KR940003751B1

KR940003751B1 - 항혈액 응고물질의 제조방법

Info

Publication number: KR940003751B1
Application number: KR1019860008120A
Authority: KR
Inventors: 마사히로 마키; 히데오 타니
Original assignee: 코와 가부시키가이샤; 미와 타카야수
Priority date: 1985-09-30
Filing date: 1986-09-27
Publication date: 1994-04-30
Also published as: EP0217341A2; JPH0710880B2; ES2001707A6; EP0217341B1; KR870002848A; JPS62174023A; US4732891A; EP0217341A3; DE3676148D1; CA1265446A; EP0217341B2

Abstract

내용 없음.

Description

항혈액 응고물질의 제조방법

제1도는 토끼의 신선한 혈액에 첨가된 TTP의 농도와 응고시간 연장 비율과의 관계를 나타내는 그래프이고,

제2도는 토끼의 신선한 혈액에 첨가된 TTP의 농도와 응고시간과의 관계 및 본 발명 물질의 농도와 응고시간과의 관계를 나타내는 그래프이며,

제3도는 인간의 신선한 혈액에 첨가된 TTP의 농도와 응고시간과의 관계 및 TTP가 첨가된 혈액에 첨가된 본 발명 물질의 농도와 응고시간과의 관계를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 신규의 항혈액 응고물질의 제조방법에 관한 것이다.

혈액의 응고는 트롬보플라스틴 활성이 전개된 후, 혈액내의 X및 V인자가 활성화되고, 그후 프로트롬빈이 트롬빈으로 활성화되고, 최종적으로 트롬빈의 작용에 의하여 피브리노겐이 피브린으로 전환됨으로써 이루어진다.

혈액응고로 인한 질병을 치료하기 위해서는 혈액응고 기작에 관여하는 여러가지 응고인자들을 불활성화시키거나 저해시킬 수 있는 물질, 즉 항혈액 응고 물질을 사용하는 것이 효과적이다. 현재 알려져 있는 항혈액 응고물질로는 헤파린, 헤파린 조인자-Ⅱ, 안티트롬빈-Ⅲ, α₂-마크로그로블린, α₁-트립신 저해제, C₁-에스테라제 저해제, 단백질 C 등이 있다.

최근, 크리스 피.엠. 로이테링슈페르거(Reutelingsperger) 등은 인간의 탯줄의 동맥에서 분자량이 32kDa인 항혈액 응고활성을 갖고 있는 신규 물질을 발견하였다[Eur. J. Biochem.,151, 625-629(1985)].

그러나 대부분의 공지된 항혈액 응고물질은 그 존재가 확인되었을 뿐이며, 현재 의약품으로 사용되고 있는 것은 헤파린 뿐이다. 그러나 헤파린은 출혈 경향을 초래하는 부작용을 갖고 있기 때문에 그의 용법 및 용량 등이 극히 제한되어, 항혈액 응고제로서는 안전성의 면에서 만족스럽지 못한 것이다.

로이테링슈페르거 등에 의해 발견된 물질은 후술하는 이유로 인하여 본 발명의 물질과는 전혀 다른 것이다. 또한 이 물질의 활성은 혼합물 형태로서만 측정되어 실용적인 면에서 유용하지 않다고 사료된다.

따라서, 보다 더 우수한 항혈액 응고의 개발이 요구되어 왔다.

본 발명의 발명자들은 부작용이 없고 생체에 무해한 항혈액 응고제에 대하여 광범위한 연구를 한 결과, 조직 트롬보플라스틴 함유량이 많고, XIII인자, 선용 저해인자 등도 함유하며, 혈전 형성 경향이 있다고 생각되며, 또한 혈액응고 기구에서도 특이한 상태를 유지하고 있는 태반중, 특히 사람태반 호모지네이트로부터 분획한 마이크로좀 획분으로부터 신규한 항혈액 응고물질이 얻어질 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기 (1)-(5)의 성질을 갖는 인간의 태반 유래의 신규 항혈액 응고물질의 제조방법을 제공하는 것이다.

