JPS6336792A - 酵素によるリン脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素によるリン脂質の製造方法に関し、特に
、塩基構造が変換されたリン脂質を製造する方法に関す
る。

（従来の技術） リン脂質は、単に乳化剤に用い得るのみならずリポソー
ムの基材として薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への
応用が近年注目されており、また、それ自体生理活性・
薬理作用を持つものとして、医学・薬学・工学的分野の
様々な用途が考えられている。このような多様な要求に
対応するために、各々の用途に応じた構造を有するリン
脂質を効率的に製造する方法を開発することは、産業上
非常に意義あることである。

酵素によるリン脂質の製造方法として、リン脂質にホス
ホリパーゼＤを任意の受容体の存在下に作用させ、ホス
ファチジル基転移反応を利用して目的とする塩基を持つ
リン脂質を製造する技術は公知である（Ｓ、Ｆ、Ｙａｎ
ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２４２、（３）　４７７〜４８４　（１９６７））　　
：　　（Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、１０２．２０５〜２１０　（
１９６７）　）。

ホスホリパーゼＤによるホスファチジル基転移反応を利
用してリン脂質の塩基部分を交換しようとする場合、一
般に水相と有機溶媒相との二相系が用いられる。すなわ
ち、主として水溶性である酵素、受容体、ｐＨ緩衝液、
無機塩等を含む水溶液と、主として親油性である原料リ
ン脂質を含む有機溶媒相とを攪拌・混合する反応系であ
る。前出の技術をはじめ、その後の研究（Ｋ、Ｂｒｕｚ
ｉｋ　ａｎｄＭ、Ｔｓａｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　２３．　　（８）　１６５６−１６６１（１９８４
）など〕においても広く用いられている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、従来用いられていたこのような反応系は、水溶
性成分の溶媒としての多量の水の存在が原因となり、ホ
スホリパーゼＤが本質的に加水分解活性を持っているた
めに、副反応として加水分解が起こり、ホスファチジン
酸（以下ＰＡと略す）を生成するという欠点を有してい
る。

加水分解によるＰＡの生成は、反応後の目的リン脂質の
分離精製を困難にするばかりでなく、加水分解反応によ
っても原料リン脂質が消費されるため、糖や二級アルコ
ール等の反応性の低い受容体に対してホスファチジル基
を転移させようとする場合、その反応速度が加水分解の
反応速度に対して極端に低いために事実上目的生成物を
得ることができなかった。

このような問題点は、ホスホリパーゼＤ自体が本来加水
分解酵素である以上、水が存在する限り不可避である。

そこで、本発明者らは、反応系中の水分含量を酵素が失
活しない範囲で極限まで減少させることによりこの問題
を解決すべく、種々検討の結果、従来二相系の水相とし
て反応系に添加していた成分ヲ、逆ミセル（Ｗｈ型マイ
クロエマルション）中に封入して添加する新規な反応系
を考案し、本発明に至ったものである。

本明細書において、逆ミセルとは、低極性溶媒中で両親
媒性分子が親油性基を外側に、親水性基を内側に向けて
極ｍｌの水相を中心として会合した状態をいう。

（問題点を解決するための手段） 本発明は原料リン脂質を溶解した有機溶媒中に、水酸基
を持つ受容体およびホスホリパーゼＤを含む水相を逆ミ
セル中に封入した形態で添加して反応を行うことを特徴
とする。

本発明において用いられる原料リン脂質としては、ホス
ホリパーゼＤの基質となり得るものであれば、天然から
抽出したもの、または抽出後精製したもの、あるいは合
成したものを問わず使用できる。また、市販のものある
いは公知の方法で調製したものを使用しても差し支えな
い。

例として脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチ
ジルコリン（以下ＰＣと略す）、ホスファチジルエタノ
ールアミン（以下ＰＥと略す）、ホスファチジルセリン
（以下ＰＳと略す）、ホスファチジルグリセロール（以
下ＰＣと略す）等またはそれらの混合物等があげられる
。本発明の効果を最大に発揮するためには、原料リン脂
質として精製したものないしは組成の単純なものを用い
た方が反応生成物の精製の面で都合が良い。また、原料
コストと入手の容易さ、酵素に対する反応性の面から特
にＰＣ，、ＰＥまたはＰＳが工業的に効果が高く好まし
い。

