JPS6351335A - 肥満細胞脱顆粒抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、キマーゼ及びトリブターゼ阻害剤殊に、肥
満細胞脱顆粒抑制剤に関するものである。

（従来の技術） アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、喘、＝、ａ麻
疹、食物性アレルギー等の、ｒｇＥ（免疫グロブリンＥ
）の関与するアレルギー性炎症において１組織中の肥満
細胞（ｍａｓｔ　ｃｅｌｌ）が重要な役；（Ａを担って
いることは既に明らかにされている（例えば「感染・ア
レルギー・免疫病学ｊ　。

１９７８年６月１１１医学書院発行参照）。即ち、細胞
表面に結合したＩｇＨに対して抗原が結合することによ
り、細胞内顆粒が放出され、その中に含まれるヒスタミ
ンや５ＲＳ−Ａ等が炎症を成立させると考えられている
。

一方、勝沼らは、肥満細胞７０粒中にキブーゼ（Ｇｈｙ
ｍａｓｅ）が存在し、これが肥満細胞の脱顆粒に必須で
あると共に、遊蕩した該酵素がＩｇＧを分解し好中球遊
走因子を作ることを明らかにした（「生化学」第５７巻
１０７６頁（１９８５））　、更に勝沼らは、キマーゼ
に対する抗体及びキマーゼ阻害作用のあるキモスタチン
（Ｃ１ｌＢＯｓｔａＬｉｎ）により脱顆粒が抑制される
ことを明らかにしたが、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎ
ｉｎ）やα１−アンチキモトリプシン（α１−ａｎｔｉ
ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）などの分子Ｑ８０００以ト
の蛋白性キマーゼ阻害剤では、その抑制は認め難かった
（”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ７１ｎｔ、、”１０．ｐｐ
、８８３〜８７１（１９８５））［発明が解決しようと
する問題点コ 木発明者等は更に研究を進める中で、肥満細胞顆粒中に
はキマーゼ以外にも存在するトリプターゼ（Ｔｒｙｐｔ
ａｓｅ）が、プロトロンビア　（Ｐｒｏｔｈｒａ　−ｍ
ｂｉｎ）をトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）に活性化さ
せ得ること、及び該活性化による血液凝固系を介する炎
症反応への関与の可能性が重要であるとの知見を得て、
これと前記キマーゼに関する実験事実から、肥満細胞顆
粒中の二種のプロテアーゼ、即ち、キマーゼ及びトリプ
ターゼに対する阻害が、脱顆粒の抑制、ひいてはアレル
ギー反応の抑制に有意義であろうとの認識を抱くに至っ
たが、現在までのところ、両プロテアーゼに対し強力な
作用を持つ、殊にキマーゼに対し強い活性を示す高分子
性阻害物質は見出されていない。

しかし、仮にかかる高分子性５０害物質を発見すること
ができれば、他の低分子性インヒビターにおけるが如き
中線拡散による標的肥満細胞以外の細胞への無差別な細
胞内侵入は生じ難いものと想像されるので、副作用の恐
れのない安全な医薬品開発への展望が開けるものと推測
される。

［発明完成の経過］ そこで本発明者らは、従来から種々の高分子性プロテア
ーゼインヒビターの存在が知られなが゛らも、基体的な
生理学的挙動については不ＩＪであった植物性プロテア
ーゼインヒビターに探究の手を進めたところ、ここに大
豆由来のポウマン−八−り（ＢｏｗＩｌａｎ　Ｂｉｒｋ
）型トリプシンインヒビターが両酵素に対しｗＪ著な阻
害作用を有すること、及びこのものが肥満細胞顆粒から
のＩｇＥ誘発によるヒスタミンの放（１１を効果的に抑
制することを発見した。

［問題点を解決するための手段］ 未発１１は以上の知見を基礎とするものであって、その
要旨は大豆由来のボウマン−バーク（Ｂｏｗｍａｎ　Ｂ
ｉｒｋ）型トリプシンインヒビターを有効成分とする肥
満細胞脱顆粒抑制剤に存する。

ここに、発明の主体である大豆由来のボウマン−バーク
型トリプシンインヒビクー（以下ＢＢＩと略す）は、約
６千〜８千の分子量を有し、他のタイプのトリプシンイ
ンヒビターである分子量約２万のクニッッ（Ｋｕｎｉｔ
ｚ）　ｐ　）リプンンインヒビターと共に大豆の水溶性
画分中に存在している。

