JPS6354385A - 混合酸型重合性リン脂質誘導体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、混合酸型重合性リン脂質誘導体、さらに詳し
くは光重合可能なジエン基を官能基と１ノで有するホス
ファチジン酸型リン脂質銹導体及びその製造法に関する
。

（従来技術） リン脂質は、生体膜脂質の主体であり、このリドといい
、両親媒性物質の１種である。

このリン脂質を水中に懸濁後、超音波処理等を用いて分
子組織化を行うことにより、内殻水相を有する脂質２分
子膜からノ♂る閉鎖小室であるリポソームを形成する。

この際、リポソーム膜に荷電を与えることによりリポソ
ーム同志の凝集を防ぎ、又、多重層リポソームの場合に
は、その静電的反発力によりによりラメラ間の内殻水相
部分を広げ、１１人物質の保持８二を拡大することがで
きる。正電荷を与える物質とし′Ｃはステアリルアミン
が、負電荷を与える物質としては、ジセチルリン酸やホ
スファチジン酸等が通常用いられる。しかし、このＪ：
うに調製されたリポソームはその構造を疎水的な凝集力
のみで維持しているため、構造が不安定であるという問
題を抱えている。

この問題の解決手段として、リポソーム調製原料である
リン脂質に光重合性官能基を８人し、分子組織化した後
、光照射によりｍ金高分子化して、その構造を安定化さ
せる技術が注目されている。特に医用リポソーム、免疫
診断薬等への応用では生体適合性の良好な天然リン脂質
類似の構造及び組成を有する光重合性リン脂質話導体が
強く要望されている。

本発明者らは、この要望に答えるものとして、通常利用
されるジアシル−３−グリセロホスホリルコリン（以下
、レシチンと称す）型のリン脂質の一方のアルキル鎖の
みにジエン基を導入したリン脂質話導体（以下、モノジ
エンレシチンと称す）を製造し、該誘導体の生体適合性
が良好なことを報告した。しかし、このようなリン脂質
話導体から調製した重合性リポソームと共重合可能なホ
スファチジン酸型のリン脂質及びこの化合物を収率よく
製造する方法は知られていないゆ （発明が解決しようとする問題点） 本発明は以上の観点からなされたもので、その目的は天
然リン脂質類似の構造及び組成を有し、さらにモノジエ
ンレシチン等との組合せにより重合性リポソームに電荷
を与えることが可能な混合酸型重合性リン脂質誘導体及
びこの化合物を収率よく製造する方法を提供するもので
ある。

（問題点を解決するための手段） かかる目的の実現のために鋭意検討を行った結果、ホス
ファチジン酸型リン脂質の一方のアルキル鎖に光重合性
官能基としてジエン基を導入したリン脂質話導体が前述
の要望を満足する化合物であり、本化合物は、合成レシ
チンや天然レシチンから収率よ〈完全り体として製造で
きることを見出し、本発明を完成するに至９た。

以下、本発明の詳細な説明する。

即ち、本発明は下記一般式（Ｉ） ｌ０ＣＨ２ Ｒ２０ＣＨＯ（Ｉ） Ｉ （：Ｈ２Ｏ−Ｐ　−０１（ Ｈ で表わされる混合酸型重合性リン脂質誘導体及びその製
造法に関する。一般式（１）で表される化合物の製造法
はａ）レシチンをホスホリパーゼＡ、又はＡ２を用いて
加水分解することにより得られるモノアシル−Ｌ−３−
グリセロホスホリルコリンに、 ｂ　）　Ｒｏ　ＣＩｔ　−ＣＩ（ＣＩＩ　−ＣＩｆ　Ｃ
ＯＯＨ（但し、ＲｏはＣ６〜Ｃ１７のアルキル基）で表
される長鎖ジエンカルボン酸とＮ、Ｎ’−カルボニルジ
イミダゾールとから得られる１−アシルイミダゾールを
、Ｃ）イミダゾールナトリウム存在下で反応させ、ｄ）
次いで加水分解酵素を反応させる工程からなる。

出発物質であるモノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホリ
ルコリンには１．１−モノアシル体と２−モノアシル体
があり、いずれも本発明に適用可能である。

