JPS6374488A - ７−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は７−アミノセファロスポラン酸（以下、７−Ａ
ＣＡと略す）およびその誘導体の酵素的手段による製造
方法に関するものである。

〔従来の技術〕

醗酵生産によって得られるセファロスポリンＣは７位ア
ミノ基に結合したアシル基を除去する反応（以下、脱ア
シル化と略す）により７−ＡＣＡに誘導され、これを出
発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質が合成
され、医薬品として実用に供されている。

セファロスポリンＣの脱アシル化方法としては化学的方
法および酵素的方法があるが、化学的脱アシル化法（例
えば特公昭４１−１３８６２号および特公昭４５−４０
８８９号の方法）は反応工程が多く、反応に用いる試薬
のコストが高いこと、反応の副産物として大量の化合物
が排出されることなど工業的に欠点が多いことが知られ
ている。

酵素的脱アシル化法としてはセファロスポリンＣの７位
側鎖７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン
アミド）基のＤ−５−アミノ基にグリオキシル酸を作用
させ化学的に脱アミノ反応を行なう特公昭５５−１２９
１０の方法、あるいは微生物酵素を作用させて脱アミノ
反応を行なう特公昭５０−７１５８の方法などにより、
セファロスポリンＣを７β−（５−カルボキシ−オキソ
ペンタンアミド）セファロスポラン酸に誘導し。

ついで過酸化水素を作用させることにより脱炭酸反応を
行なわせて７β−（４−カルボキシブタンアミド）セフ
ァロスポラン酸（通称グルタリルアミドセファロスポラ
ン酸。以下、グルタリル７−ＡＣＡと略す）に誘導して
おき、更にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）細菌の生産する酵素（文献：シブヤ（Ｓｈｉｂｕｙａ
）ら（１９８１）アグリカルチュラルバイオロジカルケ
ミストリー （Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４５　、　１５６１−１５６７）
を作用させることにより脱アシル化反応を行なわせ、７
−ＡＣＡへ誘導する方法がある。この方法は化学的脱ア
シル化法の問題点の多くを解決できるが、３段の反応で
あるため、より勝れた酵素的な一段反応による方法の開
発が望まれていた。

セファロスポリンＣを直接脱アシル化して７−ＡＣＡを
得る方法としては、アクロモバクタ−属（Ａｃｈｒｏｍ
ｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）あるいはフラボバクテリウム属
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌を用いるアメ
リカ特許Ｎｏ、３２３９３９４　（１９６６）の方法、
アスペルギルス属（ハｕ」区は肛）あるいはアルタナリ
ア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）の真菌を用いる特開昭５
２−１４３２８９の方法、シュードモナス属の細菌を用
いる特開昭５３−９４０９３の方法、ペシロミセス属（
ｈ可カシ竺弦）の真菌を用いる特開昭５９−４４３９２
の方法およびシュードモナス属の新種に属する細菌を用
いる特開昭６１−２１０９７の方法がある。さらにはシ
ュードモナス属の細菌からクローニングされたセファロ
スポリンＣアシラーゼの遺伝子を含む大腸菌の形質転換
体を用いる特開昭６１−１５２２８６の方法がある。

〔発明が解決しようとしている問題点〕一般に微生物の
培養物、その菌体処理物あるいは抽出物による酵素反応
を工業的に利用するためには、これらの調製が容易であ
ること、安価であること、あるいはこれらの諸性質がす
ぐれていることなどの特長が必要とされている。しかし
上記の従来の方法で工業的にセファロスポリンＣを直接
脱アシル化することに成功した例はいまだに知られてい
ない。

〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
は上記の問題点を解決するため、セファロスポリンＣか
ら酵素的に１段の工程で７−ＡＣＡを生成させる研究を
行なってきた。この過程でコマモナス属（Ｃｏｍａｍｏ
ｎａｓ）細菌よりグルタリル７−ＡＣＡを水解する能力
を有する７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファ
ロスポラン酸アシラーゼ（以下グルタリル７−ＡＣＡア
シラーゼと称す）の遺伝子を分離して大腸菌に導入し、
この酵素を著量生産させることに成功した（特開昭６Ｏ
−１１０２９２）。さらにトリゴノプシス属（回加■四
阻国）酵母からセファロスポリンＣを酸化する能力を有
するＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を分離して大腸菌
に導入し、この酵素を著量生産させることに成功した（
特願昭６ｌ−１０６６６３）。更に本発明者らが鋭意研
究を行なった結果、上記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子を含む大腸菌の形質転換体とグルタリル７−ＡＣＡ
アシラーゼ遺伝子を含む大腸菌の形質転換体の培養物を
同時にセファロスポリンＣに作用させると意外にも一段
の工程で７−ＡＣＡが生成することを見出した。これら
の知見にもとづき本発明を完成するに到った。

すなわち本発明によれば、一般式（Ｉ）（式中Ｒは一〇
〇ＯＣＲ，、−Ｈまたは−○Ｈである）で表わされる化
合物またはその塩を脱アシル化して一般式（ｎ） （式中Ｒは前記と同じ意味を有する）で表わされる化合
物またはその塩を生成する７−ＡＣＡおよびその誘導体
の製造方法において、前記式（１）で表わされる化合物
に組換ＤＮＡ技術により大腸菌に産生せしめたＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼ及びグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ
を含む酵素混合物を過酸化水素の存在下または非存在下
に水性媒体中で作用させることを特徴とする７−ＡＣＡ
およびその誘導体の製造方法が提供される。

本発′明の方法は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物ま
たはその塩と、組換えＤＮＡ技術により大腸菌に産生せ
しめたＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びグルタリル７−Ａ
ＣＡアシラーゼを含む酵素混合物とを水性媒体中で混合
し、二九らの酵素の作用により一般式（ｎ）で表わされ
る化合物またはその塩を製造するものである。

本発明の方法で出発物質として用いる一般式（Ｉ’）で
表わされる化合物またはその塩及び本発明の方法で得ら
れる最終生成物である一般式（Ｉｆ）で表わされる化合
物またはその塩に関し、一般式％式％ のものがそれぞれセファロスポリンＣ及び？−ＡＣＡを
示す。本発明において一般式（１）及び（ｎ）で表わさ
れる化合物の塩としては例えば、ナトリウム塩やカリウ
ム塩などが挙げられる。

本発明で用いられる酵素混合物としては、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換さ
れた大腸菌の培養物またはその処理物とグルタリル７−
ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転
換された大腸菌の培養物またはその処理物との混合物を
用いることができる。また、代わりに、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡおよびグルタリ
ル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを
共存させて保有する単一の大腸菌の形質転換体を造成し
、その培養物またはその処理物を用いることもできるし
、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子およびグルタリル７
−ＡＣ：Ａアシラーゼ遺伝子を単一のベクター上に含む
組換え体ＤＮＡを造成し、これにより形質転換された単
一の大腸菌の培養物またはその処理物を用いることもで
きる。

尚、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体Ｄ
ＮＡおよびグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを共存させて保有する単一の大腸菌の
形質転換体を造成するには互いに不和合性の異なるグル
ープに属する２種類のプラスミドをベクターとして用い
、各々に上記の２種の遺伝子を別々に含む組換え体ＤＮ
Ａを造成し、得られた２種の組換え体ＤＮＡ両者で同時
に一種の大腸菌を形質転換すればよい。

前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子としては例えば
、酵母トリゴノプシス・パリアビリス（Ｉｏｒｉ　ｏｎ
ｏ　ｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）　ＣＢ　Ｓ　４０
９５由来のものがあげられ、またグルタリル７−ＡＣＡ
アシラーゼ遺伝子としては例えば、コマモナス・エスピ
ー（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ、）　ＳＹ　　７７−１
　（微工研菌寄第２４１０号）由来のものがあげられる
。

トリゴノプシス・パリアビリス由来のＤ−アミノ酸オキ
シダーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体ＤＮＡは
例えば特願昭６１−１０６６３号に記載されている方法
により得ることができる。即ち、以下のようにして取得
することができる。

（１）トリゴノプシス・パリアビリスＣＢＳ　　４０９
５から全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断した後、ベク
ターに組みこみ、大腸菌に導入し、ＤＮＡライブラリー
を作成する。トリゴノプシス・パリアビリスＣＢＳ　　
４０９５は寄託機関であるセントラール・ビューロー・
フオーア・シメルカルチュレス（Ｃｅｎｔｒａａｌ　Ｂ
ｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌ−ｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ）、オランダ国に寄託番号４０９５号の下に寄託
されている酵母である。

