JPS6379896A - Synthesis of polynucleotide - Google Patents
Synthesis of polynucleotideInfo
- Publication number
- JPS6379896A JPS6379896A JP22458786A JP22458786A JPS6379896A JP S6379896 A JPS6379896 A JP S6379896A JP 22458786 A JP22458786 A JP 22458786A JP 22458786 A JP22458786 A JP 22458786A JP S6379896 A JPS6379896 A JP S6379896A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- coupling
- amidite
- reaction system
- deprotected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title abstract description 15
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 30
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 4
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- -1 triester phosphate Chemical class 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSKHPKMHTQYZBB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC=N1 BSKHPKMHTQYZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANPWLBTUUNFQIO-UHFFFAOYSA-N n-bis(phenylmethoxy)phosphanyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound C=1C=CC=CC=1COP(N(C(C)C)C(C)C)OCC1=CC=CC=C1 ANPWLBTUUNFQIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、ポリヌクレオチド合成装置を用いたホスファ
イト法によるポリヌクレオチドの合成方法に関し、さら
に詳しくは、長鎖のボリヌクレＡヂドを収率よくしかも
短時間で得ることができるような、ポリヌクレオチド合
成装置を用いたポリヌクレオチドの合成法に閉覆る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Technical Field of the Invention The present invention relates to a method for synthesizing polynucleotides by the phosphite method using a polynucleotide synthesizer. We now turn to methods for synthesizing polynucleotides using a polynucleotide synthesizer, such as can be obtained in hours.
発明の技術的背碩ならびにその問題点
近年に至ってｊｍ伝子工学に代表される分子生物学か急
速な発展をとげ、これに伴ってデオギシリ小核酸（ＤＮ
Ａ）必るいはり小核酸（ＲＮＡ）を構成するポリヌクレ
オチドを合成しようとする試みが盛んに行なわれている
。Technical background of the invention and its problems In recent years, molecular biology, represented by genetic engineering, has made rapid progress, and along with this, small nucleic acid (DN)
A) Many attempts are being made to synthesize polynucleotides that necessarily constitute small nucleic acids (RNA).
ポリヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシンあ
るいはチミンの４種の核酸塩基とデオキシリボースとが
結合してなるデオギシリボヌクレオシドにリン酸が結合
したヌクレオチドか、複数１固連なつｌこ＋Ｖ＋造をイ
ｊしており、このポリヌクレオチドを合成するには、リ
ン酸トリエステル法か従来採用されてさた。ところかこ
のリン酸トリエスチル法では５圃のリン酸が用いられる
ため、活性が低いという問題点があった。A polynucleotide is a nucleotide in which a phosphate is bound to a deoxyribonucleoside formed by bonding four types of nucleobases, adenine, guanine, cytosine, or thymine, and deoxyribose, or a nucleotide in which a phosphoric acid is bonded to a deoxyribonucleoside formed by bonding four types of nucleobases: adenine, guanine, cytosine, or thymine, or a polynucleotide consisting of a plurality of one fixed Natsu+V+ structure. The phosphotriester method has traditionally been used to synthesize this polynucleotide. However, since this triester phosphate method uses 5 fields of phosphoric acid, there was a problem in that the activity was low.
このため、ポリスクレオチドを合成重るに際して、反応
活姓に富む３価の亜リン酸トリエステルを用いるホスフ
ァイト法が広く採用されるようになってきた。このよう
なホスファイト法によりポリヌクレオチドを合成Ｊるに
は、通常、次のような４つの工程（ａ）〜（ｄ＞か必要
である。For this reason, the phosphite method using trivalent phosphite triester, which is highly reactive, has come to be widely adopted when synthesizing polyscleotides. Synthesizing polynucleotides by such a phosphite method usually requires the following four steps (a) to (d>).
（ａ）担持体に結合されたヌクレオシドの５−位の保護
基であるトリチル基などを酸によって切断し、ヌクレオ
−シトの５′位を水酸基に変える工程（脱保＾ρ基工程
）。(a) A step in which a trityl group, which is a protecting group at the 5-position of a nucleoside bonded to a support, is cleaved with an acid to convert the 5'-position of the nucleoside into a hydroxyl group (deprotection ^ρ group step).
（ｂ）次いでこの水ＨＥｆ＝に、テトラゾールなどによ
って活ｉ生化されたＮ、Ｎ−ジイソプロピルホスホアミ
ダイトなとの、アデニン、グアニン、シトシン、必るい
はチミンのいずれかの塩基が結合したアミダイトを反応
さけてホスファイトを形成さける工程（カップリング工
程）。(b) Next, this water HEf= is reacted with an amidite bonded with a base of adenine, guanine, cytosine, or thymine, such as N,N-diisopropylphosphoramidite activated with tetrazole or the like. A process that avoids the formation of phosphite (coupling process).
（Ｃ）カップリング工程で得られたボスファイトをヨ１
り索、テ１〜ラヒドロフラン、２，６−ルチジン、水な
どからなる試薬を用いて酸化りる工程（酸化工程）。(C) The bossite obtained in the coupling process is
A step (oxidation step) of oxidizing using a reagent consisting of chloride, Te1-lahydrofuran, 2,6-lutidine, water, etc.
（ｄ）カップリング工程で反応しなかったヌクレオチド
の５′位水酸基を、無水酢酸およびジメチルアミノピリ
ジンなどからなる二％ｍ ＜ｙツピング液を用いて保古
する工程（キャッピング工程）。(d) A step (capping step) in which the 5'-position hydroxyl group of the nucleotide that did not react in the coupling step is preserved using a 2% m<y coupling solution consisting of acetic anhydride, dimethylaminopyridine, and the like.