因に、これら両種インヒビターの基本的性質はｒＭｅＬ
ｈｏｄ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ　１９巻８５３
頁（１９７０）及び「クン白質研究の新しい視点（化学
研究を中心として）」共立出版刊（１９８２）に記載さ
れ、かつそれらの構造も既に判明しているので（Ｅｕｒ
、Ｊ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｓ、　、３２．４１７；Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　、７４，８Ｓ７　（１９７３）　）それ
の化学的及び生化学的方法による合成や修飾も今日では
可能である。従って、ここにいうＢＢＩは、大豆から原
始的に得られた天然ボウマン−バーク型トリプシンイン
ヒビターのみならず、その活性フラグメント若しくは修
飾物又はそれらの化学的又は生化学合成物を包含する概
念である。

ところで、天然ＢＢＩの調製法としては既に種々の方法
が知られており１．に発りＪではどの方法で作られたも
のでもよいが、一般的には、大豆、脱脂大豆、大豆ホエ
ーなどを出発原料として、これを水性媒質又は極性有機
溶剤（例えば低級アルコール類若しくは低級）偕肋族ケ
トン類又はジオキサン“や）による抽出、膜分離、等電
点沈澱、塩析等による濃縮、分画によって先ず粗精製物
の状態にまで予備的に精製した後、この組成物を、更に
ゲル鑓過、イオン交換又は吸着などの精製手段を施すこ
とにより、ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動で
単一のパターンを示す標品にまで純化することが可能で
ある。しかし実用的には、活性さえＩ）］らかであれば
粗製品で充分である。なお、活性のアッセイには、公知
の方法、例えばクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）のカゼイン消
化法又は合成基質（例えばＮ−Ｂｅｎｚｏｙｌａｒｇｉ
ｎｉｎｅ−ｐ−’ｎ１ｔｏｒｏａｎｉｌｉｄｅ　）を利
用することができる。なお？ロー性及び純度の検定には
、ＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高
速液体クロマトグラフィーを利用するのがよい。

［作用］ 大豆由来のＢＢＩは、肥満細胞より精製したキマーゼ及
びトリプターゼを強力に阻Ｉヒする。この阻害機作は、
ＢＢＩの分子鎖中のキモトリプシン系及びトリプシン系
酵素の活性中心に対する特異的結合作用によるものと理
解される。

更に大豆由来のＢＢＩは、肥満細胞からの脱顆粒を抑制
する。この作用は、上の両酵素に対する阻害作用の結果
と考えられるが、ＢＢＩの分子量（約８，０ＱＱ）から
考えて、この間、細胞膜との界面において伺等かの取り
込み機作が存在することは確実であろう。

とまれ、上のＢＢＩでは、その高分子性から他の低分子
性インヒビターにおれるが如さ単純拡散による被標的細
胞以外の他種細胞中への侵入は生じないと考えられ、事
実、標的肥満細胞以外の細胞への影響は現在のところ発
見されていない。

以上のように、ＢＢＩは肥満細胞に作用してその脱顆粒
を抑制するため、アレルギー性疾患に対する有力な薬剤
としての効用が嘱望される。

［実施例］ 以下、実施例及び参考例により発明をより具体的に説明
するが、例示は当然説明用のものであって、発明思想の
限定を意味するものではない。

参考例１（ＢＢＩの調製例） 低変性脱脂大豆から分離大豆蛋白を製造する過程で得ら
れる大豆ホエーを濃縮し、このＣ線動（粗蛋白資金７５
．５％）１容に対し０５容のアセトンを加えて約１時間
攪拌後、遠心分路して得られた旧情に対し、更に１，５
容のアセトンを加えて約１時間攪拌し、生じた沈ｋｊ、
画分を木に対して透析した。この透析液に’１５０量の
０．５　Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１７．Ｑ）を加
えてＰＨ７，０に調節後、ＤＥＡＥ−セルロースイオン
交換カラムに通して、該樹脂に吸７１させた０次いで、
カラムを０〜０．４　Ｍの直線食塩濃度勾配で溶出し、
溶出液をアラクシ３ンコレクターにより分画し、ＢＢＩ
に富む両分とクニッツ型トリプシンインヒビターに富む
両分を得た。

ＢＢＩに富む両分は、ｅ錦、透析後、そのｐＨを４．０
に調製し、ＣＭセルロースイオン交換カラムに通し、吸
着したＢＢＩを０〜０１５Ｍの食塩濃度勾配にて溶出し
、溶出物を凍結乾燥して精製ＢＢＩを得た。またクニッ
ツ型の両分も、等電沈鍛後、凍結乾燥し、精製インヒビ
ターを得た。各標品の純度は、ＳＯ８含有ポリアクリル
アミドゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー（
ゲル鑓過法）にて測定したところ両者ともに蛋白質中９
５％以上であった。また、ＢＢＩの比活性は。