逆ミセルは界面活性剤により形成することが好ましい。

原料リン脂質の大部分が、炭素鎖長１２以上のアシル基
二本を有するＰＣ，ＰＥ、ＰＣまたはＰＳまたはこれら
の混合物である場合、原料リン脂質自身が逆ミセルを形
成するための界面活性剤としての作用をする。しかし、
原料リン脂質が炭素鎖長１０以下のアシル基二本を有す
るＰＣ，ＰＥ５ＰＳ、ＰＣまたはリゾＰＣ，リゾＰＥ、
リゾｐｓ、リゾＰＧの場合のように、原料リン脂質自体
では逆ミセルを形成し難い場合には、下記の条件を満た
す界面活性剤を別に添加することが好ましい。

（ａ）反応溶媒中に臨界ミセル濃度以上の濃度で溶解し
得る。

（ｂ）逆ミセルを形成し得る。

（ｃ）酵素活性に決定的な損失を与えない。

（ｄ）アルコール残基を持たないことが望ましい。

例として、ラウリル硫酸ナトリウム、ジ（２−エチルヘ
キシル）スルホコハク酸ナトリウム、ジｎ−オクチルス
ルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルフ
ェニルエーテル等があげられる。これら界面活性剤の添
加量は、原料リン脂質１モルに対して０．５〜５モルで
、好ましくは１〜３モルである。

反応溶媒としては、下記の条件を満たすものであれば使
用できる。

（ａ）原料リン脂質を臨界ミセル濃度以上の濃度で溶解
し得る。

（ｂ）水をほとんど混和あるいは溶解しない。

（ｃ）酵素活性に決定的な損失を与えない。

すなわち、分子内に二重結合またはエーテル結合を有し
ていても構わない、アルキル基等の官能基を有していて
も構わない、炭素数５〜１０の直鎖状または分岐鎖状ま
たは環状の炭化水素化合物もしくは炭素数１〜２のハロ
ゲン化炭化水素化合物あるいはそれらの混合物であり、
例としてｎ−ヘキサン、イソオクタン、ジエチルエーテ
ル、ジイソプロピルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼ
ン、キシレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエ
タンおよびこれらのうち二種以上の混合系があげられる
。アルコール構造を持つ化合物は、ホスファチジル基転
移反応の受容体となるため、基質として用いる以外に添
加することはあまり好ましくない。

ホスホリパーゼＤとしては、ホスファチジル基転移活性
を有するものであれば、市販のものあるいは公知の方法
で調製したものを問わず使用できる。例として、ベーリ
ンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ　Ｇｍｂｔ＋）製のキャベツ由来のホスホリ
パーゼＤ、東洋醸造（１菊製の微生物由来のホスホリパ
ーゼＤ　（ＰＬＤＰ）　、公知の方法〔−例としてケー
ラとサストリイ（Ｍ、Ｋａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｐ、Ｓ。

Ｓａｓ　ｔｒｙ）の方法、”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ｊ　、　Ｍ　。

Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ、　　ｅｄ、）、　　ｖｏｌ、１
４＋　　ｐｐ１９７−２０３゜八ｃｈａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６９）　）により
抽出し精製または部分精製した酵素標品、または抽出し
た粗酵素があげられる。

受容体としては、コリン、メタノール、エタノール、エ
タノールアミン、セリン、グリセロール、グルコース等
の従来ホスファチジル基転移反応の受容体として知られ
ている化合物のみならず、１−アミノ−２−プロパノー
ル、１−オルソメチルグルコシド、トレハロースをはじ
めとする従来ホスファチジル基転移反応の受容体とはな
らないとされていた糖類を含む一級または二級アルコー
ル構造を持つ化合物をも用いることができる。

酵素、受容体等を逆ミセル中に封入するには、原料リン
脂質を臨界ミセル濃度以上に溶かした有ｎ溶媒中に、酵
素、受容体等の溶液を滴下し、ただちに振盪攪拌または
超音波処理するなどの公知の方法を用いることができる
。

