JPS63503309A

JPS63503309A - Atrial sodium excretion increased peptide receptor protein

Info

Publication number: JPS63503309A
Application number: JP62503204A
Authority: JP
Inventors: シェンク，デール　ビー．
Original assignee: カリフォルニア　バイオテクノロジー　インコーポレイテッド
Priority date: 1986-05-09
Filing date: 1987-05-11
Publication date: 1988-12-02
Also published as: AU7481087A; WO1987006938A1; EP0267272A1; EP0267272A4; US5512455A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】心　ナトリウムト　ペプチドレセプタータンパク肢歪分互本発明は、心房性ナトリウム排出増加ペプチドレセプタータンパク、天然型および合成レセプタータンパクの両者の生産方法、およびレセプタータンパクの使用方法に関する。[Detailed description of the invention] heart sodium peptide receptor protein limb strain distribution The present invention provides atrial sodium excretion augmentation peptide receptor protein, naturally occurring and methods for producing both synthetic and synthetic receptor proteins, and uses of receptor proteins. Regarding the method.

光里■宜景心房性ナトリウム排出増加ペプチド（ＡＮＰ）は、＠乳動物の心房から抽出され、ナトリウム排出増加、および血管弛緩に効力のあるポリペプチドである。ＤｅＢｏｌｄら、（１９８１）Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ。Mitsuri Yikei Atrial sodium efflux peptide (ANP) is extracted from mammalian atria. , a polypeptide that is effective in increasing sodium excretion and vasorelaxation. De Bold et al. (1981) Life Sci.

２８：　８９−９４；Ｎａｐｉｅｒら、（１９８４）　Ａｎｎ、Ｒｅｐ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、　１９：２５３−２６２；Ｋａｎｇａｗａら、（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏａ＋＋ＩＩｕｎ、１１８　：１３１− １３９；Ｆｌｙｎｎら、（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１１７　：８５９−８６５；Ｎａｐｉｅｒら、（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１２０　：９８１− ９８８；Ｃｕｒｒｉｅら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３：６７−６９；　Ｔｈ１ｂａｕｌｔら、　（１９８４）ＦＥＢＳＬｅｔｔ、　１６７　：３５２ −３５６ＨＡｔｌａｓら、　（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９　ニア１７−７１９゜これらのペプチドには、様々な名前（例えば、アトリオペプチンおよびカルディオナトリン）が与えられているが、ここではまとめて、八ＮＰとする。28: 89-94; Napier et al. (1984) Ann, Rep, Med , Chem, 19:253-262; Kangawa et al. (1984) Bio chem, Biophys, Res, Coa++IIun, 118:131- 139; Flynn et al. (1983) Biochem, Biophys, Res , Commun, 117:859-865; Napier et al. (1984) B iochen+, Biophys, Res, Commun, 120:981- 988; Currie et al. (1984) Science 223:67-69; Th1bault et al. (1984) FEBSLett, 167: 352 -356 HAtlas et al. (1984) Nature 309 Near 17-7 19° These peptides have various names (e.g. atriopeptin and carbonate). (rudionathrine), but here they are collectively referred to as eight NPs.

これらのペプチドのクローン化ｃＤＮＡの配列より、該ペプチドは、前駆体タンパク（その構造が最近明らかとなっている）のカルボキシル末端領域に全て由来することが決定されている。Ｙａｏ＋ａｎａｋａら、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９　ニア１９−７２２ＨＭａｋｉら、　（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９ニア２２−７２４；　Ｏｉｋａｗａら、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９ニア２４−７２６；Ｓ　ｅ　ｉ　ｄ　ｍ、ａ　ｎ　ら、（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２５　：３２４−３２６；Ｆｌｙｎｎら、　（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８　：３２３−３２５゜サイズが異なるＡＮＰは、翻訳後プロセッシング、あるいは単離工程における人為的な分解によるためであると考えられる。いくつかの合成ＡＮＰもまた。調製され、天然型ペプチドの生物学的特性の全てを有することが示されている。５ｅｉｄａｈら、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８旦２６４０−２６４４；Ｒ，Ｐ、Ｎｕｔｔら＋　ｉｎ　ＰＥＰＴＩＤＥＳ　１９８４（Ｕ、Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ　ｌｉ。The sequences of the cloned cDNAs for these peptides indicate that the peptides are derived from the precursor proteins. All derived from the carboxyl terminal region of Pak (the structure of which has recently been revealed) It has been decided to do so. Yao + anaka et al. (1984) Nature e 309 Near 19-722 HMaki et al. (1984) Nature 3 09 Near 22-724; Oikawa et al. (1984) Nature 3 09 Near 24-726; S e i d m, an et al. (1984) 5c ience 225:324-326; Flynn et al. (1985) Sci. ence　228　:323-325゜ANPs with different sizes are processed in the post-translation process. This is thought to be due to washing or artificial decomposition during the isolation process. Ru. Also some synthetic ANPs. Biological properties of prepared and native peptides It has been shown that it has everything. 5eidah et al. (1984) Proc. Natl, Acad, Sci, USA 8th 2640-2644; R, P, Nu tt et al. + in PEPTIDES 1984 (U, Ragnarsson l i.