（２）トリゴノプシス・パリアブリスＣＢＳ　　４０９
５からセファロスポリンＣを酸化する能力をもつＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミ
ノ酸配列を決定する。

（３）得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末
端アミノ酸配列の一部分について、これより推定される
遺伝子のＤＮＡ塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物を合成し、これをＤＮ４プローブとする。

（４）ＤＮＡプローブをｆｆ２ｐでラベルし、前記（１
）で得られたＤＮＡライブラリーとコロニー・ハイブリ
ダイゼーションを行なわせ、ＤＮＩＡプローブと相補性
を示した大腸菌のコロニーを選択・分離する。

（５）選択された大腸菌の菌株からプラスミドＤＮＡを
とりだし、ベクターに組みこまれたトリゴノプシス・パ
リアビリスＣＢＳ　　４０９５由来のＤＮＡの塩基配列
を決定する。

（６）決定されたＤＮＡ塩基配列中にＤ−アミノ酸オキ
シダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむア
ミノ酸配列の読取り枠を見出し、これをふくむＤＮＡ断
片に適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現
のためのベクターに組みこみ、発現用の組換え体ＤＮＡ
を造成する。

また、コマモナス・エスピー由来のグルタリル７−ＡＣ
Ａアシラーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａは例えば特開昭６０−１１０２９２号に記載されてい
る方法により取得することができる。即ち、以下のよう
にして得ることができる。

１）コマモナス属細菌５Ｙ−７７−１（微工研菌寄第２
４１０号）の菌体より全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切
断する。

２）ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させる。

３）ベクターＤＮＡの開裂部位に１）で得たＤＮＡ断片
を組込ませ、閉環した組換え体ＤＮＡをつくる。

４）組換え体ＤＮＡを宿主たる大腸菌に導入する。

５）組換え体ＤＮＡを導入させた大腸菌の中から、グル
タリル７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有する菌株を選択分
離する。

６）選択された大腸菌の菌株よりプラスミドＤＮＡをと
り出し、制限酵素および再結合酵素あるいは他のベクタ
ーを用いて改変し、グルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺
伝子の発現が増大するようになった組換え体ＤＮＡをつ
くる。

７）改変された組換え体ＤＮＡを大腸菌に導入し、その
後導入された大腸菌の中からグルタリル７−ＡＣＡアシ
ラーゼ産生能の増大した株を選択分離する。

尚、前記２種の遺伝子の調製、それらを含む組換え体Ｄ
ＮＡならびにその組換え体Ｄ’Ｎ　Ａで形質転換転換さ
れた大腸菌の調製は通常の公知の組換えＤＮＡ技術によ
り行なうことができる。

以上のようにして得られる大腸菌を通常の培養条件で培
養することによりＤ−アミノ酸オキシダーゼまたはグル
タリル７−ＡＣＡアシラーゼを、あるいは両者を同時に
著量含む培養物が得られる。

得られた培養物はそのまま用いてもよいし、この培養物
を例えば菌体を集めて破砕して酵素を抽出したり、それ
を液体クロマトグラフィーや等電点電気泳動等に供する
などの公知の常用手段を用いる精製処理に付すことによ
り、部分精製もしくは実質的に完全に精製したＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼおよび／又はグルタリル７−ＡＣＡア
シラーゼを調製してこれを用いてもよい。

上記両酵素活性を有する培養物またはその部分的または
実質的に完全に精製した両酵素を含む混合物を酵素混合
物として用いて化合物（Ｉ）またはその塩に作用させる
ことにより、化合物（ｎ）またはその塩を効率よく生成
させることができる。

この反応は水性媒体中で行なわれ、反応時のｐＨは７．
０〜８．５を、温度は２０〜４０℃を維持することが好
ましい。本発明の方法で用いら九る水性媒体としては例
えば水およびリン酸緩衝液などの緩衝液などがあげられ
る。

本発明の方法により、化合物（１）またはその塩から化
合物（ＩＩ）またはその塩を製造するメカニズムを化合
物（Ｉ）においてＲが一０ＣＯＣＨ３である場合、即ち
セファロスポリンＣである場合を例にとって説明すると
以下のようになる。

まず、セファロスポリンＣが酵素混合物中のＤ−アミノ
酸オキシダーゼの作用により酸化されて７β−（５−カ
ルボキシ−５−オキソペンタンアミド）セファロスポラ
ン酸が生成する。この時に過酸化水素が同時に生成する
。この過酸水素の作用により、生成した７β−（５−カ
ルボキシ−５−オキソペンタンアミド）セファロスポラ
ン酸が脱炭酸されてグルタリル７−ＡＣＡに転化される
。

グルタリル７−ＡＣＡは酵素混合物中のグルタリル７−
ＡＣＡアシラーゼの作用を受けて脱アシル化され７−Ａ
ＣＡ　［一般式（ｎ）で表わされる化合物においてＲが
−○ＣＯＣＨ３のものコが生成する。

上記反応系において用いる酵素混合物を調製する際に使
用する大腸菌として、通常の大腸菌を用いた場合、過酸
化水素を分解するカタラーゼ活性を有しているため、該
酵素混合物中にカタラーゼが混入し、そのためその酵素
混合物を用いると上記の反応過程で生成する過酸化水素
を分解し、反応の進行をさまたげる。これを解決するた
めには、過酸化水素の存在下に水性媒体中で該酵素混合
物−１［ｉ− を作用させればよい。過酸化水素を存在させる方法とし
ては、高濃度の過酸化水素はセファロスポリン化合物を
分解してしまうので必要量をできるだけ低濃度になるよ
うに加えるのが好ましく、適当な方法で過酸化水素を補
給することが望ましい。

また、カタラーゼ活性を欠損している大腸菌の変異株を
誘導し、これを宿主とした形質転換体を用いた場合には
該酵素混合物を過酸化水素の非存在下に作用させること
ができる。

尚、上記カタラーゼ欠損変異株の誘導は通常の公知の方
法、例えばＮ−メチル−Ｎ″−ニトロソグアニジンなど
の変異誘起剤を用いる方法などにより行なうことができ
る。

以上のようにして生成した化合物（Ｉｒ）またはその塩
は公知の通常の方法、例えばカラムクロマトグラフ法、
等電点性でん法などを使用して反応液から分離精製する
ことができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。

なお実施例において化合物（ＩＩ）またはその塩の定量
には高速液体カラムクロマトグラフを用いた。カラムは
ミクロボンダパック（μｍＢｏｎｄａｐａｋ）Ｃ１８（
ウォーターズ社製）を用い、移動相としては５％酢酸ア
ンモニウム９８容とアセトニトリル２容の混合液を用い
た。化合物（ＩＩ）またはその塩の検出は２６０ｍｍで
行なった。

また実施例において７−ＡＣＡまたはその誘導体の生成
率は１次式により求めた 更に、実施例において７−ＡＣＡまたはその誘導体の純
度は実施例で得られた７−ＡＣＡまたはその誘導体の粉
末を一定量とって水に溶解し、これを前記液体クロマト
グラフィーに供し、７−ＡＣＡまたはその誘導体を定量
し、該粉末中の７−ＡＣＡまたはその誘導体の含量（％
）を計算することにより求めた。

〔実施例〕

実施例１ 本実施例はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む形質
転換体とグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を含む
形質転換体を別々に培養して得られる培養物を用いる方
法である。

〔１〕酵母トリゴノプシス・パリアビリス（Ｉｒｉｇｏ
ｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｖｉｌｉｓ）からクローニン
グされたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え
体ｐＥＤＡＯ１を保持し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを
生産する大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏ旦）ＭＢ６５／ｐＥＤＡＯ１（特願昭６ｌ
−１０６６３）は下記の方法によって調製した。

１、トリゴノプシス・パリアビリスからの全ＤＮＡの抽
出と切断 クライヤー（Ｃｒｙｅｒ）らの方法〔文献：メソッズイ
ンセルバイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ）　１２巻、３９−４４．アカデミツク
プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）社、１９７５
）にしたがって、トリゴノプシス・パリアビリスＣＢＳ
　　４０９５から全ＤＮＡを抽出精製した。このＤＮＡ
４０μｇをとり、制限酵素ＭｂｏＩ４単位と３７℃、１
５分間反応させた。反応液を等量のフェノール・クロロ
ホルム（１：　１）で抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈
澱させた後、０．１倍濃度のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡ）にとかした
。得られたＤＮＡ溶液の全量を０．７％アガロースゲル
電気泳動に供し、６〜９ｋｂの大きさに相当するゲルか
らＤＮＡをふくむ部分を切出して、電気溶出法によりゲ
ルからＤＮＡ断片を溶出させた。ついで溶出液を等量の
フェノールおよびフェノール・クロロホルムで順次抽出
し、得られる水層にエタノールを添加してＤＮＡを沈澱
させた後、０．１倍濃度のＴＥ緩衝液２０μΩにとかし
た。