逆ミセルを形成させると同時に、ホスファチジル基転移
反応時のＰＡの副生を抑えるためには、反応系中の水分
含量を原料リン脂質または界面活性剤１モルに対して６
〜１５モルにする必要があり、好ましくは、８〜１２モ
ルで最も良好な結果を得ることができる。

反応温度は用いる酵素の至適温度であればよく、通常３
０〜４０°Ｃの範囲である。好ましくは、逆ミセルを形
成させてから酵素反応終了に至るまで一定に保つことに
より逆ミセルの安定性が向上する。

ただし、用いる溶媒が低沸点のものである場合等はこの
限りではない。

反応時間は０．５〜３６時間で、好ましくは４〜２．１
時間である。

このようにして製造した任意の塩基を持つ目的リン脂質
は溶剤分画、ケイ酸またはシリカゲルクロマトグラフィ
ー、アルミナクロマトグラフィー、ＤＩＥＡＥ−セルロ
ースクロマトグラフィー等の公知の手段を適宜用いるこ
とにより、容易に精製することができる。

また、ｐＡの生成が抑制されているため、未反応基質の
回収も容易に行うことができる。

（発明の効果） 本発明の反応系を用いることにより、従来の反応系で見
られたようなＰＡの生成は抑制され、反応後の目的リン
脂質の分＾１ｔ↑１１製が容易になった。

また、従来の反応系では殆どあるいは全く得ることので
きなかった目的リン脂質をも製造することが可能となっ
た。

（実施例） 以下、参考例、実施例、および比較例に基づいて本発明
を具体的に説明する。

なお、リン脂質の組成分析、純度検定は薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）で行った。ＴＬＣ板（メルク社製Ｎ
１１５７２１）に脂質試料２０〜１００μｇを直径３〜
５ｍｍにスポットし、クロロホルム−メタノール−水（
１２０ニア０：５）またはクロロホルム−アセトン−酢
酸−メタノール−水（５０：２０：１５：１０：５）で
展開した。検出にはジットマー試薬、５０％硫酸、ニン
ヒドリン試薬またはアンスロン試薬を目的に応じて使用
した。定量的な測定にはジットマー試薬で発色したもの
を高速薄層クロマトスキャナー（島原製作所製Ｃ５−９
２０型）で測定した。

参考例１ 大豆ＰＣおよびＰＥをパルダン（Ｖｏｎ　Ｈ。

Ｐａｒｄｕｎ）の方法（Ｆｅｔｔｅ　５ｅｉｆｅｎ　Ａ
ｎｓｔｒｉｃｈｍｉｔｔｅ皿、　（２）　５５−６２　
（１９８４））により分離、分画した。

市販脱脂大豆レシチン粉末（ＰＣ２４％、ＰＥ２１％、
ホスファチジルイノシトール１４％、ＰＡ８％）２０ｇ
をイソプロパノ−ルーメタノール−水（５０：４５：５
）　１００ｍｊに分散し、４０゛Ｃで加熱撹拌し溶解し
た。攪拌しながら２０℃まで冷却し、２０℃に１時間保
った。不溶物を２０℃に保ったまま遠心分離またはガラ
スフィルターで減圧濾過した。集めた上清を減圧下で乾
固し、ＰＣおよびＰ　Ｅ　濃縮物（ＰＣ６８％、ＰＥ１
７％、ＰＡ７％、ＰＳは含まない）９．７ｇを得た。

参考例２ 牛脳からリーズ（Ｍ、Ｌｅｅｓ）の方法〔“Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ｓ、Ｐ、Ｃｏｌｏ
ｗｉｃｋ　ａｎｄ　Ｎ、０．Ｋａｐｌａｎ　ｅｄ、）。

ｖｏｌ、３．　　ｐｐ３２８．　　八ｃｈａｄｅｍｉｃ
　　Ｐｒｅｓｓ＋　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９５７）
〕により粗セファリンを抽出し、ＤＥＡＥ−セルロース
カラムクロマトグラフィーで精製した。