(1) 분자량(SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 환원상태) : 34,000±2,000

(2) 등전점(암포라이트를 사용하는 등전점 컬럼 전기영동) : 4.7±0.1

(3) 안정성

(a) 50℃, 30분간 가열처리하여 실활

(b) pH 4~10에서 안정

(C) 혈장중 37℃, 30분 동안 안정

(4) 작용

(a) 칼슘재가응고(recalcification)시간을 연장

(b) 프로트롬빈 시간을 연장

(c) 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간을 연장

(5) 아미노산 분석

아미노산 분석 결과, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루타민산, 프롤린, 글리신,알라닌, 1/2 시스틴, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 리신 및 아르기닌의 존재가 확인됨.

본 발명의 항혈액 응고 물질(이하

본 발명 물질＂이라 칭함)은 예를 들면 인간의 태반 호모지네이트를 만들고, 원심분리한다. 호모지네이트 조작은 다음과 같이 수행한다 : 양막을 태반으로부터 제거하고 생리 식염수로 충분히 세척한 후, 위링(Waring)혼합기와 폴리트론(polytron)을 사용하여 균질화한다. 생성된 호모지네이트를 원심분리하여 상충액과 침강물 또는 잔류물을 얻는다.

상충액을 50,000 내지 100,000xg에서 초고속 원심분리하여 마이크로좀 분획을 얻는다. 호모지네이트로부터 얻은 잔사와 상기의 마이크로좀 분획을 완충액으로 충분히 세척하고 원심분리 또는 초고속 원심분리에 의하여 세척된 잔사 및 마이크로좀을 각각 회수한다.

세척된 두 물질을 합하여 킬레이트제 및/또는 계면활성제의 용액중에 침지한다. 킬레이트제로서는 EDTA, EGTA, 시트레이트, 옥살레이트, 니트릴로트리아세트산 킬레이트, 인산 등을 예로 들 수 있으며, 계면활성제로서는 트리톤(Triton) X-100, 루부롤(Lubrol), SDS, 데옥시콜린산 등이 있다. 킬레이트제 및/또는 계면활성제로 처리한 물질을 4~8℃에서 하룻밤 방치시킨다. 상충액을 회수하고 원심분리하여 추출물을 얻는다. 전술한 추출과정은 킬레이트제 및 계면활성제의 존재하에 수행함이 바람직하다. 이렇게 얻어진 추출물을 다시 황산암모늄을 사용하여 분획시킨다. 황산암모늄 분획과정은 2단계로 수행된다. 먼저 35%의 포화농도로 될 때까지 고체 황산암모늄을 추출물로 가하고, 상충액을 원심분리시킨다. 그 후, 85%의 포화농도에 이를 때까지 고체 황산암모늄을 상충액에 가하고 원심분리에 의하여 황산암모늄을 침강물 형태로 얻는다. 얻어진 황산암모늄 획분을 투석, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과, 흡착 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 등전점 컬럼 전기영동, 렉틴 또는 항체 등을 이용하는 친화성 크로마토그래피 등과 같은 공지의 분리 및 정제과정에 의해 정제함으로, 본 발명의 물질을 얻는다. 상기의 정제과정들은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 킬레이트제 및/또는 계면활성제로 처리한 추출물을 황산암모늄으로 분획시킴으로써 얻어진 획분을 충분히 투석하여 얻어진 투석물을 DEAE-토요펄(Toyopearl)을 사용하는 직선농도 구배법에 따라 용출시키고, 얻어진 활성획분을 투석시킨 후, 블루 세파로오즈(Blue Sepharose)를 통과시킨다.

상기의 활성획분을 농축시킨 후, 세파덱스(Sephadex) G-100을 사용하여 겔 여과 함으로써 본 발명의 물질을 얻는다.

얻어진 본 발명의 물질은 전술한 바와 같은 성질들을 갖는다. 전술한 성질의 측정법 및 결과를 보다 상세히 기술한다.

(1) 분자량 측정

SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(12% 폴리아크릴아미드겔 ; 환원상태)의 결과 분자량은 34,000±2,000으로 측정되었다. 세파덱스 G-100을 사용하는 겔 여과에 의한 측정시 저분자량의 유로키나제(분자량 ; 약 34,000)와 동일한 위치에서 나타났다.

