JPS6374488A - 7−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法 - Google Patents
7−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法Info
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は7−アミノセファロスポラン酸(以下、7−A
CAと略す)およびその誘導体の酵素的手段による製造
方法に関するものである。
CAと略す)およびその誘導体の酵素的手段による製造
方法に関するものである。
醗酵生産によって得られるセファロスポリンCは7位ア
ミノ基に結合したアシル基を除去する反応(以下、脱ア
シル化と略す)により7−ACAに誘導され、これを出
発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質が合成
され、医薬品として実用に供されている。
ミノ基に結合したアシル基を除去する反応(以下、脱ア
シル化と略す)により7−ACAに誘導され、これを出
発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質が合成
され、医薬品として実用に供されている。
セファロスポリンCの脱アシル化方法としては化学的方
法および酵素的方法があるが、化学的脱アシル化法(例
えば特公昭41−13862号および特公昭45−40
889号の方法)は反応工程が多く、反応に用いる試薬
のコストが高いこと、反応の副産物として大量の化合物
が排出されることなど工業的に欠点が多いことが知られ
ている。
法および酵素的方法があるが、化学的脱アシル化法(例
えば特公昭41−13862号および特公昭45−40
889号の方法)は反応工程が多く、反応に用いる試薬
のコストが高いこと、反応の副産物として大量の化合物
が排出されることなど工業的に欠点が多いことが知られ
ている。
酵素的脱アシル化法としてはセファロスポリンCの7位
側鎖7β−(D−5−アミノ−5−カルボキシペンタン
アミド)基のD−5−アミノ基にグリオキシル酸を作用
させ化学的に脱アミノ反応を行なう特公昭55−129
10の方法、あるいは微生物酵素を作用させて脱アミノ
反応を行なう特公昭50−7158の方法などにより、
セファロスポリンCを7β−(5−カルボキシ−オキソ
ペンタンアミド)セファロスポラン酸に誘導し。
側鎖7β−(D−5−アミノ−5−カルボキシペンタン
アミド)基のD−5−アミノ基にグリオキシル酸を作用
させ化学的に脱アミノ反応を行なう特公昭55−129
10の方法、あるいは微生物酵素を作用させて脱アミノ
反応を行なう特公昭50−7158の方法などにより、
セファロスポリンCを7β−(5−カルボキシ−オキソ
ペンタンアミド)セファロスポラン酸に誘導し。
ついで過酸化水素を作用させることにより脱炭酸反応を
行なわせて7β−(4−カルボキシブタンアミド)セフ
ァロスポラン酸(通称グルタリルアミドセファロスポラ
ン酸。以下、グルタリル7−ACAと略す)に誘導して
おき、更にシュードモナス属(Pseudomonas
)細菌の生産する酵素(文献:シブヤ(Shibuya
)ら(1981)アグリカルチュラルバイオロジカルケ
ミストリー (Agricultural Biological
Chemistry)45 、 1561−1567)
を作用させることにより脱アシル化反応を行なわせ、7
−ACAへ誘導する方法がある。この方法は化学的脱ア
シル化法の問題点の多くを解決できるが、3段の反応で
あるため、より勝れた酵素的な一段反応による方法の開
発が望まれていた。
行なわせて7β−(4−カルボキシブタンアミド)セフ
ァロスポラン酸(通称グルタリルアミドセファロスポラ
ン酸。以下、グルタリル7−ACAと略す)に誘導して
おき、更にシュードモナス属(Pseudomonas
)細菌の生産する酵素(文献:シブヤ(Shibuya
)ら(1981)アグリカルチュラルバイオロジカルケ
ミストリー (Agricultural Biological
Chemistry)45 、 1561−1567)
を作用させることにより脱アシル化反応を行なわせ、7
−ACAへ誘導する方法がある。この方法は化学的脱ア
シル化法の問題点の多くを解決できるが、3段の反応で
あるため、より勝れた酵素的な一段反応による方法の開
発が望まれていた。
セファロスポリンCを直接脱アシル化して7−ACAを
得る方法としては、アクロモバクタ−属(Achrom
obacter)、ブレビバクテリウム属(Brevi
bacterium )あるいはフラボバクテリウム属
(Flavobacterium)の細菌を用いるアメ
リカ特許No、3239394 (1966)の方法、
アスペルギルス属(ハu」区は肛)あるいはアルタナリ
ア属(Alternaria)の真菌を用いる特開昭5
2−143289の方法、シュードモナス属の細菌を用
いる特開昭53−94093の方法、ペシロミセス属(
h可カシ竺弦)の真菌を用いる特開昭59−44392
の方法およびシュードモナス属の新種に属する細菌を用
いる特開昭61−21097の方法がある。さらにはシ
ュードモナス属の細菌からクローニングされたセファロ
スポリンCアシラーゼの遺伝子を含む大腸菌の形質転換
体を用いる特開昭61−152286の方法がある。
得る方法としては、アクロモバクタ−属(Achrom
obacter)、ブレビバクテリウム属(Brevi
bacterium )あるいはフラボバクテリウム属
(Flavobacterium)の細菌を用いるアメ
リカ特許No、3239394 (1966)の方法、
アスペルギルス属(ハu」区は肛)あるいはアルタナリ
ア属(Alternaria)の真菌を用いる特開昭5
2−143289の方法、シュードモナス属の細菌を用
いる特開昭53−94093の方法、ペシロミセス属(
h可カシ竺弦)の真菌を用いる特開昭59−44392
の方法およびシュードモナス属の新種に属する細菌を用
いる特開昭61−21097の方法がある。さらにはシ
ュードモナス属の細菌からクローニングされたセファロ
スポリンCアシラーゼの遺伝子を含む大腸菌の形質転換
体を用いる特開昭61−152286の方法がある。
〔発明が解決しようとしている問題点〕一般に微生物の
培養物、その菌体処理物あるいは抽出物による酵素反応
を工業的に利用するためには、これらの調製が容易であ
ること、安価であること、あるいはこれらの諸性質がす
ぐれていることなどの特長が必要とされている。しかし
上記の従来の方法で工業的にセファロスポリンCを直接
脱アシル化することに成功した例はいまだに知られてい
ない。
培養物、その菌体処理物あるいは抽出物による酵素反応
を工業的に利用するためには、これらの調製が容易であ
ること、安価であること、あるいはこれらの諸性質がす
ぐれていることなどの特長が必要とされている。しかし
上記の従来の方法で工業的にセファロスポリンCを直接
脱アシル化することに成功した例はいまだに知られてい
ない。
〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
は上記の問題点を解決するため、セファロスポリンCか
ら酵素的に1段の工程で7−ACAを生成させる研究を
行なってきた。この過程でコマモナス属(Comamo
nas)細菌よりグルタリル7−ACAを水解する能力
を有する7β−(4−カルボキシブタンアミド)セファ
ロスポラン酸アシラーゼ(以下グルタリル7−ACAア
シラーゼと称す)の遺伝子を分離して大腸菌に導入し、
この酵素を著量生産させることに成功した(特開昭6O
−110292)。さらにトリゴノプシス属(回加■四
阻国)酵母からセファロスポリンCを酸化する能力を有
するD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を分離して大腸菌
に導入し、この酵素を著量生産させることに成功した(
特願昭6l−106663)。更に本発明者らが鋭意研
究を行なった結果、上記のD−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子を含む大腸菌の形質転換体とグルタリル7−ACA
アシラーゼ遺伝子を含む大腸菌の形質転換体の培養物を
同時にセファロスポリンCに作用させると意外にも一段
の工程で7−ACAが生成することを見出した。これら
の知見にもとづき本発明を完成するに到った。
は上記の問題点を解決するため、セファロスポリンCか
ら酵素的に1段の工程で7−ACAを生成させる研究を
行なってきた。この過程でコマモナス属(Comamo
nas)細菌よりグルタリル7−ACAを水解する能力
を有する7β−(4−カルボキシブタンアミド)セファ
ロスポラン酸アシラーゼ(以下グルタリル7−ACAア
シラーゼと称す)の遺伝子を分離して大腸菌に導入し、
この酵素を著量生産させることに成功した(特開昭6O
−110292)。さらにトリゴノプシス属(回加■四
阻国)酵母からセファロスポリンCを酸化する能力を有
するD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を分離して大腸菌
に導入し、この酵素を著量生産させることに成功した(
特願昭6l−106663)。更に本発明者らが鋭意研
究を行なった結果、上記のD−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子を含む大腸菌の形質転換体とグルタリル7−ACA
アシラーゼ遺伝子を含む大腸菌の形質転換体の培養物を
同時にセファロスポリンCに作用させると意外にも一段
の工程で7−ACAが生成することを見出した。これら
の知見にもとづき本発明を完成するに到った。
すなわち本発明によれば、一般式(I)(式中Rは一〇
〇OCR,、−Hまたは−○Hである)で表わされる化
合物またはその塩を脱アシル化して一般式(n) (式中Rは前記と同じ意味を有する)で表わされる化合
物またはその塩を生成する7−ACAおよびその誘導体
の製造方法において、前記式(1)で表わされる化合物
に組換DNA技術により大腸菌に産生せしめたD−アミ
ノ酸オキシダーゼ及びグルタリル7−ACAアシラーゼ
を含む酵素混合物を過酸化水素の存在下または非存在下
に水性媒体中で作用させることを特徴とする7−ACA
およびその誘導体の製造方法が提供される。
〇OCR,、−Hまたは−○Hである)で表わされる化
合物またはその塩を脱アシル化して一般式(n) (式中Rは前記と同じ意味を有する)で表わされる化合
物またはその塩を生成する7−ACAおよびその誘導体
の製造方法において、前記式(1)で表わされる化合物
に組換DNA技術により大腸菌に産生せしめたD−アミ
ノ酸オキシダーゼ及びグルタリル7−ACAアシラーゼ
を含む酵素混合物を過酸化水素の存在下または非存在下
に水性媒体中で作用させることを特徴とする7−ACA
およびその誘導体の製造方法が提供される。
本発′明の方法は、一般式(I)で表わされる化合物ま
たはその塩と、組換えDNA技術により大腸菌に産生せ
しめたD−アミノ酸オキシダーゼ及びグルタリル7−A
CAアシラーゼを含む酵素混合物とを水性媒体中で混合
し、二九らの酵素の作用により一般式(n)で表わされ
る化合物またはその塩を製造するものである。
たはその塩と、組換えDNA技術により大腸菌に産生せ
しめたD−アミノ酸オキシダーゼ及びグルタリル7−A
CAアシラーゼを含む酵素混合物とを水性媒体中で混合
し、二九らの酵素の作用により一般式(n)で表わされ
る化合物またはその塩を製造するものである。
本発明の方法で出発物質として用いる一般式(I’)で
表わされる化合物またはその塩及び本発明の方法で得ら
れる最終生成物である一般式(If)で表わされる化合
物またはその塩に関し、一般式%式% のものがそれぞれセファロスポリンC及び?−ACAを
示す。本発明において一般式(1)及び(n)で表わさ
れる化合物の塩としては例えば、ナトリウム塩やカリウ
ム塩などが挙げられる。
表わされる化合物またはその塩及び本発明の方法で得ら
れる最終生成物である一般式(If)で表わされる化合
物またはその塩に関し、一般式%式% のものがそれぞれセファロスポリンC及び?−ACAを
示す。本発明において一般式(1)及び(n)で表わさ
れる化合物の塩としては例えば、ナトリウム塩やカリウ
ム塩などが挙げられる。
本発明で用いられる酵素混合物としては、D−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体DNAで形質転換さ
れた大腸菌の培養物またはその処理物とグルタリル7−
ACAアシラーゼ遺伝子を含む組換え体DNAで形質転
換された大腸菌の培養物またはその処理物との混合物を
用いることができる。また、代わりに、D−アミノ酸オ
キシダーゼ遺伝子を含む組換え体DNAおよびグルタリ
ル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含む組換え体DNAを
共存させて保有する単一の大腸菌の形質転換体を造成し
、その培養物またはその処理物を用いることもできるし
、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子およびグルタリル7
−AC:Aアシラーゼ遺伝子を単一のベクター上に含む
組換え体DNAを造成し、これにより形質転換された単
一の大腸菌の培養物またはその処理物を用いることもで
きる。
オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体DNAで形質転換さ
れた大腸菌の培養物またはその処理物とグルタリル7−
ACAアシラーゼ遺伝子を含む組換え体DNAで形質転
換された大腸菌の培養物またはその処理物との混合物を
用いることができる。また、代わりに、D−アミノ酸オ
キシダーゼ遺伝子を含む組換え体DNAおよびグルタリ
ル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含む組換え体DNAを
共存させて保有する単一の大腸菌の形質転換体を造成し
、その培養物またはその処理物を用いることもできるし
、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子およびグルタリル7
−AC:Aアシラーゼ遺伝子を単一のベクター上に含む
組換え体DNAを造成し、これにより形質転換された単
一の大腸菌の培養物またはその処理物を用いることもで
きる。
尚、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体D
NAおよびグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含
む組換え体DNAを共存させて保有する単一の大腸菌の
形質転換体を造成するには互いに不和合性の異なるグル
ープに属する2種類のプラスミドをベクターとして用い
、各々に上記の2種の遺伝子を別々に含む組換え体DN
Aを造成し、得られた2種の組換え体DNA両者で同時
に一種の大腸菌を形質転換すればよい。
NAおよびグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含
む組換え体DNAを共存させて保有する単一の大腸菌の
形質転換体を造成するには互いに不和合性の異なるグル
ープに属する2種類のプラスミドをベクターとして用い
、各々に上記の2種の遺伝子を別々に含む組換え体DN
Aを造成し、得られた2種の組換え体DNA両者で同時
に一種の大腸菌を形質転換すればよい。
前述のD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子としては例えば
、酵母トリゴノプシス・パリアビリス(Iori on
o sis variabilis) CB S 40
95由来のものがあげられ、またグルタリル7−ACA
アシラーゼ遺伝子としては例えば、コマモナス・エスピ
ー(Comamonas sp、) SY 77−1
(微工研菌寄第2410号)由来のものがあげられる
。
、酵母トリゴノプシス・パリアビリス(Iori on
o sis variabilis) CB S 40
95由来のものがあげられ、またグルタリル7−ACA
アシラーゼ遺伝子としては例えば、コマモナス・エスピ
ー(Comamonas sp、) SY 77−1
(微工研菌寄第2410号)由来のものがあげられる
。
トリゴノプシス・パリアビリス由来のD−アミノ酸オキ
シダーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体DNAは
例えば特願昭61−10663号に記載されている方法
により得ることができる。即ち、以下のようにして取得
することができる。
シダーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体DNAは
例えば特願昭61−10663号に記載されている方法
により得ることができる。即ち、以下のようにして取得
することができる。
(1)トリゴノプシス・パリアビリスCBS 409
5から全DNAを抽出し、制限酵素で切断した後、ベク
ターに組みこみ、大腸菌に導入し、DNAライブラリー
を作成する。トリゴノプシス・パリアビリスCBS
4095は寄託機関であるセントラール・ビューロー・
フオーア・シメルカルチュレス(Centraal B
ureau voor Schimmel−cultu
res)、オランダ国に寄託番号4095号の下に寄託
されている酵母である。
5から全DNAを抽出し、制限酵素で切断した後、ベク
ターに組みこみ、大腸菌に導入し、DNAライブラリー
を作成する。トリゴノプシス・パリアビリスCBS
4095は寄託機関であるセントラール・ビューロー・