１．９８５）Ａｔｌａｓら、（前出）。1.985) Atlas et al., supra.

ＡＮＰは、血圧恒常性、細胞外体液容積の制御、およびレニン−アンジオテンシン系と、他のホルモン系および神経伝達物質系とにおける高血圧効果に対する拮抗剤として９重要な役割を果たしていることが示されている。ＡＮＰはラジオイムノアッセイにより血中に検出されている。Ｇｕ　ｔｋｏｗｓｋａら、　（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｏｎ、　１２５　：３１５−３２３；　Ｔａｎａｋａら、　（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｉ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１２４　：６６３−６６８゜ＡＮＰの生物学的効果は、細胞膜の特異的なレセプターに対するＡＮＰの結合により起きる。特異的なレセプターの存在は２種々の腎臓。ANP regulates blood pressure homeostasis, extracellular fluid volume control, and renin-angiotensile antagonism to hypertensive effects in the hormone system and other hormonal and neurotransmitter systems. It has been shown to play an important role as an anti-inflammatory agent. ANP is radio It has been detected in the blood by immunoassay. Gutkowska et al. (19 84) Biochem, Biophys, Res, Common, 125: 315-323; Tanaka et al. (1984) Biochei, Biop hys, Res, Commun, 124:663-668° Biology of ANP This effect occurs through the binding of ANP to specific receptors on the cell membrane. Special The presence of different receptors in two different kidneys.

副腎皮質、および血管組織中で証明されている。５ｃｈｅｎｋら（１）、（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：１４８８７−１４８９０；Ｖａｎｄｌｅｎら、　（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：１０８８９−１０８９２ＨＭｉｓｏｎｏら、（１９８５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。It has been demonstrated in the adrenal cortex, and vascular tissue. 5chenk et al. (1), (19 85) J. Biol. Chem. 260:14887-14890; Vand. len et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:10889-1 0892HMisono et al. (1985) Biochem.

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１３０　：９９４−１００１；Ｈｉｒｏｓａら、（１９８５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。Biophys, Res, Commun, 130:994-1001;Hi Rosa et al. (1985) Biochem.

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１３０　：５７４−５７９；Ｙｉｐら、（１９８５）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。Biophys, Res, Commun, 130:574-579; Yip et al. (1985) J. Biol. Chem.

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：　５９４６−５９５０ＨＨｉｒａｔａら＋（１９８４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。Sci, USA 81: 5946-5950Hhirata et al. (1984) Biochem, Biophys.

ＡＮＰには生物学的活性効果があるので、血中でのＡＮＰのレベルを制御することは、高血圧、ショックなどのような疾患を処置する治療のアプローチとなるであろう。しかし、治療のプロトコルを確立するためには、＠乳動物の血液中におけるＡＮＰレベルを測定する感度のよい定量法を使用することが必要である。そのような定量法はまた。高血圧のような疾患の診断を行うためにも用いられ得る。もし入手できるならば。Since ANP has biologically active effects, it is possible to control the level of ANP in the blood. is a therapeutic approach to treat diseases such as hypertension, shock, etc. Probably. However, in order to establish a treatment protocol, it is necessary to It is necessary to use sensitive quantitative methods to measure ANP levels in the blood. So Quantitative methods such as It can also be used to diagnose diseases like hypertension . If you can get it.

ＡＮＰレセプタータンパクは、これらの分析に容易に用いられ得る。現在の天然型ＡＮＰおよび合成ＡＮＰ　、そしてその類似物は、　ＡＮＰレベルを増加させることにより体液容積および血管機能の調整に用いられ得るが、効果的な治療をおこなうには。ANP receptor proteins can be easily used for these analyses. current natural type ANP and synthetic ANP, and their analogs, increase ANP levels. can be used to regulate fluid volume and vascular function by How to do it.

所望の細胞外体液容積および電解質恒常性を達成するために。to achieve the desired extracellular fluid volume and electrolyte homeostasis.