２、ベクターＤＮＡの開裂 ベクターｐＵｃ１８　３０μｇをＢ　ａ　ｍ　ＨＩで完
全に開裂させ、得られたＤＮＡ断片を０．１倍濃度のＴ
Ｅｆｉ衝液２ｏμＱにとかした。

３、ベクターへのＤＮＡ断片の挿入 上記工程１で得られた溶液と上記工程（２）で得られた
溶液を３：１の割合に混合し、Ｔ４・ＤＮＡリガーゼを
１５℃で６時間反応させ、ベクターとトリゴノプシス・
パリアビリスＣＢＳ　　４０９５のＤＮＡ断片を結合さ
せた。

４、トリゴノプシス・パリアビリスのＤＮＡライブラリ
ーの作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ欠損変異菌
株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）ＭＣ１０６１（米国シカゴ大
学マルコム　カサダバン（ＭａｌｃｏｍＣａｓａｄａｂ
ａｎ）博士より入手。水閘の性質はジャーナルオブモレ
キュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、１３８，１７９−２０７．１９８０に記
載されている）をＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二ト
ロソグアニジンで処理した後、セファロスポリンＣに対
する感受性が増大したコロニーを選択した。これらの中
からセファロスポリナーゼ活性をほとんど示さない株を
選択分離し、その−株をエシエリヒア・コリＭＢ６５と
命名して宿主として用いた。なお、本変異株エシュリヒ
ア・コリＭＢ６５は工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研菌寄第８９００号として寄託さ九でいる。つぎ
に上記工程３で得られた組換え体ＤＮＡを形質転換にょ
リエシェリヒア・コリＭＢ６５に導入し、アンピシリン
５０μｇ　／　ｍΩをふくむＬ−ブロス寒天培地〔バタ
トトリプトン（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕１％、酵
母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、寒天１゜５％〕
上で生育してきたコロニーを集めて、これをトリゴノプ
シス・パリアビリスＣＢＳ　　４０９５のＤＮＡライブ
ラリーと称した。

５、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端アミノ酸
配列の決定 トリゴノプシス・パリアビリスＣＢＳ　　４０９５から
前述のスワジュセル（Ｓｚｖａｊｃｓｒ）らの方法にし
たがってＤ−アミノ酸オキシダーゼを精製した。精製し
た酵素蛋白質のアミノ基末端のアミノ酸配列を前述の方
法により解析し、アミノ基末端から４１番目までのアミ
ノ酸配列を決定した。得られたＮ−末端アミノ酸配列を
次式にて表わす。

Ａｌａ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ａｒ　−Ｌ　５−Ｇｌ　一旦１ｓ−Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ａ　５ｐ−Ｌｅｕ
−５ｅｒ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−注：下線部はプ
ローブ合成に用いられた配列を示す。

６、ＤＮＡプローブの合成 上記工程５で得られたアミノ酸配列中から前記式中に下
線で示される２箇所の配列を選択し、これらのアミノ酸
配列から推定される遺伝子上の可能なりＮＡ塩基配列す
べてをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第１表に示す
ように合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能な
オリゴヌクレオチドを２群にわけて合成して混合物をつ
くり、これらをＤＮＡプローブＤＡＯ−１とＤＡｏ、２
、およびＤＡｏ−３とＤＡＯ−４と称した。オリゴヌク
レオチドの合成はすべてアプライド　バイオシステム（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社のＤＮＡシン
セサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）モデル３８０−
Ａを用いて行なった。

７、ＤＮＡライブラリーからＤ−アミノ酸オキシ−Ｚｊ
　− 〜２４− ターゼ・クローンの候補の選択・分離 上記工程６で得られたＤＮＡプローブを各々イングリア
（Ｉｎｇｌｉａ）らの方法〔文献：ヌクレイツクアシッ
ドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、
　９　。

１６２７−１６４２．１９８２）にしたがってＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼとγ−”　Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐを用
６てラベルした。つぎにＤＮＡライブラリーである前記
工程４で得られた大腸菌をアンピシリン５０μｇ　／　
ｍ　ＱをふくむＬ−ブロス寒天培地上でコロニーとして
生育させ、これをレプリカ法によってワットマン（υｈ
ａｔｍａｎ）　５４１　Ｆ紙へうつし、リゾチームで溶
菌し、アルカリでＤＮＡ変性させ、塩酸による中和処理
を行なった後、ＤＡｏ−１およびＤＡＯ−２とハイブリ
ダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは６倍
濃度のＳＳＣ（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、０．５％ノ二デッ
トＰ−４０（シグマ社、米国製）、ＤＡｏ−１あるいは
ＤＡＯ−２約２　Ｘ　１０　”ｃｐｒｎ／　ｒｎ　Ｑを
用いて、４４℃で１時間半行ない、この後６倍濃度のＳ
ＳＣを用いて室温で２回、つづいて６倍濃度のＳＳＣを
用いて４４℃で１回が紙を洗浄した。この後沼紙を乾燥
させ、オートラジオグラフィ（感光条件ニー８０°Ｃ，
３時間）に供した。その結果、ＤＡＯ−１またはＤＡＯ
−２に対しハイブリダイゼーション陽性のコロニーが多
数見出された。そこで陽性のコロニーから４０株をとり
あげ、液体培養した後、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ）らの方法〔文献：ヌクレイツクアシッドリサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）＋１．１５１３
−１５２３．１９７９）によりプラスミドＤＮＡを調製
した。ついでこれらのＤＮＡを常法により変性させた後
、ニトロセルロースフィルターにスポットして、ＤＮＡ
プローブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダ
イゼーションは６倍濃度の５ＳＣ１１０倍濃度のデンハ
ルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）液（０，０２％７，１’：Ｉ
−ＪＬ／、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２
％牛血清アルブミン）およびラベルしたＤＮＡプローブ
を用いて、４４℃（ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２の場合
）または４０℃（ＤＡＯ−３およびＤＡＯ−４の場合）
で−２７＝ １時間行ない、この後６倍濃度のＳＳＣを用いて室温で
１回、ついで４４℃（ＤＡＯ−１およびＤＡＯ−２の場
合）または４０℃（ＤＡＯ−３およびＤＡＯ−４の場合
）で１回洗浄した。この後フィルターをオートラジオグ
ラフィー（感光条件ニー８０℃、３時間）に供した結果
、ＤＡＯ−１あるいはＤＡＯ−２にハイブリダイゼーシ
ョン陽性を示すものでかつＤＡＯ−３あるいはＤＡＯ−
４にも陽性を示すものが６株見出された。これら６株か
らのプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を行なった後、ラベルしたＤＮＡプ
ローブとサザン・ハイブリダイゼーション〔方法につい
ては文献：サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）（１９７，５）
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、）　、９８，５０３−５１７）を行なった
。その結果、ＥｃｏＲＩ切断で生成する約０．６ｋｂの
ＤＮＡ断片にＤＡＯ−２とＤＡＯ−３またはＤＡＯ−４
が強くハイブリダイゼーション陽性を示すプラスミドＤ
ＮＡが見出された。このプラスミドをｐＤＡＯｃ２−１
２と命名し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候
補とした。

８、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの同定とＤＮ
Ａ塩基配列の決定 プラスミドｐＤＡＯｃ２−１２よりＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ切
断により生成する０、６ｋｂのＤＮＡ断片について、前
述のサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らの方法に従ってＤＮＡ
塩基配列を決定した。その結果、第２図に示されるよう
に真核生物の遺伝中に存在するイントロン様の配列をは
さんで、上記工程５で得られたＤ−アミノ酸オキシダー
ゼのアミノ基末端のアミノ酸配列に完全に一致するアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片が
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部をふくむことが
明らかになった。プラスミドｐＤＡＯｃ２−１２につい
ては、制限酵素切断の結果にもとづいて第３図にあられ
される制限酵素開裂地図を作成した。

上記の結果にもとづいて、すでに決定された塩基配列か
ら遺伝子読取り方向の下流にあたる領域についてＤＮＡ
塩基配列を決定したところ、第１図に示される３５５個
のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在
することが判明した（第１図では第２図で示されたイン
トロン様配列を削除して表示しである）。かくしてプラ
スミドｐＤＡＯｃ２−１２中のトリゴノプシス・パリア
ブリスＣＢＳ　　４０９５由来のＤＮＡ断片中にはＤ−
アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子が完全にふくまれて
いるものと推定された。