フオーア・シメルカルチュレス(Centraal B
ureau voor Schimmel−cultu
res)、オランダ国に寄託番号4095号の下に寄託
されている酵母である。
(2)トリゴノプシス・パリアブリスCBS 409
5からセファロスポリンCを酸化する能力をもつD−ア
ミノ酸オキシダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミ
ノ酸配列を決定する。
5からセファロスポリンCを酸化する能力をもつD−ア
ミノ酸オキシダーゼを抽出・精製し、アミノ基末端アミ
ノ酸配列を決定する。
(3)得られたD−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末
端アミノ酸配列の一部分について、これより推定される
遺伝子のDNA塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物を合成し、これをDN4プローブとする。
端アミノ酸配列の一部分について、これより推定される
遺伝子のDNA塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの混
合物を合成し、これをDN4プローブとする。
(4)DNAプローブをff2pでラベルし、前記(1
)で得られたDNAライブラリーとコロニー・ハイブリ
ダイゼーションを行なわせ、DNIAプローブと相補性
を示した大腸菌のコロニーを選択・分離する。
)で得られたDNAライブラリーとコロニー・ハイブリ
ダイゼーションを行なわせ、DNIAプローブと相補性
を示した大腸菌のコロニーを選択・分離する。
(5)選択された大腸菌の菌株からプラスミドDNAを
とりだし、ベクターに組みこまれたトリゴノプシス・パ
リアビリスCBS 4095由来のDNAの塩基配列
を決定する。
とりだし、ベクターに組みこまれたトリゴノプシス・パ
リアビリスCBS 4095由来のDNAの塩基配列
を決定する。
(6)決定されたDNA塩基配列中にD−アミノ酸オキ
シダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむア
ミノ酸配列の読取り枠を見出し、これをふくむDNA断
片に適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現
のためのベクターに組みこみ、発現用の組換え体DNA
を造成する。
シダーゼのアミノ基末端アミノ酸配列を正しくふくむア
ミノ酸配列の読取り枠を見出し、これをふくむDNA断
片に適当な修飾をほどこした上で、大腸菌の遺伝子発現
のためのベクターに組みこみ、発現用の組換え体DNA
を造成する。
また、コマモナス・エスピー由来のグルタリル7−AC
Aアシラーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体DN
Aは例えば特開昭60−110292号に記載されてい
る方法により取得することができる。即ち、以下のよう
にして得ることができる。
Aアシラーゼ遺伝子及びその遺伝子を含む組換え体DN
Aは例えば特開昭60−110292号に記載されてい
る方法により取得することができる。即ち、以下のよう
にして得ることができる。
1)コマモナス属細菌5Y−77−1(微工研菌寄第2
410号)の菌体より全DNAを抽出し、制限酵素で切
断する。
410号)の菌体より全DNAを抽出し、制限酵素で切
断する。
2)ベクターDNAを制限酵素で切断・開裂させる。
3)ベクターDNAの開裂部位に1)で得たDNA断片
を組込ませ、閉環した組換え体DNAをつくる。
を組込ませ、閉環した組換え体DNAをつくる。
4)組換え体DNAを宿主たる大腸菌に導入する。
5)組換え体DNAを導入させた大腸菌の中から、グル
タリル7−ACAアシラーゼ活性を有する菌株を選択分
離する。
タリル7−ACAアシラーゼ活性を有する菌株を選択分
離する。
6)選択された大腸菌の菌株よりプラスミドDNAをと
り出し、制限酵素および再結合酵素あるいは他のベクタ
ーを用いて改変し、グルタリル7−ACAアシラーゼ遺
伝子の発現が増大するようになった組換え体DNAをつ
くる。
り出し、制限酵素および再結合酵素あるいは他のベクタ
ーを用いて改変し、グルタリル7−ACAアシラーゼ遺
伝子の発現が増大するようになった組換え体DNAをつ
くる。
7)改変された組換え体DNAを大腸菌に導入し、その
後導入された大腸菌の中からグルタリル7−ACAアシ
ラーゼ産生能の増大した株を選択分離する。
後導入された大腸菌の中からグルタリル7−ACAアシ
ラーゼ産生能の増大した株を選択分離する。
尚、前記2種の遺伝子の調製、それらを含む組換え体D
NAならびにその組換え体D’N Aで形質転換転換さ
れた大腸菌の調製は通常の公知の組換えDNA技術によ
り行なうことができる。
NAならびにその組換え体D’N Aで形質転換転換さ
れた大腸菌の調製は通常の公知の組換えDNA技術によ
り行なうことができる。
以上のようにして得られる大腸菌を通常の培養条件で培
養することによりD−アミノ酸オキシダーゼまたはグル
タリル7−ACAアシラーゼを、あるいは両者を同時に
著量含む培養物が得られる。
養することによりD−アミノ酸オキシダーゼまたはグル
タリル7−ACAアシラーゼを、あるいは両者を同時に
著量含む培養物が得られる。
得られた培養物はそのまま用いてもよいし、この培養物
を例えば菌体を集めて破砕して酵素を抽出したり、それ
を液体クロマトグラフィーや等電点電気泳動等に供する
などの公知の常用手段を用いる精製処理に付すことによ
り、部分精製もしくは実質的に完全に精製したD−アミ
ノ酸オキシダーゼおよび/又はグルタリル7−ACAア
シラーゼを調製してこれを用いてもよい。
を例えば菌体を集めて破砕して酵素を抽出したり、それ
を液体クロマトグラフィーや等電点電気泳動等に供する
などの公知の常用手段を用いる精製処理に付すことによ
り、部分精製もしくは実質的に完全に精製したD−アミ
ノ酸オキシダーゼおよび/又はグルタリル7−ACAア
シラーゼを調製してこれを用いてもよい。
上記両酵素活性を有する培養物またはその部分的または
実質的に完全に精製した両酵素を含む混合物を酵素混合
物として用いて化合物(I)またはその塩に作用させる
ことにより、化合物(n)またはその塩を効率よく生成
させることができる。
実質的に完全に精製した両酵素を含む混合物を酵素混合
物として用いて化合物(I)またはその塩に作用させる
ことにより、化合物(n)またはその塩を効率よく生成
させることができる。
この反応は水性媒体中で行なわれ、反応時のpHは7.
0〜8.5を、温度は20〜40℃を維持することが好
ましい。本発明の方法で用いら九る水性媒体としては例
えば水およびリン酸緩衝液などの緩衝液などがあげられ
る。
0〜8.5を、温度は20〜40℃を維持することが好
ましい。本発明の方法で用いら九る水性媒体としては例
えば水およびリン酸緩衝液などの緩衝液などがあげられ
る。
本発明の方法により、化合物(1)またはその塩から化
合物(II)またはその塩を製造するメカニズムを化合
物(I)においてRが一0COCH3である場合、即ち
セファロスポリンCである場合を例にとって説明すると
以下のようになる。
合物(II)またはその塩を製造するメカニズムを化合
物(I)においてRが一0COCH3である場合、即ち
セファロスポリンCである場合を例にとって説明すると
以下のようになる。
まず、セファロスポリンCが酵素混合物中のD−アミノ
酸オキシダーゼの作用により酸化されて7β−(5−カ
ルボキシ−5−オキソペンタンアミド)セファロスポラ
ン酸が生成する。この時に過酸化水素が同時に生成する
。この過酸水素の作用により、生成した7β−(5−カ
ルボキシ−5−オキソペンタンアミド)セファロスポラ
ン酸が脱炭酸されてグルタリル7−ACAに転化される
。
酸オキシダーゼの作用により酸化されて7β−(5−カ
ルボキシ−5−オキソペンタンアミド)セファロスポラ
ン酸が生成する。この時に過酸化水素が同時に生成する
。この過酸水素の作用により、生成した7β−(5−カ
ルボキシ−5−オキソペンタンアミド)セファロスポラ
ン酸が脱炭酸されてグルタリル7−ACAに転化される
。
グルタリル7−ACAは酵素混合物中のグルタリル7−
ACAアシラーゼの作用を受けて脱アシル化され7−A
CA [一般式(n)で表わされる化合物においてRが
−○COCH3のものコが生成する。
ACAアシラーゼの作用を受けて脱アシル化され7−A
CA [一般式(n)で表わされる化合物においてRが
−○COCH3のものコが生成する。
上記反応系において用いる酵素混合物を調製する際に使
用する大腸菌として、通常の大腸菌を用いた場合、過酸
化水素を分解するカタラーゼ活性を有しているため、該
酵素混合物中にカタラーゼが混入し、そのためその酵素
混合物を用いると上記の反応過程で生成する過酸化水素
を分解し、反応の進行をさまたげる。これを解決するた
めには、過酸化水素の存在下に水性媒体中で該酵素混合
物−1[i− を作用させればよい。過酸化水素を存在させる方法とし
ては、高濃度の過酸化水素はセファロスポリン化合物を
分解してしまうので必要量をできるだけ低濃度になるよ
うに加えるのが好ましく、適当な方法で過酸化水素を補
給することが望ましい。
用する大腸菌として、通常の大腸菌を用いた場合、過酸
化水素を分解するカタラーゼ活性を有しているため、該
酵素混合物中にカタラーゼが混入し、そのためその酵素
混合物を用いると上記の反応過程で生成する過酸化水素
を分解し、反応の進行をさまたげる。これを解決するた
めには、過酸化水素の存在下に水性媒体中で該酵素混合
物−1[i− を作用させればよい。過酸化水素を存在させる方法とし
ては、高濃度の過酸化水素はセファロスポリン化合物を
分解してしまうので必要量をできるだけ低濃度になるよ
うに加えるのが好ましく、適当な方法で過酸化水素を補
給することが望ましい。
また、カタラーゼ活性を欠損している大腸菌の変異株を
誘導し、これを宿主とした形質転換体を用いた場合には
該酵素混合物を過酸化水素の非存在下に作用させること
ができる。
誘導し、これを宿主とした形質転換体を用いた場合には
該酵素混合物を過酸化水素の非存在下に作用させること
ができる。
尚、上記カタラーゼ欠損変異株の誘導は通常の公知の方
法、例えばN−メチル−N″−ニトロソグアニジンなど
の変異誘起剤を用いる方法などにより行なうことができ
る。
法、例えばN−メチル−N″−ニトロソグアニジンなど
の変異誘起剤を用いる方法などにより行なうことができ
る。
以上のようにして生成した化合物(Ir)またはその塩
は公知の通常の方法、例えばカラムクロマトグラフ法、
等電点性でん法などを使用して反応液から分離精製する
ことができる。
は公知の通常の方法、例えばカラムクロマトグラフ法、
等電点性でん法などを使用して反応液から分離精製する
ことができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。
発明は下記の実施例に限定されるものではない。
なお実施例において化合物(II)またはその塩の定量
には高速液体カラムクロマトグラフを用いた。カラムは
ミクロボンダパック(μmBondapak)C18(
ウォーターズ社製)を用い、移動相としては5%酢酸ア
ンモニウム98容とアセトニトリル2容の混合液を用い
た。化合物(II)またはその塩の検出は260mmで
行なった。
には高速液体カラムクロマトグラフを用いた。カラムは
ミクロボンダパック(μmBondapak)C18(
ウォーターズ社製)を用い、移動相としては5%酢酸ア
ンモニウム98容とアセトニトリル2容の混合液を用い
た。化合物(II)またはその塩の検出は260mmで
行なった。
また実施例において7−ACAまたはその誘導体の生成
率は1次式により求めた 更に、実施例において7−ACAまたはその誘導体の純
度は実施例で得られた7−ACAまたはその誘導体の粉
末を一定量とって水に溶解し、これを前記液体クロマト
グラフィーに供し、7−ACAまたはその誘導体を定量
し、該粉末中の7−ACAまたはその誘導体の含量(%
)を計算することにより求めた。
率は1次式により求めた 更に、実施例において7−ACAまたはその誘導体の純
度は実施例で得られた7−ACAまたはその誘導体の粉
末を一定量とって水に溶解し、これを前記液体クロマト
グラフィーに供し、7−ACAまたはその誘導体を定量
し、該粉末中の7−ACAまたはその誘導体の含量(%
)を計算することにより求めた。
実施例1
本実施例はD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む形質
転換体とグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含む
形質転換体を別々に培養して得られる培養物を用いる方
法である。
転換体とグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含む
形質転換体を別々に培養して得られる培養物を用いる方
法である。
〔1〕酵母トリゴノプシス・パリアビリス(Irigo
nopsis variavilis)からクローニン
グされたD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え
体pEDAO1を保持し、D−アミノ酸オキシダーゼを
生産する大腸菌エシェリヒア・コリ(Escheric
hia co旦)MB65/pEDAO1(特願昭6l
−10663)は下記の方法によって調製した。
nopsis variavilis)からクローニン
グされたD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え
体pEDAO1を保持し、D−アミノ酸オキシダーゼを
生産する大腸菌エシェリヒア・コリ(Escheric
hia co旦)MB65/pEDAO1(特願昭6l
−10663)は下記の方法によって調製した。
1、トリゴノプシス・パリアビリスからの全DNAの抽
出と切断 クライヤー(Cryer)らの方法〔文献:メソッズイ
ンセルバイオロジー(Methods in Cell
Biology) 12巻、39−44.アカデミツク
プレス(Academic Press)社、1975
)にしたがって、トリゴノプシス・パリアビリスCBS
4095から全DNAを抽出精製した。このDNA
40μgをとり、制限酵素MboI4単位と37℃、1
5分間反応させた。反応液を等量のフェノール・クロロ
ホルム(1: 1)で抽出し、DNAをエタノールで沈
澱させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液(10mMトリ
ス−塩酸(pH8,0)、1mMEDTA)にとかした
。得られたDNA溶液の全量を0.7%アガロースゲル
電気泳動に供し、6〜9kbの大きさに相当するゲルか
らDNAをふくむ部分を切出して、電気溶出法によりゲ
ルからDNA断片を溶出させた。ついで溶出液を等量の
フェノールおよびフェノール・クロロホルムで順次抽出
し、得られる水層にエタノールを添加してDNAを沈澱
させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液20μΩにとかし
た。
出と切断 クライヤー(Cryer)らの方法〔文献:メソッズイ
ンセルバイオロジー(Methods in Cell
Biology) 12巻、39−44.アカデミツク
プレス(Academic Press)社、1975
)にしたがって、トリゴノプシス・パリアビリスCBS
4095から全DNAを抽出精製した。このDNA
40μgをとり、制限酵素MboI4単位と37℃、1
5分間反応させた。反応液を等量のフェノール・クロロ
ホルム(1: 1)で抽出し、DNAをエタノールで沈
澱させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液(10mMトリ
ス−塩酸(pH8,0)、1mMEDTA)にとかした
。得られたDNA溶液の全量を0.7%アガロースゲル
電気泳動に供し、6〜9kbの大きさに相当するゲルか
らDNAをふくむ部分を切出して、電気溶出法によりゲ
ルからDNA断片を溶出させた。ついで溶出液を等量の
フェノールおよびフェノール・クロロホルムで順次抽出
し、得られる水層にエタノールを添加してDNAを沈澱
させた後、0.1倍濃度のTE緩衝液20μΩにとかし
た。
2、ベクターDNAの開裂
ベクターpUc18 30μgをB a m HIで完
全に開裂させ、得られたDNA断片を0.1倍濃度のT
Efi衝液2oμQにとかした。
全に開裂させ、得られたDNA断片を0.1倍濃度のT
Efi衝液2oμQにとかした。
3、ベクターへのDNA断片の挿入
上記工程1で得られた溶液と上記工程(2)で得られた
溶液を3:1の割合に混合し、T4・DNAリガーゼを
15℃で6時間反応させ、ベクターとトリゴノプシス・
パリアビリスCBS 4095のDNA断片を結合さ
せた。
溶液を3:1の割合に混合し、T4・DNAリガーゼを
15℃で6時間反応させ、ベクターとトリゴノプシス・
パリアビリスCBS 4095のDNA断片を結合さ
せた。
4、トリゴノプシス・パリアビリスのDNAライブラリ
ーの作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ欠損変異菌
株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ(Esch
erichia co旦)MC1061(米国シカゴ大
学マルコム カサダバン(MalcomCasadab
an)博士より入手。水閘の性質はジャーナルオブモレ
キュラーバイオロジー(J、Mol。
