JPS637782A - 微生物学的に製造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−アシラ−ゼ、およびその取得法 - Google Patents
微生物学的に製造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−アシラ−ゼ、およびその取得法Info
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Classifications
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、微生物学的に製造されたα−アセチルアミノ
桂皮酸−アシラーゼおよびその取得法に関する。
桂皮酸−アシラーゼおよびその取得法に関する。
本発明は、以下の種類の反応に触媒作用する、これまで
記述されなかった酵素に関する:HN−C−CH3−H
Ac NH2殊に十分な反応率がR−C,H,
−で得られる。
記述されなかった酵素に関する:HN−C−CH3−H
Ac NH2殊に十分な反応率がR−C,H,
−で得られる。
問題点を解決するための手段
本発明による化合物、すなわちα−アセチルアミン桂皮
酸−アシラーゼは以下の%EEtl−特徴とする: 1)反応性: α−7セチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−β−フェニ
ル−プロピオン酸ないLHフェニルピルビン酸の形成下
に反応する; 2)基質特異性: α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解するが、但し他の
α−アセチルアミノカルボン酸、例えばα−アセチルア
ミノアクリル酸またはN−アセチルフェニルアラニソを
加水分解しない; 6)最適−価: 蛙適−価が7.5±1である; 4) pi−1安定性ニ ー範囲6.9〜9.4で十分な安定性、すなわち4°C
で2週間後の反応率90%以上を示す;5)最適温度: 最適温度が、−価7.5で52°Cである:6)熱安定
性: 55℃で、30分の培養後になお反応率80%が検出可
能であるニ ア)阻止剤および活性剤の影響: と9わけ水銀化合物、すなわちp−水銀ベンゾエートお
よびHgCl2、CaCl2および。−フェナンスロリ
ンが阻止的に作用し、ジチオトレイトール(1mモル)
の添加がこの酵素を活性化する: 8)分子量: 分子量が50000±5000ドルトンである: 9)構成単位: 分子が、それぞれ26000±3000ドルトンを有す
る2つの同じ大きさの構成単位より成る; 10、)α−アセチルアミノ桂皮酸基質のp)17.5
におけるKM価が0.45771モルである。
酸−アシラーゼは以下の%EEtl−特徴とする: 1)反応性: α−7セチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−β−フェニ
ル−プロピオン酸ないLHフェニルピルビン酸の形成下
に反応する; 2)基質特異性: α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解するが、但し他の
α−アセチルアミノカルボン酸、例えばα−アセチルア
ミノアクリル酸またはN−アセチルフェニルアラニソを
加水分解しない; 6)最適−価: 蛙適−価が7.5±1である; 4) pi−1安定性ニ ー範囲6.9〜9.4で十分な安定性、すなわち4°C
で2週間後の反応率90%以上を示す;5)最適温度: 最適温度が、−価7.5で52°Cである:6)熱安定
性: 55℃で、30分の培養後になお反応率80%が検出可
能であるニ ア)阻止剤および活性剤の影響: と9わけ水銀化合物、すなわちp−水銀ベンゾエートお
よびHgCl2、CaCl2および。−フェナンスロリ
ンが阻止的に作用し、ジチオトレイトール(1mモル)
の添加がこの酵素を活性化する: 8)分子量: 分子量が50000±5000ドルトンである: 9)構成単位: 分子が、それぞれ26000±3000ドルトンを有す
る2つの同じ大きさの構成単位より成る; 10、)α−アセチルアミノ桂皮酸基質のp)17.5
におけるKM価が0.45771モルである。
本発明によるα−アセチルアミノ桂皮酸−7シラーゼは
、アバディーン(スコツトランド)在のナショナル・コ
レクション・オプ・インダストリアル、バクテリア(N
ational Co11ectionof 工ndu
strial Bacteria jn Aberde
en (Scho−ttland ) )に1986年
2月14日付で番号NcrB12246およびNCIB
12247下に寄託された22iのブレビバクテリウ
ム菌株を使用し得られることができる。
、アバディーン(スコツトランド)在のナショナル・コ
レクション・オプ・インダストリアル、バクテリア(N
ational Co11ectionof 工ndu
strial Bacteria jn Aberde
en (Scho−ttland ) )に1986年
2月14日付で番号NcrB12246およびNCIB
12247下に寄託された22iのブレビバクテリウ
ム菌株を使用し得られることができる。
以下の特性は、これ2つの微生物がブレビバクテリウム
属であることを示す: これらは、世代の増大とともに球菌状態へ移行するダラ
ム陽性の短棒菌中で成長する。細、胞が不動であ夛かつ
胞子を形成しない。成長が厳密に好気性に行なわれる。
属であることを示す: これらは、世代の増大とともに球菌状態へ移行するダラ
ム陽性の短棒菌中で成長する。細、胞が不動であ夛かつ
胞子を形成しない。成長が厳密に好気性に行なわれる。
グルコースから酸が形成されない。カタラーゼ反応およ
び硝酸塩還元が正、尿素分解が正、ゼラチン−、カゼイ
ン−および殿粉分解が負、H2s形成が負、41℃にお
ける成長が負である。細胞壁糖として、アラビノース、
マンノースおよびガラクトースが検出された。これら微
生物は、親液化培養物として、−80°でまたは液体窒
素中−196℃で貯蔵されることができる。使用培養物
が傾斜寒天試験管(ACA媒体)で保持される。
び硝酸塩還元が正、尿素分解が正、ゼラチン−、カゼイ
ン−および殿粉分解が負、H2s形成が負、41℃にお
ける成長が負である。細胞壁糖として、アラビノース、
マンノースおよびガラクトースが検出された。これら微
生物は、親液化培養物として、−80°でまたは液体窒
素中−196℃で貯蔵されることができる。使用培養物
が傾斜寒天試験管(ACA媒体)で保持される。
本発明によるα−アセチルアはノ桂皮酸−アシラーゼを
取得するため、ブレビバクテリウム属菌NCより 12
246 またはNCIB 12247カζ炭素および窒
素の給源、チアミン、鉱物塩および、誘導物質としての
α−アセチルアミノ桂皮酸t−官有する水性培養液中で
、出発−価6.0〜8.0および温度25〜35°Cで
通気培養され、 。
取得するため、ブレビバクテリウム属菌NCより 12
246 またはNCIB 12247カζ炭素および窒
素の給源、チアミン、鉱物塩および、誘導物質としての
α−アセチルアミノ桂皮酸t−官有する水性培養液中で
、出発−価6.0〜8.0および温度25〜35°Cで
通気培養され、 。
細胞物質が分離され、かつ酵素が細胞から単離される。
例えば、多重の酵素が、ブレビバクテリウム属菌NCI
B 12246またはNCIB 12247 tl”自
体公知の方法で所望の規模、例えば10を規模のバイオ
リアクタ中で培養するようにして得られることができる
。有効な培養に1要なのが以下の通シであるニ ー十分な通気(好気性微生物に不可欠);−媒体中の出
発−価6.0〜8.0; −鉱物塩の存在(例えば、とうもろこし膨化水として複
合せる形で); −わずかな量のチアミン(1〜2μM/l )の存在、
および 一酵素誘導用媒体中のACA (0,2〜0.4]Lt
パーセント)の存在。
B 12246またはNCIB 12247 tl”自
体公知の方法で所望の規模、例えば10を規模のバイオ
リアクタ中で培養するようにして得られることができる
。有効な培養に1要なのが以下の通シであるニ ー十分な通気(好気性微生物に不可欠);−媒体中の出
発−価6.0〜8.0; −鉱物塩の存在(例えば、とうもろこし膨化水として複
合せる形で); −わずかな量のチアミン(1〜2μM/l )の存在、
および 一酵素誘導用媒体中のACA (0,2〜0.4]Lt
パーセント)の存在。
酵素の単離は、細胞を砕解した後、自体公知の酵素精製
法を組合せることによシ可能である。
法を組合せることによシ可能である。
このものは、中間工程ヲ紗てα−イミノ−β−フェニル
プロピオン酸ないしにフェニルピルビン酸を生じる酵素
反応用の結合酵素系の取分として使用されることができ
る。従って、例えばこのものij、ACA’i相応する
α−アミノカルボン酸まfcはα−ヒドロキシカルボン
酸へ変換するため、適当なデヒドロゲナーゼと組合せる
ことができる。このものは、例えばACA i、L−フ
ェニルアラニン−デヒドロゲナーゼと組合せた場合L−
7二二ルアラニンヘf換L、L−2−ヒドロキシ−4−
メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼと組合せた場合し
一フェニル乳酸へ変換し、かつD−2−ヒドロキシ−4
−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼと組合せた場合
D−フェニル乳敗へ変換する。
プロピオン酸ないしにフェニルピルビン酸を生じる酵素
反応用の結合酵素系の取分として使用されることができ
る。従って、例えばこのものij、ACA’i相応する
α−アミノカルボン酸まfcはα−ヒドロキシカルボン
酸へ変換するため、適当なデヒドロゲナーゼと組合せる
ことができる。このものは、例えばACA i、L−フ
ェニルアラニン−デヒドロゲナーゼと組合せた場合L−
7二二ルアラニンヘf換L、L−2−ヒドロキシ−4−
メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼと組合せた場合し
一フェニル乳酸へ変換し、かつD−2−ヒドロキシ−4
−メチルペンタン酸−デヒドロゲナーゼと組合せた場合
D−フェニル乳敗へ変換する。
実施例
以下に、本発明を実施例につき詳説する。実施例中の「
パーセンテージ」は、他に別記しなイ1ilr:!it
パーセント」を表わす。
パーセンテージ」は、他に別記しなイ1ilr:!it
パーセント」を表わす。
例1:α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼ産生菌の
スクリーニング ブラウンシュヴアイク(Braunschweig)近
郊からの10個の土壌テンプルを、無菌の塩溶g (N
aCtO−9%)に懸濁し、常法で希釈し、かつ1部分
の水性上澄みg、tl−固体培地を有するベトリ皿へへ
らでなでつけた。この培地は以下の組#:を有した(
ACA媒体): α−アセチルアミノ桂皮酸(ACA) 5 、!