近在の屠殺場で入手した新鮮な牛脳の脳膜および血管を
取り除いたもの３００ｇを１．２　ｊｌ！のアセトン中
でホモジナイズし、抽出した。濾過残渣をもう一度１．
２１のアセトンで抽出する。濾過残渣を１．２１のエタ
ノールで抽出する。濾過残渣を同様にして１．２　ｊ２
の石油エーテルで２回抽出し、抽出液を集めて減圧乾固
し、粗セファリン画分３．９ｇを得た。

このものをクロロホルムに溶解し、酢酸型に調製したＤ
ＩＥＡＥ−セルロースカラム（ワットマン社製ＤＥ３２
、径２．５ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍ）を用いて分画した。ク
ロロホルム−メタノール（１：４）　　ｌ　ｌでカラム
を洗浄後、酢酸’１５０ｍ１で溶出した両分を集めた。

酢酸溶出画分に等容のクロロホルムを加え、２倍容の水
で４回洗浄した。クロロホルム層を減圧乾固し、ＰＳ（
ＰＳ９８％）０．８ｇを得た。

参考例３ 市販のジオクチルスルホコハク酸ナトリウムを精製した
。

ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（日本油脂株式会
社製、商品名ラピゾールＢ−９０）の５０％メタノール
溶液１００−を４℃で３時間静置後、４℃で２，０ＯＯ
Ｘ　ｇ　、　１５分間遠心分離し沈殿を除去した。

上清に特級活性炭（和光純薬■製）５ｇを加え、１８時
時間中かに攪拌した。活性炭を濾別し、メタノールを情
夫した。

乾固物を五酸化リンの入った減圧デシケータ−中で一昼
夜以上乾燥したものを精製ジオクチルスルホコハク酸ナ
トリウムとして用いた。

参考例４ 前出のケーラとサストリイ　（Ｍ、ＫａＬｅｓ　ａｎｄ
　Ｐ、Ｓ。

５ａｓｔｒｙ）の方法に従ってキャベツ可溶画分からホ
スホリパーゼＤを部分精製した。

近在の農家から入手した新鮮なキャベツの内側の葉を水
洗後細断し、１００ｇに水２００　ｒｎｌを加え、水冷
下で５分間ホモジナイズした。５重にしたガーゼで濾過
した濾液を４℃で１２，０ＯＯＸｇ、３０分間遠心分離
し、上清１９０ｍｊ！を得た。この上清を５５°Ｃ１５
分間熱処理後、直ちに氷冷した。４℃で１２，０ＯＯＸ
ｇ、３０分間遠心分離し、上・清１７５＋＋＋ｆを得た
。

−１５℃に冷却したアセトン３５０ｍｆを攪拌しながら
少しずつ加え、１０分間静置後４℃で１２，０ＯＯＸ　
ｇ、３０分間遠心分離して沈殿を集めた。

沈殿を１５　ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐｌ（５，６に
溶かし、４°Ｃで同じ緩衝液５００ｍ１に対し３回透析
した。

不溶物を４℃で１０，０ＯＯＸ　ｇ、１５分間遠心分離
したものをキャベツ部分精製ホスホリパーゼＤとして用
いた。

なお、この酵素液には検出可能量のリン脂質は含まれて
いないことを確認した。

実施例Ｉ Ｌ−セリン１．５Ｍ、キャベツホスホリパーゼＤ（ベー
リンガー・マンハイム社り　　７ｍｇ／　ｍｔｔ、塩化
カルシウム・三水塩Ｉｏｎ　ＭをＱ　、　５　ｍｌの５
ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５，６に溶かし、水相とした。参考
例１で得た大豆ＰＣおよびＰＥの濃縮物１．５ｇを乾燥
したジイソプロピルエーテル４０−に溶かし、有機相と
した。

有機相を３５℃に保ち、Ｎ５１００−２０型超音波洗浄
機（出力１００Ｗ、日本精機製作新製）で超音波処理し
ながら水相０．３５Ｉｎ１を滴下し、更に１分間超音波
処理し、はぼ透明な逆ミセル液を得た。