９、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の修飾クローニン
グされたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が大腸菌で発
現する上で障害となりうるＤＮＡ塩基配列部分をプラス
ミドｐＤＡＯｃ２−１２中のトリゴノプシス・パリアビ
リスＣＢ５　４０９５由来のＤＮＡ断片から第４図に示
される工程にしたがって削除した。以下に各工程を詳述
する。

（１）ブーｙＸミドｐＤＡＯｃ２−１２　４０μｇをＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩとＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断し、得ら
れる約０．４５　ｋ　ｂの断片を精製した後、その０．
８μｇにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰ、ＴＴＰを終濃
度各０．３３ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ（Ｋｌ
ｅｎｏｖ）断片５単位を加え、１０ｍＭトリス−塩酸（
ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、１ｍＭジチオレ
イトール、５０ｍＭＮａＣ１の反応液３０μΩ中で３０
℃、２０分間反応させた。これより両端が平滑端にされ
たＤＮＡ断片を精製し、その約０．２　ｐ　ｇにＢ　ａ
　ｍ　ＨＩリンカ−（０，０１７５０、Ｄ、）　とＴ４
　　ＤＮＡＩＪガーゼ１単位を加え、５０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ、、０．
５ｍＭＡＴＰ、５ｍＭジチオスレイトールの反応液２０
μａで１５℃、−夜反応させた。反応後ＤＮＡ断片を精
製し、Ｅｃ。

ＲＩとＢａｍＨＩで両端を切断し、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ−
ＢａｍＨＩ断片として回収した。一方ファージＭ１３　
ｍ　ｐ　１−８の２重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔｒ−Ｅ　ｃ　ｏ
　ＲＩとＢａｍＨＩで切断した後、これに上記のＥ　ｃ
　ｏ　ＲＩ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片を加え、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼで結合させて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子の一部を組みこんだファージＭ１３Ｍ２−１２−７
を造成した。

（２）イントロン様配列を削除するために、第４図に示
されるようにイントロン様配列の前後を直結した配列に
相補するオリゴヌクレオチドを合成し、ＤＡＯＥ　１と
命名した。ＤＡＯＥＩ　　２５ｐｍｏｌｅとＭ１３プラ
イマーＭｌ（全酒造社製）１０ｐｍｏｌｅをＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでりん酸化し、メッシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ）の方法〔文献：メソッズインエンザイモロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、遅狂、２０
−７８．１９８３）にしたがって調整したファージＭ１
３Ｍ２−１２−７の１本鎖ＤＮＡ＃０．５ｐｍｏｌｅを
加え、９５℃で５分間加熱後室温になるまで放置した。

ついでこれにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ（
各０．４ｍＭ）、ＡＴＰ（０，４ｍＭ）、ＤＮＡポリメ
ラーゼクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（５単位）、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（２単位）を加え、各７ｍＭのトリス−
塩酸（ｐＨ７，５）、ＭｇＣｌ２、ＮａＣ１および１４
　ｍ　Ｍのジチオスレイトールの反応液５０μΩ中で３
７℃、３０分間反応させた。０．５ＭのＥＤＴＡ５μＱ
を加えて反応停止後、メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の
方法（文献前出）にしたがってエシェリヒア−コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１＝３１
− 〇５を反応液でトランスフェクション処理し、ファージ
導入菌をプラークとして検出した。出現したファージ・
プラークをプラーク・ハイブリダイゼーション法〔文献
：ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）ら（１９７７）サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９６，１８０−１８２）によっ
て３２ｐでラベルしたＤＡＯＥ　１とハイブリダイゼー
ションさせ、陽性を示したプラークを見出した。陽性プ
ラーク中のファージを再度エシエリヒア・コリＪＭ１０
５に感染させて、上記と同様にしてＤＡＯＥｌとハイブ
リダイゼーションを示すプラークを純化して分離した後
、プラーク中に存在するファージを常法によって液体培
養し、１本鎖ＤＮＡを分離した。得られた１本鎖ＤＮＡ
の塩基配列を解析したところ、予定通りイントロン様配
列を欠失した塩基配列をもつトリゴノプシス・パリアビ
リスＣＢ５４０９５由来のＤ　Ｎ　Ａ断片をもつことが
判明したので、このファージをＭ１３ＭＨＩと命名した
。

（３）つぎにＤ−アミノ酸オキシダーゼ蛋白質合成開始
部位（ＡＴＧ）よりも上流にあるトリゴノプシス・パリ
アビリスＣＢ５４０９５由来のアミノ酸非コード領域を
削除するために、第４図に示されるようにこの領域の前
後を直結した配列に相補するポリヌクレオチドを合成し
、ＤＡＯＥ２と命名した。ついでＤＡＯＥ２とファージ
Ｍ１３ＭＥ１の１本鎖ＤＮＡとから、上記工程（２）で
のべた方法と同一の工程にしたがって、イントロン様配
列の削除に加えてＡＴＧより上流のアミノ酸非コード領
域をも削除されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一
部を保有するファージを造成し、これをＭｌ　３ＭＥ１
２と命名した。

１０、発現ベクターの造成 本実施例に用いられる発現用ベクター造成の出発プラス
ミドであるｐ　Ａ　Ｋ　Ｋ　Ｍ　１は公知の文献マツダ
（Ｍａｔｓｕｄａ）ら（１９８５）ジャーナルオブバク
テリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、　１６
３．１２２２−１２２８にその造成方法が示されており
、β−ラクタマーゼ遺伝子が不活化された特徴をもつ。

第５図に示すように、まずｐＡＫＫＭｌをＥ　ｃ　ｏ　
ＲＩとＢａｍＨＩで切断し、これより約５ｋｂのＤＮＡ
断片を分離・精製した。一方ｆｉａｃＵＶ５プロモータ
ーをふくむプラスミドｐＲＺ４０２２　（米国ライスコ
ンシン大学ダブりニー・レズニコフ（ＬＲｅｚｎｉｋｏ
ｆｆ）博士より入手〕をＥ　ｃ　ｏ　ＲＩとＢａｍＨＩ
で切断することによりＱａＣＵｖ５プロモーターを含む
９５ｂＰの断片を調製した。ついで上記２断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させ、発現用ベクターｐＥＸ
ＯＯ２を得た。なお上記で用いたプラスミドｐＲ２４０
２２はギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らの方法〔文献：
プロシーデイングスオブナショナルアカデミーサイエン
スユーエスエ−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ）、７０．３５８１−３５８４．１９７３〕
にしたがってｎａｃＵＶ５プモーターをふくむ９５ｂＰ
のＡ　Ｌ　ｕ　Ｉ断片を調整し、ｐＢＲ３２２のＥ　ｃ
　ｏ　ＲＩ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ部位に置換挿入するこ
とによって造成される。

１１、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の発現第６図に
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え体の造成
工程を示す。まずファージＭ１３ＭＥ１２の２本鎖ＤＮ
ＡよりＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断により約０．３
　ｋ　ｂのＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端部
分をコードするＤＮＡ断片を分離した。ついでｐＤＡＯ
ｃ２−１２よりＥ　ｃ　ｏ　ＲＩおよび５ａｌＩ切断に
よりＭ１３ＭＥ１２にふくまれている部分をのぞく約１
．２ｋｂのＤ−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部分
をコードするＤＮＡ切断を分離した。さらに発現用ベク
ターｐＥＸＯＯ２をＢ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＸｈｏＩで
切断した後、上記の２つの断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで結合反応を行なわせた。その反応液を用いてエ
シェリヒア・コリＭＢ６５を形質転換し、カナマイシン
４０μｇ／ｍｆｌをふくむＬ−ブロス寒天培地上で生育
してくるコロニーを選択した。得られたコロニーについ
て、Ｄ−メチオニンを基質とし、○−ジアニシジンを用
いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出をヘトリック
（Ｈｅｄｒｉｃｋ）ら（１９６８）アーカイブスオブバ
イオケミストリーアンドバイオフイジックス（Ａｒｃｈ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）、１２６，１５
５−１６４の方法に従って行なった結果、多数の陽性コ
ロニ　５Ｄ　− 一を得た。この中の１株からプラスミドＤＮＡを抽出し
、これをｐ　Ｅ　ＤＡＯ１−と命名し、制限酵素切断に
より第６図に示される構造を確認した。またこの組換え
体を保有する大腸菌をエシェリヒア・コリＭＢ６５／ｐ
ＥＤＡＯ１と命名した。