(2) 등전점 측정

암포라이트(pH3.5-10)을 사용하여 300V에서 48시간 동안 등전점 컬럼 전기 영동에 따라서 등전점은 4.7±0.1(4℃)인 것으로 밝혀졌다. 또한, 폴리아크릴아미드와 암포라이트(pH 4.0-6.0)을 사용하여 샘플을 10W에서 2시간 동안 등전점 전기영동에 걸은 결과, 등전점이 4.9(10℃)인 것으로 밝혀졌다.

(3) 안정성 시험

(a) 열처리에 대한 안정성

본 발명의 물질을 각기 다른 온도(0~90℃)에서 30분간 가열처리하고, 칼슘 재가응고시간 측정방법에 따라 항혈액 응고활성을 측정한 결과, 50℃ 이상의 온도에서 완전히 실활되었다.

(b) pH 안정성

2.5 내지 10.0의 각기 다른 pH값의 완충액들을 가하여 4℃에서 18시간동안, 그리고 25℃에서 3시간동안 처리한 후, 남아 있는 항혈액 응고활성을 칼슘재가 응고시간법에 의해 측정하였다. 그 결과, 활성은 4 내지 10의 pH 범위에서 낮아지지 않았다.

(c) 혈장중에서의 안정성

본 발명의 물질을 혈장에 가하고 37℃에서 30분간 방치한 후, 남아있는 항혈액 응고방지 활성을 칼슘재가 응고시간법에 의해 측정한 결과, 활성의 저하는 관찰되지 않았다.

(4)작용

(a)칼슘재가응고시간에 있어서의 작용

표준 혈장 100㎕와 본 발명 물질의 용액 100㎕를 혼합하였다. 첨가 3분 후에 0.025M의 염화칼슘용액 100㎕를 혼합물에 첨가하고 응고시간을 측정하였다. 그 결과, 하기 표 1에 나와있는 바와 같이 칼슘재가 응고시간을 연장시키는 강력한 작용이 확인된다.

[표 1]

(b) 프로트롬빈시간(PT)에 있어서의 작용

PT시약[심플라스틴(simplastin)] 100㎕와 본 발명물질의 용액 100㎕를 혼합하였다. 3분후에 표준 혈장 100㎕를 첨가한 후, 응고시간을 측정하였다. 그 결과가 표 2에 나와있으며, 이로써 강력한 PT-연장작용이 입증된다.

[표 2]

(c) 활성화된 부분 트롬보플라스틴시간(APTT)에 있어서의 작용

APTT시약(활성화된 트롬보팍스, Ortho Diagnostic Ststem Inc.) 10㎕와 본 발명 물질의 용액 90㎕를 혼합하였다. 2분 후에 표준 혈장 100㎕를 혼합물에 첨가하였다.

6분후에는 0.025M의 염화칼슘용액 100㎕를 첨가하여 응고시간을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 3에 나와있는 바와 같이 강력한 APTT 지연작용이 확인되었다.

[표 3]

(5) 아미노산 조성

본 발명의 물질을 110℃에서 24시간 동안 6N의 염산으로 가수분해시키고 위터즈 고성능 액체 크로마토그라피(Waters HPLC)의 아미노산 분석 시스템에 의한 분석을 하였다. 이 결과가 하기 표 4에 나와있다.

[표 4]

로이테링슈페르거 등이 발견한 물질의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 측정되었으나, 그 물질은 분리 또는 확인되지 않은 채, 56℃의 가열처리에 의하여 실활되는 단백질이라는 것만이 확인되었을 뿐이다. 그러나, 그 물질은 탯줄을 트리스-염산 완충액으로 추출함으로써 얻어졌다는 점에서 본 발명의 물질은 로이테링슈페르거 일행에 의해 얻어진 물질과는 다른 것이리라고 생각된다.

본 발명의 물질이 항혈액 응고제의 유효성분으로 사용되는 경우, 그 제제를 주사액으로 할 수 있다. 이 주사액은 동결건조분말이 증류수 또는 주사용 생리식염수에 용해되어 있는 형태는 바람직하다. 주사 부위는 정맥내로 하는 것이 편리하다.

