JP2651249B2

JP2651249B2 - ***の受精能試験具および試験法

Info

Publication number: JP2651249B2
Application number: JP1251190A
Authority: JP
Inventors: 勝岡部; 務三村
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1989-09-27
Filing date: 1989-09-27
Publication date: 1997-09-10
Anticipated expiration: 2012-09-10
Also published as: JPH03111760A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、ひとの***の受精能試験に用いる試験用
顆粒（ビーズ）、それを含む試験用キットおよび受精能
試験法に関するものである。

〔従来の技術〕

ほ乳類の***は、***された状態では受精能をもた
ず、雌性の生殖路内において先体反応を受けて生理的機
能変化をとげ、受精能を獲得するに至ることが知られて
いる。先体反応に際しては、先体部分の細胞膜と外先体
膜との間に融合がおこり、先体内酵素を放出するととも
に、両膜は***からはなれ、***は内先体膜を露出す
る。また受精能は、***された***をインキュベーショ
ンすることによっても獲得されることが判明している。

従来、例えば不妊の診断または治療を目的とした、ひ
との***の受精能測定法としては、古くから行なわれて
いる方法として、***量、***濃度、***の運動性等を
測定する方法があるが、これは受精能そのものを観察す
る方法ではないから、全く不正確なものである。また最
近の方法として、インキュベーションした***がハムス
ター卵子（ひと***と融合する能力をもつ）と融合する
かどうかを調べる方法（ハムスターテスト）があるが、
これは操作が繁雑であり、テストを行なう機関ごとに異
なった値が出るなど再現性が良好でないという、欠点が
ある。そのほか、種々の染色法を組み合わせる方法（ト
リプルステイン）もあるが、これも操作が繁雑であり、
また結果の信頼性が充分でない。

〔発明が解決しようとする課題〕

それ故、簡便かつ再現性があり、理論的根拠を備え
た、ひとの***の受精能測定法の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

この発明者は、ひとの***の受精能測定法を改善する
ために、抗原抗体反応を利用することに着目した。そし
て、研究を重ねた結果、受精能を獲得したひと***に現
われる抗原性部位に特異性なポリクローナル抗体および
モノクローナル抗体の製造に成功し、またその抗体を標
識抗体法（蛍光または酵素抗体法）に用いて受精能をも
つ***を特異的に染色することに成功した（特願平１−
63300号）が、さらに上記抗体を結合した顆粒を開発
し、それによって男性不妊の診断を容易かつ迅速に行な
うことを可能にしたのである。

〔発明の構成〕

すなわち、この発明は、（１）固体顆粒の表面に、ひと***先体（膜を含む）上
の抗原性部位に対して特異性を有する抗体を結合してな
る、***の受精能試験用顆粒、（２）（イ）上記１項記載の試験用顆粒（ロ）磁石（ハ）***インキュベーション培地を含む、***の受精能試験用キット、（３）上記２項において、（イ）の試験用顆粒の代わり
に、ひと***先体（膜を含む）上の抗原性部位に対して
特異性を有する抗体および上記抗体を表面に結合し得る
固体顆粒を含む、***の受精能試験用キット、および（４）上記１項記載の試験用顆粒と被検***を接触さ
せ、顆粒に結合した先体上の抗原性部位が露出した***
を観察することを特徴とする、***の受精能試験法を提供するものである。

上記抗体は、ひと***先体（膜を含む）上の抗原性部
位で免疫した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細菌と永
久増殖性を有する細胞との融合によるハイブリドーマを
培養し、培養物からひと***先体（膜を含む）上の抗原
性部位に対して特異性を有する抗体を分離採取すること
によって製造される（特願平１−63300号）。

以下、上記の発明を詳細に説明する。

（抗体の製造） 1.免疫この発明で用いる抗体を製造するには、まずひと***
先体（膜を含む）上の抗原性部位で哺乳類の動物を免疫
する。先体が露出したひと***は、例えば***された精
子を、例えばひと血清アルブミンを含有するメディウム
で前培養するか、デオキシコール酸ナトリウムのような
陰イオン界面活性剤、または陽イオン、非イオン、両性
等の界面活性剤で処理するか、A23187のようなイオノフ
オアで処理することによって得られる。免疫は例えば次
のように行なう。***を集め、マウス、ラット等の哺乳
類動物に免疫する。哺乳類動物は、細胞融合する際の相
手の永久増殖性細胞と同系統の動物の方が望ましい。動
物の週齢は、例えばマウスでは５〜10週齢がよい。性は
雌雄どちらでもよい。免疫に用いるひと***の数は、例
えばマウスの場合１匹あたり５×10⁶〜２×10⁷個が好ま
しい。***は例えばPBSに懸濁させるか、またはフロイ
ントコンプリートアジュバントと1:1の比で混合しエマ
ルジョンにして動物の腹腔内、静脈内、皮下等に投与す
るのが好ましい。この免疫操作を１〜３週間隔で１〜５
回行なう。最終免疫は、例えば***をPBSに懸濁させ、
動物の静脈内あるいは腹腔内に投与して行なう。このよ
うにして免疫した動物の体液または抗体産生細胞から
は、ポリクローナル抗体が得られる。動物の抗体価を測
定し、充分上昇したとき抗体または産生細胞を採取す
る。