この菌をカナマイシン４０μｇ　／　ｍ　１１をふくむ
Ｌ−ブロス（Ｌ−ブロス寒天培地より寒天を除いたもの
）１００ｍＱに植菌し、３２℃で２４時間振どう培養し
た。培養液を遠心分離して集菌し、これを１０　ｍ　Ｑ
の０．１Ｍピロリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した
。これを超音波処理して細胞を破砕し、遠心分離した後
の上清をＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素液とした。

〔２〕コマモナスｅエスピー（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓ
ｐ、）ＳＹ−７７−１（微工研菌寄第２４１０号）から
クローニングされたグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺
伝子を含む組換え体ｐＡＫＫＢ１００１　（特開昭６Ｏ
−１１０２９２）を下記の方法によって調製した。

１）コマモナス属細菌５Ｙ−７７−１（微工研菌寄第２
４１０号）から全ＤＮＡの調製とその切断ニュートリエ
ンド・ブロス（牛肉エキス０．３％、ペプトン０．５％
）１００ｍＱにコマモナス属細菌５Ｙ−７７−１（微工
研菌寄第２４１０号）を接種し、３０℃にて一夜培養後
集菌し、８ｍΩのＴＥ緩衝液に懸濁する。これにリゾチ
ームを終濃度１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑになるように加え
、３７℃にて１時間反応させる。次にこれにプロナーゼ
Ｅを終濃度２００μｇ　／　ｍ　Ｑになるように加え、
つづいてドデシル硫酸ナトリウムを終濃度１％になるよ
うに加えて３７℃にて１時間反応させる。反応終了後反
応液に等容量のＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉ　５−Ｈ
ＣＩ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣ１；　ｐ
Ｈ８，０）で飽和したフェノールを加え、混合した後１
０．０００ｒｐｍで１０分間遠心し、水層を採取する。

この水層に等容量のフェノール・クロロホルム混液（１
：１．Ｖ／Ｖ）を加え、同様にして遠心後水層を採取し
て、さらに等容量のクロロボルムを加えて同様にして遠
心後水層を採取する。採取した水溶液にリボヌフレアー
ゼＡを終濃度４０μｇ　／　ｍ　＋２になるように加え
、３７℃にて１時間反応させる。反応終了後Ｎ　ａ　Ｃ
ｌとポリエチレングリコール６０００を各々終濃度ＩＭ
および１０％になるように加え、４℃にて４時間保持し
てから５０００ｒｐｍで５分間遠心し、生成した沈殿を
０．１倍濃度ＴＥ緩衝液に溶かす。こうして得られた溶
液に酢酸ナトリウムを終濃度３００ｍＭになるように加
え、２倍容量のエタノールを加えて、−２０’Ｃにて４
時間保持した後、１０．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心し
てＤＮＡの沈殿を集める。この沈殿を０．１倍濃度ＴＥ
緩衝液に溶かし、以後の切断反応に供する。ＤＮＡの切
断のためには１μｇのＤＮＡに対し０．３単位のＰｓｔ
Ｉを加え、１０ｍＭＴｒｉ　５−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４
）、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４゜５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍ
Ｍジチオスレイトールの緩衝液３０μΩ中で３７℃にて
１．５時間反応を行なわせ、つづいて７０℃で１０分間
加熱して反応を停止させる。

２）ベクターｐＢＲ３２２の開裂 １μｇのｐＢＲ３２２に対し１単位のＰｓｔＩを加え、
ｌ）と同一の緩衝液３０１１μ中で３７℃にて２時間反
応させ、１）と同様にして反応を停止させる。

３）再結合反応 ０．８μｇの切断されたコマモナス属細菌５Ｙ−７７−
ＩＤＮＡ、０．４μｇの開裂されたＰＢＲ３２２，３０
ｍＭ　Ｔｒｉ　５−ＨＣＩ（ｐＨ７゜５）、１０ｍＭ　
ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、
１０ｍＭ　ＡＴＰ、１単位Ｔ４リガーゼをふくむ１００
μＱの反応液中で２２°Ｃにて２時間反応させる。その
後７０℃にて１０分間加熱することにより、反応を停止
させる。

４）組換え体プラスミドの大腸菌への導入３）で再結合
反応させることにより得られたＤＮＡｍ液でエシェリヒ
ア・コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−（ＡＴＣＣ３３５２５
）を形質転換し、テトラサイクリン１０μｇ　／　ｍ　
Ｑを含むＬ−ブロス寒天培地に生育してくるコロニーを
分離した。これらのコロニーをアンピシリン５０μｇ　
／　ｍ　ＱをふくむＬ−ブロス寒天培地上に移殖して生
育の有無を試験し、アンピシリン感受性を示すコロニー
を組換え体ＤＮＡを保持した大腸菌として分離した。

５）グルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ産生能を有する大
腸菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン感受性株をテト
ラサイクリンをふくむＬ−ブロス寒天培地上で３２℃に
て一夜培養し、生育した菌の一部をかきとって１００μ
Ｑのグルタリル７−ＡＣＡ（１ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ　）
をふくむ０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁した
後、３７℃にて５時間反応させる。その後１２０μＱの
反応停止液（１００％酢酸２容と０．２５Ｍ　ＮａＯＨ
１容の混合液）を加え、さらに４０μΩの発色液（ｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドを０．５％になるよう
にメタノールに加えた液）を加える。この反応でグルタ
リル７−ＡＣＡアシラーゼ産生能を有する大腸菌は反応
液を黄色に変色させる。こうして得られた新規な大腸菌
をエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫｌｏｏ
ｌ）と命名した。

４Ｏ− ６）大腸菌プラスミドＤＮＡの分離と解析上記の大腸菌
をＩＱＯｍＱのテトラサイクリンをふくむＬ−ブロスに
接種し３７℃にて一夜培養後、遠心集菌し、１５％蔗糖
、５０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣｌ　　（Ｐ　Ｈ８、５）　
、　５０　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび１　ｍ　ｇ　
／　ｍΩのリゾチームよりなる溶液２ｍｎに懸濁した後
、室温にて１時間保持する。

次にトリトン（Ｉｒｉｔｏｎ）溶液（０，１％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、５０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ；　ｐＨ８，５）２ｍＱを加え、３７℃に
て３０分間保持する。その後この溶液を５℃にて３０．
ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心し、上清を採取する。これ
をエチジウムブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠
心（１５℃にて４０．ＯＯＯｒｐｍ、４８時間）にかけ
、プラスミドＤＮＡを分離精製する。これを２）と同様
の方法でＰｓｔＩで切断し、断片の長さを１％アガロー
スを用いたアガロース電気泳動法で測定したところ、ベ
クターＤＮＡに相当する４、３Ｋｂの断片の他に３．６
Ｋｂ、−２，６Ｋｂ、０．９にｂの断片が見出された。

このことがら新規な大腸菌から分離された組換え体ＤＮ
Ａは第７図において制限酵素地図で示される構造を有し
、組換え体ＤＮＡではｐＢＲ３２２に７．ＩＫｂのＤＮ
Ａ断片が組み込まれていることが判明した。

７）反応生成物の確認 上記の新規な大腸菌をテトラサイクリンをふくむＬ−ブ
ロス５　ｍ　ｆｌに接種し、３２℃にて一夜培養後遠心
集菌し、１ｍΩのグルタリル７−ＡＣＡ（２５ｍ　ｇ　
／　ｍ　ｊ２　）をふくむ０．１Ｍ燐酸緩衝液に懸濁す
る。これを３７℃にて６時間反応させ、遠心して上清を
採取し、高速液体クロマトグラフィーに供する。高速液
体クロマトグラフィーにはＬｉｎｃｈｒｏｓｏｒｂ　Ｓ
　１１００を充てんしたカラム（１５０Ｘ４ｍｍ）を用
い、溶媒としては０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）を
用いて溶出し、溶出液中の紫外部吸光物質を２６０ｎｍ
の吸光度を測定して検出する。上記反応液からは７−Ａ
ＣＡに完全に一致する紫外部吸光物質が検出され、７−
ＡＣＡが生成していることが確認された。

８）組換え体ＤＮＡの改変によるグルタリル７−ＡＣＡ
アシラーゼ産生能の増大した大腸菌の分離組換え体ＤＮ
Ａ中に存在するグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ産生遺
伝子の発現を増大することによりグルタリル７−ＡＣＡ
アシラーゼの産生を増大させるため、以下にのべる工程
にしたがって組換え体ＤＮＡの改変が行なわれた。