上記の４つの工程は、脱保６基工程、カップリング工程
、酸化工程、キャッピング工程の順序で行なってもよい
か、場合によっては、ロ；２保古基工程、カップリング
工程、キャッピング工程、酸化工程の順序で行なっても
よい。The above four steps may be carried out in the order of 6 deprotection steps, coupling step, oxidation step, and capping step, or depending on the case, B; 2 preservation step, coupling step, capping step, and oxidation The steps may be performed in order.
そして上記の４つの工程からなるポリヌクレオチドの合
成工程では、上記の各工程の間にはアセトニトリルなど
の洗浄液を用いた洗浄工程が挿入されており、各工程が
不純物の存在しない状態で進行するようにされている。In the polynucleotide synthesis process, which consists of the four steps described above, a washing step using a washing solution such as acetonitrile is inserted between each of the above steps, so that each step proceeds in an impurity-free state. is being used.
このようなポリヌクレオチドの合成操作は手作業で行な
うには煩雑であるため、上記の各工程に必要な反応原料
、試薬、溶媒などを、自動的に順次反応器に供給し、次
いで排出するように崩成８れたポリヌクレオチド合成装
置が（３案されＣいる。Since such polynucleotide synthesis operations are cumbersome to perform manually, the reaction materials, reagents, solvents, etc. necessary for each of the above steps are automatically supplied to the reactor in sequence and then discharged. There are three proposed polynucleotide synthesizers (C).
上記のようなポリヌクレオチド合成装置を用いたポリヌ
クレオチド合成方法では、カップリング工程は、脱保１
されたポリヌクレオチドか存在する反応系に、アミダイ
トと活性化剤との混合物を供給することによって行なわ
れているが、このようにしてポリヌクレオチドを合成し
ようとすると、特にトリチル基などの保護基が１悦離さ
れたヌクレオチドの５′位の水Ｍ基と活性化剤によって
活１生化されたアミダイトとを反応さヒるカップリング
工程に長時間を要するとともに、ｊｒＪられるポリヌク
レオチドの収率の点でも必ずしも満足しうるしのではな
いという問題点かあった。もしＣＩられるポリヌクレオ
チドの収率か低いと、ヌクレオブトか１００個以上連な
った長鎖のポリスクレオチドを合成づることは困難であ
る。In the polynucleotide synthesis method using the above-mentioned polynucleotide synthesizer, the coupling step includes deprotection and
This is accomplished by supplying a mixture of amidites and an activator to the reaction system in which polynucleotides are present, but when trying to synthesize polynucleotides in this way, protecting groups such as trityl groups are particularly important. The coupling step of reacting the water M group at the 5' position of the released nucleotide with the amidite activated by an activator takes a long time, and the yield of the polynucleotide is reduced. However, there was a problem that it was not always possible to be satisfied. If the yield of polynucleotides subjected to CI is low, it is difficult to synthesize long-chain polynucleotides with more than 100 nucleotides.
また上記のようにしてカップリング工程を行なうには、
アミダイトと活性化剤とを予じめ混合してアミグイｌへ
の活性化を行なう予備反応器か必要となるという問題点
もあった。In addition, in order to perform the coupling process as described above,
There is also a problem in that a pre-reactor is required in which amidite and activator are mixed in advance and activated to form amidite.
本発明者らは、このような問題点を一挙に解決ずへく鋭
意研究したところ、カップリング工程（縮合工程）にＪ
３いて、活性化剤ｄ３よびアミダイトの反応系への供給
法を工夫することにより、上記のような問題点が解決し
うろことを見出して、本発明を完成りるに至った。The present inventors conducted intensive research to solve these problems all at once, and found that J
3, it was discovered that the above problems could be solved by devising a method for supplying the activator d3 and amidite to the reaction system, and the present invention was completed.
発明の目的
本発明は、上記のような従来技術に伴なう問題点を解決
しようとするものであって、ポリスクレオチド合成装置
を用いたホスファイト法によるポリスクレオチドの合成
反応にｄｊいて、ポリスクレオチドの合成数キを高める
ことによってミ艮鎖のポリスクレオチドを合成すること
ができ、しかしポリスクレオチドを短時間で合成しうる
Ｊ：つな、ポリスクレオチド合成方法を提供づることを
目的としている。Purpose of the Invention The present invention aims to solve the problems associated with the prior art as described above. The object of the present invention is to provide a method for synthesizing polystyrene chain by increasing the number of synthesized cleotides, but also capable of synthesizing polyscleotides in a short time.
発明のＩＩ！！要
本発明に係るポリヌクレオチド合成装置を用いたボリヌ
クレΔチド合成り法は、ポリスクレオチド合成反応に必
要な反応１京Ｊ：Ｅｌ、試薬、溶媒などを所定の＋ｌｌ
ｒ；序で反応器に給液し、次いでＪＪＩ出するように、
構成されたポリヌクレオチド合成装置を用いて、脱保護
基工程、カップリング工程、酸化二［程、キ（ノツピン
グ工程の各工程をこの順序またはＩ］）１保諷基工程、
カップリング工程、キャッピング工程、酸化工程の順序
で繰返して行なうことによりポリヌクレオチドを合成す
るに際して、カップリング工程を、反応系に予め活性化
剤を供給して、活性化剤と脱保護基されたポリヌクレオ
チドとを接触させた後に、アミダイトを反応系に供給し
て脱保護基されたポリヌクレオチドと反応さゼることに
より行なうことを特徴とし°Ｃいる。Invention II! ! Essentially, the method for synthesizing vorinucleotide Δ using the polynucleotide synthesizer according to the present invention involves mixing 1 quintillion J:El, reagents, solvents, etc. necessary for the polynucleotide synthesis reaction in a predetermined amount
r; In order to supply liquid to the reactor at the beginning, and then to discharge JJI,
Using the configured polynucleotide synthesizer, a deprotection step, a coupling step, an oxidation step, and a protection step (each step of the knocking step is performed in this order or I),
When synthesizing a polynucleotide by repeating the coupling step, capping step, and oxidation step in the order, the coupling step is performed by supplying an activator to the reaction system in advance, and then The method is characterized in that after contacting the polynucleotide, amidite is supplied to the reaction system and reacted with the deprotected polynucleotide.
