JPS6379896A - ポリヌクレオチドの合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、ポリヌクレオチド合成装置を用いたホスファ
イト法によるポリヌクレオチドの合成方法に関し、さら
に詳しくは、長鎖のボリヌクレＡヂドを収率よくしかも
短時間で得ることができるような、ポリヌクレオチド合
成装置を用いたポリヌクレオチドの合成法に閉覆る。

発明の技術的背碩ならびにその問題点 近年に至ってｊｍ伝子工学に代表される分子生物学か急
速な発展をとげ、これに伴ってデオギシリ小核酸（ＤＮ
Ａ）必るいはり小核酸（ＲＮＡ）を構成するポリヌクレ
オチドを合成しようとする試みが盛んに行なわれている
。

ポリヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシンあ
るいはチミンの４種の核酸塩基とデオキシリボースとが
結合してなるデオギシリボヌクレオシドにリン酸が結合
したヌクレオチドか、複数１固連なつｌこ＋Ｖ＋造をイ
ｊしており、このポリヌクレオチドを合成するには、リ
ン酸トリエステル法か従来採用されてさた。ところかこ
のリン酸トリエスチル法では５圃のリン酸が用いられる
ため、活性が低いという問題点があった。

このため、ポリスクレオチドを合成重るに際して、反応
活姓に富む３価の亜リン酸トリエステルを用いるホスフ
ァイト法が広く採用されるようになってきた。このよう
なホスファイト法によりポリヌクレオチドを合成Ｊるに
は、通常、次のような４つの工程（ａ）〜（ｄ＞か必要
である。

（ａ）担持体に結合されたヌクレオシドの５−位の保護
基であるトリチル基などを酸によって切断し、ヌクレオ
−シトの５′位を水酸基に変える工程（脱保＾ρ基工程
）。

（ｂ）次いでこの水ＨＥｆ＝に、テトラゾールなどによ
って活ｉ生化されたＮ、Ｎ−ジイソプロピルホスホアミ
ダイトなとの、アデニン、グアニン、シトシン、必るい
はチミンのいずれかの塩基が結合したアミダイトを反応
さけてホスファイトを形成さける工程（カップリング工
程）。

（Ｃ）カップリング工程で得られたボスファイトをヨ１
り索、テ１〜ラヒドロフラン、２，６−ルチジン、水な
どからなる試薬を用いて酸化りる工程（酸化工程）。

（ｄ）カップリング工程で反応しなかったヌクレオチド
の５′位水酸基を、無水酢酸およびジメチルアミノピリ
ジンなどからなる二％ｍ　＜ｙツピング液を用いて保古
する工程（キャッピング工程）。

上記の４つの工程は、脱保６基工程、カップリング工程
、酸化工程、キャッピング工程の順序で行なってもよい
か、場合によっては、ロ；２保古基工程、カップリング
工程、キャッピング工程、酸化工程の順序で行なっても
よい。

そして上記の４つの工程からなるポリヌクレオチドの合
成工程では、上記の各工程の間にはアセトニトリルなど
の洗浄液を用いた洗浄工程が挿入されており、各工程が
不純物の存在しない状態で進行するようにされている。

このようなポリヌクレオチドの合成操作は手作業で行な
うには煩雑であるため、上記の各工程に必要な反応原料
、試薬、溶媒などを、自動的に順次反応器に供給し、次
いで排出するように崩成８れたポリヌクレオチド合成装
置が（３案されＣいる。

上記のようなポリヌクレオチド合成装置を用いたポリヌ
クレオチド合成方法では、カップリング工程は、脱保１
されたポリヌクレオチドか存在する反応系に、アミダイ
トと活性化剤との混合物を供給することによって行なわ
れているが、このようにしてポリヌクレオチドを合成し
ようとすると、特にトリチル基などの保護基が１悦離さ
れたヌクレオチドの５′位の水Ｍ基と活性化剤によって
活１生化されたアミダイトとを反応さヒるカップリング
工程に長時間を要するとともに、ｊｒＪられるポリヌク
レオチドの収率の点でも必ずしも満足しうるしのではな
いという問題点かあった。もしＣＩられるポリヌクレオ
チドの収率か低いと、ヌクレオブトか１００個以上連な
った長鎖のポリスクレオチドを合成づることは困難であ
る。

また上記のようにしてカップリング工程を行なうには、
アミダイトと活性化剤とを予じめ混合してアミグイｌへ
の活性化を行なう予備反応器か必要となるという問題点
もあった。