ａ）エシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫｌｏ
ｏＩ）から６）のようにして分離したプラスミドＤＮＡ
を以下のようにしてＢ　ａ　ｍ　ＨＩで部分的に切断す
る。プラスミドＤＮＡＩμｇに対し０．５単位のＢ　ａ
　ｍ　ＨＩを加え、１）でのべたＤＮＡ切断用の緩衝液
３０μΩ中で３７℃にて１時間反応させた後１等容量の
ＴＮＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、反応を停止
させる。次に遠心によりフェノールを除去した後、等容
量のエチルエーテルを加えて混合し、エチルエーテルを
除去する。この溶液中のＤＮＡをエタノールで沈殿させ
、沈殿を０．１倍濃度ＴＥ緩衝液に溶かす。

ｂ）ベクターｐＢＲ３２５を２）でのべた方法に　４ｊ
　− よってＰｓｔＩで開裂し３）でのべた方法で再び閉環さ
せた後、エシェリヒア・コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−Ｃ
ＡＴＣＣ３３５２５）に導入し、テトラサイクリンをふ
くむＬ−ブロス寒天培地上に生育してくるコロニーから
アンピシリンに感受性になった株を選択分離する。こう
して得られたアンピシリン感受性株よりプラスミドＤＮ
Ａを取得することにより、アンピシリン耐性遺伝子（β
−ラクタマーゼ産生遺伝子）が不活化された新規なベク
ターが得られる。

Ｃ）上記の新規なベクタープラスミドをＢ　ａ　ｍ　Ｈ
■で開裂させる。

ｄ）ａ）で得られたＤＮＡと開裂された新規なベクター
プラスミドを３）でのべた方法より再結合し、エシェリ
ヒア・コリＫ　１２　Ｃ６００ｒ−ｍ−（ＡＴＣＣ３３
５２５）に導入した後、クロラムフェニコール２０μｇ
　／　ｍ　ＱをふくむＬ−ブロス寒天培地に生育するコ
ロニーを選択分離する。

ｅ）選択された株の中から５）にのべる方法によりグル
タリル７−ＡＣＡアシラーゼ産生能を有する株を選択分
離する。次にグルタリル７−ＡＣ：Ａアシラーゼ産生能
を有する株のグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ活性を測
定し最も活性の高い株を選択分離する。グルタリル７−
ＡＣＡアシラーゼ活性の測定にはクロラムフェニコール
をふくむＬ−ブロス５　ｍ　Ｑで一夜培養した菌体をグ
ルタリル７−　Ａ　ＣＡ　（２５ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ　
）　　をふくむ０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）２ｍ
Ｒに懸濁し、３７℃にて１５分間反応させ、反応後直ち
に遠心して菌体を除去した後、反応液の一定量を高速液
体クロマトグラフィーに供し、生成している７−ＡＣＡ
を定量する。

このようにして得られた高いグルタリル７−ＡＣＡアシ
ラーゼ産生能を有する新規な大腸菌の一株をエシェリヒ
ア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫＢ　１００１）と命
名した。新規な大腸菌のグルタリル７−ＡＣＡアシラー
ゼ産生能を比活性で比較したところ、コマモナス属細菌
５Ｙ−７７−１（微工研菌寄第２４１０号）の活性を１
とするとき、エシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡ
ＫＫ１００１）は３、これに対してエシェリヒア・コリ
に１２Ｃ６００（ＰＡＫＫＢｌｏｏＩ）では１５であっ
た。

９）グルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ産生能の増大した
大腸菌よりプラスミドＤＮＡの分離と解析８）で得られ
た新規な大腸菌より６）でのべた方法によってプラスミ
ドＤＮＡを分離し、ＢａｍＨＩで切断してアガロースゲ
ル電気泳動法でＤＮＡ断片の長さを測定したところ、８
）のｂ）で得られた新規なベクターに相当する５、９Ｋ
ｂの断片の他に４．８Ｋｂ、０．７Ｋｂの断片が見出さ
れた。さらにプラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動法で解析した結果にもとづいて、
第８図に示される組換え体ＤＮＡの制限酵素地図が作成
された。

このことからエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡ
ＫＫＢｌｏｏｌ）より分離された組換え体ＤＮＡでは、
ｐＢＲ３２５を改変した新規なベクターＤＮＡにエシェ
リヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫｌｏｏｌ）から
分離された組換え体−４７＝ ＤＮＡの一部分である５、５ＫｂのＤＮＡ断片が組み込
まれていることが判明した。

得られたプラスミドＰＡＫＢ１００Ｉを第９図に示す工
程により改変してから、形質転換体を得て、酵素生産に
用いた。以下にこの工程を詳しく説明する。

■プラスミドｐＡＫＫＢ１００１を制限酵素ＨｐａＩで
開裂し、つづいて制限酵素ＰｖｕＩ　Ｉで部分的に切断
した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再結合させた。これでエ
シェリヒア・コリＭＭ２９４〔アメリカンタイプカルチ
ャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）よりＡＴＣＣＮｏ
、３３６７８として入手できる〕を形質転換し、クロラ
ムフェニコール２５μｇ　／　ｍ　Ｑを含むＬ−ブロス
寒天平板上で生育するがテトラサイクリン１０μｇ　／
　ｍ　Ｑを含む培地上では生育できない（これをテトラ
サイクリン感受性と称する）コロニーを選択した。この
コロニーを培養してプラスミドＤＮＡを分離し、ｐＡＫ
ＫＢ１００３と命名した。改変された組換え体はグルタ
リル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を保持し、かつ小型化
された特徴をもつ。

■プラスミドｐＵＣ９（アメリカンタイプカルチャーコ
レクションよりＡＴＣＣＮｏ、３７２５２として入手で
きる）を制限酵素Ｈａ　ｅ　ｍで切断し、生成したＤＮ
Ａ断片から約０．２Ｋｂの大きさの断片をアガロースゲ
ル電気泳動により分離し、精製した。一方プラスミドｐ
ＡＫＫＢ１００３を制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍで開裂し
、つづいてＨａ　ｅ　ｍで部分的に切断した後、ＤＮＡ
ポリメラーゼ・フレノウ（ＫＬｅｎｏｖ）断片とｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰを作用させて、切
断端を平滑末端にした。このものと上記のｐＵＣ９から
分離した断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合反応
を行なった。これでエシェリヒア・コリＭＭ２９４を形
質転換し、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＱと５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トシド２０μｇ　／　ｍ　Ｑを含むＬ−ブロス寒天平板
上で生育し、かつ青色を呈するコロニーを選択した。こ
れらのコロニーにグルタリル７−ＡＣＡを作用させ、前
記５）に記載のｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドで
７−ＡＣＡを発色させる方法を用いてグルタリル７−Ａ
ＣＡアシラーゼ活性を検出した。酵素活性を有するコロ
ニーを選択し、これよりプラスミドＤＮＡを分離して、
ｐＡＫＫｌａｃｌｏｏｌと命名した。

この組換え体をさらに簡便なものにするため、ｐＡ　Ｋ
　Ｋ　ｌ　ａ　ｃ　１００１を制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　
ｍとＳｍａＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ
断片を前記と同様に作用させて平滑末端をもつ断片とし
た後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再結合させた。

これでエシェリヒア・コリＭＢ６５（微工研菌寄第８９
ｏＯ号）を形質転換し、クロラムフェニコールに耐性で
かつグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ活性を有するコロ
ニーを選択した。このコロニーよりプラスミドＤＮＡを
分離し、ＰＡＫＫΔＳＨ１と命名し、またこれによる形
質転換体をエシェリヒア・コリＭ　Ｂ　６５　／　ｐ　
Ａ　Ｋ　ＫΔＳＨＩと命名した。組換え体ｐＡＫＫΔＳ
　Ｈ１は、エシェリヒア・コリのβ−ガラクトシターゼ
遺伝子のプロモーターを含む部分と融合し、発現の調節
が可能になったグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子
を含むようになった特徴をもつ。

こうして得られたエシェリヒア・コリＭＢ６５／　ｐ　
Ａ　Ｋ　ＫΔＳＨＩをクロラムフェニコール２５μｇ　
／　ｍ　ｎを含むＬ−ブロスで培養し、上記（１）と同
様に処理して、グルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ酵素液
を調製した。