투여량은 하루에 체중 1kg당 10㎍~10㎎의 범위로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 물질은 전술한 투여량 범위내에서의 사용시에 이상현상을 나타내지 않으므로 무해한 것이라는 사실을 주목해야 한다. 본 발명의 물질을 주사액 형태로 제조하기 위해서 알부민,젤라틴 또는 만니톨을 안정제로서 첨가할 수 있다.

이 같은 안정제를 첨가하면 제조공정품의 분해 및 흡착이 방지되고 제제의 저장 안정성이 개선될 수 있다.

본 발명의 물질은 높은 항혈액 응고활성을 가지며, 조직 트롬보플라스틴의 활성이 더해진 상태 또는 응고가 악화된 상태에서 더 높은 활성을 나타낸다. 그러므로 본 발명의 물질을 유효성분으로 함유하는 항혈액 응고제는 부작용을 감소시키며, 무해한 것이다.

이하, 실시예로 본 발명을 상술한다.

[실시예 Ⅰ]

(ⅰ) 인간의 태반 5개 (약 2,500g)를 준비하여 막을 제거한 후, 생리식염수로 충분히 세척하였다. 그 후, 50mM의 트리스-염산 완충액 2ℓ를 태반 조각에 첨가하고 워링혼합기 및 폴리트론으로 분쇄하였다. 얻어진 호모지네이트를 7,000r.p.m.에서 15분간 윈심분리시킴으로써 침강물을 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 침강물을 동일한 완충액 2ℓ를 첨가하여 세척하고, 폴리트론을 사용하여 균질화시키고, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리시켰다.

혈액성분이 제거될 때가지 상기 과정을 몇차례 반복하여, 세척된 침강물 930g을 얻었다.

(ⅱ) 50mM의 EDTA가 함유된 50mM의 트리스-염산 완충액 약 2ℓ를 상기 (ⅰ)단계에서 얻어진 침강물 900g에 첨가한 후, 워링혼합기를 사용하여 균질화시켰다. 생성된 균질을 4℃에서 하룻밤 교반한 후 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리 시킴으로써 2ℓ의 추출물을 얻었다.

(ⅲ) 고체 황산암모늄을 (ⅱ)단계에서 얻어진 추출물에 첨가하여 35%의 포화상태로 만들고, 4℃에서 30분 내지 수시간 동안 정치시킨 후, 7,000r.p.m. 에서 15분간 원심분리시켜 상청액을 수집하였다. 상청액에 황산암모늄을 첨가하여 85%의 포화상태로 하고, 4℃에서 2시간 동안 정치시킨후 7,000r.p.m. 에서 15분간 원심분리시켜 침강물을 채집하였다.

이렇게 하여 얻어진 침강물을 소량의 20mM의 트리스-염산 완충액에 용해시키고, 동일한 완충액에 대하여 4℃에서 하룻밤 동안 충분히 투석시켰다. 투석중에 생성된 침전물을 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리시킴으로써 제거하여, 투석물 390㎖를 얻었다.

(ⅳ) 이 투석물을, 20㎖의 트리스-염산 완충액(pH 7.4)로 평형화한 DEAE_토요펄(ø5.5×19㎝)에 흡착시키고, 완충액으로 충분히 세척하였다. 그 후, 0~0.3M의 염화나트륨이 함유된 동일한 완충액 4ℓ를 사용하여 각각의 획분 20㎖씩이 직선농도 구배법에 따라 용출되도록 하였다. 활성획분은 약 0.15M의 염화나트륨 농도 근처에서 용출된 것으로 밝혀졌으며 활성 획분 380㎖가 얻어졌다.

(ⅴ) 이렇게 하여 얻어진 활성획분을 0.1M의 인산염 완충액(pH 7.0)에 대하여 충분히 투석시키고(4℃에서 하룻밤), 전술한 완충액을 사용하여 평형화한 불루세파로스 컬럼(ø2.5×12㎝)를 통과시켰다.

A₂₈₀에서 흡광도를 나타내는 통과 획분(480㎖)을 디아프로(DIAFLO) 맴브레인 필터 YM-10을 사용하여 수집, 농축하였다.