本発明によれば、ポリヌクレオチド合成装置δを用いて
、脱保護基工程、カップリング工程、酸化工程、キャッ
ピング工程の各工程をこの順序であるいは脱１呆護基工
程、カップリング工程、キャッピング工程、酸化工程の
順序で繰返して行なうことによりポリヌクレオチドを合
成するに際して、カップリング工程を、反応系に予め活
性化剤を供給して脱保護基されたポリヌクレオチドを活
性化したのら、アミダイトと反応させることにより行っ
ているので、ポリヌクレオチドの合成収率を高めること
によって長鎖のポリヌクレオチドを合成重ることができ
るとともに、ポリヌクレオチドを短時間で合成すること
ができ、その上アミダイトと活性化剤との混合を行なう
子猫反応器が不用とすることかできる。According to the present invention, each step of deprotecting group step, coupling step, oxidation step, and capping step can be performed in this order or the deprotecting group step, coupling step, and capping step using polynucleotide synthesizer δ. When synthesizing polynucleotides by repeating the oxidation steps in this order, the coupling step is performed by supplying an activating agent to the reaction system in advance to activate the deprotected polynucleotide, and then performing the coupling step with amidites. Since this is carried out by reacting, it is possible to synthesize long polynucleotides by increasing the polynucleotide synthesis yield, and also to synthesize polynucleotides in a short time. A kitten reactor for mixing with the curing agent can be dispensed with.
発明の詳細な説明
以下本発明に係るポリヌクレオチド合成装置を用いたポ
リヌクレオチドの合成方法について、具体的に説明する
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION A method for synthesizing polynucleotides using the polynucleotide synthesizer according to the present invention will be specifically described below.
まず、本発明で用いられるポリヌクレオチド合成装置の
一例について、図面を参照しながら説明すると、図中符
号１は不活性ガス（窒素ガス）のボンベ、２は溶剤ビン
、３〜６は試薬ビン、７〜１０は原料ビン、１１は反応
器、１２はｌ’ｌ ｔｉ１手段で必る。First, an example of the polynucleotide synthesis apparatus used in the present invention will be described with reference to the drawings. In the drawing, reference numeral 1 is an inert gas (nitrogen gas) cylinder, 2 is a solvent bottle, 3 to 6 are reagent bottles, 7 to 10 are raw material bottles, 11 is a reactor, and 12 is necessary for l'lti1 means.
ボンベ１に充填されているＮ２ガスは、調圧弁１３、デ
ィストリビュータ１４ａを経て溶剤ビン２、試薬ビン３
〜６、原料ビン７〜１０に送られ、該Ｎ２ガスの圧力に
より溶剤、試薬、原料が流路１４ｂ（１ｍｍφ程度の細
いデユープからなる）を経て反応器１１に送られる。ま
たＮ２カスはオリフィス１５、流路１４ｂを経て反応器
１１に送られる。オリフィス１５は、Ｎ２ガスにより反
応：盗１１内でバブリング覆るとぎオーバーフローしな
いようにＮ２カスの流量を１１１１限する役割を果して
いる。Ｎ２ガスは、通常、モレキュラシーブス等の乾燥
剤により乾燥され、フィルタでろ過された後、用いられ
ている。不活性ガスとしては、Ｎ２ガスのほかに、ヘリ
ウム、アルゴンなどを使用づることかできる。The N2 gas filled in the cylinder 1 passes through the pressure regulating valve 13 and the distributor 14a to the solvent bottle 2 and the reagent bottle 3.
~6, raw materials are sent to bottles 7 to 10, and under the pressure of the N2 gas, the solvent, reagent, and raw materials are sent to the reactor 11 through the channel 14b (consisting of a thin duplex with a diameter of about 1 mm). Further, the N2 residue is sent to the reactor 11 via the orifice 15 and the flow path 14b. The orifice 15 serves to limit the flow rate of the N2 gas so that it does not overflow due to bubbling within the reactor 11 caused by the N2 gas. N2 gas is normally used after being dried with a desiccant such as molecular sieves and filtered with a filter. In addition to N2 gas, helium, argon, etc. can be used as the inert gas.