T’(NH4)2804 0
−25&に2HPO42M 酵母エキス 0.2&トレー
サーの#y 1成Mg5O,・
7H20100■ CaCO3201nQ 蒸溜水 1を寒天
209 一価 7・5 この媒体をオートクレーブ処理することによりFj、菌
し、冷却後に、媒体1を当り滅菌濾過せるビタミン浴g
11Ltおよびシクロヘキシミド(アクチジオン)50
即t’添加し、かつこの培地を無菌のペトリ皿へ注入し
た〔ビタミン溶液の組成は、H,G、シュレーグル(8
chlegel )1アルデマイネ・ミクロピオロギー
“(Allge−mejne Mikrobjolog
ie )、チーメ・フエルラーク(Thjeme Ve
rlag)、169頁(1981年)による〕。
スクリーニング ブラウンシュヴアイク(Braunschweig)近
郊からの10個の土壌テンプルを、無菌の塩溶g (N
aCtO−9%)に懸濁し、常法で希釈し、かつ1部分
の水性上澄みg、tl−固体培地を有するベトリ皿へへ
らでなでつけた。この培地は以下の組#:を有した(
ACA媒体): α−アセチルアミノ桂皮酸(ACA) 5 、!
T’(NH4)2804 0
−25&に2HPO42M 酵母エキス 0.2&トレー
サーの#y 1成Mg5O,・
7H20100■ CaCO3201nQ 蒸溜水 1を寒天
209 一価 7・5 この媒体をオートクレーブ処理することによりFj、菌
し、冷却後に、媒体1を当り滅菌濾過せるビタミン浴g
11Ltおよびシクロヘキシミド(アクチジオン)50
即t’添加し、かつこの培地を無菌のペトリ皿へ注入し
た〔ビタミン溶液の組成は、H,G、シュレーグル(8
chlegel )1アルデマイネ・ミクロピオロギー
“(Allge−mejne Mikrobjolog
ie )、チーメ・フエルラーク(Thjeme Ve
rlag)、169頁(1981年)による〕。
接種したプレートを、6〜4日27°Cで培養した。微
生物の生長後、適当なコロニー数(50〜200)k有
する寒天プレートからコロニーサンプルを無菌でビロー
ドスタンパ(Samtste−mpel)に採夛、その
後に、異なる寒天培地金含有スる2つのプレートにスタ
ンプ移植した:1方のプレートが前記ACA媒体を含有
し、他方が以下の組成を有するフェニルアラニン含有培
養液(フェニルアラニン媒体〕を含有した:L−フェニ
ルアラニン 10IKW2P0.
2 !1酵母
エキス 0.2I寒天
20 & 蒸溜水 1を一1曲を7
.2に調節した。
生物の生長後、適当なコロニー数(50〜200)k有
する寒天プレートからコロニーサンプルを無菌でビロー
ドスタンパ(Samtste−mpel)に採夛、その
後に、異なる寒天培地金含有スる2つのプレートにスタ
ンプ移植した:1方のプレートが前記ACA媒体を含有
し、他方が以下の組成を有するフェニルアラニン含有培
養液(フェニルアラニン媒体〕を含有した:L−フェニ
ルアラニン 10IKW2P0.
2 !1酵母
エキス 0.2I寒天
20 & 蒸溜水 1を一1曲を7
.2に調節した。
これらプレー)k再び3〜5日27℃で培養した。コロ
ニーサンプルを比較することにより、ACA媒体でもま
たフェニルアラニン媒体でも成長することのできる同じ
微生物が検出されることができた。これらを採りかつ次
いでACA媒体に保持した。
ニーサンプルを比較することにより、ACA媒体でもま
たフェニルアラニン媒体でも成長することのできる同じ
微生物が検出されることができた。これらを採りかつ次
いでACA媒体に保持した。
その後に、単離されたこれら微生物全常法で納置を検査
した(希釈塗布、顕微鏡検査)。その後に、同一と認め
られる菌株を、准状媒体100N(2つのじゃま板を有
する500Mエルレンマイヤーフラスコ)中で27℃で
円運動振とり装置上12 Orpmで繁殖させた。この
液状媒体は以下の組成?!−有しfc= α−7セチルアミノ桂皮#1.(ACA) 31
1(NH4)2804 0−2
59酵母エキス 1gとうもろ
こし膨化水(乾燥粉末> 5flK、HPo、
211蒸溜水
1tpH7,5 2〜6日後、振とうフラスコの内容物を遠心分離しく2
0分冷間遠心分離機中10000&で)、かつ沈殿せる
細胞を0.05 Mの燐酸カリウム緩衝液(pH7,4
)に懸濁し7?、(バクテリア−含水物質11轟シ緩衝
液4M)0 その後に、この懸濁液中の微生物全常法で砕解する必要
がある(例えば、微小ながラスビーズを使用する振とう
、超音波処理、フレンチプレス)。本発明者等は、懸濁
液にガラスピーズ(0,1〜0.2 mφ)き混合し、
その場合細胞懸濁液1成1)ガラスピーズ2yを使用し
、かつその後に試験管中で10分実験呈用振とう装置〔
リアツクス(Reax ) 1− D −R型、ハイド
オルフ社(Firma Hejdolph ) ) f
使用し混合した。これら条件下に、大部分の分離物を十
分に砕解することができた。禾浴解の細胞成分およびガ
ラスピーズを遠心分離によシ分離した〔エツペンドル7
卓上遠心分離機(Eppendorf−Tischze
ntrifuge )中1200 Orpmで2分〕。
した(希釈塗布、顕微鏡検査)。その後に、同一と認め
られる菌株を、准状媒体100N(2つのじゃま板を有
する500Mエルレンマイヤーフラスコ)中で27℃で
円運動振とり装置上12 Orpmで繁殖させた。この
液状媒体は以下の組成?!−有しfc= α−7セチルアミノ桂皮#1.(ACA) 31
1(NH4)2804 0−2
59酵母エキス 1gとうもろ
こし膨化水(乾燥粉末> 5flK、HPo、
211蒸溜水
1tpH7,5 2〜6日後、振とうフラスコの内容物を遠心分離しく2
0分冷間遠心分離機中10000&で)、かつ沈殿せる
細胞を0.05 Mの燐酸カリウム緩衝液(pH7,4
)に懸濁し7?、(バクテリア−含水物質11轟シ緩衝
液4M)0 その後に、この懸濁液中の微生物全常法で砕解する必要
がある(例えば、微小ながラスビーズを使用する振とう
、超音波処理、フレンチプレス)。本発明者等は、懸濁
液にガラスピーズ(0,1〜0.2 mφ)き混合し、
その場合細胞懸濁液1成1)ガラスピーズ2yを使用し
、かつその後に試験管中で10分実験呈用振とう装置〔
リアツクス(Reax ) 1− D −R型、ハイド
オルフ社(Firma Hejdolph ) ) f
使用し混合した。これら条件下に、大部分の分離物を十
分に砕解することができた。禾浴解の細胞成分およびガ
ラスピーズを遠心分離によシ分離した〔エツペンドル7
卓上遠心分離機(Eppendorf−Tischze
ntrifuge )中1200 Orpmで2分〕。
その後に、この上置み液を#累源(粗製エキス)として
試験した。酵素を検出するため、測光法試験を使用した
。試験バッチは以下を含有した二NADH0,1mM ACA 10mM
L−フェニルアラニン−デヒドロ NADHの34 OnInにおける吸光夏低減が測定さ
れた。得られた価から、試験がACA添加なしに進行し
た場合に得られた零価を差引いた・酵素活性t−国際単
位で記載した、その場合1単位がNADH1μモル/分
の低減を表わす。
試験した。酵素を検出するため、測光法試験を使用した
。試験バッチは以下を含有した二NADH0,1mM ACA 10mM
L−フェニルアラニン−デヒドロ NADHの34 OnInにおける吸光夏低減が測定さ
れた。得られた価から、試験がACA添加なしに進行し