この１−モノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリ
ンは、通常レシチンを適当な溶媒、例えばクロロホルム
やエチルエーテルなど、中でｐｌ！約７の適当な緩衝液
、例えば０．２Ｍ　Ｉ−リス塩酸緩衝液（ｐｌ（７，４
）など、および賦活剤、例えば塩化カルシウム溶液の存
在下、蛇毒、例えばナジャ・ナジャ　（Ｎａｊａ　ｎａ
ｊａ）などの毒から得られるホスホリパーゼＡ２または
その類縁酵素を用いて、常温にて、アシル転移を起こさ
ぬよう注意深く加水分解を行うことにより得られる。

また、２−モノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコ
リンは、各種バクテリア、例えば工・シエリチア・コリ
（Ｅ、Ｃｏ１１）、　　ミコバクテリウム・フレイ（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｅｒｉ　）　、バチル
ス・スブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、から得ら
れるホスホリパーゼＡ１または類縁酵素を用いて、同様
に、レチシンを加水分解することにより得られる。

さらに、得られたモノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホ
リルコリンに水素添加処理を行い、アルキル鎖中の不飽
和結合をなくした飽和型の完全水添モノアシル−Ｌ−３
−グリセロホスホリルコリンの形にしても本発明に供す
ることができる。

一１１２式（１）におけるＲ１又はＲ２の脂肪酸残基は
、炭素数が１０〜２２個で飽和又は不飽和であれば特に
制限はないが、より生体適合性を高めるためには、飽和
の脂肪酸残基が好ましい。木すン脂質話導体の脂肪酸残
基は、レシチンの２木のアシル釦のうち、ホスホリパー
ゼＡＩ又はＡ２によって加水分解を受けなかフたアシル
基に相当する。

レシチンには天然レシチンと合成レシチンがあるが天然
レシチンとしては、例えば卵黄由来レシチン、大豆由来
レシチン等、合成レシチンとしては、例えばシミリスト
イルグリセロホスホリルコリン、ジパルミトイルグリセ
ロホスホリルコリン、ジステアロイルグリセロホスホリ
ルコリン等をあげることができる。

未発明に用いる長鎖ジエンカルボン酸はｎ　ｏ　ＣＩｔ
　−ＣＨＣ）Ｉ　−Ｃｏ　ＣＯＯＨ（ＲＯはＣ６〜Ｃ１
７のアルキル基） で表わされるα、β、γ、δ−不飽和カルボン酸である
。このようなジエンカルボン酸の例として、２，４−デ
カジエン酸、２．４−ウンデカジエン酸、２．４−ドデ
カジエン酸、２．４−ト’）デカジエン酸、２．４−テ
トラデカジエン酸、２．４−ペンタデカジエン酸、２．
４−へキサデカジエン酸、２．４−へブタデカジエン酸
、２．４−オクタデカジエン酸、２．４−ノナデカジエ
ン酸、２．４−エイコサジエン酸、２．４−ヘンエイコ
サジエン酸、および２．４−ドコサジエン酸等の全ての
光重合性を有する幾何異性体を挙げることができる。こ
のような長鎖ジエンカルボン酸は、例えば特開昭６０−
１３７３７号公報等の方法によって得ることができる。

一般式（１）のＲ１又はＲ２のジエン基を有するアシル
基：　ＲｏＣＨ”ＣＩＩＣＨ−ＣＨＣＯ（Ｒｏは前記に
同じ）は、長鎖エンカルボン酸のアシル基に相当する。

１−アシルイミダゾールはＮ、Ｎ’−カルボニルジイミ
ダゾールを無水クロロホルム中に懸濁させ、これに長鎖
ジエンカルボン酸を加え、窒素気流中、遮光下で室温に
て約１時間反応させることによって得られる。この化合
物は単口した後、又は単離することなく反応液のまま、
次の工程に供することがで与る。

以」二のように得られた１−アシルイミダゾール反応液
に、触媒であるイミダゾールナトリウムージメヂルスル
ホキシドｉ容液及び無水ピリジンと共に先に調製したモ
ノアシル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリンを加える
。反応は０℃ないし３０℃の温度で、通常は室温で数時
間攪拌することにより終了する。アシル化剤は、モノア
シル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリンに対し、過剰
量用いることが好ましく、さらに好ましくは１．２当二
〜１．５当二である。