ＡＮＰレベルを減少させることが必要とされ得る。ＡＮＰレセプターの可溶画分が、治療のために血清レベルのＡＮＰを減少させるために用いられ得る。Decreasing ANP levels may be required. Soluble fraction of ANP receptor can be used to reduce serum levels of ANP therapeutically.

ＡＮＰレセプターを特徴付けるために種りの試みが行われてきているが、精製はなされていない。さらに、特徴付けを行うこのような試みにより矛盾する結果が生み出されてきている。例えば＋　５ｃｈｅｎｋら（１）、（前出）Ｇ　Ｖａｎｄｌｅｎら、（前出）ＨＭｉｓｏｎ。Separate attempts have been made to characterize ANP receptors, but purification has not been possible. Not done. Moreover, such attempts at characterization have led to contradictory results. It is being produced. For example, +5chenk et al. (1), (supra) G. Van dlen et al. (supra) HMison.

ら、（前出）；　Ｈｉｒｏｓｅら、（１９８５）、　（前出）；　Ｙｉｐら、（前出）を参照されたい。(supra); Hirose et al. (1985) (supra); Yip et al. (supra) Please refer to (mentioned above).

最近の研究により、２つ以上のＡＮＰレセプターが存在し得ることが示唆されている。ｌｅｉｔｍａｎら＋（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｔｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ。Recent research suggests that more than one ANP receptor may exist. There is. Leitman et al. (1986) Biochtm Biophys.

Ａｃｔａ　８８５ニア４−７５ＨＫｕｎｏら、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　：５８１７−５８２３（ラット肺からのＡＮＰ結合およびグアニル酸シクラーゼ活性の共精製）。ＡＮＰレセプターに関して、この他に興味あるのは９次の文献である：　Ｌｅｉｔｍａｎ　ら、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、２６１　：１１６５０−１１６５５；　Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈら、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　：１２９６０−１２９６４；　Ｈａｙａｓｈｉら、（１９８６）　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８５．ｐｐ、２７−３２；Ｈｉｒａｔａら＋（１９８５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１３２　：　９７１−９８４ｓＮａｐｉｅｒら、（１９８６）　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２４８　：５１６−５２２゜従って、精製ＡＮＰレセプタータンパクが入手でき、そして。Acta 885 Near 4-75 HKuno et al. (1986) J, Biol, C hem, 261:5817-5823 (ANP binding and guar from rat lung) co-purification of nilate cyclase activity). Is there anything else I'm interested in regarding ANP receptors? There are nine references: Leitman et al. (1986) J. Biot. , Chem, 261:11650-11655; Scarborough et al. , (1986) J. Biol. Chem., 261:12960-12964. ; Hayashi et al., (1986) Peptide Chemistry 1985. pp, 27-32; Hirata et al. (1985) Biochem , Biophys, Res, Comm, 132: 971-984sNap ier et al. (1986) Arch, Biochen+, Biophys, 2 48:516-522° Therefore, purified ANP receptor protein is available, and.

組換え手段を用いてその生産を促進する遺伝子が入手できることが非常に望ましい。レセプタータンパクに対するモノクローン抗体も有効である。なぜなら、それらは、レセプタータンパクを特徴付け、レセプタータンパクを発現している付加的な組織を同定し、そしてレセプターへのＡＮＰの結合を阻止するために使用し得るためである。It would be highly desirable to have genes available to facilitate their production using recombinant means. stomach. Monoclonal antibodies directed against receptor proteins are also effective. Because that They characterize the receptor protein and identify the adjuncts that express the receptor protein. Used to identify additional tissues and block ANP binding to receptors This is because it is possible.

ＡＮＰレセプターに関係しないいくつかのレセプター分子が。Some receptor molecules are not related to ANP receptors.

これまでに単離され、精製されている：讐ｉｍａｌａｓｅｎａら、　（１９Ｂ５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：１０６８９−１０６９７　（ブタＬＨ／ｈＣＧ　レセプター）；Ｐｅｔｒｕｚｚｅｌｌｉ　ら、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：３３２７−３３３１　（インシュリン　レセプター）；　５ｃｈｎｅｉｄｅｒら、（１９８２）　Ｊ。Previously isolated and purified: animalasena et al. (19B5 ) J, Biol, Chem, 260:10689-10697 (Pig LH/ hCG receptor); Petruzzelli et al. (1984) Proc , Natl, Acad, Sci, USA 81:3327-3331 (Inc. 5chneider et al. (1982) J.

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７　：２６６４−２６７３　（ＬＤＬ　レセプター）。Biol, Chem, 257:2664-2673 (LDL receptor) .