(ⅵ) 단계 (ⅴ)에서 얻어진 농축물을 세파덱스 G-100을 사용하여 겔 열과시키고 생리식염수로 용출시켜 각각의 획분 8㎖씩을 만들었다.

88에서 104까지의 활성 획분을 한외여과에 의해 수집, 농축하여 본 발명 물질의 용액 14.5㎖ (단백질 중량 136.1mg, Lowry법)을 얻었다.

각각의 정제단계에서 얻어진 단백질의 수율은 다음과 같다.

[실시예 2]

실시예 1의 단계 (ⅰ)에서 얻어진 세척된 침강물 1g을 각기 다른 농도의 EDTA(0~200mM)가 함유된 50mM의 트리스-염산완충액(pH 7.4) 각 1㎖씩과 혼합하고 균질화시킨후, 4℃에서 하룻밤 정지시키고, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리시킴으로써 1㎖의 상청액을 얻었다. 상청액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴플로팅(western plotting)한 후, 토끼 항혈청으로 면역 염색을 하고, 밀도계를 사용하여 본 발명의 물질을 정량적으로 측정하였다. 그 결과가 하기 표 5에 나와 있다.

[표 5]

상기 결과로부터, 본 발명의 물질은 12.5mM이상, 바람직하게는 20~100mM의 EDTA가 함유된 동량의 트리스-염산 완충액을 사용하여 효율적으로 추출될 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 3]

인간의 태반 3개(약 1,500g)를 사용하여 실시예 1의 단계(ⅰ)에서와 같은 방법에 따라 510g의 세척된 침강물을 얻었다.

위에서 얻어진 세척침강물 10g에 하기 표 6에 나와 있는 50mM 및 100mM 킬레이트제가 함유된 50㎖ 트리스-염산완충액(pH7.4) 10㎖를 첨가한 후 균질화시켰다. 생성된 호모지네이트를 4℃에서 하룻밤 정치시킨후, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리시켜 상청액 10㎖을 채집하였다.

이렇게 하여 얻어진 상청액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 시킨후, 단백질을 염색함으로써, 본 발명의 물질을 대상으로 했을 때 검출되는 것과 동일한 이동 위치에서 단백질 띠가 검출되었다.

단백질 띠를 드러낸 샘플들을 실시예 1에 나온 단계 (ⅲ), (ⅳ), (ⅴ) 및 (ⅵ), 즉 황산암모늄에 의한 분별, DEAE-토요펄(ø1.4×7cm)에 의한 이온교환, 블루 세파로스(ø1.4×6.5cm) 통과 및 세파덱스 G-100(ø2.0×90cm)에 의한 겔 여과 단계를 순서대로 거치도록 하여, 정제된 본 발명의 물질을 얻었다.

정제된 샘플의 최종 수율(mg, Lowry법으로 측정)을 하기 표 6에 나타냈다.

표에서 “-”는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 할 때 상응되는 단백질 띠가 검출되지 않았음을 뜻하며 “ND”는 시험을 행하지 않았음을 뜻한다.

[표 6]

* 글리코에테르디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산

상기 결과로부터, 본 발명의 물질은 세척 침강물에 대하여 최소한 등몰량의 트리스-염산 완충액과 칼슘에 대해 강력한 킬레이트 효과를 갖고 있는 킬레이트제를 사용함으로써 효율적으로 추출 또는 정제될 수 있다는 사실을 알 수 있다.

[실시예 4]

실시예 3과 같은 방법에 의해 얻어진 세척침강물 1g에 하기 표 7에 나타낸 계면활성제를 각각 0.5 또는 1.0% 함유된 50mM 트리스-염산 완충액(pH 7.4)을 4㎖씩 첨가하였다. 혼합용액을 하룻밤 정치시킨후, 원심분리시켜 상청액을 채집하였다. 생성된 상청액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동시켜 본 발명의 물질이 추출되는 것을 조사하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타냈다.

이 표에서 염색된 단백질 띠가 본 발명의 물질에 상응되는 이동 위치에서 검출된 샘플들을 “+” 라고 표시하였으며, 염색된 단백질 띠가 분명하게 검출되지 않은 샘플들은 “±”라고 표시하였다.