反応終了後、反応液を塩酸−メタノールで中和し、減圧
濃縮する。ついでこの濃縮液をクロロポルム−メタノー
ルに溶解し、さらに水を入れた後、分液し、その下層を
さらに減圧濃縮する。得られた）層幅ン夜にクロロホル
ム−メタノール−水、続いてエタノールを加えて「アン
バーライトＭｉｌｌ−３型」樹脂カラムに通し、同溶媒
で洗い、その通導液および洗液を合せて減圧？５１縮す
る。この濃縮物を常法に従って例えばシリカゲルカラム
クロマトグラフ法にて処理精製後、再びクロロホルムに
溶解する。続いてこの加水分解酵素としてホスホリパー
ゼＤを含むｐＨ約７の緩衝液及び塩化カルシウム溶液を
加える。この溶液を室温にて十数時間攪拌後、塩酸を加
えて反応を停止する。反応混合物より目的物を４１殖す
るには、まず、反応液を遠心分離して上層を除去し、残
った下層に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥し、減圧？
層幅し、この濃縮液を五酸化リンを用いて室温で乾燥す
ればよい。

（実施例） 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものでない。

実施例１ １−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェ
ノシル）−Ｌ−３−グリセロホスファチジン酸の合成 （ａ）１−バルミトイル−Ｌ−３−グリセロホスホリル
コリンの調製 １．２−ジパルミトイル−Ｌ−３−グリセロホスボリル
コリン３ｇをクロロホルム６０嵯に溶解し、これに、ナ
ジャ・ナジャの毒から得られたホスホリパーゼＡ、　３
０Ｂを０．２Ｍ）−リス塩酸１」重液（ｐＨ７，４）　
６−に溶解した液およびＩＭＩ！Ｘ化カルシウム溶液０
．１　ｍ（ｌを加えて室温にて約２０時間攪拌した。

この反応液にエタノールを加えて減圧濃縮乾固し、乾固
物を少量のクロロホルムに溶かし、同溶奴で活性化した
シリカゲル（４０ｇ）カラムにかけ、クロロホルム６０
０　ｍｌ、クロロホルム−メタノール−水（６５：２５
：４）　１．５　ｕで順次溶出された。得られた溶出分
画を薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣと略す）を用
いて目的画分を集め、減圧濃縮後、五酸化リンで、約２
０時間減圧乾燥し、１−バルミトイル−Ｌ−３−グリセ
ロホスホリルコリン１．８ｇ（収率：　８７．８％）を
得た。

（ｂ）１−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オフタデ
カシェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリンの
調製 ２Ｅ、４Ｅ−才クタデカシエン酸３．５ｇ（１２，５ミ
リモル）とＮ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール２．４
ｇ（１５ミリモル）乾燥クロロホルム５０ｍＮを入れて
窒素気流中、遮光下、室温にて約１時間反応させた。つ
いで、この反応液に（ａ）の方法で得た１−バルミトイ
ル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリン５．１ｇ　（１
０ミリモル）を入れ、さらに水冷下で触媒として、水素
化ナトリウム５００　ｍｇ　（５０％）とイミダゾール
（以下１ｍＨと略す）１ｇとを乾燥ジメチルスルホキシ
ド（以下ＤＭＳＯと略す）２０ＩＩＩＮ中、約１時間反
応させて調製したイミダゾールナトリウム（以下ｌｍＮ
ａと略す）　−ＤＭＳＯＩ液２０＋Ｊおよび無水ピリジ
ンｌｄを加えた後、室温にて２時間攪拌した。

反応終了後、反応液をＩＮ塩酸−メタノールで中和し、
減圧濃縮する。得られた？Ｑ縮物をクロロホルム−メタ
ノール（２：１）１ｉ００　ｍｌに溶解し、ついで水１
２０　ｍＮを入れて分液ロートにて分液し、下層を分取
して減圧濃縮する。

得られた残渣にクロロホルム−メタノール−水（６５：
２５：４）　２００　ｍｌ、エタノール１０００＋ｎＱ
を加えて溶解し、次いで「アンバーライトＭＢ−３型Ｊ
　８０ｍＭを加えて約２時間攪拌した後、樹脂をｒ別し
、前記溶媒系で洗浄し、得られたｆ液と洗液を合せて減
圧濃縮した。

この濃縮液を適量の９５％エタノールに溶解し、あらか
じめ９５％エタノールで活性化したアルミナ　（４０ｇ
）カラムにかけ、同溶媒２４０　ｍｌで溶出し、この溶
出液を減圧濃縮した。