た場合に得られた零価を差引いた・酵素活性t−国際単
位で記載した、その場合1単位がNADH1μモル/分
の低減を表わす。
この試験において最高の活性を示した凶株が、ブレビバ
クテリウム属菌57/3 (NCIB 12246)お
よび38/3 (N(JB 12247 )である。ア
シラーゼの大規模製造には菌株37/3に使用する。
クテリウム属菌57/3 (NCIB 12246)お
よび38/3 (N(JB 12247 )である。ア
シラーゼの大規模製造には菌株37/3に使用する。
例2:α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼの製造
a)ブレビバクテリウム属菌37/3の10を規模の培
養 バイオリアクタを使用し、これに媒体10tt−a填し
た。この媒体は、1を当9以下を官有した: ACA 3
、li’(NHa)*5O40−25g 酵母エキス 1yとうもろこ
し膨化水(乾燥粉末)109に、HPo、
2.9−価が7.5であった。
養 バイオリアクタを使用し、これに媒体10tt−a填し
た。この媒体は、1を当9以下を官有した: ACA 3
、li’(NHa)*5O40−25g 酵母エキス 1yとうもろこ
し膨化水(乾燥粉末)109に、HPo、
2.9−価が7.5であった。
滅菌後、この媒体に、48時間同じ媒体中で培養した前
培養物3QQIntを接種した。発酵装置中の成長条件
は以下の通りであった:温度 30°C 通気速度 空気60t/時間ター
ビンミキサ 25 Orpm種々の成
長時間でサンプル(1QQau)を採シ、かつこれら細
胞の酵素活性に関する試験により達成可能な最高酵素含
有率ないしは最有利な採取時点を確定した。さらに、培
養物成長の尺度として濁度(光密度) t−578nm
で測定した。土量の7シラーゼは、微生物が十分に成長
し去った場合に形成されると判明した。最高価に達した
後、酵素活性が相対的に迅速に再び低減する。
培養物3QQIntを接種した。発酵装置中の成長条件
は以下の通りであった:温度 30°C 通気速度 空気60t/時間ター
ビンミキサ 25 Orpm種々の成
長時間でサンプル(1QQau)を採シ、かつこれら細
胞の酵素活性に関する試験により達成可能な最高酵素含
有率ないしは最有利な採取時点を確定した。さらに、培
養物成長の尺度として濁度(光密度) t−578nm
で測定した。土量の7シラーゼは、微生物が十分に成長
し去った場合に形成されると判明した。最高価に達した
後、酵素活性が相対的に迅速に再び低減する。
b)粗抽出物の取得
バクテリア−言水物質(230,9)t−120mM燐
酸塩緩衝液(pH7,5)中に2−メルカゾトエタノー
ル0.1%の添加下に懸濁し、その結果細胞懸濁液の1
11度が40%であった(この場合の最終容積575M
)。細胞含有成分を、冷却せる懸濁液(〜4°C)から
、バッハオーフェン社(Firma Bachofen
)のガラスピーズミル〔ダイノミ& (Dyno−M
ill )、KDL型〕中で機械的に細胞砕解すること
によシ分離した。この場合、300μ容量のミル容器に
0.25〜0.5籠のガラスピーズを装填し、その結果
嵩容積255111が得られた(85%)1.砕解t、
ミキサ軸回転数300 Orpmおよび流量5t/hで
実施した。生成物の発熱を十分に回避するため、ミル容
器の冷却ジャケット並びにミキサ軸々承を、回転中に一
20℃のエチレングリコール溶液で冷却した。3回の通
過後に、砕解率90%が得られた。ホモジナイズ後に、
懸濁液の一価を苛性カリ溶液でp)17.5に調節した
。
酸塩緩衝液(pH7,5)中に2−メルカゾトエタノー
ル0.1%の添加下に懸濁し、その結果細胞懸濁液の1
11度が40%であった(この場合の最終容積575M
)。細胞含有成分を、冷却せる懸濁液(〜4°C)から
、バッハオーフェン社(Firma Bachofen
)のガラスピーズミル〔ダイノミ& (Dyno−M
ill )、KDL型〕中で機械的に細胞砕解すること
によシ分離した。この場合、300μ容量のミル容器に
0.25〜0.5籠のガラスピーズを装填し、その結果
嵩容積255111が得られた(85%)1.砕解t、
ミキサ軸回転数300 Orpmおよび流量5t/hで
実施した。生成物の発熱を十分に回避するため、ミル容
器の冷却ジャケット並びにミキサ軸々承を、回転中に一
20℃のエチレングリコール溶液で冷却した。3回の通
過後に、砕解率90%が得られた。ホモジナイズ後に、
懸濁液の一価を苛性カリ溶液でp)17.5に調節した
。
C)液−液分散
第1の分散工程で、細胞破片を粗抽出物から西ドイツ国
特許明細書第2639139号によシ分離する。この目
的で、混合物1.15に9中にポリエチレングリコール
6000 10(重量/菖量)%、p)18.0に相応
する燐酸塩緩衝剤7(1景/if量)係、塩化ナトリウ
ム0.05Mおよび粗抽出物575m1t含有する水性
の2相混合@を製造した。分散の平衡を得るため、この
2相混合物を1時間にわたり攪拌しかつ引続き遠心分離
により分離した。
特許明細書第2639139号によシ分離する。この目
的で、混合物1.15に9中にポリエチレングリコール
6000 10(重量/菖量)%、p)18.0に相応
する燐酸塩緩衝剤7(1景/if量)係、塩化ナトリウ
ム0.05Mおよび粗抽出物575m1t含有する水性
の2相混合@を製造した。分散の平衡を得るため、この
2相混合物を1時間にわたり攪拌しかつ引続き遠心分離
により分離した。
上相(7451M)がACA−アシラーゼ90%以上を
含有した。下相が細胞破片並びに、これら条件下に下相
中へ抽出きれた蛋白−it金含有、かつこれを廃却した
。酵素金言有する上相に、NLP:谷!1.5tに対し
、plL6.0に相応する燐酸塩緩衝剤8(It警/谷
甘せ%および塩化ナトリウム0.6 M k混合しかつ
1時間撹拌した。形成されたポリエチレングリコール/
塩混合物は、沈殿容器中でほぼ1時間で完全に沈殿する
ことができた。この分散工程において、ACAアシラー
ゼがほぼ完全に下相中へ抽出された。これら相の分離ヲ
、下相(1040μ)全排出することにより行なった。
含有した。下相が細胞破片並びに、これら条件下に下相
中へ抽出きれた蛋白−it金含有、かつこれを廃却した
。酵素金言有する上相に、NLP:谷!1.5tに対し
、plL6.0に相応する燐酸塩緩衝剤8(It警/谷
甘せ%および塩化ナトリウム0.6 M k混合しかつ
1時間撹拌した。形成されたポリエチレングリコール/
塩混合物は、沈殿容器中でほぼ1時間で完全に沈殿する
ことができた。この分散工程において、ACAアシラー
ゼがほぼ完全に下相中へ抽出された。これら相の分離ヲ
、下相(1040μ)全排出することにより行なった。
d) フェニル−セファロース(Phenyl−8e
pha−roae)CL−4BKよるりo”vトゲラフ
イーACA−アシラーゼt−宮有する塩に冨む下相を、
直接に疎水性のフェニルセファロースCL−4Bでクロ
マトグラフ処理した。この方法の利点は、塩に富む下相
の、クロマトグラフ工程前の時間のかかる透析がなくな
ることである。このフェニル−セファロースCL−4B
は、pH7,5に相応する燐酸塩緩衝剤50mM、2−
メルカプトエタノール0.1(谷!/容り%および硫酸
アンモニウムIMt−含有する緩衝液(出発緩衝液)に