ーの作成 まず大腸菌宿主としてセファロスポリナーゼ欠損変異菌
株を造成した。すなわちエシェリヒア・コリ(Esch
erichia co旦)MC1061(米国シカゴ大
学マルコム カサダバン(MalcomCasadab
an)博士より入手。水閘の性質はジャーナルオブモレ
キュラーバイオロジー(J、Mol。
Biol、)、138,179−207.1980に記
載されている)をN−メチル−N′−二トローN−二ト
ロソグアニジンで処理した後、セファロスポリンCに対
する感受性が増大したコロニーを選択した。これらの中
からセファロスポリナーゼ活性をほとんど示さない株を
選択分離し、その−株をエシエリヒア・コリMB65と
命名して宿主として用いた。なお、本変異株エシュリヒ
ア・コリMB65は工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研菌寄第8900号として寄託さ九でいる。つぎ
に上記工程3で得られた組換え体DNAを形質転換にょ
リエシェリヒア・コリMB65に導入し、アンピシリン
50μg / mΩをふくむL−ブロス寒天培地〔バタ
トトリプトン(ディフコ(Difco)社製〕1%、酵
母エキス0.5%、NaCl0.5%、寒天1゜5%〕
上で生育してきたコロニーを集めて、これをトリゴノプ
シス・パリアビリスCBS 4095のDNAライブ
ラリーと称した。
載されている)をN−メチル−N′−二トローN−二ト
ロソグアニジンで処理した後、セファロスポリンCに対
する感受性が増大したコロニーを選択した。これらの中
からセファロスポリナーゼ活性をほとんど示さない株を
選択分離し、その−株をエシエリヒア・コリMB65と
命名して宿主として用いた。なお、本変異株エシュリヒ
ア・コリMB65は工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研菌寄第8900号として寄託さ九でいる。つぎ
に上記工程3で得られた組換え体DNAを形質転換にょ
リエシェリヒア・コリMB65に導入し、アンピシリン
50μg / mΩをふくむL−ブロス寒天培地〔バタ
トトリプトン(ディフコ(Difco)社製〕1%、酵
母エキス0.5%、NaCl0.5%、寒天1゜5%〕
上で生育してきたコロニーを集めて、これをトリゴノプ
シス・パリアビリスCBS 4095のDNAライブ
ラリーと称した。
5、D−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端アミノ酸
配列の決定 トリゴノプシス・パリアビリスCBS 4095から
前述のスワジュセル(Szvajcsr)らの方法にし
たがってD−アミノ酸オキシダーゼを精製した。精製し
た酵素蛋白質のアミノ基末端のアミノ酸配列を前述の方
法により解析し、アミノ基末端から41番目までのアミ
ノ酸配列を決定した。得られたN−末端アミノ酸配列を
次式にて表わす。
配列の決定 トリゴノプシス・パリアビリスCBS 4095から
前述のスワジュセル(Szvajcsr)らの方法にし
たがってD−アミノ酸オキシダーゼを精製した。精製し
た酵素蛋白質のアミノ基末端のアミノ酸配列を前述の方
法により解析し、アミノ基末端から41番目までのアミ
ノ酸配列を決定した。得られたN−末端アミノ酸配列を
次式にて表わす。
Ala−Lys−11e−Val−Val−11e−G
ly−Ala−Gly−Val−Ala−Gly−Le
u−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu
−Leu−Ar −L 5−Gl 一旦1s−Glu−
Val−Thr−11e−Val−3er−Glu−P
he−Th r−Pro−G 1y−A 5p−Leu
−5er−I 1e−Gly−Tyr−注:下線部はプ
ローブ合成に用いられた配列を示す。
ly−Ala−Gly−Val−Ala−Gly−Le
u−Thr−Thr−Ala−Leu−Gln−Leu
−Leu−Ar −L 5−Gl 一旦1s−Glu−
Val−Thr−11e−Val−3er−Glu−P
he−Th r−Pro−G 1y−A 5p−Leu
−5er−I 1e−Gly−Tyr−注:下線部はプ
ローブ合成に用いられた配列を示す。
6、DNAプローブの合成
上記工程5で得られたアミノ酸配列中から前記式中に下
線で示される2箇所の配列を選択し、これらのアミノ酸
配列から推定される遺伝子上の可能なりNA塩基配列す
べてをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第1表に示す
ように合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能な
オリゴヌクレオチドを2群にわけて合成して混合物をつ
くり、これらをDNAプローブDAO−1とDAo、2
、およびDAo−3とDAO−4と称した。オリゴヌク
レオチドの合成はすべてアプライド バイオシステム(
Applied Biosystem)社のDNAシン
セサイザー(Synthesizer)モデル380−
Aを用いて行なった。
線で示される2箇所の配列を選択し、これらのアミノ酸
配列から推定される遺伝子上の可能なりNA塩基配列す
べてをふくむオリゴヌクレオチド混合物を第1表に示す
ように合成した。すなわち各アミノ酸配列ごとに可能な
オリゴヌクレオチドを2群にわけて合成して混合物をつ
くり、これらをDNAプローブDAO−1とDAo、2
、およびDAo−3とDAO−4と称した。オリゴヌク
レオチドの合成はすべてアプライド バイオシステム(
Applied Biosystem)社のDNAシン
セサイザー(Synthesizer)モデル380−
Aを用いて行なった。
7、DNAライブラリーからD−アミノ酸オキシ−Zj
− 〜24− ターゼ・クローンの候補の選択・分離 上記工程6で得られたDNAプローブを各々イングリア
(Inglia)らの方法〔文献:ヌクレイツクアシッ
ドリサーチ(Nucleic Ac1dsRes、)、
9 。
− 〜24− ターゼ・クローンの候補の選択・分離 上記工程6で得られたDNAプローブを各々イングリア
(Inglia)らの方法〔文献:ヌクレイツクアシッ
ドリサーチ(Nucleic Ac1dsRes、)、
9 。
1627−1642.1982)にしたがってT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼとγ−” P −A T Pを用
6てラベルした。つぎにDNAライブラリーである前記
工程4で得られた大腸菌をアンピシリン50μg /
m QをふくむL−ブロス寒天培地上でコロニーとして
生育させ、これをレプリカ法によってワットマン(υh
atman) 541 F紙へうつし、リゾチームで溶
菌し、アルカリでDNA変性させ、塩酸による中和処理
を行なった後、DAo−1およびDAO−2とハイブリ
ダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは6倍
濃度のSSC(0,15M NaC1,0,015M
クエン酸ナトリウム、pH7,0)、0.5%ノ二デッ
トP−40(シグマ社、米国製)、DAo−1あるいは
DAO−2約2 X 10 ”cprn/ rn Qを
用いて、44℃で1時間半行ない、この後6倍濃度のS
SCを用いて室温で2回、つづいて6倍濃度のSSCを
用いて44℃で1回が紙を洗浄した。この後沼紙を乾燥
させ、オートラジオグラフィ(感光条件ニー80°C,
3時間)に供した。その結果、DAO−1またはDAO
−2に対しハイブリダイゼーション陽性のコロニーが多
数見出された。そこで陽性のコロニーから40株をとり
あげ、液体培養した後、バーンボイム(Birnboi
m)らの方法〔文献:ヌクレイツクアシッドリサーチ(
Nucleic Ac1dsRes、)+1.1513
−1523.1979)によりプラスミドDNAを調製
した。ついでこれらのDNAを常法により変性させた後
、ニトロセルロースフィルターにスポットして、DNA
プローブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダ
イゼーションは6倍濃度の5SC110倍濃度のデンハ
ルト(Denhardt)液(0,02%7,1’:I
−JL/、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02
%牛血清アルブミン)およびラベルしたDNAプローブ
を用いて、44℃(DAO−1およびDAO−2の場合
)または40℃(DAO−3およびDAO−4の場合)
で−27= 1時間行ない、この後6倍濃度のSSCを用いて室温で
1回、ついで44℃(DAO−1およびDAO−2の場
合)または40℃(DAO−3およびDAO−4の場合
)で1回洗浄した。この後フィルターをオートラジオグ
ラフィー(感光条件ニー80℃、3時間)に供した結果
、DAO−1あるいはDAO−2にハイブリダイゼーシ
ョン陽性を示すものでかつDAO−3あるいはDAO−
4にも陽性を示すものが6株見出された。これら6株か
らのプラスミドDNAを種々の制限酵素で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を行なった後、ラベルしたDNAプ
ローブとサザン・ハイブリダイゼーション〔方法につい
ては文献:サザン(Southern)(197,5)
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー(J、Mo1
.Biol、) 、98,503−517)を行なった
。その結果、EcoRI切断で生成する約0.6kbの
DNA断片にDAO−2とDAO−3またはDAO−4
が強くハイブリダイゼーション陽性を示すプラスミドD
NAが見出された。このプラスミドをpDAOc2−1
2と命名し、D−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候
補とした。
ヌクレオチドキナーゼとγ−” P −A T Pを用
6てラベルした。つぎにDNAライブラリーである前記
工程4で得られた大腸菌をアンピシリン50μg /
m QをふくむL−ブロス寒天培地上でコロニーとして
生育させ、これをレプリカ法によってワットマン(υh
atman) 541 F紙へうつし、リゾチームで溶
菌し、アルカリでDNA変性させ、塩酸による中和処理
を行なった後、DAo−1およびDAO−2とハイブリ
ダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは6倍
濃度のSSC(0,15M NaC1,0,015M
クエン酸ナトリウム、pH7,0)、0.5%ノ二デッ
トP−40(シグマ社、米国製)、DAo−1あるいは
DAO−2約2 X 10 ”cprn/ rn Qを
用いて、44℃で1時間半行ない、この後6倍濃度のS
SCを用いて室温で2回、つづいて6倍濃度のSSCを
用いて44℃で1回が紙を洗浄した。この後沼紙を乾燥
させ、オートラジオグラフィ(感光条件ニー80°C,
3時間)に供した。その結果、DAO−1またはDAO
−2に対しハイブリダイゼーション陽性のコロニーが多
数見出された。そこで陽性のコロニーから40株をとり
あげ、液体培養した後、バーンボイム(Birnboi
m)らの方法〔文献:ヌクレイツクアシッドリサーチ(
Nucleic Ac1dsRes、)+1.1513
−1523.1979)によりプラスミドDNAを調製
した。ついでこれらのDNAを常法により変性させた後
、ニトロセルロースフィルターにスポットして、DNA
プローブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダ
イゼーションは6倍濃度の5SC110倍濃度のデンハ
ルト(Denhardt)液(0,02%7,1’:I
−JL/、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02
%牛血清アルブミン)およびラベルしたDNAプローブ
を用いて、44℃(DAO−1およびDAO−2の場合
)または40℃(DAO−3およびDAO−4の場合)
で−27= 1時間行ない、この後6倍濃度のSSCを用いて室温で
1回、ついで44℃(DAO−1およびDAO−2の場
合)または40℃(DAO−3およびDAO−4の場合
)で1回洗浄した。この後フィルターをオートラジオグ
ラフィー(感光条件ニー80℃、3時間)に供した結果
、DAO−1あるいはDAO−2にハイブリダイゼーシ
ョン陽性を示すものでかつDAO−3あるいはDAO−
4にも陽性を示すものが6株見出された。これら6株か
らのプラスミドDNAを種々の制限酵素で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を行なった後、ラベルしたDNAプ
ローブとサザン・ハイブリダイゼーション〔方法につい
ては文献:サザン(Southern)(197,5)
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー(J、Mo1
.Biol、) 、98,503−517)を行なった
。その結果、EcoRI切断で生成する約0.6kbの
DNA断片にDAO−2とDAO−3またはDAO−4
が強くハイブリダイゼーション陽性を示すプラスミドD
NAが見出された。このプラスミドをpDAOc2−1
2と命名し、D−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの候
補とした。
8、D−アミノ酸オキシダーゼ・クローンの同定とDN
A塩基配列の決定 プラスミドpDAOc2−12よりE c o RI切
断により生成する0、6kbのDNA断片について、前
述のサンガー(Sanger)らの方法に従ってDNA
塩基配列を決定した。その結果、第2図に示されるよう
に真核生物の遺伝中に存在するイントロン様の配列をは
さんで、上記工程5で得られたD−アミノ酸オキシダー
ゼのアミノ基末端のアミノ酸配列に完全に一致するアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片が
D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部をふくむことが
明らかになった。プラスミドpDAOc2−12につい
ては、制限酵素切断の結果にもとづいて第3図にあられ
される制限酵素開裂地図を作成した。
A塩基配列の決定 プラスミドpDAOc2−12よりE c o RI切
断により生成する0、6kbのDNA断片について、前
述のサンガー(Sanger)らの方法に従ってDNA
塩基配列を決定した。その結果、第2図に示されるよう
に真核生物の遺伝中に存在するイントロン様の配列をは
さんで、上記工程5で得られたD−アミノ酸オキシダー
ゼのアミノ基末端のアミノ酸配列に完全に一致するアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列が見出され、この断片が
D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部をふくむことが
明らかになった。プラスミドpDAOc2−12につい
ては、制限酵素切断の結果にもとづいて第3図にあられ
される制限酵素開裂地図を作成した。
上記の結果にもとづいて、すでに決定された塩基配列か
ら遺伝子読取り方向の下流にあたる領域についてDNA
塩基配列を決定したところ、第1図に示される355個
のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在
することが判明した(第1図では第2図で示されたイン
トロン様配列を削除して表示しである)。かくしてプラ
スミドpDAOc2−12中のトリゴノプシス・パリア
ブリスCBS 4095由来のDNA断片中にはD−
アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子が完全にふくまれて
いるものと推定された。
ら遺伝子読取り方向の下流にあたる領域についてDNA
塩基配列を決定したところ、第1図に示される355個
のアミノ酸よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存在
することが判明した(第1図では第2図で示されたイン
トロン様配列を削除して表示しである)。かくしてプラ
スミドpDAOc2−12中のトリゴノプシス・パリア
ブリスCBS 4095由来のDNA断片中にはD−
アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子が完全にふくまれて
いるものと推定された。
9、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の修飾クローニン
グされたD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が大腸菌で発
現する上で障害となりうるDNA塩基配列部分をプラス
ミドpDAOc2−12中のトリゴノプシス・パリアビ
リスCB5 4095由来のDNA断片から第4図に示
される工程にしたがって削除した。以下に各工程を詳述
する。
グされたD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が大腸菌で発
現する上で障害となりうるDNA塩基配列部分をプラス
ミドpDAOc2−12中のトリゴノプシス・パリアビ
リスCB5 4095由来のDNA断片から第4図に示
される工程にしたがって削除した。以下に各工程を詳述
する。
(1)ブーyXミドpDAOc2−12 40μgをE
c o RIとHi n d IIIで切断し、得ら
れる約0.45 k bの断片を精製した後、その0.