この濃縮物を少量のクロロホルムに溶解し、あらかじめ
同溶媒で活性化したシリカゲル（ｔ５ｏｇ）カラムにか
け、クロロホルム１文、クロロホルム−メタノール−水
　（６５：２５：２）４．０１で順次溶出させた。得ら
れた溶出画分からＴＬＣによって目的画分を集め、減圧
濃縮乾燥して、１−バルミトイル−２−（２Ｅ。

４Ｅ−オフタデカシェノイル）−Ｌ−３−グリセロホス
ホリルコリン４．７ｇ　（収率：　６０．６％）を得た
。

本物質はＴＬＣ分析（シリカゲルプレート。

展開溶媒：クロロホルム−メタノール−水（６５：２５
：４）　）を行ったところ、紫外線およびリンモリブデ
ン酸による検出で、単一のスポットを与え、そのＲｆ値
はジパルミトイル−し−α−グリセロホスホリルコリン
（シグマ）とほぼ一致した。なお、旋光度は次のようで
あった。

〔α）２：　　＝　＋　６．４９　　（ＣＯＯ交。、　
Ｃ−１）又、本物質の元素分析値、核磁気共鳴 （ＮＭＲ）スペクトル、赤外線（ＩＲ）吸収スペクトル
及び紫外線（ＵＶ）吸収スペクトルの測定結果を示した
。

元素分析値（Ｃ４Ｊａ。０ａＮＰ−Ｈ２０分子量７７８
．１として） 計算値（％）：　Ｃ；６５．００．　Ｈ，１０，６５，
Ｎ；１．８０５実測値（駒：　Ｃ，６４，６、Ｈ，１０
，７、Ｎ、２．２■２ ０　　　■ ６：ｅ：＝− α　−ロ　Ｑ■ ム　ｎ〜 一一＝− へ　　　　　　　　　　　　　　− ■ｌ Ｏ■ 口ｌ＋ｊ＋−一〇 −Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＣＪへ ＦＴ−１１スヘクｌ−ル（ｃＩＴｌ−’）（Ｋ［ｌｒデ
ィスク） １７１６（ν。。） １６４５　、１６２４　（υｃ＝ｃ） １２４６　（νＰヨ。） １１４４　（シｐ−ｏ−ｃ） ＋０９０　（υ、。ｅ） １０５７　（δｐ−ｏ−ｃ） ９９７（δＣ−Ｈ） ＵＶスペクトル（エタノール中）： λｍａＸ　＝２６２．５　（ｎｍ） ｅ　＝　２４７００　（Ｒ・ｍｏｌ−’−ｃｍ−’）（
Ｃ）１−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカ
ジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスホファチジン酸の
合成 （ｂｌ　で得られた１−バルミトイル−２−（２巳、４
Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−グリセロホスホリル
コリン０．５ｇをクロロホルム５０＋Ｊに１容解し、ス
トレブトマイセスクロモフセイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｕｉｓ）から得られたホス
ホリパーゼＤ　（５４，ＯＬｌｎｉｔｓ／ｍ）；）　　
１．５Ｂ　Ｏ，２ｉ、！をトリス塩酸＃３　ａｘ　ン＆
　（ｐＨ７，４）１．５ｍＲに２容角？した？夜および
ＩＭ塩化カルシウム水溶液ｏ、ｉ載を加えて室温にて約
１６時間攪拌した。

この反応液にＩＮ塩酸（約０．５　ｍりを加えて反応を
停止し、遠心分離（２５００ｒｐｍ　、　１０分間）に
かけ、上層を除去した。

得られた下層に少量の無水硫酸ナトリウムを加えて乾煙
し、減圧濃縮後、五酸化リンを用いて室温で約２０時間
減圧乾燥し、１−バルミトイル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オ
クタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスファチジ
ン酸０．４２ｇ　　（収率９５％）を得た（以下モノジ
エンホスファチジン酸と称す）。

本物質は７１Ｃ分析（シリカゲルプレート、展開溶媒：
クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４）を行
ったところ、紫外線、ヨウ素およびリンモリブデン酸に
よる検出で単一のスポットを与え、そのＩｌｆ値はジパ
ルミトイル−Ｌ−α−ホスファチジン酸（シグマ）とほ
ぼ一致した。なお、旋光度は次のようであった。

（α）、＝　＋７．６１ （？ｌＯ，Ｏｃｍ、Ｃ−１．０２４ｇ／ｄｉ　ｉｎ　Ｃ
ＩＩＣＬ）又、本物質の元素分析値、核磁気共鳴 （ＮＭＲ）スペクトル、赤外線ＣＩＩり吸収スペクトル
及び紫外線（ＵＶ）吸収スペクトルを測定した結果を示
した。

