JPS6351140B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はタンパク質水解物からアミノ酸を回収
する方法に関する。

植物性又は動物性タンパク質からアミノ酸を回
収するには、タンパク質をまず各成分（すなわち
個々のアミノ酸）に分解しなくてはならない。既
知の酸加水分解法では、タンパク質を塩酸又は硫
酸と共に長時間加熱する。その他の既知の方法に
は、アルカリによるタンパク質加水分解及び酵素
的加水分解がある。

タンパク質水解物からアミノ酸を回収する方法
として、諸種の特別の沈殿法が提示されてきた。
これらの沈殿には芳香族スルホン酸、ピクリン
酸、水銀及び銅塩を使用する。これらの方法は沈
殿剤を回収する必要がある点と有機溶媒を使用す
る点から、非常に複雑である。

エチルエステルの蒸留によるアミノ酸の分離
は、現在ではほとんど用いられない。イオン交換
体を用いればアミノ酸の分析分離をきわめて有効
に実施できる。しかしアミノ酸の分取回収におい
ては、大きな分離カラムが必要である点や、溶液
の希釈度が大きい点及び溶離に使用する緩衝剤に
よるアミノ酸溶液の汚染という難点が生ずる。

本発明は、より簡便でかつより低い経費でより
高い収率が得られる（すなわち工業規模で実施で
きる）ようなタンパク質水解物らアミノ酸を回収
する新規の分離方法の開発をめざした研究の結果
である。

本発明の方法は、水解物を中和した後で分別
過することにより別々に異なる組成をもつアミノ
酸分画を得ることを特徴とする。

タンパク質水解物の中和段階で、難溶性のアミ
ノ酸が異なつた速度で晶出することが判明した。
中和後すぐに沈殿する１番めの分画はＬ―ロイシ
ンに富み、一方少なくとも３日間の結晶期間を経
た後で得られる分画はＬ―チロシン及びＬ―シス
チンに富む。難溶性のアミノ酸を少なくとも２種
の分画に分ける点は、本発明の特色の一つであ
る。

本発明の方法の実施に用いる出発物質は、Ｌ―
チロシン、Ｌ―ロイシン、及びＬ―フニルアラニ
ンに富む諸種のタンパク源（例えば脱糖した糖
密、穀物又はトウモロコシの胚、油かす、微生物
特に酵母又はカゼイン）から得ることができる。
上記のようなタンパク源のバラスト物質を適宜除
去した後、酸加水分解して得られるものが好まし
い。

本発明による分離法の以後の好ましい諸段階に
ついて以下に記す。

Ｌ―シスチン及びＬ―チロシンの回収 シスチン及びチロシンの分離は困難である。と
いうのはこの２種のアミノ酸は共に双極状である
のできわめて水に溶けにくいからである。この双
極状態を陰イオンに変えることにより、所定のPH
範囲内ではＬ―シスチンの溶解度がＬ―チロシン
の溶解度よりも急速に増すことが判明した。例え
ばPH値7.0では0.04％のＬ―チロシンと0.02％のＬ
―シスチンが溶けているが、PH値9.2では0.04％
のＬ―チロシンと1.0％のＬ―シスチンが溶ける。
アミノ酸（Ｌ―チロシン及びＬ―シスチン）の溶
解度のこの比較的狭範囲のPH（9.0ないし10.0）
における変化を用いて、この２種のアミノ酸を分
離することができる。

したがつてＬ―チロシンの回収が可能な方法の
１つは以下の特徴をもつ。Ｌ―チロシンに富む分
画をPH値10ないし11にて溶解させ、得られた溶液
を過してPH値8.5ないし10（9.5が好ましい）に
てＬ―チロシンを沈殿させ、分離して再結晶によ
り精製する。

Ｌ―シスチンの回収が可能な方法の１つは以下
の特徴をもつ。Ｌ―チロシンの分離後得られた溶
液のPH値を3.0ないし6.0に調整し、沈殿したＬ―
シスチンを分離して再結晶により精製する。