対し平衡化されていた。第2の分散工程の下相’e、5
X11cInカラムへ装入しかつ2カラム容量の出発緩
−J#放で後洗浄し友。その後にACA−7シラーゼを
、pH7,5に相応する燐酸塩緩衝液1 mMで溶離し
た。
pha−roae)CL−4BKよるりo”vトゲラフ
イーACA−アシラーゼt−宮有する塩に冨む下相を、
直接に疎水性のフェニルセファロースCL−4Bでクロ
マトグラフ処理した。この方法の利点は、塩に富む下相
の、クロマトグラフ工程前の時間のかかる透析がなくな
ることである。このフェニル−セファロースCL−4B
は、pH7,5に相応する燐酸塩緩衝剤50mM、2−
メルカプトエタノール0.1(谷!/容り%および硫酸
アンモニウムIMt−含有する緩衝液(出発緩衝液)に
対し平衡化されていた。第2の分散工程の下相’e、5
X11cInカラムへ装入しかつ2カラム容量の出発緩
−J#放で後洗浄し友。その後にACA−7シラーゼを
、pH7,5に相応する燐酸塩緩衝液1 mMで溶離し
た。
e)モノQ (Mono q )による高速蛋白質液体
クロマトグラフィー(Fasi Protein Lj
quidChromatography : FPLC
)溶離物を、スーパー・ループ(5uper Loop
)を経て0−5X5c1nモノQカラム(FPLC:
スx−デン国つプサラ在ファーマシ7社(FirmaP
harmacia 、 Uppsala 、 Schw
eden )の装置〕へ装入しかつ圧力最高40 ba
rでクロマトグラフ処理した。蛋白質量58rn9に対
し、2行程が必要であった。その前にアニオン交換体ヲ
、−7,5に相応する燐酸塩緩衝液10 mMに対し平
衡化した(出発緩衝液)。
クロマトグラフィー(Fasi Protein Lj
quidChromatography : FPLC
)溶離物を、スーパー・ループ(5uper Loop
)を経て0−5X5c1nモノQカラム(FPLC:
スx−デン国つプサラ在ファーマシ7社(FirmaP
harmacia 、 Uppsala 、 Schw
eden )の装置〕へ装入しかつ圧力最高40 ba
rでクロマトグラフ処理した。蛋白質量58rn9に対
し、2行程が必要であった。その前にアニオン交換体ヲ
、−7,5に相応する燐酸塩緩衝液10 mMに対し平
衡化した(出発緩衝液)。
塩
ACAアシラーゼを、出発緩衝液中に7化ナトリウム0
.1〜0.4 M ?含有する直線的な201d勾配で
溶離した。溶離を塩化ナトリウム0.25〜0.3Mで
行なった。このようなりロマトグラフイーの時間に約2
0分あてることができる。
.1〜0.4 M ?含有する直線的な201d勾配で
溶離した。溶離を塩化ナトリウム0.25〜0.3Mで
行なった。このようなりロマトグラフイーの時間に約2
0分あてることができる。
f)スプロース(5uperose ) 12による高
速蛋白質液体クロマトグラフィー(FPLC)スプロー
ス12を充填したカラム(HR10/30)を、p)1
7.5に相応する燐酸塩緩衝剤50rILMおよび塩化
ナトリウム0.15Mt−含有する緩衝液に対し平衡化
した。Qカラムからの溶離物を、差当りアミコン社(F
a、 Au1con )のミニコン濃縮装置(Mini
cOn−KOnZentratOr )中で容積500
μtに濃縮しかつその後に2行程でそれぞれサンプルf
250μtを使用しスプロース12で濾別した。スプロ
ース12によるグル濾過(HR10/30カラム;圧力
〜60bar )の時間は約40分である。
速蛋白質液体クロマトグラフィー(FPLC)スプロー
ス12を充填したカラム(HR10/30)を、p)1
7.5に相応する燐酸塩緩衝剤50rILMおよび塩化
ナトリウム0.15Mt−含有する緩衝液に対し平衡化
した。Qカラムからの溶離物を、差当りアミコン社(F
a、 Au1con )のミニコン濃縮装置(Mini
cOn−KOnZentratOr )中で容積500
μtに濃縮しかつその後に2行程でそれぞれサンプルf
250μtを使用しスプロース12で濾別した。スプロ
ース12によるグル濾過(HR10/30カラム;圧力
〜60bar )の時間は約40分である。
活性のフラクションを合し、グリセリン50(TL量/
容f)%を混合しかつ一20°Cで凍結した。
容f)%を混合しかつ一20°Cで凍結した。
精製の結果を第1表に1とめた。
例6:α−アセチルアミノ桂皮酸−アシラーゼの誘導
a)培養媒体の変更
アシラーゼは、ブレビバクテリウム属菌37/3t−1
C−およびN給源としてのACA 含有する媒体中で培
養した場合に形成される。実際に酵素収率(U/、!i
l ACA)は相対的にわずかである。第2表に示し
たように、収率は、媒体が付加的に適当な窒素含有化合
物を含有した場合に増大されることができる。グリセリ
ンまたはグルコースのよりなC給源がアシラーゼ形成全
阻止する。
C−およびN給源としてのACA 含有する媒体中で培
養した場合に形成される。実際に酵素収率(U/、!i
l ACA)は相対的にわずかである。第2表に示し
たように、収率は、媒体が付加的に適当な窒素含有化合
物を含有した場合に増大されることができる。グリセリ
ンまたはグルコースのよりなC給源がアシラーゼ形成全
阻止する。
第2衣:媒体の組成との関連におけるアシラーゼ活性(
全ての媒体は、それぞれ KH2PO42& / L % ビタミン+トレーサ
ーを含有した:PHが7.5であった)媒体CIA)
u/l mu/mgACA (5)
33 60ACA (5) +
(NH4)2804 (0−25) 80 9
0ACA (5)生酵母エキス(1) 40
70ACA (5)+とうもろこし膨化 水(5) 100 95ACA
(5)+とうもろこし膨化 水(5) + (NH4)2804 (0,25)
110 95ACA (5)+グリセリン(10)
O0ACA (5)+グルコース(10)
O0b) ACA濃度の変更 とうもろこし膨化水 5g(NH4)2S
O40−25、S’ KI(2P0. 2 !1ビ
タミン浴液 1′トレーサー溶液
1MH2O1t より成るベース媒体に、種々の濃度のACA k添加し
た。第3表は、媒体が1を当りACA 2〜5g全含有
した場合に、粗抽出物の十分な活性が得られることを示
す。
全ての媒体は、それぞれ KH2PO42& / L % ビタミン+トレーサ
ーを含有した:PHが7.5であった)媒体CIA)
u/l mu/mgACA (5)
33 60ACA (5) +
(NH4)2804 (0−25) 80 9
0ACA (5)生酵母エキス(1) 40
70ACA (5)+とうもろこし膨化 水(5) 100 95ACA
(5)+とうもろこし膨化 水(5) + (NH4)2804 (0,25)
110 95ACA (5)+グリセリン(10)
O0ACA (5)+グルコース(10)
O0b) ACA濃度の変更 とうもろこし膨化水 5g(NH4)2S
O40−25、S’ KI(2P0. 2 !1ビ
タミン浴液 1′トレーサー溶液
1MH2O1t より成るベース媒体に、種々の濃度のACA k添加し
た。第3表は、媒体が1を当りACA 2〜5g全含有
した場合に、粗抽出物の十分な活性が得られることを示
す。
第3表:増大量のACAの存在において培養した場合の
酵素含有率 α−7シルアミノ桂皮酸 アシラーゼな
し 00 0・5 39 0.0361
51 0.0682 9
5 0.1003 112 0.