ｌＩＩと」丘本発明の目的は、天然型および合成の、精製ＡＮＰレセプタータンパクを提供することにある。lII and "hill" It is an object of the present invention to provide purified ANP receptor proteins, both natural and synthetic. There are many things.

本発明の他の目的は、天然型ＡＮＰレセプタータンパクの精製法を提供することにある。Another object of the present invention is to provide a method for purifying native ANP receptor protein. It is in.

本発明のさらに他の目的は、　ＡＮＰレセプタータンパクをコードするＤＮＡ分子を提供することにある。Still another object of the present invention is to obtain a DNA fragment encoding an ANP receptor protein. It is about providing children.

本発明のさらに他の目的は２組換えＤＮＡ法によりＡＮＰレセプタータンパクを生産する方法を提供することにある。Still another object of the present invention is to obtain ANP receptor protein by recombinant DNA method. The purpose is to provide a method of production.

本発明のさらに他の目的は、　ＡＮＰ　レセプタータンパク上のエピトープに結合する抗体、およびそのような抗体を生産する細胞系を提供することにある。Still another object of the present invention is to bind to an epitope on the ANP receptor protein. An object of the present invention is to provide antibodies that are compatible with the present invention, and cell lines that produce such antibodies.

本発明のこれらの、および他の目的は、以下の実施態様の１またはそれ以上により達成される。These and other objects of the invention may be achieved by one or more of the following embodiments. will be achieved.

ある実施態様においては１本発明は哺乳動物の心房性ナトリウム排出増加ペプチド（ＡＮＰ）　レセプタータンパクサブユニットを含む細胞非含有組成物を指向し、該レセプタータンパクサブユニットは、約６０．５００ダルトンの分子量を有し、該組成物中のタンパクの最低約７５重量％を含有する。In one embodiment, the present invention provides a mammalian atrial sodium excretion increasing peptide. Directed to cell-free compositions containing ANP receptor protein subunits The receptor protein subunit has a molecular weight of approximately 60.500 daltons. and contains at least about 75% by weight of protein in the composition.

他の実施態様においては１本発明は、　６０．５ｋｄ　ＡＮＰレセプターサブユニットとの実質的な相同性を有し、　ＡＮＰに結合するタンパクを指向している。In another embodiment, the present invention provides a 60.5 kd ANP receptor subunit. It has substantial homology with Nit and is directed toward proteins that bind to ANP. .

さらに他の実施態様においては９本発明は、以下の事項を包含する天然型のＡＮＰ　レセプタータンパクを精製する方法を指向している：（ｉ　）　ＡＮＰレセプターを有する哺乳動物細胞から調製される膜含有細胞画分を与えること；（ｉｉ）ｍ膜画分中のＡＮＰレセプタータンパクをＣ＋ｚＥ＋ｓ界面活性剤を用いて可溶化し、該ＡＮＰレセプタータンパクを含有する上清を調製すること：および（ｉｉｉ）該上清を、固定化ＡＮＰを含有するクロマトグラフィーカラムに、該ＡＮＰ　レセプタータンパクが該固定化ＡＮＰに結合するような条件下で通過させ１次いで結合したＡＮＰレセプタータンパクを該カラムから溶離し、精製されたへＮＰレセプタータンパクを与えることによって、該上清がらＡＮＰレセプタータンパクを精製すること。In yet another embodiment, the present invention provides a natural form of AN comprising: Directed to a method for purifying P receptor protein: (i) Membrane-containing cell fraction prepared from mammalian cells having ANP receptors to give one's share; (ii) ANP receptor protein in the m membrane fraction was purified using C+zE+s surfactant. to solubilize the ANP receptor protein and prepare a supernatant containing the ANP receptor protein: call (iii) Transfer the supernatant to a chromatography column containing immobilized ANP. Passed under conditions such that ANP receptor protein binds to the immobilized ANP. The bound ANP receptor protein is then eluted from the column and purified. By feeding the supernatant with NP receptor protein, the ANP receptor protein can be extracted from the supernatant. – To purify proteins.

本発明はまた。　ＡＮＰレセプタータンパクをコードするＤＮＡ配列を単離する方法を具体化する。この方法は、以下の事項を包含する：（ｉ）＠乳動物の細胞源から調製されたＤＮＡライブラリーを与えること；（ｉｉ　）　ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットの選択された領域との相同性を有するアミノ酸配列のコドンを含むｃＤＮ＾またはオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションすることによって、　該ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること；および（ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチドが選択的にハイブリダイズするＤＮＡ分子を１ＤＮＡライブラリーから単離すること。The present invention also includes: Isolate the DNA sequence encoding the ANP receptor protein Make the method concrete. This method includes: (i) providing a DNA library prepared from a mammalian cell source; (ii) Homology with selected regions of ANP receptor protein subunits A cDN^ or oligonucleotide protein containing a codon with an amino acid sequence having a By hybridizing with the DNA library, screening; and (iii) one DNA molecule to which the oligonucleotide selectively hybridizes; Isolating from a DNA library.