Ｌ―ロイシンの回収 ２種のアミノ酸異性体であるＬ―ロイシンとＬ
―イソロイシンとは物理的性質がきわめて似てい
るので、分離が困難である。

双極状態を陽イオンに変えると、所定のPH範囲
内ではＬ―イソロイシンの溶解度がＬ―ロイシン
の溶解度よりも急速に増すことが判明した。飽和
塩化ナトリウム溶液中では、PH値6.0では0.4％の
Ｌ―ロイシンと0.5％のＬ―イソロイシンが溶け
ているが、PH値1.5では1.1％のＬ―ロイシンと1.7
％のＬ―イソロイシンが溶けている。Ｌ―イソロ
イシンが所定の濃度になるように溶液を調整する
ことにより、PH1.0ないし2.0にてＬ―ロイシンを
沈殿させることができる。Ｌ―メチオニンが存在
する場合はさらに問題点が生じる。なぜならこの
アミノ酸はＬ―メチオニンと共沈殿を生ずるから
である。したがつて酸化（Ｌ―ロイシンの沈殿前
が好ましい）によりＬ―メチオニンを可溶性メチ
オニンスルホキシドに変えておく。

ゆえにＬ―ロイシンの回収が可能な方法の１つ
は以下を特徴とする。Ｌ―ロイシンに富む分画を
酸に溶かし、酸化剤を加えてＬ―メチオニンを酸
化し、PH値1.0ないし2.0にて粗製Ｌ―ロイシンを
沈殿させるが、その際に溶液のＬ―イソロイシン
含量1.0ないし1.5％に調整するのが好ましい。

1.0ないし2.0の範囲内の正確なPH値は、Ｌ―ロ
イシンに富む分画中のＬ―チロシン含量による。
同じPH範囲内で沈殿過程をくり返すことにより、
Ｌ―ロイシンをさらに精製してもよい。

Ｌ―フエニルアラニン、Ｌ―チロシン及びＬ―ロ
イシンの抽出 Ｌ―ロイシンの沈殿後得られる母液はアミノ
酸、Ｌ―フエニルアラニン、Ｌ―チロシン及び残
存するＬ―ロイシン）を含有する。水不混和性ア
ルコール）を用いると、塩化ナトリウムを含有す
る上記の溶液からこれらのアミノ酸の塩酸塩がき
わめて高収率で回収できることが判明した。ブタ
ノール又はイソブタノールを用いた、水溶液から
のアミノ酸及びアミノ酸塩酸塩の抽出は既知であ
る。しかしこの抽出により得られる収率は低い。
なぜならブタノール／水系中のアミノ酸又はアミ
ノ酸塩酸塩の分配係数は1.0以下だからである。
この溶液を塩化ナトリウムで飽和させると、上記
分配係数を10以上の値まで上昇させることができ
る。

したがつてＬ―ロイシン、Ｌ―フエニルアラニ
ン及びＬ―チロシンの回収が可能な方法の１つは
以下の特徴をもつ。塩化ナトリウムで飽和させた
上記アミノ酸の塩酸塩の溶液を、水不混和性アル
コール（特にイソブタノール又はブタノール）に
て抽出する。

このアルコール抽出物を水洗すると、抽出物中
のバリン及びチロシン含量をさらに低下させるこ
とができる。この水洗は抽出カラムの頂部から直
接行つてもよいし、又は別の装置を用いてもよ
い。水を加えた後で、アルコールを共沸蒸留して
アルコール抽出物から除去し、抽出カラムに戻し
てもよい。弱塩基性の陰イオン交換体を用いてア
ミノ酸塩酸塩水溶液中の塩酸を除去し、中性溶液
を濃縮した後でＬ―ロイシン、Ｌ―フエニルアラ
ニン及びチロシンの混合物を得ることもできる。

Ｌ―フエニルアラニンの回収 通常の場合Ｌ―フエニルアラニンはＬ―チロシ
ンと共に酸性溶液から活性炭に吸着させることに
より回収する。この方法にはいろいろな欠点があ
る。例えば活性炭を酢酸で処理して活性化する必
要があり、フエニルアラニンの吸着量（活性炭の
容積に応ずる）がきわめて少なく、また有機溶媒
（例えばピリジン又はアニリン）を用いてＬ―フ
エニルアラニンを溶難しなくてはならない。

したがつて本発明によれば、中性の塩を含まな
いアミノ酸溶液を水酸化物の形をとる強塩基性陰
イオン交換体で処理することにより、Ｌ―フエニ
ルアラニン及びＬ―チロシンを吸着させることが
好ましい。なぜならこの方法で吸着させると、活
性炭上に吸着させる場合と比較して単位容量あた
り５倍量のＬ―フエニルアラニンの吸収が可能で
あると判明したからである。