[표 7]

다음으로, 다음과 같은 방법에 따라 본 발명의 물질을 루브롤 추출로 정제하였다. 1%의 루브롤이 함유된 50mM 트리스-염산완충액 (pH 7.4) 40㎖을 10g의 세척 침강물에 첨가한 후 균질화시켰다.

생성된 호모지네이트를 4℃에서 하룻밤 정치시키고, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리시켜 상청액을 채집하였다. 상청액 40㎖를 세파덱스 G-100(ø4.8×75cm)에 서 겔 여과시킨 후, DEAE-토요펄(ø1.4×7cm)에 의해 이온교환시켰다. 그 후, 상기 샘플을 (세파덱스 G-100)(ø2.0×90cm)에서 다시 겔 여과시켜,정제된 본 발명의 물질 0.95mg(로우리 법에 의해 측정)을 얻었다.

본 발명의 물질은 세척 침강물에 대하여 최소한 등몰량인 트리스-염산 완충액과 계면활성제를 사용함으로써 효율적으로 추출될 수 있다는 것을 상기 결과에 의하여 알 수 있다.

[실시예 5]

실시예 1의 (ⅰ)과 (ⅱ)의 방법과 같은 방법으로 제조된 추출물을 40~80%의 각각 다른 포화도를 갖는 황산암모늄 용액과 혼합하고, 4℃에서 30분 이상 정치 시킨 후, 7,000r.p.m.에서 15분간 원심분리시켜, 상청액과 침강물을 각각 분리하였다.

상청액과 침강물을 각기 50㎖의 트리스-염산완충액(pH 7.4)에 대하여 4℃에서 하룻밤 투석시킨 후 농축시키고, 실시예 2와 같은 방법에 따라 본 발명의 물질을 정량적으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타냈다.

[표 8]

상기 결과로부터, 본 발명의 물질은, 킬레이트제 추출물을 40% 이하의 포화도를 갖는 황산암모늄 용액으로 처리하여, 불순물을 제거하고, 처리된 추출물을 80% 이상의 포화도를 갖는 황산암모늄 용액을 사용하여 농축시킴으로써 분리될 수 있다는 것을 위의 결과로 알 수 있다.

[실시예 6]]

(ⅰ) 인간의 태반 4개 (약 1,950g)를 생리식염수로 충분히 세척하고, 막과 혈관을 제거한 후 얇게 썰었다. 50mM의 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 2ℓ를 첨가한 후, 폴리트론에 의해 여러 조각으로 자르고 테프론(Teflon) 호모나이저로 분쇄하였다. 생성된 호모지네이트를 7,000r.p.m.에서 15분간 윈심분리시켜 상청액을 채집하였다.

(ⅱ) 상청액 55,000g을 1시간 동안 초원심분리시켜, 침강물의 마이크로좀 획분을 얻었다. 마이크로좀 획분을 20mM 트리스-염산완충액(pH 7.4) 50mM에 현탁시키고 10% 트리톤 X-100 10㎖과 혼합한 후 초음파처리를 하였다. 그 후, 혼합비가 3:2인 에탄올과 에테르의 냉혼합용매 500㎖를 첨가하고 저온실(4℃)에서 2시간 동안 진탕하였다. 진탕용액을 2,000r.p.m.에서 10분간 원심분리하고, 생성된 침강물을 냉에테르 500㎖로 현탁시키고, 진탕한 다음, 2,000r.p.m.에서 10분간 원심분리시켜 침강물을 채집하였다. 침강물을 20mM의 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 약 50㎖에 현탁시키고, 초음파 처리후, 105,000g에서 1시간동안 초원심분리를 시켜 상청액(마이크로좀-용해성 획분) 53㎖를 얻었다.