本発明者らは、このような問題点を一挙に解決ずへく鋭
意研究したところ、カップリング工程（縮合工程）にＪ
３いて、活性化剤ｄ３よびアミダイトの反応系への供給
法を工夫することにより、上記のような問題点が解決し
うろことを見出して、本発明を完成りるに至った。

発明の目的 本発明は、上記のような従来技術に伴なう問題点を解決
しようとするものであって、ポリスクレオチド合成装置
を用いたホスファイト法によるポリスクレオチドの合成
反応にｄｊいて、ポリスクレオチドの合成数キを高める
ことによってミ艮鎖のポリスクレオチドを合成すること
ができ、しかしポリスクレオチドを短時間で合成しうる
Ｊ：つな、ポリスクレオチド合成方法を提供づることを
目的としている。

発明のＩＩ！！要 本発明に係るポリヌクレオチド合成装置を用いたボリヌ
クレΔチド合成り法は、ポリスクレオチド合成反応に必
要な反応１京Ｊ：Ｅｌ、試薬、溶媒などを所定の＋ｌｌ
ｒ；序で反応器に給液し、次いでＪＪＩ出するように、
構成されたポリヌクレオチド合成装置を用いて、脱保護
基工程、カップリング工程、酸化二［程、キ（ノツピン
グ工程の各工程をこの順序またはＩ］）１保諷基工程、
カップリング工程、キャッピング工程、酸化工程の順序
で繰返して行なうことによりポリヌクレオチドを合成す
るに際して、カップリング工程を、反応系に予め活性化
剤を供給して、活性化剤と脱保護基されたポリヌクレオ
チドとを接触させた後に、アミダイトを反応系に供給し
て脱保護基されたポリヌクレオチドと反応さゼることに
より行なうことを特徴とし°Ｃいる。

本発明によれば、ポリヌクレオチド合成装置δを用いて
、脱保護基工程、カップリング工程、酸化工程、キャッ
ピング工程の各工程をこの順序であるいは脱１呆護基工
程、カップリング工程、キャッピング工程、酸化工程の
順序で繰返して行なうことによりポリヌクレオチドを合
成するに際して、カップリング工程を、反応系に予め活
性化剤を供給して脱保護基されたポリヌクレオチドを活
性化したのら、アミダイトと反応させることにより行っ
ているので、ポリヌクレオチドの合成収率を高めること
によって長鎖のポリヌクレオチドを合成重ることができ
るとともに、ポリヌクレオチドを短時間で合成すること
ができ、その上アミダイトと活性化剤との混合を行なう
子猫反応器が不用とすることかできる。

発明の詳細な説明 以下本発明に係るポリヌクレオチド合成装置を用いたポ
リヌクレオチドの合成方法について、具体的に説明する
。

まず、本発明で用いられるポリヌクレオチド合成装置の
一例について、図面を参照しながら説明すると、図中符
号１は不活性ガス（窒素ガス）のボンベ、２は溶剤ビン
、３〜６は試薬ビン、７〜１０は原料ビン、１１は反応
器、１２はｌ’ｌ　ｔｉ１手段で必る。

ボンベ１に充填されているＮ２ガスは、調圧弁１３、デ
ィストリビュータ１４ａを経て溶剤ビン２、試薬ビン３
〜６、原料ビン７〜１０に送られ、該Ｎ２ガスの圧力に
より溶剤、試薬、原料が流路１４ｂ（１ｍｍφ程度の細
いデユープからなる）を経て反応器１１に送られる。ま
たＮ２カスはオリフィス１５、流路１４ｂを経て反応器
１１に送られる。オリフィス１５は、Ｎ２ガスにより反
応：盗１１内でバブリング覆るとぎオーバーフローしな
いようにＮ２カスの流量を１１１１限する役割を果して
いる。Ｎ２ガスは、通常、モレキュラシーブス等の乾燥
剤により乾燥され、フィルタでろ過された後、用いられ
ている。不活性ガスとしては、Ｎ２ガスのほかに、ヘリ
ウム、アルゴンなどを使用づることかできる。

溶剤ビン２にはアセトニトリルなどの溶剤、試薬ビン３
にはトリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸などの脱保シ基剤、
試薬ビン４にはヨウ素、デトラヒドロフラン、２，６−
ルチジン、水などからなる酸化剤、試薬ビン５には無水
酢酸とジメチルアミノピリジンとの混合物などのキｉ・
ラビング剤、試薬ビン６にはテ］〜ラゾール、テ１〜ラ
ヒドロフラン、アセトニトリルなどからなる活性化剤が
それぞれ充填されている。また原料ビン７、原料ビン８
、原料ビン９、原料ビン１０には、それぞれアデニン（
Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（
Ｔ＞を塩基として含むホスホアミダイト（ヌクレオチド
試薬）と溶剤とからなる溶液がそれぞれ充填きれている
。