2.細胞融合上記のようにしてひと***で免疫した動物から抗体産
生細胞をとり出す。抗体産生細胞は、脾臓、リンパ節、
末梢血等から得られるが、脾臓が好ましい。例えば、脾
臓を最終免疫の２〜５日後に無菌的に摘出し、ダルベッ
コーMEM培地中ではさみによって細切し脾臓細胞を浮遊
させた後、遠心分離することにより脾臓細胞を集めて用
いる。

融合の相手の永久増殖性細胞としては、永久増殖性を
有する任意の細胞を用いることができるが、繁用される
のは骨髄腫細胞である。永久増殖性細胞は抗体産生細胞
と同種の動物由来のものが好ましい。例えばマウスの場
合、P3U1P3X63−Ag8.U1（P3U1）,P3/NS1/1−Ag4−１（N
S−１）,SP2/0−Ag14（SP2）,P3X63Ag8（X63）,P3X63−
Ag8.653（653）などが用いられる。また、永久増殖性細
胞としては、８−アザグアニン耐性細胞株、ヒポキサン
チングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損細
胞株のような、選別の際のマーカーとなり得る特性を有
するものが好ましい。これらの細胞株は、例えばアメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、藤沢薬品
工業（株）または大日本製薬（株）より入手可能であ
る。融合に際しては、これらの永久増殖性細胞のいずれ
かを増殖培地中で培養し、融合の前に例えばダルベッコ
ーMEM培地で洗浄後遠心分離により集める。

融合は、例えば次のように行なう。抗体産生細胞（例
えば脾臓細胞）と永久増殖性細胞（例えば骨髄腫細胞）
を細胞数比で２〜10:1になるように混合し、37℃に保ち
つつポリエチレングリコール（例えば平均分子量1300〜
7500、20〜40％）等の融合促進剤を徐々に加えるか、ま
たは電気パルス（例えば約1000V/cmのような高電圧の直
流）を短時間作用させて細胞融合を起させる。培養液を
加え融合促進剤を希釈して融合を停止させ、遠心分離に
より細胞を分離する。次に、例えば細胞をヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジンを増殖培地に加えたHAT
培地中に懸濁させ、96ウェルマイクロテストプレートに
200μl/ウェルずつ分注し、37℃、CO₂5％、湿度95％のC
O₂インキュベータ中（以下、CO₂インキュベータ中の培
養条件は全て上記と同一とする）で培養する。培養液は
２日間隔で半量ずつ新しいHAT培地と交換する。約１週
間培養後、交換する培地を増殖培地にヒポキサンチン及
びチミジンを添加したHT培地に変える。

3.ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニング次に、HT培地中で数日間培養し、ハイブリドーマのコ
ロニーがマイクロテストプレートのウェルの半分程度ま
で広がってきた時点でどのウェルのハイブリドーマがひ
と***に対するモノクローナル抗体を産生しているかを
スクリーニングする。スクリーニングは、例えば次のよ
うに行なう。ハイブリドーマが増殖して来ているウェル
の培養上清を一部とり、それがひと***と反応するかど
うかを例えば酵素抗体法あるいは蛍光抗体法等の公知の
標識抗体法で調べる。

次に、例えば限界希釈法や軟寒天法等の公知の技術を
用いて、ひと***と反応するモノクローナル抗体を産生
しているハイブリドーマをクローニングして単一のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマの集団を選択
する。クローニング及びスクリーニングは２回以上繰り
返すことが望ましい。

4.モノクローナル抗体の製造上記のようにして得られたハイブリドーマをインビト
ロ（培養器具内または栄養培地中）及びインビボ（生体
内または動物組織中）で培養することによりモノクロー
ナル抗体を産生させる。培養は、例えば次のように行な
う。インビトロでの培養では、増殖培地の様な適当な培
地を用い、例えばCO₂インキュベータ中でハイブリドー
マを培養する。ハイブリドーマが増殖限度まで増殖した
時点で培養液を採取し、遠心分離のような固液分離手段
でハイブリドーマと培養上清を分離する。培養上清中の
モノクローナル抗体は目的によっては精製せずに用いる
ことも可能であるが、分離する場合には例えば硫酸アン
モニウムで塩析し、0.02Mりん酸緩衝液（pH7.2）で透析
後、ジエチルアミノエチルセルロースカラム等に通して
精製する。