(ⅲ) 단계(ⅱ)에서 얻은 용액을 콘카나발린 A 세파로스 컬럼(ø1.4×5.5cm)에 통과시켜 OD₂₈₀의 흡수성을 나타내는 획분 63㎖를 비흡수 획분으로부터 채집하였다. 이 획분을 DEAE-세파덱스 컬럼(ø1.4×8.5cm)에 흡착시키고, 20mM의 트리스-염산 완충액(pH 7.4)으로 충분히 세척하였다. 이어서, 0~0.5M의 염화나트륨을 함유하는 동일한 완충액 150㎖를 사용하여 각 획분 3㎖씩을 직선 농도 구배법에 따라 용출되도록 하였다. 활성획분 64㎖를 농축시키고 세파크릴(Sephacryl) S-200을 사용하여 겔 여과(ø2.5×8.6cm)시킨 후, 각각의 획분이 3㎖씩 되도록 생리식염수를 사용하여 용출시켰다. 그 결과, 활성을 나타내는 85에서 95까지의 획분 33.5㎖를 얻었다. 활성은 칼슘재가응고법에 따라 측정하였다.

(ⅳ) 세파덱스 G-100을 사용하여 획분들을 겔 여과(ø2.0×90cm)시키고, 각각의 획분이 2㎖씩 되도록 생리식염수로 용출시켜 활성획분 74~89를 얻었다. 이 획분들을 한외 여과에 의해 농축시켜 본 발명 물질의 정제된 제제 3.0㎖[단백질 함량 : 3.8mg(Lowry법)]을 얻었다. SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의하여 단일 띠를 나타내는 이같은 본 발명의 물질은 단일성분이라고 생각된다.

[실시예 7]

(ⅰ) 인간의 태반 45개 (약 20kg)를 생리식염수로 충분히 세척하고, 막을 제거한 후,잘게 썰었다. 잘게 썰어진 태반에다 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 약 16ℓ를 첨가한 후, 워링혼합기와 폴리트론에 의해 여러 조각으로 분쇄하였다. 생성된 호모지네이트를 7,000r.p.m.에서 15분간 윈심분리시켜 상청액을 채집하였다. 원심분리에 의해 얻어진 침강물을 다시 50㎖ 트리스-염산완충액(pH 7.4) 약 13ℓ와 혼합하고 잘게 썬 다음, 원심분리시켜 상청액을 얻었다.

(ⅱ) 두번에 걸친 잘게 썰기 작업과 원심분리 작업으로 얻어진 상청액들을 합하고 (약 30ℓ), 샤프리스(sharpless) 초고속원심분리기를 사용하여 45,000r.p.m. 에서 다시 원심분리하여 마이크로좀 획분을 침강물로 얻었다. 그 후,50㎖ 트리스-염산완충액(pH 7.4) 3ℓ를 마이크로좀에다 첨가하고 테프론 호모지나이저에 의해 잘게 갈은 후, 샤프리스 초고속 원심분리기를 사용하여 수거함으로써 세척된 마이크로좀을 얻었다.

(ⅲ) 이렇게 하여 얻어진 마이크로좀에다 20mM EDTA가 함유된 50mM의 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 약 4ℓ를 첨가하고 분쇄한 후 마그네틱 스터더를 사용하여 하룻밤 교반하였다. 그런 다음, 이 혼합물을 샤프리스 초고속 원심분리기로 다시 원심분리시켜, 상청액으로 마이크로좀으로부터 EDTA 추출물을 얻었다.

(ⅳ) 마이크로좀으로부터 분리한 EDTA 추출물을 투석시켜 EDTA를 제거한후, 실시예 1과 같은 방법에 따라 이온교환크로마토그라피하고, 블루 세파로스에 통과시키고 겔 여과 함으로써 정제하였다. 그 결과, 태반 약 20kg의 마이크로좀으로부터 항혈액 응고물질 95mg을 얻었다.

[실시예 8]

실시예 1에서 얻어진 본 발명 물질의 항혈액 응고작용을 트롬보엘라스토그라피에 의해 측정하였다.

(1) 신선한 혈액에 첨가하는 실험(측정방법) :

본 발명에 의한 물질의 생리식염수(최종 농도 : 0, 0.15, 0.5, 1.5, 5, 15㎍/㎖)10㎕를 신선한 혈액 490㎕에 첨가하고 충분히 혼합한 후, 이 혼합물을 트롬보엘라스토그라피에 걸어 트롬보엘라스토그램을 70분에 걸쳐 얻었다. r값과 R값의 전체 시간을 항혈액 응고시간으로서 측정하였다.