試薬ビン３，４．５の入口側にはそれぞれ逆止弁１６，
１７．１８が設けられていて、脱保賞基剤、酸化剤、キ
ャツピング剤の蒸気やミス１〜か流路１４ｂを逆流して
他のビン内に流入覆るのを阻止するようになっている。

流路１４ｂには電磁弁１９が設けられ、また流路１４ｂ
のビン２〜１０の出口側にはそれぞれ電磁弁２０〜２８
が設けられ、また流路１４ｂの反応器１１の底部側と頂
部側にはそれぞれ電磁弁２９〜３２が設けられている。

これら電磁弁１９〜３２は制御手段（プログラマブルコ
ントローラ）１２により制御されて開閉覆るようになっ
ている。

電磁弁１９は二方弁で通電時に聞き、また電磁弁２０〜
３０は三方弁で通電時に点線部分か実線部分と連通し、
また電磁弁３１．３２は三ノブ弁で通電時に実線状態か
ら点線状態に切り替わる。

次に、このようなポリヌクレオチド合成）（置の一般的
な操作方法について説明すると、反応操作に際しては、
まず、反応器１１内に例えばアミンヌクレオシド（Ｔ＞
を結合させた多孔質ガラスの担持体（サポート）（！−
充填し、次いで制御手段１２を動作させると、該制御手
段１２に設定したプログラムの内容に従って電磁弁１９
〜３２が順次開閉されて、ラインバージ工程→洗浄工程
→１１（１トリデル基工程→洗浄工程→カツプリング工
程→洗浄工程→酸化工程→洗浄工程→キヤツピング工程
→）ん浄工程が行われる。

以上かポリヌクレオチド合成装買の概要である。

このようなポリヌクレオチド合成装買を用いたポリヌク
レオチド合成反応は、前述のように、脱保護基工程、カ
ップリング工程、酸化工程、４トッピング工程の４つの
工程を、各工程間に洗浄工程を１Φ人しながらこの順序
であるいは脱保心↓ユニ程、カップリング工程、キｔ７
ツピングエ程、酸化工程の順序で繰り返して行なってい
るか、本発明では、このカップリング工程を、以下のよ
うにして行なうことを特徴としている。

すなわち、脱保護基されたポリヌクレオチドか存在する
反応系に、予め活性化剤を供給して、活性化剤と脱保護
基させたポリヌクレオチドとを接触させた後に、Ｎ、Ｎ
−ジイソプロピルホスホアミグイ１へなどのアミダイ１
へを反応系に供給して、活性化剤とアミダイ１〜とを接
触さＵてアミダイ１−を活［４化し、このアミダイトと
脱保護基されたポリスクレオチドとを反応８せることに
より、前記カップリング工程を行なっている。

活性化剤としては、たとえば、１−ｈ−テトラゾール、
５−二１へロー１−テトラゾール、トリアゾールなどが
具体的に用いられる。

このような活性化剤は、通常溶剤としては反応系に供給
されるか、この溶剤として（ま、ピリジン、ピコリン、
ルチジンなどのピリジン類、ギノリン、イソキノリン、
オキサゾール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムア
ミド、ジクロロメタン、アセトニ１−リルなどがｆｉ体
的に用いられる。

脱保１されたポリヌクレオチドが存在する反応系に、予
め活性化剤を供給して、このポリヌクレオチドと活は止
剤とを接触させることによって、脱保４基されたポリヌ
クレオチドが活性化される。

活１（Ｆ他剤の供給に際しＣは、その一部をアミタイト
とともに反応系に供給することがＣき、それによって収
率は一段と向上りる。かかる手法の具体例とし−では、
たとえば予め供給する活性化剤の一部を流路中に残して
おき、そこへ７ミグイトを供給して流路中で混合しなが
ら供給覆る方法、アミダイトを供給したのら、さらに活
［１化剤を供給す゛る方法などが例示される。

また上記のようなカップリング工程は、通常１０〜５０
’Ｃの温度で行なわれることか好ましい。

このようにして脱保護基されたポリスクレオチドか存（
「覆る反応系に活性化剤を供給した後、この反応系を窒
素などの不活性ガスによってバブリングして、脱保護基
されるポリスクレオチドと活性化剤とを充分に接触さけ
ることか好ましい。