元素分析値 （Ｃ３７）１６９０♂Ｐ−Ｒ２０分析１６９０．９とし
て）計算値情）：　（：；６４．３２　Ｈ；１０．０６
．　Ｎ；０．００実測値（ネ）二（：；６４．３６　）
１．１０．０５　Ｎ、＜０．３”Ｃ−ＮＭＩＩスペクト
ル　δ値（ＣＤＣｆｆｉａ、　ｌ）Ｉ）ｍ）ＣＨ３ＣＨ
２ＣＨ２（ＣＨ２）　ｔｏＣＩＩ２ＣｔｂＣ０２Ｃｔ１
２Ｃ１１＊ＣＩｈＣＨ２（Ｃｔｌ２）ａｃＨ２ｃＨ２ｃ
ｌＩ　”　Ｃｔｌ（：Ｈ−ＣＨＣＯ□ＣＯＯ１°２゛３
°　４゛５°６゛７°　８°９′１０°１１°１１Ｃ１
（２０ＰＯＨ ０ｌ Ｈ 炭素番号　δ　（ｐｐｍ） １・１’　　　　　１４．５ ２．２°　　　　２３．０ ５’　　　　　　　　　　２５．２ ４°、　４．５　　　２９．Ｑ〜３０．１３．３°　　
　　３２．２ ６°　　　　　　　　　３３．４ ６　　　　　　　　　３４．４ ８、１０　　　６２．７．８４．６ ９　　　　　　　　　７０．３ ９’　　　　　　　　　１１８．２ ７’　　　　　　　　　１２８．１ ８°、１０’　　　１４５．５，１４６．４１１’　　
　　　　　　１６６．５ ７　　　　　　　　１７３．５ ’ＩＩ−ＮＭＲスペクトル　　δ値（ＣＤＣＲ３，δ（
ｌｌｐｍ）　、ＴＭＳ）（：ｌ＋３　（Ｃ）ｌｚ）　１
２Ｇ＋１□に）１２ＣＯ２ＣＨ２Ｃｔｌ３　（Ｃｔｌ２
）　＋ｏＣｔ１２ＣＩＩｚＣＨ−ＣＮＣ）ｌ　−Ｃ１１
Ｃ０２Ｃ）ｌ　　ｆ）１’２’３’４°５゛６°７°　
８°　１１Ｃ８２０ＰＯＨ Ｈ ＦＴ−Ｉｎスペクトル（ｃｍ−’） （ＮａＣｌディスク） ２８５２．２９２０．２９５４　（νＣ−Ｈ）１７２０
．１７３８　（シｃ−ｏ） １６４３　（υｃ＊ｃ） １４５６．１４６６　（δ、−０） １２６８　　（シル−ｏ） １０６４　　（シル−ｏ　■） ｕｖスペクトル（クロロホルム中）： λ□、　＝　２６２．５　（ｎｍ） ε−２４１３００（又・…０１−１・Ｃｌ１ｌ−１）実
ｔＪ’ｌｈ例２ 卵黄由来の１−アシル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカ
ジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスファチジン酸の合
成 卵黄由来のリン脂質から実施例１−（ａ）　、　（ｂ）
と同様な方法にて調製した１−アシル−２−（２Ｅ、４
Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスホ
リルコリン０．５８から、実施例１と同様にして、１−
アシル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−
Ｌ−３−グリセロホスファチジン酸０．３Ｅ１ｇ　　（
収率８８％）を得た（以下卵黄由来のモノジエンホスフ
ァチジン酸と称す）、。

本物質のＴＬＣ分析結果は、実施例１の場合と同様に１
−スポットを示し、そのＲｆ値は、卵黄ホスファチジン
酸のそれと一致した。

又、旋光度は次のようであった。

（α）ｏ−＋７．８２ （９，−１０，０ｃｍ、　Ｃ−１，０７４ｇ／ｄｕ　ｉ
ｎ　ＣＨ（４ａ）さらに、次に示すような実施例１と同
様の分析結果から、本物質が純物質であることを確認し
た。