培養上清から分離したハイブリドーマは、例えばジメ
チルスルホキシド（５〜10％v/v）及び牛脂児血清（10
〜20％v/v）を添加したダルベッコーMEMの様な適当な培
地中に１〜10×10⁶個/mlの細胞密度で懸濁させ、適当な
アンプルに入れて徐々に−80℃以下に凍結させることに
より、生きたままの状態で長期保存することが可能であ
る。特に、例えば液体窒素等の超低温下ではハイブリド
ーマを半永久的に保存することができる。

ハイブリドーマをインビボで培養する場合には、任意
の動物にハイブリドーマを移植するが、細胞融合に用い
た脾臓細胞を採取した動物と同種のものを使用するのが
好ましい。例えばBALB/cマウスの場合には、ハイブリド
ーマの移植の１〜３週間前に2,6,10,14−テトラメチル
ペンタデカン（プリスタン）0.5mlを腹腔内に注射して
おき、マウス１匹あたり２〜10×10⁶個のハイブリドー
マを腹腔内に注射する。１〜２週間後にマウスの腹腔内
にモノクローナル抗体を高濃度に含んだ腹水が貯留し腹
部が肥大してくるので、腹水を採取し培養上清の場合と
同様に精製する。

5.モノクローナル抗体の特性上記のようにして得られたモノクローナル抗体の特性
の検討は、例えば以下のようにして行なう。まず、モノ
クローナル抗体がひと***のどの部位と反応するかを調
べるために、公知の標識抗体法、例えば蛍光抗体法また
は酵素抗体法を行なう。

次にモノクローナル抗体の特異性の検討を、ひと精し
ょう、マウス***等との反応性を調べる公知の標識免疫
測定法（例えば酵素免疫測定法）によって行う。

（試験用顆粒の製造）この発明で使用する試験用顆粒を製造するには、適当
な顆粒、例えばクロマト用ゲルに、物理的または化学的
にこの発明で用いる抗体を結合させるが、好ましいのは
顆粒にあらかじめこの発明で用いる抗体に対して特異性
を有する抗体（以下、２次抗体という）、プロテイン
Ａ、プロテインＧ等を化学的に結合させておき、この第
２抗体とこの発明で用いる抗体との特異的結合により、
この発明で用いる抗体を結合させる方法である。

顆粒としては、ガラス、アガロース、セファロース、
アガロース充填多孔性けいそう土、親水性共重合アクリ
ルゲル、ポリスチレン等からなるビーズが用いられる
が、好ましいのは可磁化物質（例えばFe₂O₃）を例えば
コア内に含ませることにより超常磁性をもたせたもので
ある。顆粒の形状は球形、不定破砕形等任意であるが、
球形が好ましい。粒径は特に制限されず、例えば数〜数
十〜数百マイクロメートルであり得る。

上記のような顆粒に２次抗体、プロテインＡまたはプ
ロテインＧを化学的に結合させるには、顆粒を活性化し
てから結合させるのが好ましい。顆粒の活性化は、この
種の顆粒に蛋白質を結合させる際の任意の活性化法で行
なうことができる。このような活性化法には、トシルク
ロリド法、ブロムシアン法、ブロムアセチル化法、グル
タールアルデヒド法等等がある。トシル活性化顆粒の中
には市販されているものもある。このような活性化、お
よび活性化した顆粒と２次抗体、プロテインＡ、プロテ
インＧ等の蛋白質との結合は、常法によって行なうこと
ができる。

また、既に２次抗体、プロテインＡ、プロテインＧ等
を結合した顆粒が市販されている。このような顆粒とし
ては、日本ダイナル（株）輸入、（株）ベリタス販売の
ダイナビーズＭ−450、Ｍ−280のそれぞれひつじ抗マウ
スIgGコートタイプ、やぎ抗マウスIgGコートタイプ、ひ
つじ抗ラットIgGコートタイプ、ひつじ抗家兎IgGコート
タイプ、ポリサイエンス・インコーポレイテッドのやぎ
抗マウスIgG（Ｈ＆Ｌ）カルボキシレートビーズ、やぎ
抗家兎IgG（Ｈ＆Ｌ）カルボキシレートビーズ、プロテ
インＡカルボキシレートビーズ、やぎ抗家兎IgG（Ｈ＆
Ｌ）ミクロマグネットパーテイクル、プロテインＡミク
ロマグネットパーテイクル、ひつじ抗マウスIgG（Ｈ＆
Ｌ）ミクロマグネットパーテイクルが含まれる。