ゆえにＬ―フエニルアラニンとＬ―チロシンの
分離が可能な方法の１つは以下を特徴とする。上
記アミノ酸の塩酸塩を含有する中性溶液を弱塩基
性及び強塩基性陰イオン交換体上を通過させる。

また強塩基性陰イオン交換体を単に塩酸溶液で
溶離すれば、イオン交換体からＬ―フエニルアラ
ニン及びＬ―チロシンを完全に除去できることが
判明した。４％の水酸化ナトリウム溶液を用いて
慣用の方法で再生を行つた場合、Ｌ―フエニルア
ラニン及びＬ―チロシンは部分的に除去できるだ
けである。

陰イオン交換体の溶出液はＬ―フエニルアラニ
ン及びＬ―チロシンの塩酸塩を含有する。6HCl
中における溶解度の挙動を検定すると、Ｌ―フエ
ニルアラニン塩酸塩は冷たい液にはほとんど溶け
ず、加熱するとよく溶けることがわかる。Ｌ―チ
ロシンは冷たい6n HCl中においてより溶解しや
すい。したがつて溶出液を濃縮しその塩酸含量を
20ないし25％に調整し、70ないし90℃にて塩化ナ
トリウムを分離して冷却することによりＬ―フエ
ニルアラニン塩酸塩を晶出させる。次にＬ―フエ
ニルアラニン塩酸塩を再結晶により精製してもよ
く、次に弱塩基性陰イオン交換体を用いて塩酸を
除去する。最後に中性溶液を蒸発させて濃縮する
と、純粋なＬ―フエニル―アラニンが得られる。

例 １ 酸性タンパク質水解物を中和し、晶出したＬ―
ロイシンに富むアミノ酸混合物を直ちに別す
る。少なくとも３日間の結晶化期間を経た後、難
溶性アミノ酸の２番めの分画を分離する。このア
ミノ酸混合物をPH10.0の希水酸化ナトリウム中に
溶かし、水を加えてＬ―シスチン濃度を1.0ない
し1.5％に調整する。溶液を過した後、PH値9.5
にてＬ―チロシンを沈殿させる。24時間の結晶化
期間を経た後、粗製Ｌ―チロシンを別して水洗
し、酸中に溶かしてPH1.5ないし1.8にて加熱して
沈殿させる。この沈殿条件下で、結晶性の純粋な
Ｌ―チロシンを得る。

粗成Ｌ―チロシンの液を酸を用いてPH値7.0
ないし2.0（PH値5.0が好ましい）に調整し、24時
間後に晶出した粗製Ｌ―シスチンを分離する。こ
の粗製Ｌ―シスチンを酸中に溶かし、活性炭を加
えて残存するＬ―チロシンを吸着させる。過
後、PH値2.0にてＬ―シスチンを沈殿させて分離
する。

例 ２ タンパク質水解物を中和した後、沈殿した難溶
性アミノ酸をＬ―ロイシンに富む１番めの分画と
して分離する。このアミノ酸混合物をPH値0.5に
て溶かし、水を加えてＬ―イソロイシン濃度を約
1.5％に調整する。Ｌ―メチオニン含量を測定し
た後、90℃にて等モル量の過酸化水素を加えてＬ
―メチオニンを酸化する。次にこの溶液に活性炭
を加えた後で過し、希水酸化ナトリウムにより
PH値を1.0ないし1.5に調整し、冷却後晶出した粗
製Ｌ―ロイシンをを分離する。この粗製Ｌ―ロイ
シンをPH0.5にて再度溶かし、PH1.0ないし2.0にて
沈殿させることによりさらに精製する。Ｌ―ロイ
シンが必要な純度に達するまで、この過程をくり
返す。

PH値の選択は溶液中のＬ―チロシン含量により
決まる。溶液中のＬ―チロシン含量が0.65，0.8，
1.0，1.2，1.4，1.6及び1.8％であれば、PH値はそ
れぞれ1.0，1.65，1.52，1.42，1.33，1.26及び1.16
を選択する。