１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル　δ値　（（：ＤＣｕ：＋、
　［１ｍ）１４．２．２２．８．２５．０．２８．９〜
３０．７．３２．１．３３．３゜３４．２．６１．９・
６４．８．７０．７，１１８．７．１２８．４．１４５
．６・１４６．４　、１６６．９　、１７３．９Ｊｌ−
ＮＭＩ’ｌスペクトル　　δ値　（ＣＤＩ４ｈ、Ｉ）ｌ
）ｍ、ＴＭＳ）０．８８゜１．２５．　１．４０．１．
５５．２．１５．２．２７．４．１２゜４．２５．４．
３７．５．３０．５．７７、８．１５．７．２ＦＴ−Ｉ
ｎスペクトル（ｃ＋ｎ−Ｊ （ＮａｃＮディスク）　　　２８５０，２９２０．２９
５８（シｃ−Ｈ）１７３６．１７１８（ν、。） １８４３　　（ｖｃ−ｃ） １４６７　　（δ。−０） １２５３　　（νＰＭＯ） １０６６　　（シｐ−ｏＪ Ｕｖスペクトル（クロロホルム）二 λｍａｘ　＝　２８２．２　（ｎｍ） ε＝　２３７００　（トｍｏｌ−’−ｃｍ−’）実施例
３ 大豆由来（水添）の１−アシル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オ
フデカジェノイル）−Ｌ−３−グリセロホスファチジン
酸の合成 実施例１−（ａ）の１．２−ジパルミトイル−Ｌ−３−
グリセロホスホリルコリンを用いて１−アシル−Ｌ−３
−グリセロホスボリルコリンを調製し、これに水添処理
を施した後、実施例１−（ｂ）と同一条件下で反応させ
ることによって得られた水素添加処理を行なった大豆由
来のアシル基をもつ１−アシル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オ
フデカジェノイル）−り一３−グリセロホスホリルコリ
ン０．５ｇから、実施例１及び２と同様にして、１−ア
シル−２−（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ
−３−グリセロホスファチジン酸０．３７ｇ（収率８３
％）を得た（以下、大豆由来（水添）のモノジエンホス
ファチジン酸と称す）。

本物質のＴＬＣ分析結果は、実施例１及び２の場合と同
様に、単一スポットを示し、そのＲｆ値は水添大豆ホス
ファチジン酸のそれと一致した。

又、旋光度は次のようになった。

〔α〕。＝＋７．００ （？ｌＯ，Ｏｃｍ、　Ｃ＝１．０４２ｇ／ｄｕ　ｉｎ　
ＣＩＩＣＵ＋＋）さらに、次に示すような実施例１及び
２と同様の分析結果から本物質が純物質であることを確
認した。

ｌ３Ｃ−ＮＭＲスペクトル　δ値　ＣＣＤＣｌ３．　Ｉ
）ｐｍ）１４．２．　２２．８．　２５．０．　２９．
０〜３０．１．　３２．０．　３３．２゜３４．２．　
８５．５　・　６４．６．　７０．１．　１１８．４．
　１２８．４．　１４５．８・１４６’、６　　、　１
６８．８　　、　１７３．９’＋１−ＮＭＲスペクトル
　δ値　（ＣＤＣ４３，Ｉ）Ｉ）ｍ、　ＴＭＳ）０．８
８．　１．２６．　１．４１．　１．５７．　２．１４
．　２．２９．　４．１２゜４．２５．　４．３１．　
５．３１．　５．７７、　　δ、１５．　７．２８ＦＴ
−Ｉｎスペクトル（ｃｌＪ （ＮａＣｌディスク） ２８５２．２９２４．２９５３　　（１／　Ｃ−Ｈ）１
７１６．１７３２　（νｃｏｏ） １６４３　　（νＣＩＣ） １４６５　　（δＣ−Ｈ） １２Ｂ’ｌ　　（シル−ｏ） １０６６　　（Ｖｐ−ｏ　ｅ） ｕｖスペクトル（クロロホルム中）： λｔｈａｗ　＝　２６２　、１　（ｎｍ）ε＝　２２０
００　（１・ｍｏｌ−’−ｃｍ−’）実施例４ 実施例１，２及び３で得られたリン脂質話導体のそれぞ
れについて、モル比で１０％となるように合成レシチン
又は天然レシチンから得た１−アシル−２−（２Ｅ、４
Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ；−３−グリセロホス
ホリルコリン（以下、本化合物をモノジエンレシチと称
す）と混合し、全脂質濃度が１０ｍＭとなるように、常
法に従って多重層リポソーム水溶液を調製した。さらに
、この溶液から超音波法により、小さな１枚膜すデソー
ムを調製した。以下、これを負荷電のモノメリックリポ
ソームと呼ぶ。