1084 136 0.1165
169 0.105ルアミノ桂皮酸
倹twからの加水分解による酢酸離脱、および後続する
、生じたフェニルぎルベートの、L−フェニルアラニン
−デヒドロゲナーゼの存在におけるL−フェニルアラニ
ンへの還元アミン化、またはフェニルピルベートへD−
2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼの存在におけるD−フェニル乳酸への水素添加の反
応速度を、反応溶液の一価との関連において試験した。
酵素含有率 α−7シルアミノ桂皮酸 アシラーゼな
し 00 0・5 39 0.0361
51 0.0682 9
5 0.1003 112 0.
1084 136 0.1165
169 0.105ルアミノ桂皮酸
倹twからの加水分解による酢酸離脱、および後続する
、生じたフェニルぎルベートの、L−フェニルアラニン
−デヒドロゲナーゼの存在におけるL−フェニルアラニ
ンへの還元アミン化、またはフェニルピルベートへD−
2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼの存在におけるD−フェニル乳酸への水素添加の反
応速度を、反応溶液の一価との関連において試験した。
試験バッチは、L−フェニルアラニン−デヒドロゲナー
ゼとの関連において以下の組成を有した: NADH0,23mM ACA I6
mML−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ0.5U 種々の一価における塩化アンモニウム溶液0.7M および制限量のACA−7シラーゼ。
ゼとの関連において以下の組成を有した: NADH0,23mM ACA I6
mML−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ0.5U 種々の一価における塩化アンモニウム溶液0.7M および制限量のACA−7シラーゼ。
選択され九−価7.5〜10.3を、試験バッチを形成
する前に、アンモニアないしは塩酸を塩化アンモニウム
溶液0.7Mに添加することによシp4節した。
する前に、アンモニアないしは塩酸を塩化アンモニウム
溶液0.7Mに添加することによシp4節した。
最適な反応速度が一範囲7.5〜9にある。
試験バッチは、D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタ
ン酸−デヒドロゲナーゼとの関連において以下の組成を
有した: NADHO,18mM ACA O,88mM
D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼ 、2.7 U種々の一価に
おける燐酸塩緩衝剤 0.1 Mおよび制限量のAC
A−アシラーゼ。
ン酸−デヒドロゲナーゼとの関連において以下の組成を
有した: NADHO,18mM ACA O,88mM
D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼ 、2.7 U種々の一価に
おける燐酸塩緩衝剤 0.1 Mおよび制限量のAC
A−アシラーゼ。
選択され7cPH価が−6,2〜8.0であった。
最適な反応速度が一範囲6.5〜7.8にある。
分解による酢酸離脱の温度依存性tb ACA−アシラ
ーゼおよびD−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼの存在において試験した。
ーゼおよびD−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼの存在において試験した。
フェニルぎルベートe水素添加するための試験バッチは
以下の組成を有した: NADHO,23mM ACA 5 mM
−7,5に相応する燐酸塩緩衝剤 Q、1Mこの反
応混合物を、10分25〜60℃の種々の温度で培養し
、それぞれD−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼ2.5Uおよび制限量のACA−ア
シラーゼを混合し、かつその後に選択された培養温度に
おける反応の速度を分光測光計で測定した。最高反応速
度が52℃で得られた、従ってこれは標準温度30℃に
おけるよりも倍数2.5だけ大である。
以下の組成を有した: NADHO,23mM ACA 5 mM
−7,5に相応する燐酸塩緩衝剤 Q、1Mこの反
応混合物を、10分25〜60℃の種々の温度で培養し
、それぞれD−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸
−デヒドロゲナーゼ2.5Uおよび制限量のACA−ア
シラーゼを混合し、かつその後に選択された培養温度に
おける反応の速度を分光測光計で測定した。最高反応速
度が52℃で得られた、従ってこれは標準温度30℃に
おけるよりも倍数2.5だけ大である。
例6: ACA−アシラーゼの一安定性ACAアシラー
ゼの一安定性を一価範囲5.0〜11.0で試験した。
ゼの一安定性を一価範囲5.0〜11.0で試験した。
この酵素を所定の時間種々の一価に維持し、かつその後
にACA−アシラーゼ活性を標準的条件下に30℃で測
定した。試験的に、この酵y/!、を、種々のめ価を有
する緩衝剤100mMで1:11に希釈した。これら種
々の一範囲のために、以下の緩衝剤を使用した:クエン
i!l! / NaOH100mM p)1 s、
0# 5−5; 6.0燐酸カリウム
pH6,0:6.5;7.0ニア、5;8.0 トリス/ HC2p)18.0:8.5:9.ONH,
CL / NH,OHp)’19.0:9.5グリシy
/NaCL / NaOHpH10−0;10−5:1
1−0;11.5 標準的条件: NADHO,2!1 mM ACA 5 mMp
H7,5に相応する燐酸塩緩衝剤 0.1MD−2
−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−テヒドロデナー
ゼ 2.50制限量のACA−アシラ
ーゼ。
にACA−アシラーゼ活性を標準的条件下に30℃で測
定した。試験的に、この酵y/!、を、種々のめ価を有
する緩衝剤100mMで1:11に希釈した。これら種
々の一範囲のために、以下の緩衝剤を使用した:クエン
i!l! / NaOH100mM p)1 s、
0# 5−5; 6.0燐酸カリウム
pH6,0:6.5;7.0ニア、5;8.0 トリス/ HC2p)18.0:8.5:9.ONH,
CL / NH,OHp)’19.0:9.5グリシy
/NaCL / NaOHpH10−0;10−5:1
1−0;11.5 標準的条件: NADHO,2!1 mM ACA 5 mMp
H7,5に相応する燐酸塩緩衝剤 0.1MD−2
−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−テヒドロデナー
ゼ 2.50制限量のACA−アシラ
ーゼ。
下記第4表は、ACA−アシラーゼの、1時間、1日、
1週ないしは2週後の残存活性パーセンテージを示す。
1週ないしは2週後の残存活性パーセンテージを示す。
2週後に、−範囲6.9〜9.4ではじめのACA−ア
シラーゼ活性のなお90%以上を検出することができた
。
シラーゼ活性のなお90%以上を検出することができた
。
例7 : ACA−アシラーゼの熱安定性ACACブー
ラーゼの熱安定性を温度範囲25〜60’Cで試験した
。この酵素t、10,20および30分選択された温度
で燐酸緩衝液(pl−17,5)中で培養した。その後
に、残存するACA−アシラーゼ活性を標準的条件下に
60°Cで測定した。