例 ３ Ｌ―ロイシンを沈殿させた液を塩酸を用いて
PH値0.5に調整し、適宜塩化ナトリウムで飽和さ
せる。この溶液を抽出カラム中でイソブタノール
を用いて向流にて抽出する。イソブタノールのア
ミノ酸溶液に対する比率は１：１又は１：２に調
整する。この方法ではＬ―ロイシン、Ｌ―イソロ
イシン及びＬ―フエニルアラニンというアミノ酸
を約90％レベルまで抽出する。Ｌ―バリン及びＬ
―チロシンというアミノ酸は約50％レベルまで抽
出される。イソブタノール抽出物を水洗すると、
Ｌ―バリン及びＬ―チロシン含量がさらに低下す
る。この水洗操作は抽出カラムの頂部から直接実
施する。水を加えた後、イソブタノール抽出物か
らイソブタノールを共沸蒸留して除き、抽出カラ
ムに戻す。弱塩基性の陰イオン交換体を用いてア
ミノ酸塩酸塩水溶液から塩酸を除去し、中性溶液
を中和するとＬ―ロイシン、Ｌ―イソロイシン及
びＬ―フエニルアラニンの混合物を得る。

例 ４ イソブタノールで抽出して得たＬ―ロイシン、
Ｌ―イソロイシン、Ｌ―フエニルアラニン及びＬ
―チロシンのアミノ酸塩酸塩を、弱塩基性陰イオ
ン交換体上を通過させて塩酸を分離する。この中
性アミノ酸混合物を、水酸化物の形をとる強塩基
性の陰イオン交換体上を通過させる。カラムから
出た液体中にＬ―ロイシン及びＬ―イソロイシン
に純粋な溶液を得る。この溶液から既知の方法で
銅錯体をメチルアルコールと共に抽出することに
より、純粋なＬ―イソロイシンが得られる。

例 ５ Ｌ―フエニルアラニン及びＬ―チロシンを充填
した陰イオン交換体カラムを、１ベツド容量の10
％塩酸にて再生し、次に１ベツド容量の４％水酸
化ナトリウム溶液にて再生する。塩酸再生からの
溶出液を採取して濃縮する。濃塩酸を加えること
により酸濃度を少なくとも20％に調整し、存在す
る塩化ナトリウムを70ないし90℃の温度で分離す
る。溶液を冷却した後、Ｌ―フエニルアラニン塩
酸塩が晶出するので、6n HClよりこれを再結晶
する。遊離状態のＬ―フエニルアラニンを回収す
るには、Ｌ―フエニルアラニン塩酸塩を水に溶か
し、弱塩基性の陰イオン交換体を用いて塩酸を除
去する。中性溶液を濃縮すると、純粋なＬ―フエ
ニルアラニンが晶出する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ―ロイシン、Ｌ―フエニルアラニン、Ｌ―
   チロシンおよびＬ―シスチンに富むタン白源を酸
   加水分解して得たタン白加水分解物からこれらの
   アミノ酸を回収する方法において、第１工程にお
   いて、タン白加水分解物を中和し、中和直後に沈
   澱する富Ｌ―ロイシン分画を中和加水分解物から
   先ず分別し、ついで中和後少なくとも３日間放置
   中に結晶化する富Ｌ―チロシン分画を中和加水分
   解物から分別し、第２工程において、第１工程よ
   り得た富Ｌ―チロシン分画をPH10―11のアルカリ
   溶液に溶解し、生成溶液を濾過し、Ｌ―チロシン
   をＬ―シスチンからPH8.5―9.5で沈澱分別しつい
   でＬ―チロシン回収残渣をPH３―６に調整してＬ
   ―シスチンを得、第３工程において、第１工程よ
   り得た富Ｌ―ロイシン分画を酸に溶解し、酸化剤
   をそれに加えてＬ―メチオニンを酸化し、Ｌ―ロ
   イシンをPH1.0―2.0でそこから沈澱させ、第４工
   程において、第３工程におけるＬ―ロイシンの沈
   澱後に得た液をHClでPH0.5に調整しかつ塩化ナ
   トリウムで飽和させ、この溶液を水不混和性アル
   コールで抽出して、Ｌ―ロイシンとＬ―フエニル
   アラニン混液を得、第５工程において、アルコー
   ルを留去した後、これらのアミノ酸の塩酸塩を含
   む溶液を弱塩基アニオン交換体および強塩基アニ
   オン交換体に通し、強塩基アニオン交換体に吸着
   したＬ―フエニルアラニンを塩酸で溶離しそして
   Ｌ―フエニルアラニン塩酸塩を20―25％塩酸より
   晶出させることを特徴とする、上記アミノ酸の回
   収方法。