***凝集試験
***不動化試験を礒島と香山のマイクロ***不動化試験
法(MicroLechnique of sperm
imsobilization test、 I
n [mmunology oflleprodu
ction (Bratanov、に、 Valcha
nov、 V、11. 。
法(MicroLechnique of sperm
imsobilization test、 I
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ction (Bratanov、に、 Valcha
nov、 V、11. 。
Dikov、 V、、 Georgieva、 R,a
nd Somlev、 B、 ads)pp215−2
19. Bulgarian Academy of
5cience。
nd Somlev、 B、 ads)pp215−2
19. Bulgarian Academy of
5cience。
5ofia、 1979)をわずかに修飾した方法によ
って、***凝集試験をフリバーブ(文献は上記)のトレ
ー凝集試験法によって行なった。すなわち、まず、10
.1の段階希釈した検体をテラサキのプレート(ファル
コン−3014)の個々のウェルに入れ、液体パラフィ
ンをその上に積層した。2#Llのプールされた補体源
としてのモルモット血清と、11の活性なヒト***懸濁
液(2x 10’/鵬1)とをウェルに加えた。補体の
コントロールとして2glの熱不活化(56°C230
分)モルモット血清を用いた。***不動化抗体値は、5
01 M子不動化単位(SI5o)として計算した(1
島と香山(1976)、文献は上記)。***凝集は、熱
不活化モルモット血清を含むウェル中で顕微鏡下で調べ
、WHO研修会、Aarhus、1974 (ローズ
ら、1971i)の方法によって評価した。
って、***凝集試験をフリバーブ(文献は上記)のトレ
ー凝集試験法によって行なった。すなわち、まず、10
.1の段階希釈した検体をテラサキのプレート(ファル
コン−3014)の個々のウェルに入れ、液体パラフィ
ンをその上に積層した。2#Llのプールされた補体源
としてのモルモット血清と、11の活性なヒト***懸濁
液(2x 10’/鵬1)とをウェルに加えた。補体の
コントロールとして2glの熱不活化(56°C230
分)モルモット血清を用いた。***不動化抗体値は、5
01 M子不動化単位(SI5o)として計算した(1
島と香山(1976)、文献は上記)。***凝集は、熱
不活化モルモット血清を含むウェル中で顕微鏡下で調べ
、WHO研修会、Aarhus、1974 (ローズ
ら、1971i)の方法によって評価した。
M1織培養フラスコに広げて培養した上記培養物の上清
は、1.s gg/slのヒトIgMを含んでいた。こ
の上清の***不動化値を上記方法により調べたところ5
lsoとして5000単位であった。また。
は、1.s gg/slのヒトIgMを含んでいた。こ
の上清の***不動化値を上記方法により調べたところ5
lsoとして5000単位であった。また。
***凝集値を上記方法により調べたところ、1:160
0希釈てあった。このバイプリトーマは、強い***不動
化抗体活性及び***凝集抗体活性な示すIgMの産生を
低下することなく8力月以上m持生育している。細胞融
合後の培養日数とIgMの生産量並びに***不動化値及
び***凝集値を第1表に示す、なお、免疫グロブリンの
クラスは、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgG(γ−特異性)
抗血清、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgM(g−特異性)抗
血清、H鎖特異性ヤギ抗ヒトIgA(α−特異性)抗血
清、L鎖特異性(入、に)ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗
血清(いずれもマイルズ・サイエンティフィック社製)
を用いた寒天グルー内の二重免疫拡散法により試験した
。上記ヒトハイブリドーマの上清の硫酸アンモニウム沈
殿分画は、終−特異性及び入−特異性抗血清に対して単
一の沈降線を示した。
0希釈てあった。このバイプリトーマは、強い***不動
化抗体活性及び***凝集抗体活性な示すIgMの産生を
低下することなく8力月以上m持生育している。細胞融
合後の培養日数とIgMの生産量並びに***不動化値及
び***凝集値を第1表に示す、なお、免疫グロブリンの
クラスは、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgG(γ−特異性)
抗血清、H釦特異性ヤギ抗ヒトIgM(g−特異性)抗
血清、H鎖特異性ヤギ抗ヒトIgA(α−特異性)抗血
清、L鎖特異性(入、に)ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗
血清(いずれもマイルズ・サイエンティフィック社製)
を用いた寒天グルー内の二重免疫拡散法により試験した
。上記ヒトハイブリドーマの上清の硫酸アンモニウム沈
殿分画は、終−特異性及び入−特異性抗血清に対して単
一の沈降線を示した。
第 1 表
53 1.5 5000
1:1500120 未検出
8400 未検出189 2.1
5900 1:3200249 2.