上記のような顆粒にこの発明で用いる抗体を結合させ
るには、例えば衝撃液のような適当な媒質中でけんだく
した顆粒を好ましく非特異的吸着を除くため蛋白質溶液
て処理後、抗体を含む腹水または精製した抗体の溶液を
混合する。

（試験法）この発明の試験法を実施するには、被験者から***を
採取し、***けんだく液とする。採取直後および24時間
インキュベーション後に、上記のように製造した試験用
顆粒を加え、10−30分間インキュベーションし、顆粒を
分離し、洗浄し、例えば顕微鏡のような手段により顆粒
100個当りの結合***数を測定する。受精能を有する精
子は先体上の抗原性部位が露出しているので、顆粒上の
抗体に1:1、1:2、2:1、1:3、3:1、2:3、3:2等の比率で
結合する。なお、結合は外れ易いので、顆粒の分離、洗
浄に遠心分離を行なうことは避けるべきである。結合量
が、例えば採取直後で５以下、24時間後で25以上であれ
ば、受精能は良好と判断される。

（キット）上記の試験を実施するには、実施に必要な材料をキッ
トにしておくのが便利である。このようなキットは、前
述した試験用顆粒、磁石および***インキュベーション
培地を含み得る。インキュベーション培地は、無機塩、
有機酸塩、糖、血清アルブミン、抗生物質、指示薬等を
含み得る。そのほか、キットには、（ニ）試験管、遠心
管、その他類似のガラス容器、（ホ）ピペットまたは類
似の吸引器具、（ヘ）顕微鏡等を含ませることができ
る。なお、上記試験用顆粒の代りに、その製造原料とな
る固体顆粒と抗体を組合わせることができる。

［効果］この発明によると、抗体を固体顆粒に結合させて試験
用顆粒とし、これに***を結合させて、結合した***を
計数することにより、受精能を評価できるようにしたの
で、放射能、蛍光等の繁雑な測定を必要とせず、短時間
で容易・確実に受精能の試験ができる。また、顕微鏡下
に直接***を計数できるので、結果の信頼性が高い。し
たがって、この発明は、不妊の診断の迅速化および客観
化に大きく寄与するものである。

〔実施例〕

以下、この発明を、参考例および実施例によりさらに
詳細に説明する。

参考例１（抗ヒト***モノクローン抗体の作成） ***は一般に、卵子と結合する前に先体反応と呼ばれ
る反応を起こして内部の内先体膜（以下IAMと略す）を
露出させる。

このIAMに特異的に存在する抗原を検出できる抗体な
らば、***の受精能の発現に伴って***表面と反応し得
ることになる。

（実験方法）ひと***懸濁液の調製実験に使用したメディウムは、上口らの方法〔上口勇
次郎他：日本不妊学会雑誌，30,57（1985）〕に従い、
0.3％ひと血清アルブミン（以下HSAと略す。シグマ社、
Fr.V）を添加した変法ビッガース・ホワイトイン・ホワ
イテインガム培地（以下ｍ−BWWと略す）を用いた。

成人男子より用手法にて採取した***を37℃、５％CO
₂含有空気で30〜60分間液化させた。この各0.5mlを小試
験管にとり、この上にｍ−BWW2mlを重層した。***との
接触面を増すため、小試験管を約30゜に傾け、パラフィ
ルムで蓋をして37℃、５％CO₂含有空気中で60分間***
の遊出を待った。上清をマイクロピペッター（ギルソン
社、ピペットマンｐ−1000）で吸い取り、***をｍ−BW
Wで２回洗浄した。得られた***にｍ−BWW（HSA濃度3.5
％を1ml加えて***懸濁液とした。

得られた***はA23187処理をほどこして受精能獲得、
またはIAMを露出させる処理を行なった。

A23187による処理 A23187により処理を施した***は先体反応を起こす割
合が高くなることが電顕的に観察されている。そこで上
口らの方法〔上口勇次郎他：日本不妊学会雑誌，30,57
（1985）〕に従い、メディウム中に最終濃度10μＭとな
るようにA23187（シグマ社、遊離酸）を加え、10分間反
応させた後ｍ−BWWで２回洗浄して免疫に使用した。