本発明の他の実施態様は２組換えベクターを含有する組成物であって、該ベクターは６０．５ｋｄ　ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列を含まない組換えベクターを実質的に含有しない。Another embodiment of the invention is a composition containing two recombinant vectors, the vector - has homology with the 60.5kd ANP receptor protein subunit A recombinant vector that contains a DNA sequence encoding an amino acid sequence but does not contain the DNA sequence. Contains substantially no vectors.

本発明の他の実施態様は、原核細胞および真核細胞のような細胞を指向しており、それらの細胞は上記ベクターまたはＤＮＡ配列により形質転換されている。本発明のさらに他の実施態様は、　ＡＮＰレセプターサブユニットを生産する方法を指向し、その方法は、上記細胞をＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを含むペプチドが発現される条件下で増殖させること、およびそれを回収すること、を包含する。Other embodiments of the invention are directed to cells such as prokaryotes and eukaryotes. , those cells have been transformed with the vector or DNA sequence described above. Book Yet another embodiment of the invention is a method of producing an ANP receptor subunit. The method is directed to the generation of cells containing ANP receptor protein subunits. growing the peptide under conditions in which the peptide is expressed, and recovering the same; includes.

本発明のさらに他の実施態様は、実質的に他の抗体を含有しない抗ＡＮＰレセプタータンパク抗体、そのような抗体を生産する哺乳動物の永久増殖性細胞系、およびそのような抗体によりＡＮＰレセプタータンパクを精製する方法を指向する。Still other embodiments of the invention provide anti-ANP receptors that are substantially free of other antibodies. protein antibodies, permanently proliferating mammalian cell lines that produce such antibodies, and and methods for purifying ANP receptor proteins with such antibodies. .

■皿公皿単産脱里第１図は、精製ＡＮＰレセプタータンパクに対する放射能標識化ＡＮＰ　（４− ２８）と種々のＡＮＰペプチドとの間の拮抗的結合を示す。■Sarako plate single production escape Figure 1 shows radiolabeled ANP (4- 28) and various ANP peptides.

第２図Ａは、精製ウシＡＮＰ　レセプターにより決定されたＮ末端アミノ酸配列、およびそれに対応し、　ｃＤＮＡライブラリーを調べるプローブとして用いられる合成オリゴヌクレオチドを示す。Figure 2A shows the N-terminal amino acid sequence determined from purified bovine ANP receptor. , and correspondingly, can be used as probes to investigate cDNA libraries. The synthetic oligonucleotide shown in FIG.

第２図Ｂは、　ＡＮＰレセプターＲＮＡ、および第２図Ａに示されるプローブを用いて得たｃＤＮＡクローンの説明図である。Figure 2B shows ANP receptor RNA and the probe shown in Figure 2A. FIG. 2 is an explanatory diagram of cDNA clones obtained using the method.

第３図は、ウシＡＮＰレセプターｃＤＮＡ配列、および予想されるアミノ酸配列である。Figure 3 shows bovine ANP receptor cDNA sequence and predicted amino acid sequence. It is.

第４図は、ウシＡＮＰ　レセプタータンパクのハイドロパシシティ（）Ｉｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）の特徴を示す。Figure 4 shows the hydropacity ()Iydr of bovine ANP receptor protein. opacity).

第５図は、ヒトＡＮＰレセプターｃＤＮＡ配列、および予想されるアミノ酸配列である。Figure 5 shows human ANP receptor cDNA sequence and predicted amino acid sequence. It is.

溌１ｊ」１■Ｔ礼呪本発明は、使用し得る型の精製ＡＮＰ　レセプタータンパクを提供する。精製ＡＮＰ　レセプタータンパクによって、アミノ酸配列が決定され、核酸プローブが設計され、そしてＡＮＰレセプター遺伝子がクローン化される。一般的には、　Ａｔ１ａｓ　ら。溌1j”1■T courtesy spell The present invention provides purified ANP receptor proteins of a type that can be used. Purification A The amino acid sequence is determined by the NP receptor protein, and the nucleic acid probe is The ANP receptor gene is designed and cloned. In general, At1as et al.