このものを３５℃、１２時間、１５ｒｐｍで往復振盪し
、反応させた。

反応混液の一部を取り１．直接ＴＬＣで分析したところ
、ＰＣ４８％、ＰＥ１４％、ＰＡＬＬ％で、標準ＰＳと
Ｒｆが一致し、ジットマー試薬およびニンヒドリン試薬
に陽性を示すことがらＰＳと同定した生成物２４％を含
んでいた。

反応混液をその°まま酢酸型に調製したＤＥＡＥ−セル
ロースカラム（ワットマン社’ＪＡ　ＤＥ３２　、径２
．５Ｘ　２０ｃｍ）を用いて分画した。

カラムをクロロホルム−メタノール（１：　４）５００
　ｍｌで溶出し、減圧乾固して未反応基質（ＰＣ７３％
、ＰＥ２７％）を回収した。

更にカラムを酢酸４００ｍ１で溶出した。酢酸溶出画分
を集め、等容のクロロホルムを加え、２倍容の水で４回
洗浄した。クロロホルム層を減圧乾固し、ＰＳ（ＰＳ９
８％）　２９４ｍｇを回収した。

実施例２ 市販水素添加卵黄レシチン（ＰＳ９９％）　４０ｍｇを
溶かしたイソオクタン１−を有機相として、３８℃で実
施例１と同様にして、塩酸でｐＨ５，７に調整した１−
アミノ−２−プロパノール１．５Ｍ、キャベツホスホリ
パーゼＤ（ベーリンガー・マンハイム社製＞　７■／−
１塩化カルシウム・三水塩１０　ｍＭからなる水相１１
　ｐｌを滴下し、逆ミセルを形成させた。

このものを３８℃、８時間、１５ｒｐｍで往復振盪し、
反応させた。

反応混液の一部を取り、直接ＴＬＣで分析したところ、
ＰＣ６２％、ＰＡ５％で、標準ＰＥとＲｆが近接しジッ
トマー試薬およびニンヒドリン試薬に陽性を示すことか
ら１−アミノ−２−プロパツ−ルにホスファチジル基が
導入された目的リン脂質と判定した生成物２４％を含ん
でいた。

実施例３ 参考例２で得た牛脳ＰＳ（ＰＳ９８％）　４０ｍｇを溶
かしたシクロヘキサン１−を有機相として、３８°Ｃで
実施例１と同様にして、グリセリン１．５Ｍ、キャベツ
ホスホリパーゼＤ（ベーリンガー・マンノλイム社製）
７■／−１塩化カルシウム・三水塩１０ｍＭ、５ｍＭ酢
酸緩衝液ｐＨ５，６からなる水相９μｌを滴下し、逆ミ
セルを形成させた。

このものを３８°Ｃ１１２時間、１５ｒｐｍで往復振盪
し、反応させた。

反応混液の一部を取り、直接ＴＬＣで分析したところ、
ＰＳ７０％、ＰＡ３％で、標準ＰＣ（！：Ｒｆが一致し
、ジットマー試薬に陽性を示すことからＰＧと同定した
生成物２５％を含んでいた。

実施例４ 市販ジパルミトイルＰ　Ｃ１００ｍｇを溶かしたベンゼ
ン２．５−を有機相として、３５°Ｃで実施例１と同様
にして、１−オルソメチルグルコシド１．５Ｍ、ホスホ
リパーゼＤ（東洋醸造ａ＠製ＰＬＤＰ）１■／−１５ｍ
Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５，６からなる水相２０μｌを滴下し
、逆ミセルを形成させた。

このものを３５℃、１２時間、１５ｒｐｍで往復振盪し
、反応させた。

反応混液の一部を取り、直接ＴＬＣで分析したところ、
ＰＣ７４％、ＰＡ４％で、未同定リン脂質１９％を含ん
でいた。

反応混液を直接、１１ｍ５７４５分取用ＴＬＣプレート
（メルク社製）を用い、クロロホルム−メタノール−水
（１２０ニア０：５）を展開溶媒として分画、分取し、
未同定リン脂質１６ｍｇを得た。

このリン脂質をＪＭＳ−Ｄ×３０３型質量分析装置（日
本電子（４ｉ製）を用い、下記条件にて分析したところ
、陽イオン側の親ピークがｍ／ｅ　８４７、陰イオン側
の親ピークがｍ／ｅ　８２３であった。