又、このリポソーム溶液に高圧水銀ランプ（理工科学産
業■製）を用いて窒素雰囲気下、紫外線照射を行い、紫
外部の特性吸収スペクトルの経時変化を測定したところ
、λ□８が２６２　（ｎｍ）付近の吸収ピークが減少し
ていき、約１時間後には、完全に消失し、逆に１９３　
ｎｍ付近の吸収が増加した。このことから、重合が完了
したことを確認した（以下、これを負荷電のポリメリッ
クリポソームと呼ぶ。）。

酢酸ウラニルを用いたネガティブ染色法による透過型電
顕観察では、モノメリックリポソームとポリメリックリ
ポソームにおける形態変化は、はとんどないことが認め
られた。

この事はゲル？ＦＡパターンの比較によっても確認され
た。

さらに、室温状態に招ける濁度変化も、モノメリックに
比べ、ポリメリックリポソームの方が、はるかに小さく
保存安定性が優れていることがわかった。

実施例５ 実施例２で得た卵黄由来のモノジエンホスファチジン酸
とモノジエンレシチンとの混合物（モル比１　：　１０
）から成るモノメリックリポソームおよびポリメリック
リポソームと該モノジエンホスファチジン酸と１．２−
（２Ｅ、４Ｅ−オクタデカジェノイル）−Ｌ−３−グリ
セロホスホリルコリン（以下、本化合物をジジエンレシ
チンと称す）との混合物（モル比１：１０）から成る同
様のリポソームに関して、示差走差熱量計（埋研科学■
’ｊりによる測定を行った。その結果、ジジエンレシチ
ンとの組み合せより成るリポソームにおいては、モノメ
リックリポソームにおいて観察された熱量吸収ピーク（
２２℃付近）がポリメリックリポソームになるとほぼ完
全に消失した。これに対し、モノジエンレシチンと９組
合せより成るリポソームにおいては、ポリメリックリポ
ソームにおいても、モノメリックリポソームに存在した
熱量吸収ピーク（２９℃付近）が完全に消失せず、残存
するこ　′とが確認された。

実施例６ 実施例１．２及び３から得られたリン脂質銹導体より調
製したリポソームに関して、グルコースと５（６）−カ
ルボキシフルオレッセインを封入マーカーとして用い、
マーカー保持能力、放出挙動等を検討した。その結果、
それぞれの脂質について、モノメリックリボソームに比
へ、ポリメリックリポソームの方が、放出速度か小さく
、保持能力が向した。

又、熱、有機溶媒（例えばエタノール）および、界面活
ｉ生剤（例えば和光純薬工業■社製、商品名ｒ　Ｔｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ　−１００Ｊやドデシル硫酸ナトリウム）に
対する安定性が向上した。

さらに、ジシェンレシヂンとの組み合わせより成るリポ
ソームにおいてはほとんど観察されなかった室温におけ
るモノメリックリポソームのマーカー保持能力が、モノ
ジエンレシチンとの組合せより成るモノメリックリポソ
ームにおいて認められた。

実施例７ 実施例１，２及び３で得られたリン脂質誘導体のそれぞ
わをモル比が５〜２０％となるようにモノジエンレシチ
ンと混合し、全脂質濃度がｌ　ＯｍＭで、常法に従って
、多ｍ層すポソーム水ｍ　液を調製した。さらに、この
溶液から超音波照射法により小さな１枚膜リポソームを
調製した。このリポソームの表面荷電を電導風滴定で測
定したところ、上記ホスファチジン酸型リン脂質誘導体
のモノジエンレシチンに対するモル比か増加する程、リ
ポソームの表面電荷」か、市、線的に増加することがわ
かった。

（発明の効果） 本発明によりば、天然レシヂーン又は合成ｌ／レシチン
ら調製容易なりゾレシヂンと長鎖ジエンカルボン酸から
モノジエンレシチンを合成し、ついて酵素的加水分解を
行うことにより、目的とする混合酸型重合性リン脂質誘
導体を高純度、高収率で完全り体として製造することが
できる。