〔３〕Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素液１ｏｍＱ、グル
タリル７−ＡＣＡアシラーゼ酵素液１０　ｍ　Ｑおよび
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）３０ｍαを混合し
、セファロスポリンＣ（純度７０％）７１４ｍｇを添加
して、３７℃で振とうしながら反応を行なった。３０％
過酸化水素水を反応開始後１５分、３０分、４５分後に
各々０　、０５　ｍ　Ｑ、７０分、８５分、１００分後
に各々０．０１ｍ１１加えて１２０分間反応を行なった
。反応終了液中の７−ＡＣＡの生成率は５５．７％であ
った。

反応液を水で３倍に希釈し、１００　ｍ　ＱのＤＥＡＥ
セファデックスＡ−２５（Ｃ１−型、ファルマシア社製
）のカラムに通した。１２０　ｍ　Ｑの水で洗い、つい
で０．０５Ｍの食塩水を通すと７−ＡＣＡが溶出された
。７−ＡＣＡ画分を集め、ｐＨ７，０に調節して減圧濃
縮後、予め０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗っ
たダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成製）１００ｍＱの
カラムを通過させ、次に脱イオン水で充分カラムを水洗
した後、５０％メタノール水で溶出した。７−ＡＣＡ溶
出画分を集め、減圧濃縮後、ｐ　Ｈ３、０に調節し、冷
所に放置したところ、７−ＡＣＡが析出した。沈殿物を
集め、真空乾燥して、１６０ｍｇの７−ＡＣＡを得た。

この純度は８０％であった。

実施例２ 実施例１と同様の反応系にデアセチルセファロスポリン
Ｃ（純度６５％）５００ｍｇを添加し、３７℃で１２０
分反応を行なった。反応終了液中の７−アミツブアセチ
ルセファロスボラン酸の生成率は５２％であった。

実施例３ 本実施例はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換
え体とグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を含む組
換え体が共存する形質転換体を用いる方法に関する。

（１）ｐＥＤＡ○１およびｐＡＫＫΔＳＨＩはともにｐ
ＢＲ３２２に起源をもつベクターを用いて造成された組
換え体である。そこでｐＢＲ３２２とは不和合性の異な
ることが知られているプラスミドｐＡｃＹ０１８４　（
アメリカンタイプカルチャーコレクションよりＡＴＣＣ
Ｎｏ、３７０３３として入手できる）に、第１０図に示
される工程で、ｐＡＫＫＡＳＨＩ中のグルタリル？−Ａ
ＣＡアシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだ。

すなわち、まずｐＡｃＹｃ１８４をＨｉｎｄ’ｌＩＩで
開裂した。一方ｐＡＫＫへＳＨＩを制限酵素ＰｖｕｌＩ
とＮｄｅｌで切断し、生成した約３ＫｂのＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動で分離し、精製した後、ＤＮＡ
ポリメラーゼ・フレノウ断片を前記と同様に作用させて
、平滑末端をもつ断片とした。これにＴＤＮＡリガーゼ
の作用でＨｉ　ｎ　ｄ■クリンカを付加し、Ｈｉ　ｎ　
ｄ　ｍで処理した後、　ｂｉ　− 上記のｐＡＣＹＣ１８４と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で両者を結合させた。これでエシェリヒア・コリＭＢ６
５を形質転換し、クロラムフェニコールに耐性でかつテ
トラサイクリンに感受性であり、しかもグルタリル７−
ＡＣＡアシラーゼ活性を有するコロニーを選択した。こ
のコロニーを培養してプラスミドＤＮＡを分離し、これ
をｐＡＣＹＣａｃｌと命名した。ｐ　Ａ　ＣＹ　Ｃａ　
ｃ　１でエシェリヒア・コリＭ　Ｂ　６５　／　ｐ　Ｅ
　Ｄ　Ａ　Ｏ１を形質転換し、カナマイシン４０μｇ　
／　ｍΩとクロラムフェニコール２５μｇ　／　ｍ　Ｑ
を含むＬ−ブロス寒天平板上で生育してくるコロニーを
選択して、これをエシェリヒア・コリＭ　Ｂ　６５　／
　ｐ　Ｅ　Ｄ　Ａ　Ｏ１／　ｐ　Ａ　ＣＹＣａｃｌと命
名した。

（２）エシェリヒア・コリＭ　Ｂ　６５　／　ｐ　Ｅ　
Ｄ　Ａ　０１／ｐＡｃＹｃａｃｌをカナマイシン４０μ
ｇ／ｍＱとクロラムフェニコール２５μｇ　／　ｍ　Ｑ
を含むＬ−ブロスで培養して、実施例１と同様にして酵
素液を調製した。酵素液１ｍＦ！、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）４ｒｎＱにセファロスボリンＣ（純度
７０％）を７０　ｍ　ｇ添加し、実施例１と同様にして
１２０分間反応を行なった。反応終了液中の７−ＡＣＡ
生成率は４０．６％であった。

実施例４ 本実施例はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子とグルタリ
ル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子が共存する組換え体を保
有する形質転換体の培養物を用いる方法である。

（１）上記両遺伝子が共存する組換え体の造成工程を第
１１図に示す。すなわちｐＡＫＫΔＳＨＩをＰｖｕＵお
よびＮｄｅＩで切断し、生成したＤＮＡ断片の両端をＤ
ＮＡポリメラーゼ・フレノウ断片を前記と同様に作用さ
せて平滑末端とした。

これよりアガロースゲル電気泳動により約３Ｋｂの大き
さの断片を分離し、精製した。一方ｐＥＤＡＯＩをＳｍ
ａｌで開裂し、これと上記の断片を混合した後、両者を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用で結合させた。これを用いて
エシェリヒア・コリＭＢ６５を形質転換し、カナマイシ
ン４０μｇ／ｍ１を含むＬ−ブロス寒天平板上に生育し
かつグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ活性を示すコロニ
ーを選択した。このコロニーよりプラスミドＤＮＡを分
離し、これをｐＤＯａｃｌと命名し、これを保持する形
質転換体をエシェリヒア・コリＭＢ６５　／　ｐ　Ｄ　
Ｏａ　ｃ　１と命名した。

（２）エシェリヒア・コリＭ　Ｂ　６５　／　ｐ　Ｄ　
Ｏａ　ｃｌをカナマイシン４０μｇ／μｇを含むＬ−ブ
ロスで培養し、実施例１と同様にして酵素液を調製した
。これを実施例３と同様にしてセファロスポリンＣに作
用させたところ１反応終了液中の７−ＡＣＡ生成率は１
６％であった。

実施例５ エシェリヒア・コリＭＢ６５を変異誘起剤Ｎ−メチル−
Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジンで処理した後、
ルーエン（ｌｏｅｗｅｎ）の方法（文献：ジャーナルオ
ブバクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１５
２．６２２−６２６．１９８４）にしたがって、カタラ
ーゼ活性の欠損した変異株を分離し、これをエシェリヒ
ア・コリＭＢＣ１０１３と命名した。なお本変異株は工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研−〇Ｄ　− 菌寄第８９０１号として寄託されている６ｐＥＤＡＯ１
およびＰＡＫＫΔＳＨＩで独立にエシェリヒア・コリＭ
ＢＣ１０１３を形−質転換し、得ら九た各々の形質転換
体を培養して、実施例１と同様にして酵素液を調製した
。各々の形質転換体からの酵素液各１ｍＱ、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８，０）３ｍＱにセファロスポリンｃ
（純度７０％）７０ｍｇを添加し、３７℃で振とうさせ
ながら、過酸化水素水を添加せずに１２０分反応を行な
った。反応終了液中の７−ＡＣＡ生成率は５９％であっ
た。

実施例６ エシェリヒア・コリＭＢＣ１０１３をｐＥＤＡｏｌおよ
びｐＡｃＹｃａｃｌで同時に形質転換し、カナマイシン
４０μｇ／ｍ（ｌとクロラムフェニコール２５μｇ　／
　ｍ　Ｑを含むＬ−ブロス寒天平板上で生育してくるコ
ロニーを形質転換体として分離した。この形質転換体を
カナマイシン４０μｇ／ｍＱとクロラムフェニコール２
５μｇ　／　ｍ　Ｑを含むＬ−ブロスで培養して、実施
例１と同様にして酵素液を調製した。酵素液１ｍＱ、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ８、０）にセファロスポリ
ンＣ（純度７０％）７０ｍｇを添加し、３７℃で振とう
させながら、過酸化水素水を添加せずに１２０分反応を
行なった。反応終了液中の７−ＡＣＡ生成率は４２．６
％であった。