（前出）；　Ｙａｍａｎａｋａ　ら、（前出）ＨＭａｋｉら、（前出）ＨＯｉｋａｗａら、（前出）を参照されたい。一度クローン化されると、へＮＰレセプター遺伝子は３合成ＡＮＰレセプタータンパクを生産するのに用いられ得る。例えば、米国特許第４．４４０，８５９号；第４，４３６．８１５号；第４．４３１．７４０号を参照されたい。(supra); Yamanaka et al., (supra) HMaki et al., (supra) HOik See awa et al., supra. Once cloned, the NP receptor -gene can be used to produce three synthetic ANP receptor proteins. example For example, U.S. Patent Nos. 4,440,859; 4,436,815; 4,431 ．． See No. 740.

例えば患者の血清中のＡＮＰレベルを測定するために、拮抗結合分析においてレセプタータンパク（天然型または合成の）を用いることができる。　ＡＮＰ　レセプタータンパクは、天然型ＡＮＰの類似物がＡＮＰ　レセプターを結合する能力もしくはＡＮＰレセプターを阻害する能力について試験する際にも非常に有用である。　ＡＮＰレセプター結合部位のコンピューターモデルもまた。インビボにおいてＡＮＰレセプター部位を阻害もしくはＡＮＰレセプター部位に結合する新しい化合物を設計するためにも補助となり得る。For example, to measure ANP levels in a patient's serum, Scepter proteins (natural or synthetic) can be used. ANP Le The receptor protein is an analogue of natural ANP that has the ability to bind to the ANP receptor. Also very useful when testing for the ability to inhibit ANP receptors or ANP receptors. It is. Also a computer model of the ANP receptor binding site. in vivo inhibits or binds to the ANP receptor site in It can also be of assistance in designing new compounds.

”心房性ナトリウム排出増加ペプチドレセプタータンパク”または”ＡＮＰレセプター”とは、あらゆる哺乳動物起源由来の天然型ＡＮＰレセプタータンパクを意味する。ここで哺乳動物とは、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ９　ヒツジ、ネズミ、ラット。“Atrial sodium excretion augmentation peptide receptor protein” or “ANP receptor protein” "ANP receptor" refers to the natural ANP receptor protein derived from all mammalian sources. means. Mammals here include humans, cows, pigs, horses9 sheep, rats, rat.

ウサギ、ハムスター、およびヤギを包含するが、これらに限定されない。この用語はまた９合成ＡＮＰ　レセプタータンパクつまり１組換え技術もしくは直接的な化学合成により生産されたタンパクをも包含する。例えば、Ｃ１ａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、　（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３１　：１３４−１３９を参照されたい。ＡＮＰ　レセプタータンパク、種々の血管および腎組織の細胞膜において見出されるタンパクである。このような細胞および組成としては、腎臓皮質細胞、血管内皮細胞、副腎皮質、副腎糸球体、および肺組織が包含されるが、これらに限定されない。Including, but not limited to, rabbits, hamsters, and goats. for this purpose The term also refers to 9 synthetic ANP receptor proteins, i.e. 1 recombinant or direct It also includes proteins produced by chemical synthesis. For example, C1ark-Le See Wis et al. (1986) Science 231:134-139. I want to be. ANP receptor protein, in cell membranes of various blood vessels and renal tissues It is a protein found in Such cells and composition include renal cortical cells. cells, vascular endothelial cells, adrenal cortex, adrenal glomeruli, and lung tissue, but this It is not limited to these.

本発明の好ましいレセプタータンパクは、大動脈平滑筋細胞のような血管組織に由来する。血管ＡＮＰレセプタータンパクのクラスの例としては、ウシの大動脈平滑筋細胞から単離されたレセプタータンパクがある（ウシの血管ＡＮＰ　レセプター）。他の組織から単離されたこのクラスのＡＮＰ　レセプタータンパクは、同じ構造を有する。ウシの血管ＡＮＰレセプタータンパクは、２つの実質的に同一なタンパクのサブユニットを含む。ポリアクリルアミドの濃度が１０％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）による分析により、この二量体の見かけの分子量が（非還元条件下において）１２５±１２ｋｄであり、そして、サブユニットの見かけの分子量が（還元条件下において）　６０．５±６ｋｄであることが示される。Preferred receptor proteins of the invention target vascular tissues such as aortic smooth muscle cells. Originates from Examples of the class of vascular ANP receptor proteins include the bovine aorta There is a receptor protein isolated from smooth muscle cells (bovine vascular ANP receptor). Pter). This class of ANP receptor proteins isolated from other tissues is , have the same structure. The bovine vascular ANP receptor protein consists of two essentially Contains identical protein subunits. Dosing with a polyacrylamide concentration of 10% Sodium decyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SO3-PAGE) analysis revealed that the apparent molecular weight of this dimer (under non-reducing conditions) was 12 5 ± 12 kd, and the apparent molecular weight of the subunit (under reducing conditions) ) is shown to be 60.5±6 kd.