溶剤ビン２にはアセトニトリルなどの溶剤、試薬ビン３
にはトリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸などの脱保シ基剤、
試薬ビン４にはヨウ素、デトラヒドロフラン、２，６−
ルチジン、水などからなる酸化剤、試薬ビン５には無水
酢酸とジメチルアミノピリジンとの混合物などのキｉ・
ラビング剤、試薬ビン６にはテ］〜ラゾール、テ１〜ラ
ヒドロフラン、アセトニトリルなどからなる活性化剤が
それぞれ充填されている。また原料ビン７、原料ビン８
、原料ビン９、原料ビン１０には、それぞれアデニン（
Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（
Ｔ＞を塩基として含むホスホアミダイト（ヌクレオチド
試薬）と溶剤とからなる溶液がそれぞれ充填きれている
。Solvent bottle 2 contains a solvent such as acetonitrile, reagent bottle 3
De-retaining bases such as trichloroacetic acid and dichloroacetic acid,
Reagent bottle 4 contains iodine, detrahydrofuran, 2,6-
An oxidizing agent consisting of lutidine, water, etc.;
The rubbing agent and reagent bottles 6 are each filled with an activating agent such as te-razole, te-rahydrofuran, acetonitrile, and the like. Also, raw material bin 7, raw material bin 8
, raw material bottle 9, and raw material bottle 10, adenine (
A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (
Each container is completely filled with a solution consisting of a phosphoramidite (nucleotide reagent) containing T> as a base and a solvent.
試薬ビン３，４．５の入口側にはそれぞれ逆止弁１６，
１７．１８が設けられていて、脱保賞基剤、酸化剤、キ
ャツピング剤の蒸気やミス１〜か流路１４ｂを逆流して
他のビン内に流入覆るのを阻止するようになっている。A check valve 16 is provided on the inlet side of the reagent bottles 3, 4.5, respectively.
17 and 18 are provided to prevent the vapors of the debonding base, oxidizing agent, and capping agent from flowing back through the flow path 14b and flowing into other bottles and covering them. .
流路１４ｂには電磁弁１９が設けられ、また流路１４ｂ
のビン２〜１０の出口側にはそれぞれ電磁弁２０〜２８
が設けられ、また流路１４ｂの反応器１１の底部側と頂
部側にはそれぞれ電磁弁２９〜３２が設けられている。A solenoid valve 19 is provided in the flow path 14b, and a solenoid valve 19 is provided in the flow path 14b.
Solenoid valves 20 to 28 are installed on the outlet sides of the bottles 2 to 10, respectively.
, and electromagnetic valves 29 to 32 are provided at the bottom and top sides of the reactor 11 in the flow path 14b, respectively.
これら電磁弁１９〜３２は制御手段（プログラマブルコ
ントローラ）１２により制御されて開閉覆るようになっ
ている。These electromagnetic valves 19 to 32 are controlled by a control means (programmable controller) 12 to open and close.
電磁弁１９は二方弁で通電時に聞き、また電磁弁２０〜
３０は三方弁で通電時に点線部分か実線部分と連通し、
また電磁弁３１．３２は三ノブ弁で通電時に実線状態か
ら点線状態に切り替わる。The solenoid valve 19 is a two-way valve that listens when energized, and the solenoid valve 20 ~
30 is a three-way valve that communicates with the dotted line or solid line when energized.
The electromagnetic valves 31 and 32 are three-knob valves that switch from a solid line state to a dotted line state when energized.
次に、このようなポリヌクレオチド合成）（置の一般的
な操作方法について説明すると、反応操作に際しては、
まず、反応器１１内に例えばアミンヌクレオシド（Ｔ＞
を結合させた多孔質ガラスの担持体（サポート）（！−
充填し、次いで制御手段１２を動作させると、該制御手
段１２に設定したプログラムの内容に従って電磁弁１９
〜３２が順次開閉されて、ラインバージ工程→洗浄工程
→１１（１トリデル基工程→洗浄工程→カツプリング工
程→洗浄工程→酸化工程→洗浄工程→キヤツピング工程
→）ん浄工程が行われる。Next, to explain the general operation method for such polynucleotide synthesis), during reaction operation,
First, in the reactor 11, for example, amine nucleoside (T>
A porous glass support (!-
When the fuel is filled and the control means 12 is operated, the solenoid valve 19 is activated according to the contents of the program set in the control means 12.
- 32 are sequentially opened and closed to perform the line barge process → cleaning process → 11 (1 tridel base process → cleaning process → coupling process → cleaning process → oxidation process → cleaning process → capping process →) cleaning process.
以上かポリヌクレオチド合成装買の概要である。This is an overview of polynucleotide synthesis and purchasing.
このようなポリヌクレオチド合成装買を用いたポリヌク
レオチド合成反応は、前述のように、脱保護基工程、カ
ップリング工程、酸化工程、４トッピング工程の４つの
工程を、各工程間に洗浄工程を１Φ人しながらこの順序
であるいは脱保心↓ユニ程、カップリング工程、キｔ７
ツピングエ程、酸化工程の順序で繰り返して行なってい
るか、本発明では、このカップリング工程を、以下のよ
うにして行なうことを特徴としている。As mentioned above, a polynucleotide synthesis reaction using such a polynucleotide synthesis equipment involves four steps: a deprotection step, a coupling step, an oxidation step, and a four-topping step, with a washing step between each step. 1Φ person in this order or unprotected ↓ Uni process, coupling process, kit t7
The coupling step and the oxidation step are repeatedly carried out in this order, and the present invention is characterized in that this coupling step is carried out as follows.
すなわち、脱保護基されたポリヌクレオチドか存在する
反応系に、予め活性化剤を供給して、活性化剤と脱保護
基させたポリヌクレオチドとを接触させた後に、Ｎ、Ｎ
−ジイソプロピルホスホアミグイ１へなどのアミダイ１
へを反応系に供給して、活性化剤とアミダイ１〜とを接
触さＵてアミダイ１−を活［４化し、このアミダイトと
脱保護基されたポリスクレオチドとを反応８せることに
より、前記カップリング工程を行なっている。That is, an activating agent is supplied in advance to a reaction system in which a deprotected polynucleotide is present, and after the activating agent and the deprotected polynucleotide are brought into contact, N,N
- diisopropylphosphoramiidae 1 etc.
is supplied to the reaction system, the activating agent and amidite 1- are brought into contact with each other to activate amidite 1-, and this amidite is reacted with the deprotected polyscleotide. The coupling process is in progress.