8μgにdATP、dGTP、dcTP、TTPを終濃
度各0.33mM、DNAポリメラーゼクレノウ(Kl
enov)断片5単位を加え、10mMトリス−塩酸(
pH7,5)、10mM MgC1□、1mMジチオレ
イトール、50mMNaC1の反応液30μΩ中で30
℃、20分間反応させた。これより両端が平滑端にされ
たDNA断片を精製し、その約0.2 p gにB a
m HIリンカ−(0,01750、D、) とT4
DNAIJガーゼ1単位を加え、50mMトリス−
塩酸(pH7,5)、10mM M g CI、、0.
5mMATP、5mMジチオスレイトールの反応液20
μaで15℃、−夜反応させた。反応後DNA断片を精
製し、Ec。
c o RIとHi n d IIIで切断し、得ら
れる約0.45 k bの断片を精製した後、その0.
8μgにdATP、dGTP、dcTP、TTPを終濃
度各0.33mM、DNAポリメラーゼクレノウ(Kl
enov)断片5単位を加え、10mMトリス−塩酸(
pH7,5)、10mM MgC1□、1mMジチオレ
イトール、50mMNaC1の反応液30μΩ中で30
℃、20分間反応させた。これより両端が平滑端にされ
たDNA断片を精製し、その約0.2 p gにB a
m HIリンカ−(0,01750、D、) とT4
DNAIJガーゼ1単位を加え、50mMトリス−
塩酸(pH7,5)、10mM M g CI、、0.
5mMATP、5mMジチオスレイトールの反応液20
μaで15℃、−夜反応させた。反応後DNA断片を精
製し、Ec。
RIとBamHIで両端を切断し、E c o RI−
BamHI断片として回収した。一方ファージM13
m p 1−8の2重鎖D N A tr−E c o
RIとBamHIで切断した後、これに上記のE c
o RI −B a m HI断片を加え、T4DN
Aリガーゼで結合させて、D−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子の一部を組みこんだファージM13M2−12−7
を造成した。
BamHI断片として回収した。一方ファージM13
m p 1−8の2重鎖D N A tr−E c o
RIとBamHIで切断した後、これに上記のE c
o RI −B a m HI断片を加え、T4DN
Aリガーゼで結合させて、D−アミノ酸オキシダーゼ遺
伝子の一部を組みこんだファージM13M2−12−7
を造成した。
(2)イントロン様配列を削除するために、第4図に示
されるようにイントロン様配列の前後を直結した配列に
相補するオリゴヌクレオチドを合成し、DAOE 1と
命名した。DAOEI 25pmoleとM13プラ
イマーMl(全酒造社製)10pmoleをT4ポリヌ
クレオチドキナーゼでりん酸化し、メッシング(Mes
sing)の方法〔文献:メソッズインエンザイモロジ
ー(Methods Enzymol、)、遅狂、20
−78.1983)にしたがって調整したファージM1
3M2−12−7の1本鎖DNA#0.5pmoleを
加え、95℃で5分間加熱後室温になるまで放置した。
されるようにイントロン様配列の前後を直結した配列に
相補するオリゴヌクレオチドを合成し、DAOE 1と
命名した。DAOEI 25pmoleとM13プラ
イマーMl(全酒造社製)10pmoleをT4ポリヌ
クレオチドキナーゼでりん酸化し、メッシング(Mes
sing)の方法〔文献:メソッズインエンザイモロジ
ー(Methods Enzymol、)、遅狂、20
−78.1983)にしたがって調整したファージM1
3M2−12−7の1本鎖DNA#0.5pmoleを
加え、95℃で5分間加熱後室温になるまで放置した。
ついでこれにdATP、dGTP、dCTP、TTP(
各0.4mM)、ATP(0,4mM)、DNAポリメ
ラーゼクレノウ(Klenow)断片(5単位)、T4
DNAリガーゼ(2単位)を加え、各7mMのトリス−
塩酸(pH7,5)、MgCl2、NaC1および14
m Mのジチオスレイトールの反応液50μΩ中で3
7℃、30分間反応させた。0.5MのEDTA5μQ
を加えて反応停止後、メッシング(Messing)の
方法(文献前出)にしたがってエシェリヒア−コリ(E
scherichia coli) J M 1=31
− 〇5を反応液でトランスフェクション処理し、ファージ
導入菌をプラークとして検出した。出現したファージ・
プラークをプラーク・ハイブリダイゼーション法〔文献
:ベントン(Benton)ら(1977)サイエンス
(Science)、196,180−182)によっ
て32pでラベルしたDAOE 1とハイブリダイゼー
ションさせ、陽性を示したプラークを見出した。陽性プ
ラーク中のファージを再度エシエリヒア・コリJM10
5に感染させて、上記と同様にしてDAOElとハイブ
リダイゼーションを示すプラークを純化して分離した後
、プラーク中に存在するファージを常法によって液体培
養し、1本鎖DNAを分離した。得られた1本鎖DNA
の塩基配列を解析したところ、予定通りイントロン様配
列を欠失した塩基配列をもつトリゴノプシス・パリアビ
リスCB54095由来のD N A断片をもつことが
判明したので、このファージをM13MHIと命名した
。
各0.4mM)、ATP(0,4mM)、DNAポリメ
ラーゼクレノウ(Klenow)断片(5単位)、T4
DNAリガーゼ(2単位)を加え、各7mMのトリス−
塩酸(pH7,5)、MgCl2、NaC1および14
m Mのジチオスレイトールの反応液50μΩ中で3
7℃、30分間反応させた。0.5MのEDTA5μQ
を加えて反応停止後、メッシング(Messing)の
方法(文献前出)にしたがってエシェリヒア−コリ(E
scherichia coli) J M 1=31
− 〇5を反応液でトランスフェクション処理し、ファージ
導入菌をプラークとして検出した。出現したファージ・
プラークをプラーク・ハイブリダイゼーション法〔文献
:ベントン(Benton)ら(1977)サイエンス
(Science)、196,180−182)によっ
て32pでラベルしたDAOE 1とハイブリダイゼー
ションさせ、陽性を示したプラークを見出した。陽性プ
ラーク中のファージを再度エシエリヒア・コリJM10
5に感染させて、上記と同様にしてDAOElとハイブ
リダイゼーションを示すプラークを純化して分離した後
、プラーク中に存在するファージを常法によって液体培
養し、1本鎖DNAを分離した。得られた1本鎖DNA
の塩基配列を解析したところ、予定通りイントロン様配
列を欠失した塩基配列をもつトリゴノプシス・パリアビ
リスCB54095由来のD N A断片をもつことが
判明したので、このファージをM13MHIと命名した
。
(3)つぎにD−アミノ酸オキシダーゼ蛋白質合成開始
部位(ATG)よりも上流にあるトリゴノプシス・パリ
アビリスCB54095由来のアミノ酸非コード領域を
削除するために、第4図に示されるようにこの領域の前
後を直結した配列に相補するポリヌクレオチドを合成し
、DAOE2と命名した。ついでDAOE2とファージ
M13ME1の1本鎖DNAとから、上記工程(2)で
のべた方法と同一の工程にしたがって、イントロン様配
列の削除に加えてATGより上流のアミノ酸非コード領
域をも削除されたD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一
部を保有するファージを造成し、これをMl 3ME1
2と命名した。
部位(ATG)よりも上流にあるトリゴノプシス・パリ
アビリスCB54095由来のアミノ酸非コード領域を
削除するために、第4図に示されるようにこの領域の前
後を直結した配列に相補するポリヌクレオチドを合成し
、DAOE2と命名した。ついでDAOE2とファージ
M13ME1の1本鎖DNAとから、上記工程(2)で
のべた方法と同一の工程にしたがって、イントロン様配
列の削除に加えてATGより上流のアミノ酸非コード領
域をも削除されたD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一
部を保有するファージを造成し、これをMl 3ME1
2と命名した。
10、発現ベクターの造成
本実施例に用いられる発現用ベクター造成の出発プラス
ミドであるp A K K M 1は公知の文献マツダ
(Matsuda)ら(1985)ジャーナルオブバク
テリオロジー(J、Bacteriol、 )、 16
3.1222−1228にその造成方法が示されており
、β−ラクタマーゼ遺伝子が不活化された特徴をもつ。
ミドであるp A K K M 1は公知の文献マツダ
(Matsuda)ら(1985)ジャーナルオブバク
テリオロジー(J、Bacteriol、 )、 16
3.1222−1228にその造成方法が示されており
、β−ラクタマーゼ遺伝子が不活化された特徴をもつ。
第5図に示すように、まずpAKKMlをE c o
RIとBamHIで切断し、これより約5kbのDNA
断片を分離・精製した。一方fiacUV5プロモータ
ーをふくむプラスミドpRZ4022 (米国ライスコ
ンシン大学ダブりニー・レズニコフ(LRezniko
ff)博士より入手〕をE c o RIとBamHI
で切断することによりQaCUv5プロモーターを含む
95bPの断片を調製した。ついで上記2断片をT4D
NAリガーゼを用いて結合させ、発現用ベクターpEX
OO2を得た。なお上記で用いたプラスミドpR240
22はギルバート(Gilbert)らの方法〔文献:
プロシーデイングスオブナショナルアカデミーサイエン
スユーエスエ−(Proc、Natl、Acad、Sc
i、USA)、70.3581−3584.1973〕
にしたがってnacUV5プモーターをふくむ95bP
のA L u I断片を調整し、pBR322のE c
o RI −B a m HI部位に置換挿入するこ
とによって造成される。
RIとBamHIで切断し、これより約5kbのDNA
断片を分離・精製した。一方fiacUV5プロモータ
ーをふくむプラスミドpRZ4022 (米国ライスコ
ンシン大学ダブりニー・レズニコフ(LRezniko
ff)博士より入手〕をE c o RIとBamHI
で切断することによりQaCUv5プロモーターを含む
95bPの断片を調製した。ついで上記2断片をT4D
NAリガーゼを用いて結合させ、発現用ベクターpEX
OO2を得た。なお上記で用いたプラスミドpR240
22はギルバート(Gilbert)らの方法〔文献:
プロシーデイングスオブナショナルアカデミーサイエン
スユーエスエ−(Proc、Natl、Acad、Sc
i、USA)、70.3581−3584.1973〕
にしたがってnacUV5プモーターをふくむ95bP
のA L u I断片を調整し、pBR322のE c
o RI −B a m HI部位に置換挿入するこ
とによって造成される。
11、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の発現第6図に
D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え体の造成
工程を示す。まずファージM13ME12の2本鎖DN
AよりEcoRIおよびBamHI切断により約0.3
k bのD−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端部
分をコードするDNA断片を分離した。ついでpDAO
c2−12よりE c o RIおよび5alI切断に
よりM13ME12にふくまれている部分をのぞく約1
.2kbのD−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部分
をコードするDNA切断を分離した。さらに発現用ベク
ターpEXOO2をB a m HIおよびXhoIで
切断した後、上記の2つの断片と混合し、T4DNAリ
ガーゼで結合反応を行なわせた。その反応液を用いてエ
シェリヒア・コリMB65を形質転換し、カナマイシン
40μg/mflをふくむL−ブロス寒天培地上で生育
してくるコロニーを選択した。得られたコロニーについ
て、D−メチオニンを基質とし、○−ジアニシジンを用
いるD−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出をヘトリック
(Hedrick)ら(1968)アーカイブスオブバ
イオケミストリーアンドバイオフイジックス(Arch
、Biochem、Biophys、)、126,15
5−164の方法に従って行なった結果、多数の陽性コ
ロニ 5D − 一を得た。この中の1株からプラスミドDNAを抽出し
、これをp E DAO1−と命名し、制限酵素切断に