測定条件 イオン化法　　　　ｒ　ＦＡＢ法 衝撃ガス　　　　　：ｘｅ 一部イオン加速電圧：６ｋＶ フィラメント電流　：２０ｍＡ 検出器　　　　　　：コンバージョン・ダイノード 押し出し電圧　　　：１５ｋＶ マトリクス　　　　　ニトリエタノールアミン（陽イオ
ンの場合塩化 ナトリウム添加） データ処理　　　　：　ＪＭＡ−ＤＡ５０００これらの
値は１−オルソメチルグルコシドにホスファチジル基が
導入されたと仮定した分子量（８２４）の各々ナトリウ
ム塩（分子量８２／１　＋　２３）および陰イオン（分
子ｆｆ１８２４−１）と一致したことから、目的リン脂
質であると同定した。

実施例５ 市販ジパルミトイル ロホルム−イソオクタン（３５：６５）２．５ｍｆを有
機相として、３５℃で実施例１と同様にして、トレハロ
ース１．５Ｍ　、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造（４ｔＪ
製ＰＬＤＰ）　　１ｍｇ／ｍｌ、５ｍＭ酢酸１１　衝液
ｐＨ５．６からなる水相１７μｌを滴下し、逆ミセルを
形成させた。

このものを３５°Ｃ、１２時間、１５ｒｐｍで往復振盪
し、反応させた。

反応混液の一部を取り、直接ＴＬＣで分析したところ、
ＰＣ７６％、ＰＡ５％で、ジットマー試薬およびアンス
ロン試薬に同時に陽性を示すことから、トレハロースに
ホスファチジル基が導入された目的リン脂質であると判
定したリン脂ｉ１７％を含んでいた。

反応混液を実施例４と同様にして分画分取して得たリン
脂質１６ｍｇを実施例４と同様にして質量分析を行った
ところ、陽イオン側視ピークｍ／ｅ　９９５、陰イオン
側視ピークｍ／ｅ　９７１で、計算分子量（９７２）の
各々ナトリウム塩（分子，ｌ　９７２＋２３）　、陰イ
オン（分子量９７２−１）と一致したことから、目的リ
ン脂質であると同定した。

実施例６ 市販ジオクチルＰ　Ｃ　１００ｍｇ、参考例３で得た精
製ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム９０ｍｇを溶か
したｎ−ヘキサン３　ｍｌを有機相として、３７°Ｃで
実施例１と同様にして、塩酸でｐＨ６．０に調整した１
．５Ｍエタノールアミンに１ｍｇ／ｍｌのホスホリパー
ゼＤ（東洋醸造（樽製Ｐ’ＬＤＰ）を溶かしたもの３６
μｌを水相として滴下し、逆ミセルを形成させた。

このものを３７℃、１０時間、１５ｒｐｍで往復振盪し
、反応させた。

反応混液の一部を取り、直接ＴＬＣで分析したところ、
ＰＣ７１％、Ｐへ７％で、標準ＰＥに近いＲｆ値を持ち
、ジットマー試薬およびニンヒドリン試薬に同時に陽性
を示すことから、目的リン脂質であると判定したリン脂
質２２％を含んでいた。

実施例７ 市販１−ステアロイルリゾＰ　Ｃ　２００ｍｇ、ラウリ
ル硫酸ナトリウム（和光純薬ｔｒｉ製、生化学用）１０
０ｍｇを？容かしたジクロロメタン−イソオクタン（３
ニア）　　５ｍｉを有機相とし、３５°Ｃで実施例１と
同様にして、参考例４で得たキャベツ部分精製酵素液に
１．５Ｍのグリセリン、塩化カルシウム・二水塩１、０
ｍＭを溶かしたもの６５μＥを水相として滴下し、逆ミ
セルを形成させた。

このものを３５℃、１５時間、１５ｒｐｍで往復振盪し
、反応させた。

反応混液を直接、酢酸型に調製したＤＥＡＥ−セルロー
スカラム（ワットマン社製ＤＥ５２　、径１．８×５ｃ
ｍ）を用いて分画した。クロロホルム−メタノール（１
　：　４）　１００　ｎｄｌでカラムを洗浄後、５０ｍ
Ｍ酢酸アンモニウムを含むクロロホルム−メタノール（
１：４）　１００　ｍｌで溶出した両分を集めた。酢酸
溶出画分に、等容のクロロホルムを加え、２倍容の水で
４回洗浄した。