活性化剤としては、たとえば、１−ｈ−テトラゾール、
５−二１へロー１−テトラゾール、トリアゾールなどが
具体的に用いられる。Examples of the activator include 1-h-tetrazole,
5-21 hero-1-tetrazole, triazole, etc. are specifically used.
このような活性化剤は、通常溶剤としては反応系に供給
されるか、この溶剤として（ま、ピリジン、ピコリン、
ルチジンなどのピリジン類、ギノリン、イソキノリン、
オキサゾール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムア
ミド、ジクロロメタン、アセトニ１−リルなどがｆｉ体
的に用いられる。Such an activator is usually supplied to the reaction system as a solvent, or as a solvent (such as pyridine, picoline, etc.).
Pyridines such as lutidine, gynoline, isoquinoline,
Oxazole, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dichloromethane, acetonyl-1-lyl, etc. are commonly used.
脱保１されたポリヌクレオチドが存在する反応系に、予
め活性化剤を供給して、このポリヌクレオチドと活は止
剤とを接触させることによって、脱保４基されたポリヌ
クレオチドが活性化される。The deprotected polynucleotide is activated by supplying an activating agent in advance to a reaction system in which the deprotected polynucleotide is present, and bringing the polynucleotide into contact with the activating agent. Ru.
活１（Ｆ他剤の供給に際しＣは、その一部をアミタイト
とともに反応系に供給することがＣき、それによって収
率は一段と向上りる。かかる手法の具体例とし−では、
たとえば予め供給する活性化剤の一部を流路中に残して
おき、そこへ７ミグイトを供給して流路中で混合しなが
ら供給覆る方法、アミダイトを供給したのら、さらに活
［１化剤を供給す゛る方法などが例示される。When supplying active 1 (F) and other agents, a part of C can be supplied to the reaction system together with amitite, thereby further improving the yield. As a specific example of such a method,
For example, a part of the activator supplied in advance may be left in the flow channel, and 7 migite may be supplied thereto and covered while being mixed in the flow channel. Examples include methods for supplying agents.
また上記のようなカップリング工程は、通常１０〜５０
’Ｃの温度で行なわれることか好ましい。In addition, the above coupling step usually takes about 10 to 50 minutes.
Preferably, it is carried out at a temperature of 'C.
このようにして脱保護基されたポリスクレオチドか存（
「覆る反応系に活性化剤を供給した後、この反応系を窒
素などの不活性ガスによってバブリングして、脱保護基
されるポリスクレオチドと活性化剤とを充分に接触さけ
ることか好ましい。Polyscleotide deprotected in this way exists (
After supplying the activating agent to the reaction system to be covered, it is preferable to bubble the reaction system with an inert gas such as nitrogen to avoid sufficient contact between the polyscleotide to be deprotected and the activating agent.
次に、脱保Ａｎされたポリヌクレオチドと活性化剤とか
存在する反応系に、上１本のようにアミダイトを供給す
るか、アミダイトは通常溶剤とともに反応系に供給され
、この溶剤としては、活性化剤を希釈づるのに用いた溶
剤と同様なものが用いられる。このようにしてアミダイ
１〜を反応系に供給すると、アミダイトは活性化剤によ
り活性化されて脱保護基されたポリヌクレオチドと反応
して、鎖長が延長さけたポリヌクレオチドか収率よくし
かも短時間で（ｑられる。したかってヌクレオチドが９
０個以上つらなった長鎖のポリヌクレオチドを含成りる
ことができる。Next, amidite is supplied to the reaction system where the debonded polynucleotide and activator are present, as shown in the above example, or amidite is usually supplied to the reaction system together with a solvent. The same solvent used to dilute the curing agent is used. When amidites 1~ are supplied to the reaction system in this way, the amidites are activated by the activator and react with the deprotected polynucleotide, resulting in a polynucleotide with a short chain length or a short polynucleotide with high yield. (q) in time. Therefore, the number of nucleotides is 9
It can contain zero or more long-chain polynucleotides.
す；２保４阜されたポリヌクレオチド１モル当り、活性
化剤は２〜５モルの２，１１合で用いられることか好ま
しく、またアミダイトは脱保護すされたポリスクレオチ
ド１当量当り２〜１０当量の割合で用いられることか好
ましい。Preferably, the activating agent is used in 2 to 5 moles of 2,11 molecules per mole of the deprotected polynucleotide, and the amidite is used in an amount of 2 to 10 moles per mole of the deprotected polynucleotide. It is preferred that they be used in equivalent proportions.
これに対して、カップリング工程を、１１）１保護基さ
れたポリヌクレオチドが存在する反応系に、活性化剤と
７ミグイトとの混合物を供給りることによって行なう場
合には、脱保６”ｔ ；、ｉＧされたポリヌクレオチド
とアミダイトとの反応速度は近くしかも鎖長が延長され
たポリヌクレオチドを本発明はどに収率よ＜１′７るこ
とはできない。On the other hand, when the coupling step is carried out by supplying a mixture of an activating agent and a 7-miguite to a reaction system in which a 11) 1-protected polynucleotide is present, the deprotected 6" The reaction rate of the iG-treated polynucleotide with the amidite is similar, but the present invention cannot achieve a yield of polynucleotide with an extended chain length of <1'7.