より第6図に示される構造を確認した。またこの組換え
体を保有する大腸菌をエシェリヒア・コリMB65/p
EDAO1と命名した。
D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え体の造成
工程を示す。まずファージM13ME12の2本鎖DN
AよりEcoRIおよびBamHI切断により約0.3
k bのD−アミノ酸オキシダーゼのアミノ基末端部
分をコードするDNA断片を分離した。ついでpDAO
c2−12よりE c o RIおよび5alI切断に
よりM13ME12にふくまれている部分をのぞく約1
.2kbのD−アミノ酸オキシダーゼの構造遺伝子部分
をコードするDNA切断を分離した。さらに発現用ベク
ターpEXOO2をB a m HIおよびXhoIで
切断した後、上記の2つの断片と混合し、T4DNAリ
ガーゼで結合反応を行なわせた。その反応液を用いてエ
シェリヒア・コリMB65を形質転換し、カナマイシン
40μg/mflをふくむL−ブロス寒天培地上で生育
してくるコロニーを選択した。得られたコロニーについ
て、D−メチオニンを基質とし、○−ジアニシジンを用
いるD−アミノ酸オキシダーゼ活性の検出をヘトリック
(Hedrick)ら(1968)アーカイブスオブバ
イオケミストリーアンドバイオフイジックス(Arch
、Biochem、Biophys、)、126,15
5−164の方法に従って行なった結果、多数の陽性コ
ロニ 5D − 一を得た。この中の1株からプラスミドDNAを抽出し
、これをp E DAO1−と命名し、制限酵素切断に
より第6図に示される構造を確認した。またこの組換え
体を保有する大腸菌をエシェリヒア・コリMB65/p
EDAO1と命名した。
この菌をカナマイシン40μg / m 11をふくむ
L−ブロス(L−ブロス寒天培地より寒天を除いたもの
)100mQに植菌し、32℃で24時間振どう培養し
た。培養液を遠心分離して集菌し、これを10 m Q
の0.1Mピロリン酸緩衝液(pH8,0)に懸濁した
。これを超音波処理して細胞を破砕し、遠心分離した後
の上清をD−アミノ酸オキシダーゼ酵素液とした。
L−ブロス(L−ブロス寒天培地より寒天を除いたもの
)100mQに植菌し、32℃で24時間振どう培養し
た。培養液を遠心分離して集菌し、これを10 m Q
の0.1Mピロリン酸緩衝液(pH8,0)に懸濁した
。これを超音波処理して細胞を破砕し、遠心分離した後
の上清をD−アミノ酸オキシダーゼ酵素液とした。
〔2〕コマモナスeエスピー(Comamonas s
p、)SY−77−1(微工研菌寄第2410号)から
クローニングされたグルタリル7−ACAアシラーゼ遺
伝子を含む組換え体pAKKB1001 (特開昭6O
−110292)を下記の方法によって調製した。
p、)SY−77−1(微工研菌寄第2410号)から
クローニングされたグルタリル7−ACAアシラーゼ遺
伝子を含む組換え体pAKKB1001 (特開昭6O
−110292)を下記の方法によって調製した。
1)コマモナス属細菌5Y−77−1(微工研菌寄第2
410号)から全DNAの調製とその切断ニュートリエ
ンド・ブロス(牛肉エキス0.3%、ペプトン0.5%
)100mQにコマモナス属細菌5Y−77−1(微工
研菌寄第2410号)を接種し、30℃にて一夜培養後
集菌し、8mΩのTE緩衝液に懸濁する。これにリゾチ
ームを終濃度1 m g / m Qになるように加え
、37℃にて1時間反応させる。次にこれにプロナーゼ
Eを終濃度200μg / m Qになるように加え、
つづいてドデシル硫酸ナトリウムを終濃度1%になるよ
うに加えて37℃にて1時間反応させる。反応終了後反
応液に等容量のTNE緩衝液(50mMTri 5−H
CI、5mM EDTA、100mM NaC1; p
H8,0)で飽和したフェノールを加え、混合した後1
0.000rpmで10分間遠心し、水層を採取する。
410号)から全DNAの調製とその切断ニュートリエ
ンド・ブロス(牛肉エキス0.3%、ペプトン0.5%
)100mQにコマモナス属細菌5Y−77−1(微工
研菌寄第2410号)を接種し、30℃にて一夜培養後
集菌し、8mΩのTE緩衝液に懸濁する。これにリゾチ
ームを終濃度1 m g / m Qになるように加え
、37℃にて1時間反応させる。次にこれにプロナーゼ
Eを終濃度200μg / m Qになるように加え、
つづいてドデシル硫酸ナトリウムを終濃度1%になるよ
うに加えて37℃にて1時間反応させる。反応終了後反
応液に等容量のTNE緩衝液(50mMTri 5−H
CI、5mM EDTA、100mM NaC1; p
H8,0)で飽和したフェノールを加え、混合した後1
0.000rpmで10分間遠心し、水層を採取する。
この水層に等容量のフェノール・クロロホルム混液(1
:1.V/V)を加え、同様にして遠心後水層を採取し
て、さらに等容量のクロロボルムを加えて同様にして遠
心後水層を採取する。採取した水溶液にリボヌフレアー
ゼAを終濃度40μg / m +2になるように加え
、37℃にて1時間反応させる。反応終了後N a C
lとポリエチレングリコール6000を各々終濃度IM
および10%になるように加え、4℃にて4時間保持し
てから5000rpmで5分間遠心し、生成した沈殿を
0.1倍濃度TE緩衝液に溶かす。こうして得られた溶
液に酢酸ナトリウムを終濃度300mMになるように加
え、2倍容量のエタノールを加えて、−20’Cにて4
時間保持した後、10.OOOrpmで20分間遠心し
てDNAの沈殿を集める。この沈殿を0.1倍濃度TE
緩衝液に溶かし、以後の切断反応に供する。DNAの切
断のためには1μgのDNAに対し0.3単位のPst
Iを加え、10mMTri 5−HCI (pH7,4
)、10mM MgSO4゜50mM NaC1,1m
Mジチオスレイトールの緩衝液30μΩ中で37℃にて
1.5時間反応を行なわせ、つづいて70℃で10分間
加熱して反応を停止させる。
:1.V/V)を加え、同様にして遠心後水層を採取し
て、さらに等容量のクロロボルムを加えて同様にして遠
心後水層を採取する。採取した水溶液にリボヌフレアー
ゼAを終濃度40μg / m +2になるように加え
、37℃にて1時間反応させる。反応終了後N a C
lとポリエチレングリコール6000を各々終濃度IM
および10%になるように加え、4℃にて4時間保持し
てから5000rpmで5分間遠心し、生成した沈殿を
0.1倍濃度TE緩衝液に溶かす。こうして得られた溶
液に酢酸ナトリウムを終濃度300mMになるように加
え、2倍容量のエタノールを加えて、−20’Cにて4
時間保持した後、10.OOOrpmで20分間遠心し
てDNAの沈殿を集める。この沈殿を0.1倍濃度TE
緩衝液に溶かし、以後の切断反応に供する。DNAの切
断のためには1μgのDNAに対し0.3単位のPst
Iを加え、10mMTri 5−HCI (pH7,4
)、10mM MgSO4゜50mM NaC1,1m
Mジチオスレイトールの緩衝液30μΩ中で37℃にて
1.5時間反応を行なわせ、つづいて70℃で10分間
加熱して反応を停止させる。
2)ベクターpBR322の開裂
1μgのpBR322に対し1単位のPstIを加え、
l)と同一の緩衝液3011μ中で37℃にて2時間反
応させ、1)と同様にして反応を停止させる。
l)と同一の緩衝液3011μ中で37℃にて2時間反
応させ、1)と同様にして反応を停止させる。
3)再結合反応
0.8μgの切断されたコマモナス属細菌5Y−77−
IDNA、0.4μgの開裂されたPBR322,30
mM Tri 5−HCI(pH7゜5)、10mM
MgC1z、10mM 2−メルカプトエタノール、
10mM ATP、1単位T4リガーゼをふくむ100
μQの反応液中で22°Cにて2時間反応させる。その
後70℃にて10分間加熱することにより、反応を停止
させる。
IDNA、0.4μgの開裂されたPBR322,30
mM Tri 5−HCI(pH7゜5)、10mM
MgC1z、10mM 2−メルカプトエタノール、
10mM ATP、1単位T4リガーゼをふくむ100
μQの反応液中で22°Cにて2時間反応させる。その
後70℃にて10分間加熱することにより、反応を停止
させる。
4)組換え体プラスミドの大腸菌への導入3)で再結合
反応させることにより得られたDNAm液でエシェリヒ
ア・コリに12C600r−m−(ATCC33525
)を形質転換し、テトラサイクリン10μg / m
Qを含むL−ブロス寒天培地に生育してくるコロニーを
分離した。これらのコロニーをアンピシリン50μg
/ m QをふくむL−ブロス寒天培地上に移殖して生
育の有無を試験し、アンピシリン感受性を示すコロニー
を組換え体DNAを保持した大腸菌として分離した。
反応させることにより得られたDNAm液でエシェリヒ
ア・コリに12C600r−m−(ATCC33525
)を形質転換し、テトラサイクリン10μg / m
Qを含むL−ブロス寒天培地に生育してくるコロニーを
分離した。これらのコロニーをアンピシリン50μg
/ m QをふくむL−ブロス寒天培地上に移殖して生
育の有無を試験し、アンピシリン感受性を示すコロニー
を組換え体DNAを保持した大腸菌として分離した。
5)グルタリル7−ACAアシラーゼ産生能を有する大
腸菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン感受性株をテト
ラサイクリンをふくむL−ブロス寒天培地上で32℃に
て一夜培養し、生育した菌の一部をかきとって100μ
Qのグルタリル7−ACA(1m g / m Q )
をふくむ0.1M燐酸緩衝液(pH7,0)に懸濁した
後、37℃にて5時間反応させる。その後120μQの
反応停止液(100%酢酸2容と0.25M NaOH
1容の混合液)を加え、さらに40μΩの発色液(p−
ジメチルアミノベンズアルデヒドを0.5%になるよう
にメタノールに加えた液)を加える。この反応でグルタ
リル7−ACAアシラーゼ産生能を有する大腸菌は反応
液を黄色に変色させる。こうして得られた新規な大腸菌
をエシェリヒア・コリに12C600(pAKKloo
l)と命名した。
腸菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン感受性株をテト
ラサイクリンをふくむL−ブロス寒天培地上で32℃に
て一夜培養し、生育した菌の一部をかきとって100μ
Qのグルタリル7−ACA(1m g / m Q )
をふくむ0.1M燐酸緩衝液(pH7,0)に懸濁した
後、37℃にて5時間反応させる。その後120μQの
反応停止液(100%酢酸2容と0.25M NaOH
1容の混合液)を加え、さらに40μΩの発色液(p−
ジメチルアミノベンズアルデヒドを0.5%になるよう
にメタノールに加えた液)を加える。この反応でグルタ
リル7−ACAアシラーゼ産生能を有する大腸菌は反応
液を黄色に変色させる。こうして得られた新規な大腸菌
をエシェリヒア・コリに12C600(pAKKloo
l)と命名した。
4O−
6)大腸菌プラスミドDNAの分離と解析上記の大腸菌
をIQOmQのテトラサイクリンをふくむL−ブロスに
接種し37℃にて一夜培養後、遠心集菌し、15%蔗糖
、50mMTris −HCl (P H8、5)
、 50 m M E D T Aおよび1 m g
/ mΩのリゾチームよりなる溶液2mnに懸濁した後
、室温にて1時間保持する。
をIQOmQのテトラサイクリンをふくむL−ブロスに
接種し37℃にて一夜培養後、遠心集菌し、15%蔗糖
、50mMTris −HCl (P H8、5)
、 50 m M E D T Aおよび1 m g
/ mΩのリゾチームよりなる溶液2mnに懸濁した後
、室温にて1時間保持する。
次にトリトン(Iriton)溶液(0,1%Trit
onX−100,50mM Tris−HCI、50m
M EDTA; pH8,5)2mQを加え、37℃に
て30分間保持する。その後この溶液を5℃にて30.
OOOrpmで30分間遠心し、上清を採取する。これ
をエチジウムブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠
心(15℃にて40.OOOrpm、48時間)にかけ
、プラスミドDNAを分離精製する。これを2)と同様
の方法でPstIで切断し、断片の長さを1%アガロー
スを用いたアガロース電気泳動法で測定したところ、ベ
クターDNAに相当する4、3Kbの断片の他に3.6
Kb、−2,6Kb、0.9にbの断片が見出された。
onX−100,50mM Tris−HCI、50m
M EDTA; pH8,5)2mQを加え、37℃に
て30分間保持する。その後この溶液を5℃にて30.