次に、脱保Ａｎされたポリヌクレオチドと活性化剤とか
存在する反応系に、上１本のようにアミダイトを供給す
るか、アミダイトは通常溶剤とともに反応系に供給され
、この溶剤としては、活性化剤を希釈づるのに用いた溶
剤と同様なものが用いられる。このようにしてアミダイ
１〜を反応系に供給すると、アミダイトは活性化剤によ
り活性化されて脱保護基されたポリヌクレオチドと反応
して、鎖長が延長さけたポリヌクレオチドか収率よくし
かも短時間で（ｑられる。したかってヌクレオチドが９
０個以上つらなった長鎖のポリヌクレオチドを含成りる
ことができる。

す；２保４阜されたポリヌクレオチド１モル当り、活性
化剤は２〜５モルの２，１１合で用いられることか好ま
しく、またアミダイトは脱保護すされたポリスクレオチ
ド１当量当り２〜１０当量の割合で用いられることか好
ましい。

これに対して、カップリング工程を、１１）１保護基さ
れたポリヌクレオチドが存在する反応系に、活性化剤と
７ミグイトとの混合物を供給りることによって行なう場
合には、脱保６”ｔ　；、ｉＧされたポリヌクレオチド
とアミダイトとの反応速度は近くしかも鎖長が延長され
たポリヌクレオチドを本発明はどに収率よ＜１′７るこ
とはできない。

このようなカップリング工程を、ポリヌクレオヂド合成
装置を用いて行なうには、制御手段１２を下記のように
制御ツればよい。

まず、電磁弁２４．２９を聞く。電磁弁２ＩＩを開くと
、点線部分と実線部分が連通することがらＮ２ガスの圧
力でビン６から活性化剤（テトラゾール／アトセニトリ
ル／テトラヒドロフラン）昆合溶）１１）が送り出され
る。このときの電磁”；ｔ　２４の開時間は、反応器１
１内の担体をひたＪことがてぎる程度の量の活性化剤か
ビン６から送り出される時間に設定されていることか好
ましい。次に電磁弁１９を開く。電磁弁１９の開時間は
、活性化剤を反応器１１に送り込んで担持体をひたし、
かつ瞬間的ないしは数秒間程度のバブリングを可能とづ
る時間に設定されていることが好ましい。次いで、例え
ば電磁弁２５を聞く。電磁弁２５の開時間は、カップリ
ングに必要なｆＩ）のアミダイ１〜試薬／溶剤（アセト
ニトリル）溶液が送る出される時間に設定されているこ
とが好ましい。この後、必要に応じて電磁弁２４を再庭
聞にＪることもできる。

ここで、電磁ｊ’ｉ　２４の合訓開萌間は、縮合反応に
必要なけよりも若干多い程度の活性化剤をビン６から送
り出す時間になっている。

このようにしてアミダイト試薬／溶剤（アセｌ−二トリ
ル）溶液と活性化剤を送り出した後、電磁弁を１９を開
く。電磁弁１９の開時間は、Ｊｆｉ１４ｂ、電磁弁２４
〜２９内に残ったアミダイト試薬／溶剤（アセトニトリ
ル）溶液ｄ５よびび活（４化剤が存在する場合にはその
活性化剤を反応器１１に送り込み縮合反応が終了づるま
での時間に設定されている。

ビン７〜１０から二種類のアミダイト試薬／′溶剤（ア
セトニトリル）溶液を退り出す場合には、（例えばＡと
Ｇ、ＡとＴ、ＧとＴなど）、電磁弁２５〜２８の開時間
は一種類のアミダイト試薬／溶剤（アセトニトリル）溶
液を送り出すときの開時間の２分の１に設定され、また
二種類（例えばＡとＧとＣ，ＡとＧとＴ、ＡとＣとＴな
ど）のとき、電磁弁２５〜２８の開時間は一種類のとき
の開時間の３分の１に設定されている。　カップリング
反応中は、電磁：？　１９か開状態になってＮ２ガスか
流路１４ｂおよび電磁弁２４〜２８内に残ったアミダイ
ト試薬／溶剤（アセトニトリル）溶液を活性化剤ととも
に反応器１１に送り込み、バブリングか行なわれる。バ
ブリングは、間欠的に続行されることが好ましい。例え
ば、０．１〜１．０秒程度Ｎ２を供給した後２〜１０秒
程；哀供給を停止１−シて行う。ここでカップリング反
応に凹づる時間は、結合重る塩基によりそれぞれ設定さ
れ、Ｃおよび王が２０秒、Ａが１４秒、Ｇ　ｈ）１８秒
であって、ＣおよびＴ＞Ｇ＞△の関係である。