このようなカップリング工程を、ポリヌクレオヂド合成
装置を用いて行なうには、制御手段１２を下記のように
制御ツればよい。In order to perform such a coupling step using a polynucleotide synthesizer, the control means 12 may be controlled as described below.
まず、電磁弁２４．２９を聞く。電磁弁２ＩＩを開くと
、点線部分と実線部分が連通することがらＮ２ガスの圧
力でビン６から活性化剤（テトラゾール／アトセニトリ
ル／テトラヒドロフラン）昆合溶）１１）が送り出され
る。このときの電磁”；ｔ ２４の開時間は、反応器１
１内の担体をひたＪことがてぎる程度の量の活性化剤か
ビン６から送り出される時間に設定されていることか好
ましい。次に電磁弁１９を開く。電磁弁１９の開時間は
、活性化剤を反応器１１に送り込んで担持体をひたし、
かつ瞬間的ないしは数秒間程度のバブリングを可能とづ
る時間に設定されていることが好ましい。次いで、例え
ば電磁弁２５を聞く。電磁弁２５の開時間は、カップリ
ングに必要なｆＩ）のアミダイ１〜試薬／溶剤（アセト
ニトリル）溶液が送る出される時間に設定されているこ
とが好ましい。この後、必要に応じて電磁弁２４を再庭
聞にＪることもできる。First, listen to solenoid valve 24.29. When the electromagnetic valve 2II is opened, the dotted line portion and the solid line portion communicate with each other, so that the activator (tetrazole/atocenitrile/tetrahydrofuran) 11) is sent out from the bottle 6 under the pressure of N2 gas. At this time, the opening time of electromagnetic wave t24 is as follows:
Preferably, the time is set such that an amount of the activating agent is delivered from the bottle 6 to the extent that the carrier in the bottle 6 can be drained. Next, open the solenoid valve 19. The opening time of the solenoid valve 19 is determined by feeding the activator into the reactor 11 to soak the carrier,
It is also preferable that the time is set to allow instantaneous or several seconds of bubbling. Then listen to the solenoid valve 25, for example. It is preferable that the opening time of the solenoid valve 25 is set to the time during which the amidi 1 to reagent/solvent (acetonitrile) solution of fI required for coupling is delivered. Thereafter, the solenoid valve 24 can be turned on again if necessary.
ここで、電磁ｊ’ｉ ２４の合訓開萌間は、縮合反応に
必要なけよりも若干多い程度の活性化剤をビン６から送
り出す時間になっている。Here, the opening period of the electromagnetic j'i 24 is the time for sending out from the bottle 6 slightly more activator than is necessary for the condensation reaction.
このようにしてアミダイト試薬／溶剤（アセｌ−二トリ
ル）溶液と活性化剤を送り出した後、電磁弁を１９を開
く。電磁弁１９の開時間は、Ｊｆｉ１４ｂ、電磁弁２４
〜２９内に残ったアミダイト試薬／溶剤（アセトニトリ
ル）溶液ｄ５よびび活（４化剤が存在する場合にはその
活性化剤を反応器１１に送り込み縮合反応が終了づるま
での時間に設定されている。After discharging the amidite reagent/solvent (acetyl-nitrile) solution and activator in this manner, the solenoid valve 19 is opened. The opening time of the solenoid valve 19 is Jfi14b, solenoid valve 24
The amidite reagent/solvent (acetonitrile) solution d5 remaining in ~29 and the activation agent (if the activating agent is present, the activating agent is sent to the reactor 11 and the time is set until the condensation reaction is completed. There is.
ビン７〜１０から二種類のアミダイト試薬／′溶剤（ア
セトニトリル）溶液を退り出す場合には、（例えばＡと
Ｇ、ＡとＴ、ＧとＴなど）、電磁弁２５〜２８の開時間
は一種類のアミダイト試薬／溶剤（アセトニトリル）溶
液を送り出すときの開時間の２分の１に設定され、また
二種類（例えばＡとＧとＣ，ＡとＧとＴ、ＡとＣとＴな
ど）のとき、電磁弁２５〜２８の開時間は一種類のとき
の開時間の３分の１に設定されている。 カップリング
反応中は、電磁：？ １９か開状態になってＮ２ガスか
流路１４ｂおよび電磁弁２４〜２８内に残ったアミダイ
ト試薬／溶剤（アセトニトリル）溶液を活性化剤ととも
に反応器１１に送り込み、バブリングか行なわれる。バ
ブリングは、間欠的に続行されることが好ましい。例え
ば、０．１〜１．０秒程度Ｎ２を供給した後２〜１０秒
程；哀供給を停止１−シて行う。ここでカップリング反
応に凹づる時間は、結合重る塩基によりそれぞれ設定さ
れ、Ｃおよび王が２０秒、Ａが１４秒、Ｇ ｈ）１８秒
であって、ＣおよびＴ＞Ｇ＞△の関係である。When discharging two types of amidite reagent/solvent (acetonitrile) solutions from bottles 7-10 (for example, A and G, A and T, G and T, etc.), the opening time of solenoid valves 25-28 is It is set to half the opening time when delivering one type of amidite reagent/solvent (acetonitrile) solution, and two types (for example, A, G, and C, A, G, and T, A, C, and T, etc.) At this time, the opening time of the electromagnetic valves 25 to 28 is set to one-third of the opening time when one type is selected. During the coupling reaction, electromagnetic:? 19 is opened, the amidite reagent/solvent (acetonitrile) solution remaining in the N2 gas flow path 14b and the electromagnetic valves 24 to 28 is sent into the reactor 11 together with the activator, and bubbling is performed. Bubbling is preferably continued intermittently. For example, after supplying N2 for about 0.1 to 1.0 seconds, the supply is stopped for about 2 to 10 seconds. Here, the time required for the coupling reaction is set by the overlapping bases, and is 20 seconds for C and A, 14 seconds for A, and 18 seconds for Gh), and the relationship of C and T>G>△. It is.