ラーゼの熱安定性を温度範囲25〜60’Cで試験した
。この酵素t、10,20および30分選択された温度
で燐酸緩衝液(pl−17,5)中で培養した。その後
に、残存するACA−アシラーゼ活性を標準的条件下に
60°Cで測定した。
標準的条件:
NADH0−23mM
ACA 5 mMp
i(7,5に相応する燐酸塩緩衝剤 0.1MD−
2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼ 2.5U制限量のACA−アシ
ラーゼ。
i(7,5に相応する燐酸塩緩衝剤 0.1MD−
2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロゲナ
ーゼ 2.5U制限量のACA−アシ
ラーゼ。
55°Cで30分培養した後、なお出発活性の80%を
検出することができ、烙らに培養温度を増大させた場合
はACA−アシラーゼが迅速に変性する。
検出することができ、烙らに培養温度を増大させた場合
はACA−アシラーゼが迅速に変性する。
例8:阻止剤および活性剤の影響
ACA−アシラーゼの活性、およびこれから生じる化合
物:α−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢
酸離脱の反応速度に対する種々の阻止剤および活性剤の
影響を、例7に記載せるような標準的条件下に測定した
。(変更:2価の金属イオン全使用する試験t−pH8
,0用のトリス/ HCl−緩衝剤0.1M中で実施し
た)。
物:α−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢
酸離脱の反応速度に対する種々の阻止剤および活性剤の
影響を、例7に記載せるような標準的条件下に測定した
。(変更:2価の金属イオン全使用する試験t−pH8
,0用のトリス/ HCl−緩衝剤0.1M中で実施し
た)。
結果を第5表にまとめた。
第5表:阻止剤および活性剤の影響
添加せず 0100
MnC22163
例9 : ACA−アシラーゼの分子量の測定および構
成単位の検出 天然酵素の分子iを、スプロース12でrル濾過するこ
とによシ測定した。FPLC装置(スエーデン国つプサ
ラ在ファーマシア社製)に連結せるカラム(1−OX3
0c*)k、流it O,4d/分で作動させ、その場
合被検物質として、モノQで精製した酵素75μtt−
使用した。
成単位の検出 天然酵素の分子iを、スプロース12でrル濾過するこ
とによシ測定した。FPLC装置(スエーデン国つプサ
ラ在ファーマシア社製)に連結せるカラム(1−OX3
0c*)k、流it O,4d/分で作動させ、その場
合被検物質として、モノQで精製した酵素75μtt−
使用した。
基準蛋白質として、シトクロムC1ペプシン、オーバル
デミン、牛血漿アルブミン(BSA )、D−2−ヒド
ロキシイソカプロエート−デヒドロゲナーゼ、L−2−
ヒドロキシイソカプロエートーデヒドログナーゼ、アル
ドラーゼ、B。
デミン、牛血漿アルブミン(BSA )、D−2−ヒド
ロキシイソカプロエート−デヒドロゲナーゼ、L−2−
ヒドロキシイソカプロエートーデヒドログナーゼ、アル
ドラーゼ、B。
セレウス(cereus )からのL−アラニン−デヒ
ドロゲナーゼおよびL−ロイシン−デヒドロゲナーゼ、
およびフェリチンを使用した。
ドロゲナーゼおよびL−ロイシン−デヒドロゲナーゼ、
およびフェリチンを使用した。
ACA−アシラーゼの分子tは5oooo±5000ド
ルトンである。
ルトンである。
ナトリウムドデシルサルフェート(SD8 )の存在に
おいてr/I/電気泳動することによシ、酵素の構成単
位の大き纒および数を測定することができた。構成単位
の分子量は26000士3000ドルトンである。これ
は、ACA−アシラーゼが2つの同じ構成単位より成る
ことを表わす。横蓋曲線には、ヘモグロビン、β−ラク
トグロブリン、キモトリデシノーrンA1ペプシン、オ
ーバルデミンおよびBAA ′f:使用した。
おいてr/I/電気泳動することによシ、酵素の構成単
位の大き纒および数を測定することができた。構成単位
の分子量は26000士3000ドルトンである。これ
は、ACA−アシラーゼが2つの同じ構成単位より成る
ことを表わす。横蓋曲線には、ヘモグロビン、β−ラク
トグロブリン、キモトリデシノーrンA1ペプシン、オ
ーバルデミンおよびBAA ′f:使用した。
例10:ACA−アシラーゼ活性の基質濃度依存性
a) ACA−アシラーゼの存在における化合物:α
−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢酸離脱
、および後続する、L−フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼの存在におけるL−フェニルアラニンへの還元ア
ミン化の反応速度の依存性を、以下の試験バッチで試験
した:塩化アンモニウム/アンモニア緩衝剤(pH8,
5)0.7 mM NADH0,23mM L−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ0.5U 制限蓄のACA−アシラーゼ。
−アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢酸離脱
、および後続する、L−フェニルアラニン−デヒドロゲ
ナーゼの存在におけるL−フェニルアラニンへの還元ア
ミン化の反応速度の依存性を、以下の試験バッチで試験
した:塩化アンモニウム/アンモニア緩衝剤(pH8,
5)0.7 mM NADH0,23mM L−フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ0.5U 制限蓄のACA−アシラーゼ。
α−アセチルアミノ桂皮酸濃度を1〜36rnMの範囲
内で変更し次。最適反応速度が16mMで得られると判
明した。α−アセチルアミン桂皮酸のKM価が3.9鮨
である。
内で変更し次。最適反応速度が16mMで得られると判
明した。α−アセチルアミン桂皮酸のKM価が3.9鮨
である。
b) ACAアシラーゼの存在における化合物:α−
アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢酸離脱、
および後続する、D−2−ヒドロキシ−4−メチルペン
タン酸−デヒドロゲナーゼの存在におけるフェニルピル
ベートのD−フェニル乳酸への水素添加の反応速度の依
存性を、以下の試験バッチで試験した: 燐酸塩緩衝剤(p)17.5 ) ・ 0.
1MNADH’ 0−23 mM D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼ 0.8U制限量のACA
−アシラーゼ。
アセチルアミノ桂皮酸からの加水分解による酢酸離脱、
および後続する、D−2−ヒドロキシ−4−メチルペン
タン酸−デヒドロゲナーゼの存在におけるフェニルピル
ベートのD−フェニル乳酸への水素添加の反応速度の依
存性を、以下の試験バッチで試験した: 燐酸塩緩衝剤(p)17.5 ) ・ 0.
1MNADH’ 0−23 mM D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロ
ゲナーゼ 0.8U制限量のACA
−アシラーゼ。
α−アセチルアミノ桂皮酸濃度t o、i〜18mMの
範囲内で変更した。最適反応速度が5 mMで得られる
と判明した。α−アセチルアミノ桂皮酸のKM価が0.
45 mMである。
範囲内で変更した。最適反応速度が5 mMで得られる
と判明した。α−アセチルアミノ桂皮酸のKM価が0.