OOOrpmで30分間遠心し、上清を採取する。これ
をエチジウムブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠
心(15℃にて40.OOOrpm、48時間)にかけ
、プラスミドDNAを分離精製する。これを2)と同様
の方法でPstIで切断し、断片の長さを1%アガロー
スを用いたアガロース電気泳動法で測定したところ、ベ
クターDNAに相当する4、3Kbの断片の他に3.6
Kb、−2,6Kb、0.9にbの断片が見出された。
このことがら新規な大腸菌から分離された組換え体DN
Aは第7図において制限酵素地図で示される構造を有し
、組換え体DNAではpBR322に7.IKbのDN
A断片が組み込まれていることが判明した。
Aは第7図において制限酵素地図で示される構造を有し
、組換え体DNAではpBR322に7.IKbのDN
A断片が組み込まれていることが判明した。
7)反応生成物の確認
上記の新規な大腸菌をテトラサイクリンをふくむL−ブ
ロス5 m flに接種し、32℃にて一夜培養後遠心
集菌し、1mΩのグルタリル7−ACA(25m g
/ m j2 )をふくむ0.1M燐酸緩衝液に懸濁す
る。これを37℃にて6時間反応させ、遠心して上清を
採取し、高速液体クロマトグラフィーに供する。高速液
体クロマトグラフィーにはLinchrosorb S
1100を充てんしたカラム(150X4mm)を用
い、溶媒としては0.1M燐酸緩衝液(pH7,5)を
用いて溶出し、溶出液中の紫外部吸光物質を260nm
の吸光度を測定して検出する。上記反応液からは7−A
CAに完全に一致する紫外部吸光物質が検出され、7−
ACAが生成していることが確認された。
ロス5 m flに接種し、32℃にて一夜培養後遠心
集菌し、1mΩのグルタリル7−ACA(25m g
/ m j2 )をふくむ0.1M燐酸緩衝液に懸濁す
る。これを37℃にて6時間反応させ、遠心して上清を
採取し、高速液体クロマトグラフィーに供する。高速液
体クロマトグラフィーにはLinchrosorb S
1100を充てんしたカラム(150X4mm)を用
い、溶媒としては0.1M燐酸緩衝液(pH7,5)を
用いて溶出し、溶出液中の紫外部吸光物質を260nm
の吸光度を測定して検出する。上記反応液からは7−A
CAに完全に一致する紫外部吸光物質が検出され、7−
ACAが生成していることが確認された。
8)組換え体DNAの改変によるグルタリル7−ACA
アシラーゼ産生能の増大した大腸菌の分離組換え体DN
A中に存在するグルタリル7−ACAアシラーゼ産生遺
伝子の発現を増大することによりグルタリル7−ACA
アシラーゼの産生を増大させるため、以下にのべる工程
にしたがって組換え体DNAの改変が行なわれた。
アシラーゼ産生能の増大した大腸菌の分離組換え体DN
A中に存在するグルタリル7−ACAアシラーゼ産生遺
伝子の発現を増大することによりグルタリル7−ACA
アシラーゼの産生を増大させるため、以下にのべる工程
にしたがって組換え体DNAの改変が行なわれた。
a)エシェリヒア・コリに12C600(pAKKlo
oI)から6)のようにして分離したプラスミドDNA
を以下のようにしてB a m HIで部分的に切断す
る。プラスミドDNAIμgに対し0.5単位のB a
m HIを加え、1)でのべたDNA切断用の緩衝液
30μΩ中で37℃にて1時間反応させた後1等容量の
TNE緩衝液で飽和したフェノールを加え、反応を停止
させる。次に遠心によりフェノールを除去した後、等容
量のエチルエーテルを加えて混合し、エチルエーテルを
除去する。この溶液中のDNAをエタノールで沈殿させ
、沈殿を0.1倍濃度TE緩衝液に溶かす。
oI)から6)のようにして分離したプラスミドDNA
を以下のようにしてB a m HIで部分的に切断す
る。プラスミドDNAIμgに対し0.5単位のB a
m HIを加え、1)でのべたDNA切断用の緩衝液
30μΩ中で37℃にて1時間反応させた後1等容量の
TNE緩衝液で飽和したフェノールを加え、反応を停止
させる。次に遠心によりフェノールを除去した後、等容
量のエチルエーテルを加えて混合し、エチルエーテルを
除去する。この溶液中のDNAをエタノールで沈殿させ
、沈殿を0.1倍濃度TE緩衝液に溶かす。
b)ベクターpBR325を2)でのべた方法に 4j
− よってPstIで開裂し3)でのべた方法で再び閉環さ
せた後、エシェリヒア・コリに12C600r−m−C
ATCC33525)に導入し、テトラサイクリンをふ
くむL−ブロス寒天培地上に生育してくるコロニーから
アンピシリンに感受性になった株を選択分離する。こう
して得られたアンピシリン感受性株よりプラスミドDN
Aを取得することにより、アンピシリン耐性遺伝子(β
−ラクタマーゼ産生遺伝子)が不活化された新規なベク
ターが得られる。
− よってPstIで開裂し3)でのべた方法で再び閉環さ
せた後、エシェリヒア・コリに12C600r−m−C
ATCC33525)に導入し、テトラサイクリンをふ
くむL−ブロス寒天培地上に生育してくるコロニーから
アンピシリンに感受性になった株を選択分離する。こう
して得られたアンピシリン感受性株よりプラスミドDN
Aを取得することにより、アンピシリン耐性遺伝子(β
−ラクタマーゼ産生遺伝子)が不活化された新規なベク
ターが得られる。
C)上記の新規なベクタープラスミドをB a m H
■で開裂させる。
■で開裂させる。
d)a)で得られたDNAと開裂された新規なベクター
プラスミドを3)でのべた方法より再結合し、エシェリ
ヒア・コリK 12 C600r−m−(ATCC33
525)に導入した後、クロラムフェニコール20μg
/ m QをふくむL−ブロス寒天培地に生育するコ
ロニーを選択分離する。
プラスミドを3)でのべた方法より再結合し、エシェリ
ヒア・コリK 12 C600r−m−(ATCC33
525)に導入した後、クロラムフェニコール20μg
/ m QをふくむL−ブロス寒天培地に生育するコ
ロニーを選択分離する。
e)選択された株の中から5)にのべる方法によりグル
タリル7−ACAアシラーゼ産生能を有する株を選択分
離する。次にグルタリル7−AC:Aアシラーゼ産生能
を有する株のグルタリル7−ACAアシラーゼ活性を測
定し最も活性の高い株を選択分離する。グルタリル7−
ACAアシラーゼ活性の測定にはクロラムフェニコール
をふくむL−ブロス5 m Qで一夜培養した菌体をグ
ルタリル7− A CA (25m g / m Q
) をふくむ0.1M燐酸緩衝液(pH7,0)2m
Rに懸濁し、37℃にて15分間反応させ、反応後直ち
に遠心して菌体を除去した後、反応液の一定量を高速液
体クロマトグラフィーに供し、生成している7−ACA
を定量する。
タリル7−ACAアシラーゼ産生能を有する株を選択分
離する。次にグルタリル7−AC:Aアシラーゼ産生能
を有する株のグルタリル7−ACAアシラーゼ活性を測
定し最も活性の高い株を選択分離する。グルタリル7−
ACAアシラーゼ活性の測定にはクロラムフェニコール
をふくむL−ブロス5 m Qで一夜培養した菌体をグ
ルタリル7− A CA (25m g / m Q
) をふくむ0.1M燐酸緩衝液(pH7,0)2m
Rに懸濁し、37℃にて15分間反応させ、反応後直ち
に遠心して菌体を除去した後、反応液の一定量を高速液
体クロマトグラフィーに供し、生成している7−ACA
を定量する。
このようにして得られた高いグルタリル7−ACAアシ
ラーゼ産生能を有する新規な大腸菌の一株をエシェリヒ
ア・コリに12C600(pAKKB 1001)と命
名した。新規な大腸菌のグルタリル7−ACAアシラー
ゼ産生能を比活性で比較したところ、コマモナス属細菌
5Y−77−1(微工研菌寄第2410号)の活性を1
とするとき、エシェリヒア・コリに12C600(pA
KK1001)は3、これに対してエシェリヒア・コリ
に12C600(PAKKBlooI)では15であっ
た。
ラーゼ産生能を有する新規な大腸菌の一株をエシェリヒ
ア・コリに12C600(pAKKB 1001)と命
名した。新規な大腸菌のグルタリル7−ACAアシラー
ゼ産生能を比活性で比較したところ、コマモナス属細菌
5Y−77−1(微工研菌寄第2410号)の活性を1
とするとき、エシェリヒア・コリに12C600(pA
KK1001)は3、これに対してエシェリヒア・コリ
に12C600(PAKKBlooI)では15であっ
た。
9)グルタリル7−ACAアシラーゼ産生能の増大した
大腸菌よりプラスミドDNAの分離と解析8)で得られ
た新規な大腸菌より6)でのべた方法によってプラスミ
ドDNAを分離し、BamHIで切断してアガロースゲ
ル電気泳動法でDNA断片の長さを測定したところ、8
)のb)で得られた新規なベクターに相当する5、9K
bの断片の他に4.8Kb、0.7Kbの断片が見出さ
れた。さらにプラスミドDNAをPstIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動法で解析した結果にもとづいて、
第8図に示される組換え体DNAの制限酵素地図が作成
された。
大腸菌よりプラスミドDNAの分離と解析8)で得られ
た新規な大腸菌より6)でのべた方法によってプラスミ
ドDNAを分離し、BamHIで切断してアガロースゲ
ル電気泳動法でDNA断片の長さを測定したところ、8
)のb)で得られた新規なベクターに相当する5、9K
bの断片の他に4.8Kb、0.7Kbの断片が見出さ
れた。さらにプラスミドDNAをPstIで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動法で解析した結果にもとづいて、
第8図に示される組換え体DNAの制限酵素地図が作成
された。
このことからエシェリヒア・コリに12C600(pA
KKBlool)より分離された組換え体DNAでは、
pBR325を改変した新規なベクターDNAにエシェ
リヒア・コリに12C600(pAKKlool)から
分離された組換え体−47= DNAの一部分である5、5KbのDNA断片が組み込
まれていることが判明した。
KKBlool)より分離された組換え体DNAでは、
pBR325を改変した新規なベクターDNAにエシェ
リヒア・コリに12C600(pAKKlool)から
分離された組換え体−47= DNAの一部分である5、5KbのDNA断片が組み込
まれていることが判明した。
得られたプラスミドPAKB100Iを第9図に示す工
程により改変してから、形質転換体を得て、酵素生産に
用いた。以下にこの工程を詳しく説明する。
程により改変してから、形質転換体を得て、酵素生産に
用いた。以下にこの工程を詳しく説明する。
■プラスミドpAKKB1001を制限酵素HpaIで
開裂し、つづいて制限酵素PvuI Iで部分的に切断
した後、T4DNAリガーゼで再結合させた。これでエ
シェリヒア・コリMM294〔アメリカンタイプカルチ
ャーコレクション(American Type Cu
1ture Co11ection)よりATCCNo
、33678として入手できる〕を形質転換し、クロラ
ムフェニコール25μg / m Qを含むL−ブロス
寒天平板上で生育するがテトラサイクリン10μg /
m Qを含む培地上では生育できない(これをテトラ
サイクリン感受性と称する)コロニーを選択した。この
コロニーを培養してプラスミドDNAを分離し、pAK
KB1003と命名した。改変された組換え体はグルタ
リル7−ACAアシラーゼ遺伝子を保持し、かつ小型化
された特徴をもつ。
開裂し、つづいて制限酵素PvuI Iで部分的に切断
した後、T4DNAリガーゼで再結合させた。これでエ
シェリヒア・コリMM294〔アメリカンタイプカルチ
ャーコレクション(American Type Cu
1ture Co11ection)よりATCCNo
、33678として入手できる〕を形質転換し、クロラ
ムフェニコール25μg / m Qを含むL−ブロス
寒天平板上で生育するがテトラサイクリン10μg /
m Qを含む培地上では生育できない(これをテトラ
サイクリン感受性と称する)コロニーを選択した。この
コロニーを培養してプラスミドDNAを分離し、pAK
KB1003と命名した。改変された組換え体はグルタ
リル7−ACAアシラーゼ遺伝子を保持し、かつ小型化
された特徴をもつ。
■プラスミドpUC9(アメリカンタイプカルチャーコ
レクションよりATCCNo、37252として入手で
きる)を制限酵素Ha e mで切断し、生成したDN
A断片から約0.2Kbの大きさの断片をアガロースゲ
ル電気泳動により分離し、精製した。一方プラスミドp
AKKB1003を制限酵素Hi n d mで開裂し
、つづいてHa e mで部分的に切断した後、DNA
ポリメラーゼ・フレノウ(KLenov)断片とdAT
P、dGTP、dCTPおよびTTPを作用させて、切
断端を平滑末端にした。このものと上記のpUC9から
分離した断片を混合し、T4DNAリガーゼで結合反応
を行なった。これでエシェリヒア・コリMM294を形
質転換し、クロラムフェニコール25μg/mQと5−
ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラク
トシド20μg / m Qを含むL−ブロス寒天平板
上で生育し、かつ青色を呈するコロニーを選択した。こ
れらのコロニーにグルタリル7−ACAを作用させ、前
記5)に記載のp−ジメチルアミノベンズアルデヒドで
7−ACAを発色させる方法を用いてグルタリル7−A
CAアシラーゼ活性を検出した。酵素活性を有するコロ
ニーを選択し、これよりプラスミドDNAを分離して、
pAKKlacloolと命名した。
レクションよりATCCNo、37252として入手で
きる)を制限酵素Ha e mで切断し、生成したDN
A断片から約0.2Kbの大きさの断片をアガロースゲ
ル電気泳動により分離し、精製した。一方プラスミドp
AKKB1003を制限酵素Hi n d mで開裂し
、つづいてHa e mで部分的に切断した後、DNA
ポリメラーゼ・フレノウ(KLenov)断片とdAT
P、dGTP、dCTPおよびTTPを作用させて、切
断端を平滑末端にした。このものと上記のpUC9から
分離した断片を混合し、T4DNAリガーゼで結合反応
を行なった。これでエシェリヒア・コリMM294を形
質転換し、クロラムフェニコール25μg/mQと5−
ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラク
トシド20μg / m Qを含むL−ブロス寒天平板
上で生育し、かつ青色を呈するコロニーを選択した。こ
れらのコロニーにグルタリル7−ACAを作用させ、前
記5)に記載のp−ジメチルアミノベンズアルデヒドで
7−ACAを発色させる方法を用いてグルタリル7−A
CAアシラーゼ活性を検出した。酵素活性を有するコロ
ニーを選択し、これよりプラスミドDNAを分離して、
pAKKlacloolと命名した。
この組換え体をさらに簡便なものにするため、pA K
K l a c 1001を制限酵素Hi n d
mとSmaIで切断し、DNAポリメラーゼ・フレノウ
断片を前記と同様に作用させて平滑末端をもつ断片とし
た後、T4DNAリガーゼで再結合させた。
K l a c 1001を制限酵素Hi n d
mとSmaIで切断し、DNAポリメラーゼ・フレノウ
断片を前記と同様に作用させて平滑末端をもつ断片とし
た後、T4DNAリガーゼで再結合させた。