〔発明の効果〕

本発明者らは大腸菌にクローニングされたＤ−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子とグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ
遺伝子を用いれば。

（１）両遺伝子を個別に保持する形質転換体の培養物ま
たは処理物の共存、 （２）両遺伝子を箇別に含む組換え体の共存する単一の
形質転換体の培養物または処理物あるいは、（３）　Ｗ
Ｊ遺伝子が共存する単一の組換え体による単一の形質転
換体の培養物または処理物のいずれを用いても、１段の
工程できわめて効率よくセファロスポリンＣおよびその
誘導体から７−ＡＣＡおよびその誘導体を生成せしめる
ことができる。また上記反応の進行のためには通常の大
陽画を宿主として用いた場合過酸化水素の補給を必要と
するが、実施例から明らかなようにカタラーゼ生産能を
欠損した大腸菌の変異株を宿主として用いれば、過酸化
水素を補給する必要もなく、さらに容易な反応工程にす
ることができる。このようにセファロスポリンＣから７
−ＡＣＡを製造する上で、従来の方法と比較して画期的
にすぐれた方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図はトリゴノプシス・パリアビリス由来のＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。 図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそれぞ
れ示す。 第２図はプラスミドｐＤＡＯｃ２−１２よりＥｃ　ｏ　
ＲＩ切断により生成する約０．６Ｋｂの断片の塩基配列
の一部を示す。図中で上段は塩基配列を、下段はこれに
対応するアミノ酸配列を、点線を引いた部分はイントロ
ン様配列を示す。 第３図はプラスミドｐＤＡＯｃ２−１２の制限酵素開裂
地図を示す。 第４図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の概要を示す。 第５図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Ｃｍｒ。 Ｋ　ｍｒ、　Ａ　ｐ　ｒは各々クロラムフェニコール、
カナマイシン、アンピシリンに対する耐性遺伝子を、Ｐ
ｌａｃＵＶ５は１ａｃＵＶ５プロモーターを示す。 第６図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工程の概要を示す。図中で−の部分はＤ−アミノ
酸オキシダーゼ（ＤＡ○の略号で表示）のアミノ酸配列
コード領域を示す。 第７図はエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫ
ｌｏｏｌ）より分離された組換え体プラスミドの制限酵
素地図である。 第８図はエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫ
Ｂｌｏｏｌ）より分離された組換え体プラスミドの制限
酵素地図である。 第９図は組換え体ｐＡＫＫＢ１００１の改変の工程を示
す。図中には工程に関与しているかあるいはマーカーと
なる制限酵素切断部位のみが以下の略号で示されている
。Ｅ、ＥｃｏＲＩ。Ｐｖ。 Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ　、　Ｈ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ。Ｂ、Ｂ
ａｍＨＩ。 Ｈｅ、ＨａｅＩＩＩ。Ｈｐ、ＨｐａＩ。Ｎ、ＮｄｅＩ。 Ｓｍ、ＳｍａＩ。また図中Ｃｍ　ｒ、Ｔ　ｃｒ、Ａ　ｐ
ｒは各々クロラムフェニコール、テトラサイクリン、お
よびアンピシリンへの耐性遺伝子を、ａ６ｙｌはグルタ
リル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を表示する。 第１０図はプラスミドｐＡｃＹｃ１８４にグルタリル７
−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体ｐＡｃＹ
ｃａｃｌの造成工程を示す。 第１１図はＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子（図中ＤＡ
Ｏの略号で表示）を含む組換え体ＰＥＤＡＯＩにグルタ
リル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体ｐ
　Ｄ　Ｏａ　ｃ　１の造成工程を示す。図中Ｋｍｒはカ
ナマイシンへの耐性遺伝子を表示する。 　ｂｏ　− 第１図 ＊　８４１ ＧＡＣ，ＣＧＡ、ＴＴＣ，ＣＣＧ、ＧＡＡ、ＣＴＧ、Ａ
ＣＣ，ＡＡＡ、ＧＡＴ、ＧＧＣ，ＣＣＴ。 Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｃ１ｕ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＊　９０】 ＣＡＣ，ＣＧＴ、ＣＣＴ、ＧＧＴ、ＡＧＡ、ＧＡＧ、Ｇ
ＧＣ，ＧＧＴ、ＣＣＣ，ＣＧＡ、ＧＴＡ。 Ｈｌｍ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃ１ｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−＊　９６】 ＴＴＴ、ＧＴＴ、ＧＴＣ，ＣＡＴ、ＡＡＣ，ＴＡＴ、Ｇ
ＧＴ、ＧＣＣ，ＧＣＣ，ＧＧＴ、ＧＣＴ。 Ｐｈａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔ（Ｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ａｔａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−＊１０２１ ＧＡＴ、ＧＡＡ、ＧＣＴ、ＧＴＴ、ＴＣＴ、ＴＡＣ，Ｇ
ＴＣ，ＧＡＡ、ＡＧＡ、ＧＣＴ、ＣＴＴ。 Ａｓｐ−Ｃ１ｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｏｒ−Ｔｙｒ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（その３） ９００＊ 口ＴＴ、ＧＡＣ，ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＣＧＣ，ＧＡＡ、Ｔ
ＧＣ，ＧＴＴ、ＧＧＣＬｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｖａｌ
−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ９６０＊ ＣＡＡ、ＴＴＡ、ＧＡＧ、ＡＡＣ、ＡＴＣ，ＣＣＣ、Ｇ
ＧＣ，ＧＴＴ　、ＧＧＣＣｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ］０２０
＊ ＧＧＴ、ＴＡＣ，ＣＡＡ、ＴＣＣ，ＴＣＴ　、ＴＡＣ，
ＧＧＣ，ＡＴＧ　、ＧＣＴＣｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃ１ｎ−３
ｓ　ｒ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅ　ｔ−Ａｌ　ｐ
ｃＡＣＴ、ＣＧＴ、ＣＣＡ、ＡＡＣ，ＣＴＴ、ＴＡｆｌ
。 Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｇｎ−Ｌｅｕ−幸＊＊−第
６図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中Ｒは−ＯＣＯＣＨ＿３、−Ｈ、または−ＯＨであ
   る）で表わされる化合物またはその塩を脱アシル化して
   一般式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中Ｒは前記と同じ意味を有する）で表わされる化合
   物またはその塩を生成させる７−アミノセファロスポラ
   ン酸及びその誘導体の製造方法において、前記式（ I
   ）で表わされる化合物に組換えＤＮＡ技術により大腸菌
   に産生せしめたＤ−アミノ酸オキシダーゼ及び７β−（
   ４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸アシ
   ラーゼを含む酵素混合物を過酸化水素の存在下または非
   存在下に水性媒体中で作用させることを特徴とする７−
   アミノセファロスポラン酸およびその誘導体の製造法。
2. （２）該酵素混合物が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝
   子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換された大腸菌の培養
   物またはその処理物と７β−（４−カルボキシブタンア
   ミド）セファロスポラン酸アシラーゼ遺伝子を含む組換
   え体ＤＮＡで形質転換された大腸菌の培養物またはその
   処理物との混合物であることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１）項に記載の製造法。
3. （３）該酵素混合物が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝
   子を含む組換え体ＤＮＡおよび７β−（４−カルボキシ
   ブタンアミド）セファロスポラン酸アシラーゼ遺伝子を
   含む組換え体ＤＮＡで形質転換された単一の大腸菌の培
   養物またはその処理物であることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１）記載の製造法。
4. （４）該酵素混合物が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝
   子および７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファ
   ロスポラン酸アシラーゼ遺伝子を共に含む単一の組換え
   体ＤＮＡで形質転換された単一の大腸菌の培養物または
   その処理物であることを特徴とする特許請求の範囲第（
   １）項に記載の製造法。
5. （５）該酵素混合物がカタラーゼ産生能を欠損していな
   い大腸菌が産生するＤ−アミノ酸オキシダーゼと７β−
   （４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸ア
   シラーゼを含む酵素混合物であり、該酵素混合物を一般
   式（ I ）で表わされる化合物またはその塩に過酸化水
   素の存在下に作用させることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１）乃至（４）項のいずれかに記載の製造法。
6. （６）該酵素混合物がカタラーゼ産生能を欠損している
   大腸菌が産生するＤ−アミノ酸オキシダーゼと７β−（
   ４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン酸アシ
   ラーゼを含む酵素混合物であり、該酵素混合物を一般式
   （ I ）で表わされる化合物またはその塩に過酸化水素
   の非存在下に作用させることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１）乃至（４）項のいずれかに記載の製造法。