45 mMである。
測定は、にM価がPH1曲に依存すること勿示す二KM
価が、p)17.5で0.45 mMであシ、pH8,
5で3.9 mMである。酵素を特定するため、最適−
で測定された価を使用すべきであジ、すなわち基質AC
AOKM価が0.45 mM (pH7,5)である。
価が、p)17.5で0.45 mMであシ、pH8,
5で3.9 mMである。酵素を特定するため、最適−
で測定された価を使用すべきであジ、すなわち基質AC
AOKM価が0.45 mM (pH7,5)である。
例11 : ACA−アシラーゼの基質特異性1連の並
列バッチ中で、α−7セチルアミノ桂皮酸基員を他の化
合物によシ代替し、かつ酸素が他の基質を受容する程度
を試験した。
列バッチ中で、α−7セチルアミノ桂皮酸基員を他の化
合物によシ代替し、かつ酸素が他の基質を受容する程度
を試験した。
この場合以下の試験バッチを、使用基質に応じ使用した
: 18基質としてα−アセチルアミノ桂皮酸を使用する試
験: NH,ct O,7MN
ADH0,1mM α−7セチルアミノ桂皮’Ill 50
mML−フェニルアラニンーデヒドロデナーゼ UAn
t ACA−7シラーゼ 0.1明包pH
9,2 活性を、例1に記載せるような測光試験により測定した
( 340 nmにおいて)。
: 18基質としてα−アセチルアミノ桂皮酸を使用する試
験: NH,ct O,7MN
ADH0,1mM α−7セチルアミノ桂皮’Ill 50
mML−フェニルアラニンーデヒドロデナーゼ UAn
t ACA−7シラーゼ 0.1明包pH
9,2 活性を、例1に記載せるような測光試験により測定した
( 340 nmにおいて)。
2、α−アセチルアミンアクリル酸を使用する試験:
NH,ct O,7MNADH
0,1mM α−アセチルアミノアクリル酸 50 mML−
アラニンーデヒドロデナーゼ 1明鯰ACA−アシ
ラーゼ 0.1いtpH8,0 活性を、類似の方法で測光試験(340nmにおける)
により測定した( NADH低減蓄低減上13モルニン
形成f1μモルに相応した)。
0,1mM α−アセチルアミノアクリル酸 50 mML−
アラニンーデヒドロデナーゼ 1明鯰ACA−アシ
ラーゼ 0.1いtpH8,0 活性を、類似の方法で測光試験(340nmにおける)
により測定した( NADH低減蓄低減上13モルニン
形成f1μモルに相応した)。
6、ペプチデンを使用する試験:
他の基質として、N−アセチル−L−7二二ルアラニン
、N−メトキシカルざニルーDL−フェニルアラニンお
よび種々のペプチドを使用した。使用せるペプチドを第
6表Vc1とめた。
、N−メトキシカルざニルーDL−フェニルアラニンお
よび種々のペプチドを使用した。使用せるペプチドを第
6表Vc1とめた。
これらの場合、試験バッチは以下を含有した:燐酸カリ
ウム緩衝剤(p)17.5) 0.1 MAC
A−アシラーゼ(17,8U/w?) 0.1
U/fng基質 50
mMこれらバッチ(合計1 ” ) ’f” 攪拌し
く 30 ’C)かつ種々の時間でサンプルを採取した
。アシラーゼ作用による生じるアミノ酸を、アミノ酸分
折装置を使用し定量的に検出した。またこの場合、酵素
の活性が国際単位で記載されているが、活性1υが1分
車ジアミノ酸1μモルの形成に相応する。3つの試験バ
ッチで測定した活性を、第6表の第2欄に単位mU /
Mで記載した。相対活性(第6表の第3欄)t−決め
るため、活性を基質:α−アセチルアミノ桂皮酸の丁度
に100%に対比した。
ウム緩衝剤(p)17.5) 0.1 MAC
A−アシラーゼ(17,8U/w?) 0.1
U/fng基質 50
mMこれらバッチ(合計1 ” ) ’f” 攪拌し
く 30 ’C)かつ種々の時間でサンプルを採取した
。アシラーゼ作用による生じるアミノ酸を、アミノ酸分
折装置を使用し定量的に検出した。またこの場合、酵素
の活性が国際単位で記載されているが、活性1υが1分
車ジアミノ酸1μモルの形成に相応する。3つの試験バ
ッチで測定した活性を、第6表の第2欄に単位mU /
Mで記載した。相対活性(第6表の第3欄)t−決め
るため、活性を基質:α−アセチルアミノ桂皮酸の丁度
に100%に対比した。
第6表: ACA−アシラーゼの基質特異性アミノ酸誘
導体: α−アセチルアミン桂皮酸 125 10
0α−アセチルアミノアクリル酸 0ON−7
セチルーL−フェニル− アラニン OOペゾチド
: Gly−L−phe40 32 ’ Gly−D−phe
OOGly−gly−L−phe
0 0L−Ala−L−phe
105 84L−Leu−L−
phe 102 82L
−Phe−L−phe 4
1 33L−Hls−L−phe
44 35L−8er−L−ph
e 56 29L−Asp
−L−phe 38 3
0L−Lau−L−tyr
109 87L−Lsu−L−t、rp
67 54L−Ala−L−tr
p 66 53L−
Ala−L−t、yr 7
8 62L−Ala−L−his
43 34例12 : L−フ
ェニルアラニンの製造ACA−アシラーゼにL−フェニ
ルアラニン−デヒドロブナ−+Pを結合させた場合、生
じる中間生成物が還元アミン化によシ立体特異的にL−
フェニルアラニンに反応されることができる。
導体: α−アセチルアミン桂皮酸 125 10
0α−アセチルアミノアクリル酸 0ON−7
セチルーL−フェニル− アラニン OOペゾチド
: Gly−L−phe40 32 ’ Gly−D−phe
OOGly−gly−L−phe
0 0L−Ala−L−phe
105 84L−Leu−L−
phe 102 82L
−Phe−L−phe 4
1 33L−Hls−L−phe
44 35L−8er−L−ph
e 56 29L−Asp
−L−phe 38 3
0L−Lau−L−tyr
109 87L−Lsu−L−t、rp
67 54L−Ala−L−tr
p 66 53L−
Ala−L−t、yr 7
8 62L−Ala−L−his
43 34例12 : L−フ
ェニルアラニンの製造ACA−アシラーゼにL−フェニ
ルアラニン−デヒドロブナ−+Pを結合させた場合、生
じる中間生成物が還元アミン化によシ立体特異的にL−
フェニルアラニンに反応されることができる。
デヒドロダン化反応で酸化された補酵素を再生するため
、バッチにホルミエートーデヒドロrナーゼ(E、C,
1,2,1,2−)およびホルミエートを添加する。こ
の場合、付加的生成物としてC02が得られる。
、バッチにホルミエートーデヒドロrナーゼ(E、C,
1,2,1,2−)およびホルミエートを添加する。こ
の場合、付加的生成物としてC02が得られる。
種々の濃度のACAを有する種々のバッチを培養したが
、これらバッチはそれぞれ以下を含有したニ ア7モニf)lhホルミエート(pH9,2) 40
0 mMト リ x/HC2(p)19−2 )
200 mMNADH0,
3mM ホルミエートーデヒドロrナーゼ(クローネル等(Kr
oner et al ) (1982年)ジエイ・ケ
ム・チクノル・バイオチクノル(J、 Chem。
、これらバッチはそれぞれ以下を含有したニ ア7モニf)lhホルミエート(pH9,2) 40
0 mMト リ x/HC2(p)19−2 )
200 mMNADH0,
3mM ホルミエートーデヒドロrナーゼ(クローネル等(Kr
oner et al ) (1982年)ジエイ・ケ
ム・チクノル・バイオチクノル(J、 Chem。
Technol、 Biotechnol )第32巻
、130〜137頁による試料〕 1明
鍮L−フェニルアラニンーデヒドロデナーゼ(44U/
Ingk有する試料) I U/fn
lACA−アシラーゼ C1,5ル似A
CA 2N00騙罷容槓
が1Mであシ、培養を攪拌下に28℃で行なった。産出
物形成をアミノ酸分析装置で追跡した。
、130〜137頁による試料〕 1明
鍮L−フェニルアラニンーデヒドロデナーゼ(44U/
Ingk有する試料) I U/fn
lACA−アシラーゼ C1,5ル似A
CA 2N00騙罷容槓
が1Mであシ、培養を攪拌下に28℃で行なった。産出
物形成をアミノ酸分析装置で追跡した。
第7表は、全てのバッチにおいて基質のフェニルアラニ
ンへの実際に完全な反応が行なわれたことを示す。
ンへの実際に完全な反応が行なわれたことを示す。
第7表二種々の量のACAのL−フェニルアラニンへの
反応 2 50 6.5 563 1
00 6.5 98反応後に、形成石れた
L−フェニルアラニンの光学的純度を測定した。このバ
ッチ中に、1部分の生成物が不溶性の形で結晶懸濁液と
して存在した( PheのH20中溶解度(25°C)
−180m14 ) 、全ての生成物を溶解するため
、バッチにH2O3111Ji添加した。セファデック
ス(8ephadaz ) G −25(ファーマシア
社製)でデル濾過することにより蛋白質を除去し、かつ