사용된 혈액은 토끼 및 사람의 혈액이었다. 그 결과를 본 발명의 물질을 첨가하지 않고서 얻어진 대조값에 대한 비율로 표시하였다.(하기 표 9).

[표 9]

응고시간-연장 비율(%)

(2) 혈액 채취후 10분간 실온에서 정치시킨 혈액에 첨가하는 실험:

(측정방법)

실험(1)에서와 같은 방법으로 측정하였다.

그 결과를 하기 표 10에 나타냈다.

[표 10]

상기 (1)과 (2)의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명 물질의 항혈액 응고활성은 혈액을 채취한 바로 직후보다는 응고시스템이 작용하기 시작한 상태에서 첨가했을 때에 더 우수하다.

(3) 조직 트롬보플라스틴(TTP)이 첨가된 혈액에다 첨가하는 실험 :

(ⅰ) 첨가된 TTP의 농도와 응고시간과의 관계 :

(측정방법)

토끼의 혈액을 채취한 후 즉시 TTP를 0~4.0㎍/㎖ (최종농도)의 양으로 첨가하고, 실험(1)에서와 같은 방법으로 응고시간을 측정하였다. 그 결과를 제1도에 나타냈다.

TTP를 약 1㎍/㎖ 만큼 첨가했을 때 응고시간은 반으로 줄어들 수 있었고, 응고가 촉진되었다는 것을 제1도의 결과에 의해 알 수 있다.

(ⅲ) TTP가 첨가된 혈액에 첨가하는 실험 :

(측정방법)

채취후에 즉시 얻은 혈액 480㎕에 TTP의 생리 식염수용액(최종농도 : 0~2 ㎍/㎖)10㎕와 본 발명 물질의 생리식염수 용액 (최종농도 : 15 ㎍/㎖)10㎕를 첨가하고 혼합하였다. 응고시간을 실험(1)에서와 같은 방법으로 측정하였다.

토끼의 혈액을 사용한 결과가 제2도에 나와 있고 인간의 혈액을 사용한 결과는 제3도에 나와 있다.

위의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명 물질의 항혈액 응고작용은 응고가 악화된 상태에서 보다 더 효과적으로 전개된다.

[실시예 9]

(제제)

본 발명의 물질 1mg

(실시예 1에서 얻어진 것)

알부민 5mg

만니톨 25mg

염화나트륨 1.95mg

인산나트륨 3.85mg

위의 성분들을 주사용 증류수 2㎖속에 용해시키고, 살균 유리병속에 넣은후, -30℃~-40℃에서 2시간동안 1차 동결시키고, 0.05~0.1Torr의 진공하에 -30℃~20℃의 온도에서 35시간 동안 1차 건조시킨후, 0.01~0.05Torr의 진공하에 30℃에서 5시간동안 2차 건조시켜 주사용액을 얻었다.

Claims

인간의 태반을 균질 분쇄시키고, 생성 호모지네이트를 2,000~7,000r.p.m.에서 원심분리하고, 필요에 따라, 생성 상층액을 50,000~100,000xg에서 초고속 원심분리한후, 계면활성제 또는 킬레이트 제를 사용하여 잔사 또는 상청액에 함유된 마이크로좀 획분으로부터 항혈액 응고물질을 추출시키고, 그 물질을 추출물로부터 정제 및 분리시키는 단계들로 이루어진 하기 성질을 갖는 인간 태반 유래의 항혈액 응고 물질의 제조방법.

(1) 분자량(SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 환원상태) : 34,000±2,000

(2) 등전점(암포라이트를 사용하는 등전점 컬럼 전기영동) : 4.7±0.1

(3) 안정성

(a) 50℃, 30분간 가열처리하여 실활

(b) pH4~10에서 안정

(c) 혈장중 37℃, 30분 동안 안정

(4) 작용

(a) 칼슘재가응고(recalcification) 시간을 연장

(b) 프로트롬빈 시간을 연장

(c) 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간을 연장

(5) 아미노산 분석

아미노산 분석 결과, 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루타민산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 1/2 시스틴, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 리신 및 아르기닌의 존재가 확인됨.