これでエシェリヒア・コリMB65(微工研菌寄第89
oO号)を形質転換し、クロラムフェニコールに耐性で
かつグルタリル7−ACAアシラーゼ活性を有するコロ
ニーを選択した。このコロニーよりプラスミドDNAを
分離し、PAKKΔSH1と命名し、またこれによる形
質転換体をエシェリヒア・コリM B 65 / p
A K KΔSHIと命名した。組換え体pAKKΔS
H1は、エシェリヒア・コリのβ−ガラクトシターゼ
遺伝子のプロモーターを含む部分と融合し、発現の調節
が可能になったグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子
を含むようになった特徴をもつ。
oO号)を形質転換し、クロラムフェニコールに耐性で
かつグルタリル7−ACAアシラーゼ活性を有するコロ
ニーを選択した。このコロニーよりプラスミドDNAを
分離し、PAKKΔSH1と命名し、またこれによる形
質転換体をエシェリヒア・コリM B 65 / p
A K KΔSHIと命名した。組換え体pAKKΔS
H1は、エシェリヒア・コリのβ−ガラクトシターゼ
遺伝子のプロモーターを含む部分と融合し、発現の調節
が可能になったグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子
を含むようになった特徴をもつ。
こうして得られたエシェリヒア・コリMB65/ p
A K KΔSHIをクロラムフェニコール25μg
/ m nを含むL−ブロスで培養し、上記(1)と同
様に処理して、グルタリル7−ACAアシラーゼ酵素液
を調製した。
A K KΔSHIをクロラムフェニコール25μg
/ m nを含むL−ブロスで培養し、上記(1)と同
様に処理して、グルタリル7−ACAアシラーゼ酵素液
を調製した。
〔3〕D−アミノ酸オキシダーゼ酵素液1omQ、グル
タリル7−ACAアシラーゼ酵素液10 m Qおよび
0.1Mリン酸緩衝液(pH8,0)30mαを混合し
、セファロスポリンC(純度70%)714mgを添加
して、37℃で振とうしながら反応を行なった。30%
過酸化水素水を反応開始後15分、30分、45分後に
各々0 、05 m Q、70分、85分、100分後
に各々0.01m11加えて120分間反応を行なった
。反応終了液中の7−ACAの生成率は55.7%であ
った。
タリル7−ACAアシラーゼ酵素液10 m Qおよび
0.1Mリン酸緩衝液(pH8,0)30mαを混合し
、セファロスポリンC(純度70%)714mgを添加
して、37℃で振とうしながら反応を行なった。30%
過酸化水素水を反応開始後15分、30分、45分後に
各々0 、05 m Q、70分、85分、100分後
に各々0.01m11加えて120分間反応を行なった
。反応終了液中の7−ACAの生成率は55.7%であ
った。
反応液を水で3倍に希釈し、100 m QのDEAE
セファデックスA−25(C1−型、ファルマシア社製
)のカラムに通した。120 m Qの水で洗い、つい
で0.05Mの食塩水を通すと7−ACAが溶出された
。7−ACA画分を集め、pH7,0に調節して減圧濃
縮後、予め0.1Mリン酸緩衝液(pH7,0)で洗っ
たダイヤイオンHP−20(三菱化成製)100mQの
カラムを通過させ、次に脱イオン水で充分カラムを水洗
した後、50%メタノール水で溶出した。7−ACA溶
出画分を集め、減圧濃縮後、p H3、0に調節し、冷
所に放置したところ、7−ACAが析出した。沈殿物を
集め、真空乾燥して、160mgの7−ACAを得た。
セファデックスA−25(C1−型、ファルマシア社製
)のカラムに通した。120 m Qの水で洗い、つい
で0.05Mの食塩水を通すと7−ACAが溶出された
。7−ACA画分を集め、pH7,0に調節して減圧濃
縮後、予め0.1Mリン酸緩衝液(pH7,0)で洗っ
たダイヤイオンHP−20(三菱化成製)100mQの
カラムを通過させ、次に脱イオン水で充分カラムを水洗
した後、50%メタノール水で溶出した。7−ACA溶
出画分を集め、減圧濃縮後、p H3、0に調節し、冷
所に放置したところ、7−ACAが析出した。沈殿物を
集め、真空乾燥して、160mgの7−ACAを得た。
この純度は80%であった。
実施例2
実施例1と同様の反応系にデアセチルセファロスポリン
C(純度65%)500mgを添加し、37℃で120
分反応を行なった。反応終了液中の7−アミツブアセチ
ルセファロスボラン酸の生成率は52%であった。
C(純度65%)500mgを添加し、37℃で120
分反応を行なった。反応終了液中の7−アミツブアセチ
ルセファロスボラン酸の生成率は52%であった。
実施例3
本実施例はD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換
え体とグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含む組
換え体が共存する形質転換体を用いる方法に関する。
え体とグルタリル7−ACAアシラーゼ遺伝子を含む組
換え体が共存する形質転換体を用いる方法に関する。
(1)pEDA○1およびpAKKΔSHIはともにp
BR322に起源をもつベクターを用いて造成された組
換え体である。そこでpBR322とは不和合性の異な
ることが知られているプラスミドpAcY0184 (
アメリカンタイプカルチャーコレクションよりATCC
No、37033として入手できる)に、第10図に示
される工程で、pAKKASHI中のグルタリル?−A
CAアシラーゼ遺伝子を含むDNA断片を組み込んだ。
BR322に起源をもつベクターを用いて造成された組
換え体である。そこでpBR322とは不和合性の異な
ることが知られているプラスミドpAcY0184 (
アメリカンタイプカルチャーコレクションよりATCC
No、37033として入手できる)に、第10図に示
される工程で、pAKKASHI中のグルタリル?−A
CAアシラーゼ遺伝子を含むDNA断片を組み込んだ。
すなわち、まずpAcYc184をHind’lIIで
開裂した。一方pAKKへSHIを制限酵素PvulI
とNdelで切断し、生成した約3KbのDNA断片を
アガロースゲル電気泳動で分離し、精製した後、DNA
ポリメラーゼ・フレノウ断片を前記と同様に作用させて
、平滑末端をもつ断片とした。これにTDNAリガーゼ
の作用でHi n d■クリンカを付加し、Hi n
d mで処理した後、 bi − 上記のpACYC184と混合し、T4DNAリガーゼ
で両者を結合させた。これでエシェリヒア・コリMB6
5を形質転換し、クロラムフェニコールに耐性でかつテ
トラサイクリンに感受性であり、しかもグルタリル7−
ACAアシラーゼ活性を有するコロニーを選択した。こ
のコロニーを培養してプラスミドDNAを分離し、これ
をpACYCaclと命名した。p A CY Ca
c 1でエシェリヒア・コリM B 65 / p E
D A O1を形質転換し、カナマイシン40μg
/ mΩとクロラムフェニコール25μg / m Q
を含むL−ブロス寒天平板上で生育してくるコロニーを
選択して、これをエシェリヒア・コリM B 65 /
p E D A O1/ p A CYCaclと命
名した。
開裂した。一方pAKKへSHIを制限酵素PvulI
とNdelで切断し、生成した約3KbのDNA断片を
アガロースゲル電気泳動で分離し、精製した後、DNA
ポリメラーゼ・フレノウ断片を前記と同様に作用させて
、平滑末端をもつ断片とした。これにTDNAリガーゼ
の作用でHi n d■クリンカを付加し、Hi n
d mで処理した後、 bi − 上記のpACYC184と混合し、T4DNAリガーゼ
で両者を結合させた。これでエシェリヒア・コリMB6
5を形質転換し、クロラムフェニコールに耐性でかつテ
トラサイクリンに感受性であり、しかもグルタリル7−
ACAアシラーゼ活性を有するコロニーを選択した。こ
のコロニーを培養してプラスミドDNAを分離し、これ
をpACYCaclと命名した。p A CY Ca
c 1でエシェリヒア・コリM B 65 / p E
D A O1を形質転換し、カナマイシン40μg
/ mΩとクロラムフェニコール25μg / m Q
を含むL−ブロス寒天平板上で生育してくるコロニーを
選択して、これをエシェリヒア・コリM B 65 /
p E D A O1/ p A CYCaclと命
名した。
(2)エシェリヒア・コリM B 65 / p E
D A 01/pAcYcaclをカナマイシン40μ
g/mQとクロラムフェニコール25μg / m Q
を含むL−ブロスで培養して、実施例1と同様にして酵
素液を調製した。酵素液1mF!、0.1Mリン酸緩衝
液(pH8,0)4rnQにセファロスボリンC(純度
70%)を70 m g添加し、実施例1と同様にして
120分間反応を行なった。反応終了液中の7−ACA
生成率は40.6%であった。
D A 01/pAcYcaclをカナマイシン40μ
g/mQとクロラムフェニコール25μg / m Q
を含むL−ブロスで培養して、実施例1と同様にして酵
素液を調製した。酵素液1mF!、0.1Mリン酸緩衝
液(pH8,0)4rnQにセファロスボリンC(純度
70%)を70 m g添加し、実施例1と同様にして
120分間反応を行なった。反応終了液中の7−ACA
生成率は40.6%であった。
実施例4
本実施例はD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子とグルタリ
ル7−ACAアシラーゼ遺伝子が共存する組換え体を保
有する形質転換体の培養物を用いる方法である。
ル7−ACAアシラーゼ遺伝子が共存する組換え体を保
有する形質転換体の培養物を用いる方法である。
(1)上記両遺伝子が共存する組換え体の造成工程を第
11図に示す。すなわちpAKKΔSHIをPvuUお
よびNdeIで切断し、生成したDNA断片の両端をD
NAポリメラーゼ・フレノウ断片を前記と同様に作用さ
せて平滑末端とした。
11図に示す。すなわちpAKKΔSHIをPvuUお
よびNdeIで切断し、生成したDNA断片の両端をD
NAポリメラーゼ・フレノウ断片を前記と同様に作用さ
せて平滑末端とした。
これよりアガロースゲル電気泳動により約3Kbの大き
さの断片を分離し、精製した。一方pEDAOIをSm
alで開裂し、これと上記の断片を混合した後、両者を
T4DNAリガーゼの作用で結合させた。これを用いて
エシェリヒア・コリMB65を形質転換し、カナマイシ
ン40μg/m1を含むL−ブロス寒天平板上に生育し
かつグルタリル7−ACAアシラーゼ活性を示すコロニ
ーを選択した。このコロニーよりプラスミドDNAを分
離し、これをpDOaclと命名し、これを保持する形
質転換体をエシェリヒア・コリMB65 / p D
Oa c 1と命名した。
さの断片を分離し、精製した。一方pEDAOIをSm
alで開裂し、これと上記の断片を混合した後、両者を
T4DNAリガーゼの作用で結合させた。これを用いて
エシェリヒア・コリMB65を形質転換し、カナマイシ
ン40μg/m1を含むL−ブロス寒天平板上に生育し
かつグルタリル7−ACAアシラーゼ活性を示すコロニ
ーを選択した。このコロニーよりプラスミドDNAを分
離し、これをpDOaclと命名し、これを保持する形
質転換体をエシェリヒア・コリMB65 / p D
Oa c 1と命名した。
(2)エシェリヒア・コリM B 65 / p D
Oa clをカナマイシン40μg/μgを含むL−ブ
ロスで培養し、実施例1と同様にして酵素液を調製した
。これを実施例3と同様にしてセファロスポリンCに作
用させたところ1反応終了液中の7−ACA生成率は1
6%であった。
Oa clをカナマイシン40μg/μgを含むL−ブ
ロスで培養し、実施例1と同様にして酵素液を調製した
。これを実施例3と同様にしてセファロスポリンCに作
用させたところ1反応終了液中の7−ACA生成率は1
6%であった。
実施例5
エシェリヒア・コリMB65を変異誘起剤N−メチル−
N′−二トローN−二トロソグアニジンで処理した後、
ルーエン(loewen)の方法(文献:ジャーナルオ
ブバクテリオロジー(J、Bacteriol、)15
2.622−626.1984)にしたがって、カタラ
ーゼ活性の欠損した変異株を分離し、これをエシェリヒ
ア・コリMBC1013と命名した。なお本変異株は工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研−〇D − 菌寄第8901号として寄託されている6pEDAO1
およびPAKKΔSHIで独立にエシェリヒア・コリM
BC1013を形−質転換し、得ら九た各々の形質転換
体を培養して、実施例1と同様にして酵素液を調製した
。各々の形質転換体からの酵素液各1mQ、0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH8,0)3mQにセファロスポリンc
(純度70%)70mgを添加し、37℃で振とうさせ
ながら、過酸化水素水を添加せずに120分反応を行な
った。反応終了液中の7−ACA生成率は59%であっ
た。
N′−二トローN−二トロソグアニジンで処理した後、
ルーエン(loewen)の方法(文献:ジャーナルオ
ブバクテリオロジー(J、Bacteriol、)15
2.622−626.1984)にしたがって、カタラ
ーゼ活性の欠損した変異株を分離し、これをエシェリヒ
ア・コリMBC1013と命名した。なお本変異株は工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研−〇D − 菌寄第8901号として寄託されている6pEDAO1
およびPAKKΔSHIで独立にエシェリヒア・コリM
BC1013を形−質転換し、得ら九た各々の形質転換
体を培養して、実施例1と同様にして酵素液を調製した
。各々の形質転換体からの酵素液各1mQ、0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH8,0)3mQにセファロスポリンc
(純度70%)70mgを添加し、37℃で振とうさせ
ながら、過酸化水素水を添加せずに120分反応を行な
った。反応終了液中の7−ACA生成率は59%であっ
た。
実施例6
エシェリヒア・コリMBC1013をpEDAolおよ
びpAcYcaclで同時に形質転換し、カナマイシン
40μg/m(lとクロラムフェニコール25μg /
m Qを含むL−ブロス寒天平板上で生育してくるコ
ロニーを形質転換体として分離した。この形質転換体を
カナマイシン40μg/mQとクロラムフェニコール2
5μg / m Qを含むL−ブロスで培養して、実施
例1と同様にして酵素液を調製した。酵素液1mQ、0
.1Mリン酸緩衝液(p H8、0)にセファロスポリ
ンC(純度70%)70mgを添加し、37℃で振とう
させながら、過酸化水素水を添加せずに120分反応を
行なった。反応終了液中の7−ACA生成率は42.6
%であった。
びpAcYcaclで同時に形質転換し、カナマイシン
40μg/m(lとクロラムフェニコール25μg /
m Qを含むL−ブロス寒天平板上で生育してくるコ
ロニーを形質転換体として分離した。この形質転換体を
カナマイシン40μg/mQとクロラムフェニコール2
5μg / m Qを含むL−ブロスで培養して、実施
例1と同様にして酵素液を調製した。酵素液1mQ、0
.1Mリン酸緩衝液(p H8、0)にセファロスポリ
ンC(純度70%)70mgを添加し、37℃で振とう