マウスへの免疫上記処理を施したひと***をそれぞれ１回当り１×10
⁷個用意し、C57BL/6マウスに対して免疫を行なった。免
疫は第０日，第21日，第28日行ない、以降抗体価が上昇
するまで２週間おきに免疫を行なった。１回目はフロイ
ント完全アジュバント、２回目はフロイント不完全アジ
ュバントとエマルジョンを作成してから、３回目以降は
PBSで懸濁したままで投与した。２回目以降は投与後３
日目に眼底採血により血清を採取した抗体価を間接蛍光
抗体法（後述）により測定した。十分抗体価が上昇した
ところで最終投与後３日目に脾臓を摘出し、融合に使用
した。

細胞融合とクローニング融合、クローニングは定法に従った。

得られた脾細胞をポリエチレングリコール4000（半井
特級）存在下でP3U1マウスミエローマ細胞株（藤沢薬品
工業（株））と融合させてハイブリドーマを作成した。
この中からひと***と反応する抗体を産生するものをス
クリーニングし、陽性株を限界希釈法によりクローニン
グして、モノクローナル抗体産生株として樹立した。こ
のモノクローナル抗体産生株であるハイブリドーマMH61
は、工業技術院微生物工業技術研究所に国際寄託受託番
号FERM BP−2257号として寄託されている。

間接蛍光抗体法による染色抗体のスクリーニングや抗体価の測定には間接蛍光抗
体法を用いた。

１×10⁶***/mlの***懸濁液50μに対し培養上清又
は抗血清のPBSによる20倍希釈液50μを加え、室温で
２時間反応させた。PBSで２回洗浄後、第２抗体として
５％うし新生児血清（以下NBCSと略す）を含むPBSで125
倍に希釈したFITC標識やぎ抗マウスIg（Ａ＋Ｍ＋Ｇ）
（カッペル社）10μを加え室温で１時間反応させた。
その後PBSで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。

抗体産生細胞の増殖（インビボ）対数増殖期にあるハイブリドーマを集めこれをプリス
タン（シグマ社、ｐ−1403）を予め（10〜20日前）0.5m
l投与してあるCBFl（Balb/c×C57BL/6）雄性マウスに、
１匹当り１−２×10⁷細胞投与する。細胞は約２週間を
かけて腹水型癌細胞として増殖してくるので、体重が40
g以上となったところで腹水を採取し、−80℃で凍結し
た後液体窒素中に保存した。

参考例２（抗ヒト***モノクローナル抗体の認識する抗
原の存在部位）（１）交叉反応射出されたヒト***には精漿中の成分が強く結合して
おり、通常の洗浄だけでは取り除くことができない。こ
れらの成分は抗原性が強く、***を免疫した場合には精
漿に対する抗体が出来てしまう可能性が強い。この発明
が目的とする抗体は***の受精能獲得に伴う変化が検出
できるものなので精漿とは反応しないことが望ましい。

（実験方法）ヒト精漿の調製成人男子より得た***を37℃、５％CO₂含有空気中で3
0〜60分間静置して液化させる。この***にｍ−BWW溶液
を当量加え、1500×ｇで５分間遠心し***を取り除く。
上清をもう一度遠心して完全に***を取り除いたものを
精漿として実験に用いた。

精漿と抗体との反応性の検討精漿との反応性はBLISA（固相酵素免疫測定法）法を
用いて測定した。陽性コントロールとしてはひと***を
プレート上にグルタールアルデヒド（和光純薬）で固定
したものを、陰性コントロールとしてはｍ−BWW溶液を
用いた。

抗原を含む溶液50μをELISAプレート（ファルコ
ン、3911）上にのせ、37℃で一晩放置して乾燥させ、抗
原を吸着させた。0.05％ツイーン20（半井一級）を含む
トリス緩衝液食塩水（pH7.4以下ツイーン−TBSと略す）
で３回洗浄後５％ミルク（森永スキムミルク）を含むPB
S200μをのせ、１時間室温で放置してブロックを行な
った。

ツイーン−TBSで３回洗浄後、第一抗体として各抗体
腹水１％BSA−PBSで1000倍希釈したものを50μ加えて
２時間反応させ、洗浄後１％BSA−PBSで1000倍希釈した
ペルオキダーゼ標識やぎ抗マウスIg（Ａ＋Ｍ＋Ｇ）（カ
ッペル）50μを加え、室温で２時間反応させた。洗浄
後、基質を用いて発色させた。基質溶液としては、ｏ−
フェニレンジアミン（半井一級）を、0.1％、H₂O₂を1.2
％含む0.1Mくえん酸緩衝液（pH4.5）を100μプレート
に加えて遮光しながら30分間反応させた。その後12.5％
H₂SO₄50μで反応を停止させ、450nmの吸光度を測定し
た。