本発明の方法によって製造されるリン脂質誘導体には、
一方のアルキル鎖のみにＲ８Ｃ１１−ＣＩ４　ＣＨ−Ｃ
ＨＣｏ　（Ｒ，は前記と同し）で示されるアシル基が導
入されているため、従来の合成リン脂質誘導体と比べて
リポソーム化した際に種々の特長を有する。即ち、 ｌ）　モノメリックリポソーム調製後、紫外線照射によ
り、温和な条件で速やかに重合し、重合前後において形
、聾的変化は殆どない。

２）　モノメリックリポソームにおいても、室温で封入
物質の保持能力を有する。

３）重合により、封入物質の保持能力や熱・有機溶媒・
界面活性剤等に対する安定性が向上し、又、潤度変化も
小さくなる。

４）　ポリメリックリポソームとなっても熱ユ吸収ピー
クは完全に消失しないため、柔軟な膜の形成が可能とな
る。

５）　モノジエンレシチンとの組合せより成るモノメリ
ックリポソームにおいて、本発明のリン脂質誘導体の含
有率の増加に伴ってモノメリックリポソーム表面の電荷
が増加する。

従って生体適合性や、生体膜との種々の親和性を配慮し
なければならない医用リポソーム等の応用分野に適した
光重合性リン脂質誘導体であり、その他、バイオセンサ
ー、マイクロカプセル、さらには生医学用材料、化粧品
への応用等、二分子膜ベシクルの形態に限らず、単分子
層膜、積層（累積）膜の形、態での利用を含めた生化学
、医学、薬学、工学など幅広い分野において利用が予想
され、その工業的価値は大きい。

Ｕｌ 新　　部　　興　　治′　・′１ １１１−工 手続補正書 昭和ＡＩ年７ρ月ｌケ日 昭Ｊ、／　手持ｒ＋　ｕ　ｍ　／ｃ／９１’？９号氏　
名（名称）東洋曹達工業株式会社 ４、代　　理　　人　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　（Ａ＋！！ｌ＾±）住　所　　東京都千代ｍ区丸
の内２丁目６番２号丸の内へ重洲ビル３３Ｇ５、補正命
令の日付　　らろ５ ８、補正の内容　　別紙のとおり 補　　　　正　　　　書 本願明細書中下記事項を補正いたしオす。

記 １、第１６頁下から７行目、第２３頁下から２行目、第
２８頁８行目、第３０頁下から６行目に「旋光度」とあ
るをそれぞれ 「旋光度」と訂正する。

２第３４頁２行目に 「示差走差熱量計Ｊとあるを 「示差走査熱量計」と訂正する。

３、第３６頁１０行目Ｋ 「ついて」とあるな 「ついで」と訂正する。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１とＲ＿２とは互いに異なり、その一方は
   飽和又は不飽和のＣ＿１＿０〜Ｃ＿２＿２の脂肪酸残基
   を示し、他方はＲ＿０ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＯ（Ｒ＿
   ０はＣ＿５〜Ｃ＿１＿７のアルキル基）のアシル基を示
   す。） で表わされる混合酸型重合性リン脂質誘導 体。
2. （２）該脂肪酸残基が卵黄リン脂質又は大豆リン脂質由
   来のアシル基である特許請求の範囲第１項記載の混合酸
   型重合性リン脂質誘導体。
3. （３）ａ）レシチンをホスホリパーゼＡ＿１又はＡ＿２
   を用いて加水分解することにより得られるモノ アシル−Ｌ−３−グリセロホスホリルコリ ンに、 ｂ）Ｒ＿０ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ（但し、Ｒ＿
   ０はＣ＿５〜Ｃ＿１＿７のアルキル基）で表される長鎖
   ジエンカルボン酸とＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾー
   ルとから得られる１−アシルイミダ ゾールを、ｃ）イミダゾールナトリウム存在下で反応さ
   せ、ｄ）次いで加水分解酵素を反応させる工程 からなることを特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１とＲ＿２とは互いに異なり、その一方は
   飽和又は不飽和のＣ＿１＿０〜Ｃ＿２＿２の脂肪酸残基
   を示し、他方はＲ＿０ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＯ（Ｒ＿
   ０は前記に同じ）のアシル基を示す。） で表される混合酸型重合性リン脂質誘導体の製造法。
4. （４）該脂肪酸残基が、卵黄リン脂質又は大豆リン脂質
   由来のアシル基である特許請求の範囲第３項記載の製造
   法。
5. （５）該加水分解酵素がホスホリパーゼＤである特許請
   求の範囲第３項又は第４項記載の製造法。