させながら、過酸化水素水を添加せずに120分反応を
行なった。反応終了液中の7−ACA生成率は42.6
%であった。
本発明者らは大腸菌にクローニングされたD−アミノ酸
オキシダーゼ遺伝子とグルタリル7−ACAアシラーゼ
遺伝子を用いれば。
オキシダーゼ遺伝子とグルタリル7−ACAアシラーゼ
遺伝子を用いれば。
(1)両遺伝子を個別に保持する形質転換体の培養物ま
たは処理物の共存、 (2)両遺伝子を箇別に含む組換え体の共存する単一の
形質転換体の培養物または処理物あるいは、(3) W
J遺伝子が共存する単一の組換え体による単一の形質転
換体の培養物または処理物のいずれを用いても、1段の
工程できわめて効率よくセファロスポリンCおよびその
誘導体から7−ACAおよびその誘導体を生成せしめる
ことができる。また上記反応の進行のためには通常の大
陽画を宿主として用いた場合過酸化水素の補給を必要と
するが、実施例から明らかなようにカタラーゼ生産能を
欠損した大腸菌の変異株を宿主として用いれば、過酸化
水素を補給する必要もなく、さらに容易な反応工程にす
ることができる。このようにセファロスポリンCから7
−ACAを製造する上で、従来の方法と比較して画期的
にすぐれた方法が提供される。
たは処理物の共存、 (2)両遺伝子を箇別に含む組換え体の共存する単一の
形質転換体の培養物または処理物あるいは、(3) W
J遺伝子が共存する単一の組換え体による単一の形質転
換体の培養物または処理物のいずれを用いても、1段の
工程できわめて効率よくセファロスポリンCおよびその
誘導体から7−ACAおよびその誘導体を生成せしめる
ことができる。また上記反応の進行のためには通常の大
陽画を宿主として用いた場合過酸化水素の補給を必要と
するが、実施例から明らかなようにカタラーゼ生産能を
欠損した大腸菌の変異株を宿主として用いれば、過酸化
水素を補給する必要もなく、さらに容易な反応工程にす
ることができる。このようにセファロスポリンCから7
−ACAを製造する上で、従来の方法と比較して画期的
にすぐれた方法が提供される。
第1図はトリゴノプシス・パリアビリス由来のD−アミ
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。 図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそれぞ
れ示す。 第2図はプラスミドpDAOc2−12よりEc o
RI切断により生成する約0.6Kbの断片の塩基配列
の一部を示す。図中で上段は塩基配列を、下段はこれに
対応するアミノ酸配列を、点線を引いた部分はイントロ
ン様配列を示す。 第3図はプラスミドpDAOc2−12の制限酵素開裂
地図を示す。 第4図はD−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の概要を示す。 第5図はD−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Cmr。 K mr、 A p rは各々クロラムフェニコール、
カナマイシン、アンピシリンに対する耐性遺伝子を、P
lacUV5は1acUV5プロモーターを示す。 第6図はD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工程の概要を示す。図中で−の部分はD−アミノ
酸オキシダーゼ(DA○の略号で表示)のアミノ酸配列
コード領域を示す。 第7図はエシェリヒア・コリに12C600(pAKK
lool)より分離された組換え体プラスミドの制限酵
素地図である。 第8図はエシェリヒア・コリに12C600(pAKK
Blool)より分離された組換え体プラスミドの制限
酵素地図である。 第9図は組換え体pAKKB1001の改変の工程を示
す。図中には工程に関与しているかあるいはマーカーと
なる制限酵素切断部位のみが以下の略号で示されている
。E、EcoRI。Pv。 P v u II 、 H、Hi n d m。B、B
amHI。 He、HaeIII。Hp、HpaI。N、NdeI。 Sm、SmaI。また図中Cm r、T cr、A p
rは各々クロラムフェニコール、テトラサイクリン、お
よびアンピシリンへの耐性遺伝子を、a6ylはグルタ
リル7−ACAアシラーゼ遺伝子を表示する。 第10図はプラスミドpAcYc184にグルタリル7
−ACAアシラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体pAcY
caclの造成工程を示す。 第11図はD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子(図中DA
Oの略号で表示)を含む組換え体PEDAOIにグルタ
リル7−ACAアシラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体p
D Oa c 1の造成工程を示す。図中Kmrはカ
ナマイシンへの耐性遺伝子を表示する。 bo − 第1図 * 841 GAC,CGA、TTC,CCG、GAA、CTG、A
CC,AAA、GAT、GGC,CCT。 Asp−Arg−Phe−Pro−C1u−Leu−T
hr−Lys−Asp−Gly−Pro−* 90】 CAC,CGT、CCT、GGT、AGA、GAG、G
GC,GGT、CCC,CGA、GTA。 Hlm−Arg−Pro−Gly−Arg−C1u−G
ly−Gly−Pro−Arg−Val−* 96】 TTT、GTT、GTC,CAT、AAC,TAT、G
GT、GCC,GCC,GGT、GCT。 Pha−Val−Val−T(In−Asn−Tyr−
Gly−Ata−Ala−Gly−Ala−*1021 GAT、GAA、GCT、GTT、TCT、TAC,G
TC,GAA、AGA、GCT、CTT。 Asp−C1u−Ala−Val−8or−Tyr−V
al−Glu−Arg−Ala−Leu−(その3) 900* 口TT、GAC,ATT、GTG、CGC,GAA、T
GC,GTT、GGCLeu−Asp−11e−Val
−Arg−Glu−Cys−Val−Gly960* CAA、TTA、GAG、AAC、ATC,CCC、G
GC,GTT 、GGCClu−Leu−Glu−Ly
s−11e−Pro−Gly−Val−Gly]020
* GGT、TAC,CAA、TCC,TCT 、TAC,
GGC,ATG 、GCTCly−Tyr−C1n−3
s r−8er−Tyr−Gly−Me t−Al p
cACT、CGT、CCA、AAC,CTT、TAfl
。 Thr−Arg−Pro−Agn−Leu−幸**−第
6図
ノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列およびそれをコードす
るD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。 図中、上段は塩基配列を、下段はアミノ酸配列をそれぞ
れ示す。 第2図はプラスミドpDAOc2−12よりEc o
RI切断により生成する約0.6Kbの断片の塩基配列
の一部を示す。図中で上段は塩基配列を、下段はこれに
対応するアミノ酸配列を、点線を引いた部分はイントロ
ン様配列を示す。 第3図はプラスミドpDAOc2−12の制限酵素開裂
地図を示す。 第4図はD−アミノ酸オキシダーゼ・クローンよりアミ
ノ酸非コード領域削除の概要を示す。 第5図はD−アミノ酸オキシダーゼ発現用ベクター造成
工程の概要を示す。図中で記号Cmr。 K mr、 A p rは各々クロラムフェニコール、
カナマイシン、アンピシリンに対する耐性遺伝子を、P
lacUV5は1acUV5プロモーターを示す。 第6図はD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子発現用組換え
体造成工程の概要を示す。図中で−の部分はD−アミノ
酸オキシダーゼ(DA○の略号で表示)のアミノ酸配列
コード領域を示す。 第7図はエシェリヒア・コリに12C600(pAKK
lool)より分離された組換え体プラスミドの制限酵
素地図である。 第8図はエシェリヒア・コリに12C600(pAKK
Blool)より分離された組換え体プラスミドの制限
酵素地図である。 第9図は組換え体pAKKB1001の改変の工程を示
す。図中には工程に関与しているかあるいはマーカーと
なる制限酵素切断部位のみが以下の略号で示されている
。E、EcoRI。Pv。 P v u II 、 H、Hi n d m。B、B
amHI。 He、HaeIII。Hp、HpaI。N、NdeI。 Sm、SmaI。また図中Cm r、T cr、A p
rは各々クロラムフェニコール、テトラサイクリン、お
よびアンピシリンへの耐性遺伝子を、a6ylはグルタ
リル7−ACAアシラーゼ遺伝子を表示する。 第10図はプラスミドpAcYc184にグルタリル7
−ACAアシラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体pAcY
caclの造成工程を示す。 第11図はD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子(図中DA
Oの略号で表示)を含む組換え体PEDAOIにグルタ
リル7−ACAアシラーゼ遺伝子を組込んだ組換え体p
D Oa c 1の造成工程を示す。図中Kmrはカ
ナマイシンへの耐性遺伝子を表示する。 bo − 第1図 * 841 GAC,CGA、TTC,CCG、GAA、CTG、A
CC,AAA、GAT、GGC,CCT。 Asp−Arg−Phe−Pro−C1u−Leu−T
hr−Lys−Asp−Gly−Pro−* 90】 CAC,CGT、CCT、GGT、AGA、GAG、G
GC,GGT、CCC,CGA、GTA。 Hlm−Arg−Pro−Gly−Arg−C1u−G
ly−Gly−Pro−Arg−Val−* 96】 TTT、GTT、GTC,CAT、AAC,TAT、G
GT、GCC,GCC,GGT、GCT。 Pha−Val−Val−T(In−Asn−Tyr−
Gly−Ata−Ala−Gly−Ala−*1021 GAT、GAA、GCT、GTT、TCT、TAC,G
TC,GAA、AGA、GCT、CTT。 Asp−C1u−Ala−Val−8or−Tyr−V
al−Glu−Arg−Ala−Leu−(その3) 900* 口TT、GAC,ATT、GTG、CGC,GAA、T
GC,GTT、GGCLeu−Asp−11e−Val
−Arg−Glu−Cys−Val−Gly960* CAA、TTA、GAG、AAC、ATC,CCC、G
GC,GTT 、GGCClu−Leu−Glu−Ly
s−11e−Pro−Gly−Val−Gly]020
* GGT、TAC,CAA、TCC,TCT 、TAC,
GGC,ATG 、GCTCly−Tyr−C1n−3
s r−8er−Tyr−Gly−Me t−Al p
cACT、CGT、CCA、AAC,CTT、TAfl
。 Thr−Arg−Pro−Agn−Leu−幸**−第
6図
Claims (6)
- (1)一般式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中Rは−OCOCH_3、−H、または−OHであ
る)で表わされる化合物またはその塩を脱アシル化して
一般式(II) ▲数式、化学式、表等があります▼(II) (式中Rは前記と同じ意味を有する)で表わされる化合
物またはその塩を生成させる7−アミノセファロスポラ
ン酸及びその誘導体の製造方法において、前記式( I
)で表わされる化合物に組換えDNA技術により大腸菌
に産生せしめたD−アミノ酸オキシダーゼ及び7β−(
4−カルボキシブタンアミド)セファロスポラン酸アシ
ラーゼを含む酵素混合物を過酸化水素の存在下または非
存在下に水性媒体中で作用させることを特徴とする7−
アミノセファロスポラン酸およびその誘導体の製造法。 - (2)該酵素混合物が、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝
子を含む組換え体DNAで形質転換された大腸菌の培養
物またはその処理物と7β−(4−カルボキシブタンア
ミド)セファロスポラン酸アシラーゼ遺伝子を含む組換
え体DNAで形質転換された大腸菌の培養物またはその
処理物との混合物であることを特徴とする特許請求の範
囲第(1)項に記載の製造法。 - (3)該酵素混合物が、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝
子を含む組換え体DNAおよび7β−(4−カルボキシ
ブタンアミド)セファロスポラン酸アシラーゼ遺伝子を
含む組換え体DNAで形質転換された単一の大腸菌の培
養物またはその処理物であることを特徴とする特許請求
の範囲第(1)記載の製造法。 - (4)該酵素混合物が、D−アミノ酸オキシダーゼ遺伝
子および7β−(4−カルボキシブタンアミド)セファ
ロスポラン酸アシラーゼ遺伝子を共に含む単一の組換え
体DNAで形質転換された単一の大腸菌の培養物または
その処理物であることを特徴とする特許請求の範囲第(
1)項に記載の製造法。 - (5)該酵素混合物がカタラーゼ産生能を欠損していな
い大腸菌が産生するD−アミノ酸オキシダーゼと7β−
(4−カルボキシブタンアミド)セファロスポラン酸ア
シラーゼを含む酵素混合物であり、該酵素混合物を一般
式( I )で表わされる化合物またはその塩に過酸化水
素の存在下に作用させることを特徴とする特許請求の範
囲第(1)乃至(4)項のいずれかに記載の製造法。 - (6)該酵素混合物がカタラーゼ産生能を欠損している
大腸菌が産生するD−アミノ酸オキシダーゼと7β−(
4−カルボキシブタンアミド)セファロスポラン酸アシ
ラーゼを含む酵素混合物であり、該酵素混合物を一般式
( I )で表わされる化合物またはその塩に過酸化水素
の非存在下に作用させることを特徴とする特許請求の範
囲第(1)乃至(4)項のいずれかに記載の製造法。
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---|---|---|---|
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JP61218057A JPH0829114B2 (ja) | 1986-09-18 | 1986-09-18 | 7−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法 |
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---|---|
JPS6374488A true JPS6374488A (ja) | 1988-04-04 |
JPH0829114B2 JPH0829114B2 (ja) | 1996-03-27 |
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-
1986
- 1986-09-18 JP JP61218057A patent/JPH0829114B2/ja not_active Expired - Fee Related
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JPH0829114B2 (ja) | 1996-03-27 |
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