ひと精漿に対してMH61の抗体は反応性を示さなかっ
た。

（２）人工的な受精能の獲得に伴う***の抗体との反応
性の変化抗体によって***の受精能を測定するためには、抗体
が受精能発現に伴って現れる抗原を認識することが必要
である。受精能を獲得した***であることは、ひと卵子
内にその***が侵入しない限り完全に証明されないが、
グリーンらは、電顕的観察ではあるが、イオノフォアA2
3187に処理した***に先体反応を起こしたものが増大す
ることを報告している〔Green et al.:Journal of Cell
Science,32,321（1978）〕。そこで、新鮮な***とA23
187処理した***との間の反応性に差を見いだすことが
出来るか否かを検討した。

（実験方法）ひと***懸濁液の調製参考例１の方法に従った。A23187をこの懸濁液中に最
終濃度10μＭとなるように加え10分間反応させた。その
後500×ｇで遠心分離してA23187を除き、ｍ−BWWで２回
洗浄したものをA23187***とした。

ひと***の反応様式の検討間接蛍光抗体法により***を染色した。この***を蛍
光顕微鏡で観察し、***の染色パターンと、その存在割
合を計測した。

（実験結果）計測結果を第１表に示す。

MH61抗体は、新鮮な***とはほとんど反応せず、***
をA23187で処理した場合に反応を示した。MH61抗体は洗
浄***とはほとんど反応しないが、A23187で処理した精
子とは高率で反応した。また、その結合部位はアクロソ
ーム部分や頭部に限局されていた。このような結果は、
マウス***において報告されている受精能獲得***に特
異的なOBF13抗原とよく類似していた。もしも、MH61に
より認識される抗原が、受精に関与する物質であれば、
抗体の添加によって受精は阻害されるはずである。そこ
で、MH61抗体の***機能に及ぼす影響を検討した。

参考例３（各モノクローナル抗体の***機能に及ぼす影
響）抗体のあるものは、強い***凝集活性を持つ、これに
より多くの***が架橋されると見かけの***濃度が低下
し、結果として受精が阻害される。

（実験方法）ひと***懸濁液の調製参考例１の方法に従った。

採取した***は10μＭのA23187と10分間反応させ、実
験に使用した。

抗体の***凝集活性の観察活性をマイクロタイター法により、測定した。

１％BSA（シグマ社、Fr.V）を含むPBS（BSA−PBS）で
500倍希釈した抗体腹水を、血球凝集反応用プレートの
小孔でBSA−PBSで２倍連続希釈を行なった。それぞれの
抗体希釈液50μに50μの***懸濁液（１×10⁶***/
ml）を加えて２倍希釈し、37℃、５％CO₂含有空気中で
１時間反応させた。小孔中の***について位相差顕微鏡
（x160）で凝集性を観察した。

なお、陰性コントロールとしてP3U1マウスミエローマ
細胞株の腹水を同様に希釈して用いた。

（実験結果）抗体の***凝集活性を第２表に示す。

陽性コントロールとして用いた抗ひと***抗体YPには
強い***凝集活性が認められたが、陰性コントロールと
して用いたP3U1やMH61には全く***凝集活性は認められ
なかった。

実施例１（試験用顆粒の製造）ビーズへのIgG共有結合法（１）ビーズの活性化法（ｐ−トルエンスルホニルク
ロリドによるトシル活性化）１）無希釈のダイナビーズＭ−450アンコーテッド（30m
g/ml）適量をドライアセトンに加え、連続洗浄を行なう
（210〜1000mgのビーズの場合は、容量を7.0mlす
る。）。

ステップ1:水／アセトン＝7/3 10ml ステップ2:水／アセトン＝6/4 10ml ステップ3:水／アセトン＝2/8 10ml ステップ４−6:水／アセトン＝0/10 10ml ステップ7:アセトンに再懸濁各ステップごと磁石でビーズを集め（１分間）、上清
を捨てる。

試験管に次の水／アセトン混液を加え、５分間懸濁す
る。

２）0.75ミリモルのピリジンと0.3ミリモルのｐ−トル
エンスルホニルクロリドを無希釈のダイナビーズＭ−45
0アンコーテッド1ml当たりに加える。（1000mgを用いる
場合は、2mlのピリジンと2gp−トルエンスルホニルクロ
リド/8mlアセトンを使用。）操作はドラフト内で行な
う。