その後、電磁弁２９と３０．３１を交Ｈに開閉しなから
残溶）１１を排出づる。電”Ｉｔｋ弁２９０手前に内圧
をかけて行われる。Thereafter, the solenoid valves 29 and 30, 31 are opened and closed in alternating current, and the residual solution 11 is discharged. This is done by applying internal pressure in front of the electric valve 290.
このカップリングエト））が柊了しノζら、−１１７ソ
ビングエ程→酸化工稈→洗）争工程→ＩＢ２保護基工稈
→洗浄工程→乾燥工程をえて再びカップリングが工程が
行われる。This coupling process is carried out again through the -117 soaking process → oxidation process → washing process → IB2 protecting group process → washing process → drying process.
なお、以上の説明は、便宜上、デオギシリポ核酸を例に
子げて行’ｃＪ：ったが、本発明のポリヌクレオチドに
リホ核酸などのその他の核酸灯ｌも含まれることはいう
までもない。Note that, for convenience, the above explanation has been made using deoxyliponucleic acid as an example, but it goes without saying that the polynucleotide of the present invention also includes other nucleic acids such as liponucleic acid.
発明の効果
本発明によれば、ポリヌクレオチド合成装買を用いて、
脱保護基工程、カップリング工程、酸化工程、キャッピ
ング工程の各工程をこの順序であるいは脱１呆８基工程
、カンプリング工程、キャッピング工程、酸化工程の順
序で繰返して行’（Ｅうことによりポリヌクレオチドを
合成りるに際して、カップリング工程を、反応系に予め
活＋ｌ他剤を供給して活性化剤と脱保占Ｍされたポリヌ
クレオチドとを接触させた後に、アミダイトを反応系に
供給してアミダイトを活性化剤により活性化し、このア
ミダイトと脱保６塁されたボリヌクレＡヂドとを反応さ
けることにより行なっているので、ボリヌクレオチドの
合成収率をγｈめることによって長鎖のポリスクレオチ
ドを合成することができるとともにポリヌクレオチドを
短時間で合成りることがてき、しかもアミダイトと活性
化剤との混合を行なう千１祐反応器が不用とすることが
できる。Effects of the Invention According to the present invention, using polynucleotide synthesis equipment,
The deprotection step, the coupling step, the oxidation step, and the capping step are repeated in this order, or the deprotection step, the campling step, the capping step, and the oxidation step are repeated in this order. When synthesizing polynucleotides, the coupling step is performed by supplying an activating agent to the reaction system in advance and bringing the activating agent into contact with the deoccupied polynucleotide, and then supplying amidites to the reaction system. This is done by activating the amidite with an activator and avoiding the reaction between the amidite and the deprotected 6-base polynucleotide, so that long-chain polynucleotides can be synthesized by increasing the polynucleotide synthesis yield. Not only can polynucleotides be synthesized, but also polynucleotides can be synthesized in a short time, and furthermore, a 1,100-liter reactor for mixing amidites and an activator can be made unnecessary.
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
ら実施例に限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be explained below using Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
実施例１
図面に示すようなポリヌクレオチド合成菰四を用いて、
ヌクレオチドがそれぞれ３０飼、６０個、および９０個
個連なったポリヌクレオチドを合成した。Example 1 Using polynucleotide synthesis as shown in the drawing,
Polynucleotides each having 30, 60, and 90 nucleotides were synthesized.
この際、カップリング工程を、１；２保護基されたポリ
ヌクレオチドが存在する反応系に予め活性剤を供給し、
この反応系を窒素でバブリングして活１生化剤と脱保ぬ
基されたポリスクレオチドとを接触させた後に、アミダ
イドを反応系に供給して）７ミダイトを活性化し、この
アミダイトと１１（２保占早されたポリスクレオチドと
を反応さＵることにＪ−つて行なった。At this time, the coupling step is performed by supplying an activator in advance to the reaction system in which the 1:2-protected polynucleotide is present,
After bubbling the reaction system with nitrogen to bring the activation agent into contact with the unretained polyscleotide, amidite is supplied to the reaction system to activate the 7midite, and the amidite and 11(2) A reaction was carried out with the prepolymerized polyscleotide.
このようにしてポリヌクレオシードを合成し、１：ｔら
れたポリスクレオチドをポリスクレオチドキナーゼによ
って５−末端を［γ３２−ＤＥＡＴＰを用いて標識し、
電気泳動にて泳動後、Ａ−トラジオグラフにより分析し
、メインバンドのイ１無によりその存在を確認した。目
的とするポリヌクレオチドの存在が、充分にＴｉ１ｒ
＝’２された場合を良とし、かなり確認された場合を可
とし、確ｈ工）されなかった場合を不可とした。Polynucleotide seeds were synthesized in this way, and the 5-terminus of the 1:t polynucleotide was labeled with [γ32-DEATP] using polynucleotide kinase.
After electrophoresis, it was analyzed by A-radiograph, and its presence was confirmed by the absence of the main band. The presence of the target polynucleotide is sufficient for Ti1r
= '2' was considered acceptable, cases where it was confirmed were considered acceptable, and cases where it was not confirmed were considered unacceptable.
結果を表１に示す。The results are shown in Table 1.