0 5900 1:]200抗体吸収試
験 上記ハイプリトーマの産生ずるヒト単一クローン抗体の
特異性を調べるために抗体吸収試験を行なった。抗体吸
収試験は、種々の組織抽出液(ホモジネート上清)、体
液、種々の!ll物の***を免疫吸収体として用いて上
記バイプリトーマの培養上清を吸収し、残存する抗体活
性を***不動化試験により求めることによって行なった
。正常ヒト血清のIH生理食塩水溶液で適当に希釈した
培養上清10寥1を、100ル1の段階希釈した免疫吸
収体と混合し、この混合物を4°Cで一夜インキユベー
トした。試験の前に予め培養上清の抗体活性を31.。
1:1500120 未検出
8400 未検出189 2.1
5900 1:3200249 2.
0 5900 1:]200抗体吸収試
験 上記ハイプリトーマの産生ずるヒト単一クローン抗体の
特異性を調べるために抗体吸収試験を行なった。抗体吸
収試験は、種々の組織抽出液(ホモジネート上清)、体
液、種々の!ll物の***を免疫吸収体として用いて上
記バイプリトーマの培養上清を吸収し、残存する抗体活
性を***不動化試験により求めることによって行なった
。正常ヒト血清のIH生理食塩水溶液で適当に希釈した
培養上清10寥1を、100ル1の段階希釈した免疫吸
収体と混合し、この混合物を4°Cで一夜インキユベー
トした。試験の前に予め培養上清の抗体活性を31.。
値て約lO単位に調箇した。インキュベート後、上清を
遠心分離しく9500g、 30分)、***不動化値を
調べた。ヒト***(RAS) 、ヒト母乳(IIM)及
び正常ヒト血清(NIIS)は硫酸アンモニウムて沈殿
させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。精
嚢内に貯蔵された体液についても同様に透析し、凍結乾
燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水に
溶解した。動物の***は3回生理食塩水で洗った後免疫
吸収試験に用いた。結果を第1図及び第2図並びに第2
表に示す、なお、相対***運動性は、被検試料について
の値(TX)とl0XNIIsを用いた対照試験におけ
る値(C%)との比(T/C%)を意味する。
遠心分離しく9500g、 30分)、***不動化値を
調べた。ヒト***(RAS) 、ヒト母乳(IIM)及
び正常ヒト血清(NIIS)は硫酸アンモニウムて沈殿
させ、蒸留水に対して十分に透析し、凍結乾燥した。精
嚢内に貯蔵された体液についても同様に透析し、凍結乾
燥した。免疫吸収試験に際して、これらは生理食塩水に
溶解した。動物の***は3回生理食塩水で洗った後免疫
吸収試験に用いた。結果を第1図及び第2図並びに第2
表に示す、なお、相対***運動性は、被検試料について
の値(TX)とl0XNIIsを用いた対照試験におけ
る値(C%)との比(T/C%)を意味する。
第 2 表
116一コC4単一クローン抗体の特性免疫グロブリン
クラス IgM(入)生物学的活性 ***不動化 + (50005lio)***
摩集 + (1:1500希釈)ヒト組織
に対する特異性 ****** 十 *** 十 母乳タンパク質 − 血清タンパク質 − 畢九 − 精巣上体 定かでない 精嚢貯蔵液 十 前立腺 士 肝臓 − 肺臓 − 脳 −赤血球
− 白血球 − !Ii特異性(***に対する反応性) ヒト + ブタ 士 ウシ − ヤギ − ウサギ − ハムスター − ラット − 第1図には、ヒト及び種々の動物の***についての結果
か示されている。図中、Xはヒト******、○はブタ射
精***、はクシ******、口はヤギ******、0はウサ
ギ******、・はハムスターの精巣上体***、マはラッ
トの精巣上体***についての結果を示す。ヒト***はそ
の量に依存して上記ハイブリトーマの産生ずるヒト単一
クローン抗体の***不動化活性を吸収したか、他の動物
の***はブタを除き全く吸収しなかった。ブタの***は
弱い吸収能力(ヒト***の約1/12)を有する。***
不動化活性の低下は、***吸収後の***凝東活性の低下
と平行していた。
クラス IgM(入)生物学的活性 ***不動化 + (50005lio)***
摩集 + (1:1500希釈)ヒト組織
に対する特異性 ****** 十 *** 十 母乳タンパク質 − 血清タンパク質 − 畢九 − 精巣上体 定かでない 精嚢貯蔵液 十 前立腺 士 肝臓 − 肺臓 − 脳 −赤血球
− 白血球 − !Ii特異性(***に対する反応性) ヒト + ブタ 士 ウシ − ヤギ − ウサギ − ハムスター − ラット − 第1図には、ヒト及び種々の動物の***についての結果
か示されている。図中、Xはヒト******、○はブタ射
精***、はクシ******、口はヤギ******、0はウサ
ギ******、・はハムスターの精巣上体***、マはラッ
トの精巣上体***についての結果を示す。ヒト***はそ
の量に依存して上記ハイブリトーマの産生ずるヒト単一
クローン抗体の***不動化活性を吸収したか、他の動物
の***はブタを除き全く吸収しなかった。ブタの***は
弱い吸収能力(ヒト***の約1/12)を有する。***
不動化活性の低下は、***吸収後の***凝東活性の低下
と平行していた。
第2図にはヒトの種々の組織の抽出液及び体液を用いた
同車−クローン抗体の吸収試験の結果か示されている0
図中、Xはヒト***、○は精嚢貯蔵液、△はヒト母乳、
口は正常ヒト血清、・は寧丸抽出液、ムは精巣上体抽出
液、◆は前立腺抽出液についての結果を示す、抗体活性
はllAs 、精嚢貯蔵液及び前立腺抽出液により吸収
されたか他のいずれの器官の抽出液又は体液によっても
吸収されなかった。精巣上体の抽出液による免疫吸収は
材料不足のため定かではない。ヒトリンパ球及び赤血球
も吸収性を示さなかった。
同車−クローン抗体の吸収試験の結果か示されている0
図中、Xはヒト***、○は精嚢貯蔵液、△はヒト母乳、
口は正常ヒト血清、・は寧丸抽出液、ムは精巣上体抽出
液、◆は前立腺抽出液についての結果を示す、抗体活性
はllAs 、精嚢貯蔵液及び前立腺抽出液により吸収