３）撹拌しながら室温で20時間インキュベーションす
る。

４）磁石でビーズを集めアセトンに再懸濁する。ビーズ
を集め、アセトンで３回洗浄する。

５）１）のステップ１〜３を通り（３→２→１）水に戻
す。

６）ビーズを集め、上清を捨て、1mM HCl 10mlに再懸濁
する。

以上のようにして調製された活性ビーズは、1mM HCl
中４℃保存で12ケ月間安定である。

（注）以上の方法で活性化してある製品（14003/14004
ダイナビーズＭ−450トシルアクテイベイテッド）が市
販されている。

（２）ビーズへの共有結合法１）活性ビーズの1mM HCl懸濁液を無菌蒸留水で１回洗
浄する。

２）必要なら簡単に撹拌して、活性ビーズの均一な懸濁
液にする。

３）精製済抗体を0.2Mほう酸緩衝液（pH9.5）に150μg/
mlの濃度に溶かす。

４）等容量の活性ビーズ懸濁液を上記IgG溶液に加える
（抗体／ビーズ＝75μg/15mg）。

５）ゆっくり撹拌しながら22℃で24時間インキュベーシ
ョンする。

６）磁石でビーズを集め、磁石を付けたまま上清を捨て
る。

７）以下の方法で洗浄する。

0.1M PBS 5ml、10分間。

0.1％ツイーン20含有1Mエタノールアミン−HCl（pH
9.5）5ml、２時間（ツイーン20は使用直前に緩衝液に加
える）。

0.1M NaCl、0.1％BSA、0.01％メチルチオレート、
0.1％ツイーン20含有0.05Mトリス（pH7.5）5ml、12時
間。

ツイーン20のないの緩衝液5ml、２時間。

８）磁石でビーズを集める。上清を捨て、PBS/BSAに約
４×10⁸ビーズ/ml（30mg/ml）が、希望の濃度に懸濁す
る。得られたIgG標識ビーズは４℃保存で少なくとも６
ケ月間は安定である。保存緩衝液は0.1M NaCl、0.1％BS
A含有0.05Mトリス。

モノクローナル抗体精製法腹水原液に飽和硫安を加えて最終濃度20％硫安溶液と
し、１時間静置する（４℃）。10000g、15分間、４℃で
遠心する。沈澱を捨て、上清に飽和硫安を加えて最終濃
度40％硫安溶液とする（４℃）。１時間静置する。1000
0g、15分間、４℃で遠心する。上清を捨て、沈澱を腹水
原液の２倍容量のプロテインＡカラム用吸着緩衝液（PI
ERCE社）に溶解させる。10000g、15分間、４℃で遠心す
る。上清をとり、プロテインＡアフイニテイクロマトグ
ラフィにかける。腹水原液1ml当たり約３〜4mgのIgGが
とれる。溶出液は脱塩（G25カラムを通した後、透析す
る）後凍結乾燥させる。こうして、精製をモノクローナ
ル抗体を得る。

脱脂粉乳によるビーズの前処理法ダイナビーズＭ−450シープ・アンテイマウスIgG₁（F
c）の４×10⁸/ml懸濁液を使用前によく懸濁させる。100
0gで５分間遠心する。上清を捨て、同量の５％脱脂粉乳
入PBS液（PBSに最終濃度５％となるように脱脂粉乳を加
え、60℃で１時間加温溶解後−20℃で凍結保存する）
（約2ml）に懸濁させ、37℃で１時間振盪加温する。100
0gで５分間遠心し、PBSで３回洗浄後、PBSで約４×10⁸/
mlに調整する。

試験用ビーズの調製前処理したビーズ50μをとり、同量の抗体MH61（腹
水原液）を加える。

抗体（腹水原液）を加える。37℃で１時間振盪しなが
らビーズに抗体を結合させた後に、これにPBS（−）を1
ml加えて1000g、５分間、４℃で遠心する。沈澱をPBS
（−）でさらに２回洗浄する。

このようにして得られたMH61−ビーズを４×10⁸/mlと
なるように５％うし新生児血清を含むPBS（−）に懸濁
する。使用前に３×10⁶/mlにｍ−BWWに希釈する。ビー
ズは４℃で保存するが、なるべく１週間以内に使い切る
ようにする。

実施例２（試験法）（用意するもの）滅菌管（ａ）（50ml、住友ベークライト）（***を入れ
るため）ｍ−BWW（別記）滅菌管（ｂ）（15ml、住友ベークライト）***量を量る
ため）ガラス試験管（ｃ）（φ12.5mm、10ml）（***の遊出
用）ガラス遠心管（ｄ）（10ml）（***の遠心濃縮用）ガラス試験管（ｅ）（10ml）（ビーズテスト用）試験管立てピペットマン（ｐ−1000、Ｐ−200、Ｐ−20）遠心器（1000gの出るもの）顕微鏡（×400、観察用） MH61ビーズ（３×10⁶ml、ｍ−BWW中）抗生物質はペニシリンＧカリウム5000IU/mlおよび硫
酸ストレプトマイシン5mg/ml。