ウシ血管の精製天然型ＡＮＰレセプタータンパクをさらに特徴付けるために、レセプターとしてのインビトロでの活性を研究した。５ｃｈｅｎｋら（ＩＩ）、（前出）、に記載されている次のＡＮＰペプチドが用いられた：　ＡＮＰ（４−２８）、ＡＮＰ（７−２８）、およびＡＮＰ（５−２５）。Ｂｉａｘ＋ＫｉおよびＫｄは標準的な方法で算出された０例えば＋　５ｃａｔｃｈａｒｄ　（１９４９）　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＋ｐｐ、６００−６７２を参照されたい。ＡＮＰ　（４−２８）の種々のＡＮＰペプチドとの拮抗結合分析は第１図に示される。結合データのコンピューター解析によれば、レセプター結合に対するＢｍａｘは５．７　（７５％レセプター活性）ｎｍｏ＋、／■タンパクであり、　ＫＡは０．３ｎＭに等しい。これは、　ＡＮＰのレセプタータンパクに対する化学量論数が１：３／サブユニツト、または０．７：　１　／ホロレセプターであることに相当する。精製レセプタータンパクもまた。無傷の細胞中のＡＮＰレセプターについて以前に記録されているのと同じ範囲（０，１〜１０．ＯｎＭ）の親和性を八ＮＰに対して示した。種々のＡＮＰペプチドに対する相対的Ｋｉ値は９次のとおりである：ＡＮＰ（４−２８）　０．３ｎＭ；ＡＮＰ（７−２８）　１．１ｎＭ；およびＡＮＰ（５−２５）　！、１２ｎＭ。To further characterize the purified native ANP receptor protein from bovine blood vessels, Its in vitro activity as a receptor was studied. 5chenk et al. (II), ( The following ANP peptide was used: ANP (4-2 8), ANP(7-28), and ANP(5-25). Biax+Ki and Kd is calculated using standard methods such as +5 catchard (1949 ) Referenced Ann, N. Y., Acad, Sci, +pp, 600-672. stomach. Competitive binding analysis of ANP (4-28) with various ANP peptides is shown in Figure 1. shown. Computer analysis of binding data indicates that Bmax is 5.7 (75% receptor activity) nmo+, /■ protein, KA is equal to 0.3 nM. This is for the ANP receptor protein. If the stoichiometry is 1:3/subunit or 0.7:1/holoreceptor corresponds to something. Also purified receptor protein. ANP levels in intact cells Same range as previously recorded for Scepter (0,1-10.OnM) showed affinity for 8NP. Relative Ki values for various ANP peptides are as follows: ANP(4-28) 0.3 nM; ANP(7-28) 1.1 nM; and ANP(5-25)! , 12 nM.

ウシ血管の天然型ＡＮＰレセプタータンパクもまた。アミノ酸分析に供された。Also the native ANP receptor protein of bovine blood vessels. Subjected to amino acid analysis.

ウシ血管レセプターの部分的なＮ末端アミノ酸配列は、成熟型タンパクの２〜３２アミノ酸に対応する配列を与えた：当業者は、所望であれば、標準的なタンパク配列決定法により、タンパクのカルボキシ末端へと上記の配列を容易に延ばすことができる。より単純な方法は、レセプタータンパクの遺伝子をクローン化して配列決定し、アミノ酸配列を与えることである。The partial N-terminal amino acid sequence of bovine vascular receptor consists of 2-3 of the mature protein. Given the sequence corresponding to 2 amino acids: Those skilled in the art will be able to determine the protein calculus, if desired, by standard protein sequencing methods. The above sequence can easily be extended to the boxy terminus. A simpler method is to The gene for the Scepter protein was cloned and sequenced, giving the amino acid sequence. That's true.

第３図のウシレセプターの完全なｃＤＮＡの解析により８成熟型レセプタータンパクは４９６アミノ酸のポリペプチドであり。Analysis of the complete cDNA of the bovine receptor shown in Figure 3 revealed that 8 mature receptor proteins were found. Paku is a polypeptide of 496 amino acids.