クロロホルム層を減圧乾固して得られたリン脂質２６．
７ｍｇを実施例４と同様にして質量分析を行ったところ
、陽イオン側視ピークｍ／ｅ　５３４、陰イオン側視ビ
ークｍ／ｅ　５１１で、計算分子量（５１２）の各々ナ
トリウム塩（分子ｆｆｌ　５１２＋２３）　、陰イオン
（分子ｌ　５１２−１）と一致したことから、目的とす
る１−ステアロイルリゾＰＣであると同定した。

比較例１ 従来の反応系で、実施例１とできるだけ近い条件で反応
を行った。

Ｌ−セリン２００ｍＭ、塩化カルシウム４０ｍＭ、ホス
ホリパーゼＤ（ベーリンガー・マンハイム社製）２．５
ｍｇを含むｐ　Ｈ５，６の５０ｍＭ酢酸緩衝液２．５ｍ
ｌと、参考例１で得た大豆ｐｃおよびｐＥ＞５縮物４０
ｍｇを溶かしたジイソプロピルエーテル５ｒｎ１を３７
℃、５００ｒｐｍで攪拌した。

同一のもの５検体を平行して各１．２．４．１２時間反
応させた。反応後、５ｒｎｌのジエチルエーテルで３回
脂質を抽出し、リン脂質組成を分析した。

結果を下表に示す。

表１ 組成（％） 反応時間（ｈ）　　　ＰＣＰＥ　　ＰＡ　　ＰＳｌ　　
　　　　１．５　３１　４２　１２比較例２ 従来の反応系で、実施例４とできるだけ近い条件で反応
を行った。

■−オルソメチルグルコシド１．５Ｍ、ホスホリパーゼ
Ｄ（東洋醸造■製ＰＬＤＰ）２０硝を溶かしたｐ！（５
，６の５０ｍＭ酢Ｍ９１衝液２．５　ｍｌと、ジパルミ
トイルＰＣ１００ｍｇを？容力）したベンゼン２．５ｎ
ｄｌを３５℃、５００ｒｐｍで攪拌し、反応させた。

比較例１と同様にして経時的に分析したが、実施例４で
認められた目的リン脂質に相当するスポットがＴＬＣ上
に認められず、１６時間反応した時点で基質が完全に分
解されたため、分析を打ち切った。

比較例３ 従来の反応系で、実施例５とできるだけ近い条件で反応
を行った。

トレハロース１．５Ｍ、ホスホリパーゼＤ　（ＥｌＫ洋
醸造（横裂ＰＬＤＰ）２０μｇを溶かしたｐＨ５，６の
５０ｍＭ酢酸緩衝液２゜５ｍｌと、ジパルミトイルＰＣ
１００ｍｇを）容かしたクロロホルム−イソオクタン（
３５：６５）２．５ａ＋ｊ！を３５℃、５００ｒｐｍで
攪拌し、反応させた。

比較例１と同様にして経時的に分析したが、実施例５で
認められた目的リン脂質に相当するスポットがＴＬＣ上
に認められず、１６時間反応した時点で基質が完全に分
解されたため、分析を打ち切った・

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）塩基構造が変換されたリン脂質を製造するにあた
   り、原料リン脂質を溶解した有機溶媒中に、水酸基を持
   つ受容体およびホスホリパーゼＤを含む水相を逆ミセル
   中に封入した形態で添加して反応を行うことを特徴とす
   る酵素によるリン脂質の製造方法。
2. （２）逆ミセルを界面活性剤により形成し、該界面活性
   剤として原料リン脂質自体を利用する特許請求の範囲第
   １項記載の製造方法。
3. （３）受容体がセリン、エタノールアミン、１−アミノ
   −２−プロパノール、１−オルソメチル−グルコシド、
   グリセロール、トレハロースのいずれかである特許請求
   の範囲第１項記載の製造方法。