乳酸ナトリウムはDL、60％シロップ中。

ひと血清アルブミンはフラクションＶ（シグマ社）。

１〜10までを加えた溶液をストック液として40〜50ml
ずつ分注し、−20℃にて凍結保存しておく。実験前日に
必要量を室温に戻し、NaHCO₃、HSAを加え、濾過滅菌後3
7℃、５％CO₂で一晩平衡化する。

（***懸濁液の調製）健常成人男子より、用手法により***を予め滅菌した
チューブに集める。***は***、前立腺液、精嚢腺液等
の混合したものであり、***直後はこれらが均一になっ
ていない。そこで、37℃で30〜60分間放置しておく（液
化）。

滅菌済試験管（ｃ）４本（***量による異なる）を30
℃に寝かせ、ｍ−BWW（0.3％HSA）2mlを入れる。次に、
この下層に液化の終わった***を0.5mlずつゆっくり注
入する。アルミキャップをして37℃、５％CO₂で60分間
静置する。運動性の良い***がｍ−BWW中に遊出してく
るので上清約1.5mlずつをゆっくり吸い取り遠心管
（ｄ）に移す。500g、５分間室温で遠心し上清を吸い、
沈澱した***をｍ−BWW（0.3％HSA）に懸濁して遠心す
る。この操作をもう１度繰り返す。２回目の沈澱にｍ−
BWW（3.5％HSA）1mlを加え、懸濁する。そのうちの10μ
を取り、トーマの血球盤にのせ***数を計測する。精
子数に応じてもう１度遠心し、沈澱にｍ−BWW（3.5％HS
A）を加え、最終濃度４×10⁶/mlになるように***懸濁
液を調製する。このうちの一部を０時間ビーズテストに
用いる。

（***の受精能獲得）ｍ−BWW（3.5％HSA）中に４×10⁶/mlに調製したヒト
***を37℃、５％CO₂で前培養を行ない、受精能を獲得
させる。

受精能獲得時間には個人差や溶液による差などがあ
り、一概に決定することはできないが、殆どのひとは24
時間後には受精能を獲得するので24時間後に24時間ビー
ズテストを行なう。

（試験）ビーズとインキュベーションする***は４×10⁶/mlが
望ましい（あまり薄いとビーズとの反応確率が低くな
る）。この***懸濁液に３×10⁶/mlのビーズ10μを加
え、37℃、５％CO₂で１時間静置しておく。振盪はビー
ズが試験管壁に付着し回収できなくなるので避ける。

軽く懸濁した反応液に強めの磁石（希土類磁石）を近
づける。１〜２分でビーズが集まるので磁石を保ったま
ま上清をピペットマンで除く（この際にピペッティング
すると***がビーズからはずれるので注意）。500μ
のｍ−BWW（0.3％HSA）を加え（磁石は保ったまま）再
び上清を捨てる。もう一度繰り返し、回収したビーズを
（ピペッティングしないように）スライドグラスにの
せ、鏡検する。ビーズを100個数え、そのなかの***付
着数をビーズテスト値とする。

（結果）次のような結果が得られた。

［０時間］ビーズテスト値^※ ***提供者Ａ１Ｂ０Ｃ４Ｄ３［24時間］ビーズテスト値^※ ***提供者Ａ 49 Ｂ 55 Ｃ 39 Ｄ 68 ※ビーズ100個を数えた時に結合していた***の数

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献特表平４−505008（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．，７（４），283−296（1984）；10（６）, 731−739（1989) Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，32 （５），1157−1162（1985)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】固体顆粒の表面に、先体反応前のひと***
とは反応せず、先体反応後にひと***の頭部全体に露出
するひと***先体（膜を含む）上の抗原性部位に対して
反応する抗体を結合してなる、***の受精能試験用顆
粒。
【請求項２】（イ）請求項１記載の試験用顆粒（ロ）磁石（ハ）***インキュベーション培地を含む、***の受精能試験用キット。
【請求項３】請求項２において、（イ）の試験用顆粒の
代りに、先体反応前のひと***とは反応せず、先体反応
後にひと***の頭部全体に露出するひと***先体（膜を
含む）上の抗原性部位に対して反応する抗体および上記
抗体を表面に結合し得る固体顆粒を含む、***の受精能
試験用キット。
【請求項４】請求項１記載の試験用顆粒と被検***を接
触させ、顆粒に結合した先体上の抗原性部位が露出した
***を観察することを特徴とする、***の受精能試験
法。