Ｓｉｇｍａ社製トリプシン「タイプ−ＸＩＪ（７５００
〜９０００　ＢＡＥＥ　ｕｎｉｔ／　ｍｇの活性蛋白）
及び合成基質（Ｎ−Ｂｅｎｚｙｌ−ＤＬ−Ａｒｇｉｎｉ
ｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌ　ｉｄｅ：ＢＡＰＡ）を
用いた測定で、５〜６　ｕｎｉｔ／■ｇ蛋白であった（
同条件で２ｕｎｉｔのＢＡＰＡを氷解するトリプシンの
活性を５０％阻害するとき阻害活性をｆｕｎ己とした。

）。

参考例２（ＢＢＩによるプロテアーゼの阻害）ラット舌
より精製したキマーゼ及びラット腹腔内肥満細胞より精
製したトリプターゼに対する阻害能は、」−記ＢＢＩ及
びクニッツ型インヒビターを加え、キマーゼの場合、Ｓ
ｕｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（Ｓｕｅ　＝サ
クシニル、ＭＣＡ　＝　４−メチルクマリル−７−アミ
ド）を基質とし、ｐ）１８．５において測定し、またト
リブターゼの場合は、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅ　ｒ−Ａｒ
ｇ−ＭＧＡ　　（Ｂｏｃ＝第三級ブチロキシカルボニル
）をＡ（質としてｐＨ７，５において測定した。ＢＢＩ
及びりこツツ型インヒビターの水溶液又はキモスタチｙ
　（Ｃ：ｂｙｍｏｓＬａＬｉｎ　：　　（財）蛋白質研
究！２劫会）のジメチルスルホキシド溶液をキマーゼ又
はトリプターゼに添加し、２５℃で５分間保温した後、
基質溶液を加えた。酵素反応精製物は蛍光光度計にて測
定し、各５１１害剤の５０％阻害率を求めた。結果を下
表１として示す。

表１ 上表１から明らかな様に、クニッツ型インヒビターのキ
マーゼに対する阻害能は強くなく、またキモスタチンの
トリプターゼに対する阻害部も弱いものであった。ＢＢ
Ｉのみがキマーゼ及びトリプターゼの双方に対し強い３
１１害能を示した。これは、従来の各種インヒビターも
見られない特徴である・ 実施例（ＢＢＩによる脱顆粒の抑制） 雄性ウィスタ一種ラットに、Ｎ　１ｐｐｏｓｔ　ｒａｎ
ｇｙ　１ｕｓｂｒａｃｉｌｉｅｎＳｉｓの幼虫を皮下接
種し、　ＩｇＥ抗体値の上昇したラットの腹腔から肥満
細胞を純度９５〜９９％の純度で調製した。

脱顆粒の測定は遊離ヒスタミン酸を指標として行った。

即ち、１１当たり４　Ｘ　１０５個の肥満細胞を０１％
牛血清アルブミン含有タイロード液中に浮遊させ、ＢＢ
Ｉ又は他のインヒビターを加えて０〜６０分間３分間３
侃 の抗うッ）　ＩｇＥ抗体を加え、３７℃１０分間内にお
けるヒスタミンの遊離量を液体クロマトグラフィーによ
り定量した．インヒビター無添加の場合の対照を１００
％とした結果をｒ表２に示す。

（以下余白） 表２ 上表から明らかなように、低分子インヒビターであるキ
モスタチン及びロイペプチンはヒスタミンの遊離を抑制
する効果を示し、特に前者の効果は顕著であった．一方
，高分子インヒビターであるα１−抗ギモトリプシン及
びアプロチニンは、自体キマーゼ抑制効果有するに拘ら
ず、ヒスタミンの遊離を抑制する効果がなく、殊に後者
は却ってヒスタミンのｉｓを促進した。

以上に対し、ＢＢＩは高分子インヒビターであるにも拘
らず、ヒスタミンの遊離を効果的に抑制する効果を示し
た。

［発明の効果〕 以上，説明した通り、大豆由来のＢＢＩは、肥満細胞中
のキマーゼ及びトリプターゼを強く阻害すると共に、該
細胞からの脱顆粒を抑制するので、炎症その他１種々の
アレルギー症状への適応が期待される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）大豆由来のボウマン−バーク（Ｂｏｗｍａｎ　Ｂ
   ｉｒｋ）型トリプシンインヒビターを有効成分とする肥
   満細胞脱顆粒抑制剤。