されたか他のいずれの器官の抽出液又は体液によっても
吸収されなかった。精巣上体の抽出液による免疫吸収は
材料不足のため定かではない。ヒトリンパ球及び赤血球
も吸収性を示さなかった。
第1図はヒト及び種々の動物の***によるこの発明の単
一クローン抗体の免疫吸収性を示す図。 第2図はヒトの種々の組織の抽出液及び体液についての
この発明の単一クローン抗体の免疫吸収性を示す図であ
る。
一クローン抗体の免疫吸収性を示す図。 第2図はヒトの種々の組織の抽出液及び体液についての
この発明の単一クローン抗体の免疫吸収性を示す図であ
る。
Claims (2)
- (1)***不動化抗体を保有する不妊婦人のリンパ球と
ミエローマ細胞とを融合させて得られるハイブリドーマ
によって産生され、λ鎖を有するヒト免疫グロブリンM
に属し、***不動化値がSI_5_0として約5000
以上であり、***凝集値が約1:1600希釈以上であ
り、ヒト******、精漿及び精嚢に対して特異的に反応
し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒト睾丸抽出液、ヒト肝臓抽
出液、ヒト脾臓抽出液、ヒト脳抽出液、ヒト赤血球、ヒ
ト白血球とは反応せず、ブタ******とは弱い交叉反応
性を示すがウシ******、ヤギ******、ウサギ***精
子、ハムスター精巣上体***及びラット精巣上体***と
は反応しないヒト***不動化ヒト単一クローン抗体。 - (2)***不動化抗体を保有する不妊婦人のリンパ球と
ミエローマ細胞とを融合させて得られ、λ鎖を有するヒ
ト免疫グロブリンMに属し、***不動化値がSI_5_
0として約5000以上であり、***凝集値が約1:1
600希釈以上であり、ヒト******、精漿及び精嚢分
泌液に対して特異的に反応し、ヒト母乳、ヒト血清、ヒ
ト睾丸抽出液、ヒト肝臓抽出液、ヒト脾臓抽出液、ヒト
脳抽出液、ヒト赤血球、ヒト白血球とは反応せず、ブタ
******とは弱い交叉反応性を示すがウシ******、ヤ
ギ******、ウサギ******、ハムスター精巣上体***
及びラット精巣上体***とは反応しないヒト***不動化
ヒト単一クローン抗体を産生するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61153581A JPS638400A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | ヒト***不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61153581A JPS638400A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | ヒト***不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS638400A true JPS638400A (ja) | 1988-01-14 |
Family
ID=15565616
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61153581A Pending JPS638400A (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | ヒト***不動化ヒト単一クロ−ン抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS638400A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0351045A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-17 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody NUH2 capable of inactivating motility of sperm, antigen defined by said monoclonal antibody and methods of using said monoclonal antibody and antigen |
JP2008089008A (ja) * | 2006-09-29 | 2008-04-17 | Icom Inc | 連結構造、および筐体の脚構造 |
-
1986
- 1986-06-30 JP JP61153581A patent/JPS638400A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0351045A2 (en) * | 1988-07-15 | 1990-01-17 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody NUH2 capable of inactivating motility of sperm, antigen defined by said monoclonal antibody and methods of using said monoclonal antibody and antigen |
EP0351045A3 (en) * | 1988-07-15 | 1990-07-18 | The Biomembrane Institute | Monoclonal antibody nuh2 capable of inactivating motility of sperm, antigen defined by said monoclonal antibody and methods of using said monoclonal antibody and antigen |
JP2008089008A (ja) * | 2006-09-29 | 2008-04-17 | Icom Inc | 連結構造、および筐体の脚構造 |
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