低分子物質を有するフラクションを凍結乾燥後にH,0
4,5紅に溶解した。
反応 2 50 6.5 563 1
00 6.5 98反応後に、形成石れた
L−フェニルアラニンの光学的純度を測定した。このバ
ッチ中に、1部分の生成物が不溶性の形で結晶懸濁液と
して存在した( PheのH20中溶解度(25°C)
−180m14 ) 、全ての生成物を溶解するため
、バッチにH2O3111Ji添加した。セファデック
ス(8ephadaz ) G −25(ファーマシア
社製)でデル濾過することにより蛋白質を除去し、かつ
低分子物質を有するフラクションを凍結乾燥後にH,0
4,5紅に溶解した。
アミノ酸分析装置による試験は、L−7二二ルアラニン
含分37.4 mMが得られた。L−アミノ酸−オキシ
ダーゼを使用する試験は、L−Phe 37 mMが得
られた。D−アミノ酸−オキシダーゼを使用する試験は
負であった、その場合検出限界がD −Phe O,0
4mMである。
含分37.4 mMが得られた。L−アミノ酸−オキシ
ダーゼを使用する試験は、L−Phe 37 mMが得
られた。D−アミノ酸−オキシダーゼを使用する試験は
負であった、その場合検出限界がD −Phe O,0
4mMである。
例13:D−フェニル乳酸の製造(連続的)ACAは、
ACA−アシラーゼにD−2−ヒドロキシ酸−デヒドロ
ゲナーゼを結合させることにより、酵素法によシD−フ
ェニル乳酸に変換することができる。デヒドロゲナーゼ
として、相ンメル等(Hummed 、 W、 et、
al )、ユーロ・ジエイ・アシル・ミクロビオル・
ビオチクノル(Eur、 J、 Appl、 Mjcr
obiol Biotechnol、 )1第18巻=
75〜85頁(1983年)参照〕またはD−2−ヒド
ロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロデナーゼ七使
用することができる。この例において、補酵素栴生が、
ホルミエートの存在においてホルミエートーデヒドロr
ナーゼを使用し達成される。
ACA−アシラーゼにD−2−ヒドロキシ酸−デヒドロ
ゲナーゼを結合させることにより、酵素法によシD−フ
ェニル乳酸に変換することができる。デヒドロゲナーゼ
として、相ンメル等(Hummed 、 W、 et、
al )、ユーロ・ジエイ・アシル・ミクロビオル・
ビオチクノル(Eur、 J、 Appl、 Mjcr
obiol Biotechnol、 )1第18巻=
75〜85頁(1983年)参照〕またはD−2−ヒド
ロキシ−4−メチルペンタン酸−デヒドロデナーゼ七使
用することができる。この例において、補酵素栴生が、
ホルミエートの存在においてホルミエートーデヒドロr
ナーゼを使用し達成される。
バッチ(総容積10M)は、詳しくは以下を含有した:
ナトリウムホルミエート(p)17−5) 400m
Mトリス/HCt(F)17−5 )
200mMPEG 20000− NADHO,3m
Mホルミエートーデヒドロrナーゼ 1
ル似D−2−ヒドロキシー4−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼ(270U/卿に有する試料)1U/&
4 ACA−アシラーゼ(6U/In9に有する試料)0.
5W似 ACA
20 mMM続的反応が酵素−薄膜リアクタ中
で達成される。このため反応バッチを、限外濾過薄膜を
経てポンプ搬送する〔アミコン社(FirmaAmic
on )のYM5型、濾別限界5000ドルトン〕。こ
の場合、低分子成分が連続的に反応混合物から除去され
る(滞留時間3時間)。この試験装置中で、濾過された
総量の生成物浴液を連続的に基質溶液によシ補充した。
Mトリス/HCt(F)17−5 )
200mMPEG 20000− NADHO,3m
Mホルミエートーデヒドロrナーゼ 1
ル似D−2−ヒドロキシー4−メチルペンタン酸−デ
ヒドロゲナーゼ(270U/卿に有する試料)1U/&
4 ACA−アシラーゼ(6U/In9に有する試料)0.
5W似 ACA
20 mMM続的反応が酵素−薄膜リアクタ中
で達成される。このため反応バッチを、限外濾過薄膜を
経てポンプ搬送する〔アミコン社(FirmaAmic
on )のYM5型、濾別限界5000ドルトン〕。こ
の場合、低分子成分が連続的に反応混合物から除去され
る(滞留時間3時間)。この試験装置中で、濾過された
総量の生成物浴液を連続的に基質溶液によシ補充した。
基質溶液は以下を含有した:
ナトリウムホルミエー) (p)17.5 ) 40
0 !IIMトリス/ HCL
200 mMACA
20 mM反反応上、生成物溶液の旋光度αを
偏光測定法により測定することによシ確定した。その後
に生成物濃度を、市販のD−フェニル乳酸〔シグマ(8
1gma ) ) を使用し得られた基準曲線から測定
することができる。
0 !IIMトリス/ HCL
200 mMACA
20 mM反反応上、生成物溶液の旋光度αを
偏光測定法により測定することによシ確定した。その後
に生成物濃度を、市販のD−フェニル乳酸〔シグマ(8
1gma ) ) を使用し得られた基準曲線から測定
することができる。
第8費は、ACA′t−実際に完全にD−フェニル乳酸
に反応させうろことt示す。
に反応させうろことt示す。
第8表: ACA C20mM )のD−フェニル乳酸
への反応率
への反応率
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、以下の特性: 1)反応性: α−アセチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−β−フェニ
ル−プロピオン酸ないしはフェニルピルビン酸の形成下
に反応する; 2)基質特異性: α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解するが、但し他の
α−アセチルアミノカルボン酸を加水分解しない; 3)最適pH価: 最適pH価が7.5±1である; 4)pH安定性: pH範囲6.9〜9.4で十分な安定性を示す; 5)最適温度: 最適温度が、pH価7.5で52℃である; 6)熱安定性: 55℃で、30分の培養後になお反応率80%が検出可
能である; 7)阻止剤および活性剤の影響: とりわけ水銀化合物が阻止的に作用し、ジチオトレイト
ールの添加がこの酵素を活性化する; 8)分子量: 分子量が50000±5000ドルトンである; 9)構成単位: 分子が、それぞれ26000±3000ドルトンを有す
る2つの同じ大きさの構成単位より成る; 10)α−アセチルアミノ桂皮酸基質のpH7.5にお
けるK_M価が0.45mモルである;ことを特徴とす
る微生物学的に製造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−
アシラーゼ。 2、以下の特性: 1)反応性: α−アセチルアミノ桂皮酸と、α−イミノ−β−フェニ
ループロピオン酸ないしはフェニルピルビン酸の形成下
に反応する; 2)基質特異性: α−アセチルアミノ桂皮酸を加水分解するが、但し他の
α−アセチルアミノカルボン酸を加水分解しない; 6)最適pH価: 最適pH価が7.5±1である; 4)pH安定性: pH範囲6.9〜9.4で十分な安定性を示す; 5)最適温度: 最適温度が、pH価7.5で52℃である; 6)熱安定性: 55℃で、30分の培養後になお反応率80%が検出可
能である; 7)阻止剤および活性剤の影響: とりわけ水銀化合物が阻止的に作用し、ジチオトレイト
ールの添加がこの酵素を活性化する; 8)分子量: 分子量が50000±5000ドルトンである; 9)構成単位: 分子が、それぞれ26000±3000ドルトンを有す
る2つの同じ大きさの構成単位より成る; 10)α−アセチルアミノ桂皮酸基質のpH7.5にお
けるK_M価が0.45mモルである;を有するα−ア
セチルアミノ桂皮酸−アシラーゼを取得するに当り、ブ
レビバクテリウム属菌NCIB12246またはNCI
B12247を、炭素および窒素の給源、チアミン、鉱
物塩および、誘導物質としてのα−アセチルアミノ桂皮
酸を含有する水性培養液中で、出発pH価6.0〜8.
0および温度25〜35℃で通気培養し、細胞物質を分
離しかつ酵素を細胞から単離することを特徴とする微生
物学的に製造されたα−アセチルアミノ桂皮酸−アシラ
ーゼの取得法。
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---|---|---|---|
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DE3621839.1 | 1986-06-28 |
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