比較例１
実施例１において、カップリング工程を、１１（１保Ｋ
ｌされたポリスクレオチドが（ｊ存する反応系に、活性
化剤とアミダイトとの混合物を一挙に供給した以外は、
実施例１と同様にした。Comparative Example 1 In Example 1, the coupling step was
Except that the mixture of activator and amidite was supplied all at once to the reaction system in which the polyscleotide was present.
The same procedure as in Example 1 was carried out.
結果を表１に示す。The results are shown in Table 1.
また比較例１では、ヌクレオチドか９０（Ｉ！］連らな
った９０ｍｅｒを合成するのに約２３時間かかったが、
実施例１では約８時間かかった。In Comparative Example 1, it took about 23 hours to synthesize a 90mer consisting of 90 (I!) nucleotides.
In Example 1, it took about 8 hours.
表 １
この表１より、ポリヌクレオヂド合成菰石を用いてポリ
ヌクレオチドを合成するに際して、カップリング工程を
本発明で特定Ｊる方法に従って行なうことにより、ポリ
ヌクレオチドの合成収捧′−を８ｊめることがてざるこ
とがわかる。Table 1 From Table 1, it is found that when synthesizing polynucleotides using polynucleotide-synthesizing phyllite, the synthesis cost of polynucleotides can be reduced by 8j by performing the coupling step according to the method specified in the present invention. I can see that it is not possible.
第１図は、本発明で用いられるポリヌクレΔチド合成装
置の３１！明図でおる。
１・・・ボンベ ２〜６・・・溶剤、試薬ビン７〜
１０・・・原料ビン １１・・・反応器１２・・・■
り御手段Figure 1 shows 31! of the polynucleotide synthesis apparatus used in the present invention. It's a clear picture. 1...Cylinder 2-6...Solvent, reagent bottle 7-
10...Raw material bottle 11...Reactor 12...■
means of control
Claims (1)
、溶媒などを所定の順序で反応器に給液し、次いで排出
するように構成されたポリヌクレオチド合成装置を用い
て、脱保護基工程、カップリング工程、酸化工程、キャ
ッピング工程の各工程をこの順序であるいは脱保護基工
程、カップリング工程、キャッピング工程、酸化工程の
順序で繰返して行なうことによりポリヌクレオチドを合
成するに際して、カップリング工程を、反応系に予め活
性化剤を供給して、活性化剤と脱保護基されたポリヌク
レオチドとを接触させた後に、アミダイトを反応系に供
給して脱保護基されたポリヌクレオチドとを反応させる
ことにより行なうことを特徴とする、ポリヌクレオチド
の合成法。1) Using a polynucleotide synthesizer configured to supply reaction materials, reagents, solvents, etc. necessary for polynucleotide synthesis reactions into a reactor in a predetermined order and then discharge them, the deprotection group step, cup When synthesizing a polynucleotide by repeating the steps of a ring step, an oxidation step, and a capping step in this order or in the order of a deprotecting group step, a coupling step, a capping step, and an oxidation step, the coupling step is Supplying an activating agent to the reaction system in advance and bringing the activating agent into contact with the deprotected polynucleotide, then supplying amidite to the reaction system to react with the deprotected polynucleotide. A method for synthesizing polynucleotides, characterized in that it is carried out by.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22458786A JPS6379896A (en) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | Synthesis of polynucleotide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22458786A JPS6379896A (en) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | Synthesis of polynucleotide |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6379896A true JPS6379896A (en) | 1988-04-09 |
Family
ID=16816069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22458786A Pending JPS6379896A (en) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | Synthesis of polynucleotide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6379896A (en) |
-
1986
- 1986-09-22 JP JP22458786A patent/JPS6379896A/en active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4517338A (en) | Multiple reactor system and method for polynucleotide synthesis | |
| US6890723B2 (en) | Method of shielding biosynthesis reactions from the ambient environment on an array | |
| EP0906917B1 (en) | Method for chemical synthesis of oligonucleotides | |
| US4483964A (en) | Reactor system and method for polynucleotide synthesis | |
| US9644225B2 (en) | Programmable oligonucleotide synthesis | |
| US6165778A (en) | Reaction vessel agitation apparatus | |
| JPH06503809A (en) | Method for synthesizing oligonucleotides with random codons | |
| US20210047668A1 (en) | Polymer synthesis system and method | |
| EP0097805A2 (en) | Nucleoside phosphite compounds | |
| JPH0368593A (en) | Method and apparatus for automatic synthesis and purification of polynucleotide | |
| JPH08506813A (en) | Automated synthesis of oligonucleotides | |
| JPH03502577A (en) | Phosphoramidite reagent for chemical synthesis of modified DNA | |
| CN110545906A (en) | apparatus for synthesizing oligonucleotides | |
| WO2019051430A1 (en) | Biopolymer synthesis system and method | |
| JPS6331480B2 (en) | ||
| NO811627L (en) | PROCEDURE FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES | |
| JPS6379896A (en) | Synthesis of polynucleotide | |
| JPS6169788A (en) | Probe having modified adenine group | |
| TWI812647B (en) | Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers via fast-flow synthesis | |
| US20070282098A1 (en) | Process for combining parallel oligonucleotide synthesis | |
| CN111479818A (en) | Method and system for synthesizing oligonucleotides | |
| JPS6379897A (en) | Storage of polynucleotide | |
| JPS6379895A (en) | Synthesis of polynucleotide | |
| JPS6379898A (en) | Control of deprotection reaction in polynucleotide synthesis reaction | |
| CN108997460A (en) | The fluoro- 2`-C- methyluridine phosphoramidite monomer of 2`- deoxidation -2`- and its synthetic method |