その後、電磁弁２９と３０．３１を交Ｈに開閉しなから
残溶）１１を排出づる。電”Ｉｔｋ弁２９０手前に内圧
をかけて行われる。

このカップリングエト））が柊了しノζら、−１１７ソ
ビングエ程→酸化工稈→洗）争工程→ＩＢ２保護基工稈
→洗浄工程→乾燥工程をえて再びカップリングが工程が
行われる。

なお、以上の説明は、便宜上、デオギシリポ核酸を例に
子げて行’ｃＪ：ったが、本発明のポリヌクレオチドに
リホ核酸などのその他の核酸灯ｌも含まれることはいう
までもない。

発明の効果 本発明によれば、ポリヌクレオチド合成装買を用いて、
脱保護基工程、カップリング工程、酸化工程、キャッピ
ング工程の各工程をこの順序であるいは脱１呆８基工程
、カンプリング工程、キャッピング工程、酸化工程の順
序で繰返して行’（Ｅうことによりポリヌクレオチドを
合成りるに際して、カップリング工程を、反応系に予め
活＋ｌ他剤を供給して活性化剤と脱保占Ｍされたポリヌ
クレオチドとを接触させた後に、アミダイトを反応系に
供給してアミダイトを活性化剤により活性化し、このア
ミダイトと脱保６塁されたボリヌクレＡヂドとを反応さ
けることにより行なっているので、ボリヌクレオチドの
合成収率をγｈめることによって長鎖のポリスクレオチ
ドを合成することができるとともにポリヌクレオチドを
短時間で合成りることがてき、しかもアミダイトと活性
化剤との混合を行なう千１祐反応器が不用とすることが
できる。

以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
ら実施例に限定されるものではない。

実施例１ 図面に示すようなポリヌクレオチド合成菰四を用いて、
ヌクレオチドがそれぞれ３０飼、６０個、および９０個
個連なったポリヌクレオチドを合成した。

この際、カップリング工程を、１；２保護基されたポリ
ヌクレオチドが存在する反応系に予め活性剤を供給し、
この反応系を窒素でバブリングして活１生化剤と脱保ぬ
基されたポリスクレオチドとを接触させた後に、アミダ
イドを反応系に供給して）７ミダイトを活性化し、この
アミダイトと１１（２保占早されたポリスクレオチドと
を反応さＵることにＪ−つて行なった。

このようにしてポリヌクレオシードを合成し、１：ｔら
れたポリスクレオチドをポリスクレオチドキナーゼによ
って５−末端を［γ３２−ＤＥＡＴＰを用いて標識し、
電気泳動にて泳動後、Ａ−トラジオグラフにより分析し
、メインバンドのイ１無によりその存在を確認した。目
的とするポリヌクレオチドの存在が、充分にＴｉ１ｒ　
＝’２された場合を良とし、かなり確認された場合を可
とし、確ｈ工）されなかった場合を不可とした。

結果を表１に示す。

比較例１ 実施例１において、カップリング工程を、１１（１保Ｋ
ｌされたポリスクレオチドが（ｊ存する反応系に、活性
化剤とアミダイトとの混合物を一挙に供給した以外は、
実施例１と同様にした。

結果を表１に示す。

また比較例１では、ヌクレオチドか９０（Ｉ！］連らな
った９０ｍｅｒを合成するのに約２３時間かかったが、
実施例１では約８時間かかった。

表　　１ この表１より、ポリヌクレオヂド合成菰石を用いてポリ
ヌクレオチドを合成するに際して、カップリング工程を
本発明で特定Ｊる方法に従って行なうことにより、ポリ
ヌクレオチドの合成収捧′−を８ｊめることがてざるこ
とがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で用いられるポリヌクレΔチド合成装
置の３１！明図でおる。 １・・・ボンベ　　　２〜６・・・溶剤、試薬ビン７〜
１０・・・原料ビン　　１１・・・反応器１２・・・■
り御手段

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）ポリヌクレオチド合成反応に必要な反応原料、試薬
   、溶媒などを所定の順序で反応器に給液し、次いで排出
   するように構成されたポリヌクレオチド合成装置を用い
   て、脱保護基工程、カップリング工程、酸化工程、キャ
   ッピング工程の各工程をこの順序であるいは脱保護基工
   程、カップリング工程、キャッピング工程、酸化工程の
   順序で繰返して行なうことによりポリヌクレオチドを合
   成するに際して、カップリング工程を、反応系に予め活
   性化剤を供給して、活性化剤と脱保護基されたポリヌク
   レオチドとを接触させた後に、アミダイトを反応系に供
   給して脱保護基されたポリヌクレオチドとを反応させる
   ことにより行なうことを特徴とする、ポリヌクレオチド
   の合成法。