プロペプチドして発現していることが示されている。仮定される成熟型レセプタータンパクの分子量は約５６．０００である。It has been shown that it is expressed as a propeptide. Postulated mature receptor -The molecular weight of the protein is approximately 56,000.

このことにより、天然型レセプタータンパクは、グリコジル化されているかもしれないことが示される。ヒトｃＤＮＡ　（第５図）は類似の構造を示す。This suggests that the native receptor protein may be glycosylated. It is shown that Human cDNA (Figure 5) shows a similar structure.

ウシ血管ＡＮＰレセプターのプロ配列は、成熟化の間においてレセプター前駆体のＮ末端から４１アミノ酸が除去されることを示唆する。最初のＮ末端の２１アミノ酸は、非常に疎水的の性質を示す可能性のある膜透過シグナルを規定している。The prosequence of the bovine vascular ANP receptor is converted into a receptor precursor during maturation. This suggests that 41 amino acids are removed from the N-terminus of . The first N-terminal 21 a Mino acids define membrane-penetrating signals that can be highly hydrophobic in nature. Ru.

Ｗａ　ｌ　ｔｅｒら、（１９８４）Ｃｅｌｌ　３８：５−８゜Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、（１９８３）Ｅｍ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。Walter et al. (1984) Cell 38:5-8°VonHe1j ne, (1983) Em, J. Biochem.

１３３　：１７−２１の一致した規則により、シグナルペプチダーゼにより開裂する可能性の高い２つの部位が予想配列内にある。133:17-21, cleaved by signal peptidase There are two sites within the predicted sequence that are likely to occur.

一方は残基１８の後方であり、他方は残基３１の後方である。これらの部位と成熟型Ｎ末端（Ｇｌｕ”）との間の残りの１０から２３残基は、レセプターの続いて起こるタンパク分解によるプロセッシングが、膜への移動中または堆積後のどちらかで起こることを示唆している。これに関しては、　Ｇｌｕ”以前の配列（残基２２−４１）が親水性であり、４つのアルギニンを含むヘキサペプチドで終わっていることが注目に値する。糖の付加し得る部位が３箇所存在する：Ａｓｎ８２．２８９．および４６５゜膜透過ドメインに非常に近接してＣｙｓ４９６が存在することは、この部位がホモダイマーのジスルフィド結合に対する部位になりそうであることを示唆している。One is after residue 18 and the other is after residue 31. These parts and growth The remaining 10 to 23 residues between the mature N-terminus (Glu”) are the continuation of the receptor. The proteolytic processing that occurs during transport to the membrane or after deposition It suggests that something is going to happen. Regarding this, the sequence before “Glu” ( Residues 22-41) are hydrophilic and terminate in a hexapeptide containing four arginines. It is worth noting that There are three sites where sugar can be added: Asn 82.289. and Cys496 in close proximity to the 465° transmembrane domain. Its presence indicates that this site is the site for the disulfide bond in the homodimer. This suggests that it is likely to occur.

ウシ血管ＡＮＰレセプター前駆体は、有意に疎水特性を有するいくつかの領域を含んでおり、これは第４図のハイドロパシシティプロットから明らかである。２０アミノ酸を越える。The bovine vascular ANP receptor precursor has several regions with significantly hydrophobic properties. This is clear from the hydropacity plot in FIG. 2 More than 0 amino acids.

多（とも６つの疎水性領域が見出され得、そして、これらの初め（ＡＡ　１−２１）はおそらくシグナルペプチドである。もう１つの他の極度に疎水性のある領域（４７８−５００）は、非常に親水性のある２つの領域に隣接しており、膜透過ドメインの候補となりそうである。Ｃ末端からこのドメインまでの領域は。Six hydrophobic regions can be found, and the first of these (AA 1-2 1) is probably a signal peptide. Another extremely hydrophobic region The region (478-500) is adjacent to two regions that are highly hydrophilic and have membrane permeability. This is likely to be a candidate for a hyper-domain. The region from the C-terminus to this domain.

配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１ｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇで始まり、優れた膜アンカーとなり得る。ＡＮＰレセプターは、その負電荷の大部分が細胞外にある酸性分子であり、そのリガンドが塩基性タンパクであるという事実を反映すると考えられる。It starts with the sequence Arg-Lys-1ys-Tyr-Arg and is an excellent membrane anchor. can be obtained. ANP receptors are acidic molecules with most of their negative charge located outside the cell. This is thought to reflect the fact that the ligand is a basic protein.

天然型のウシレセプターにおける特定のアミノ酸残基合量をさらに解析すると２表１に示されている結果が得られる。Further analysis of the amount of specific amino acid residues in the natural bovine receptor revealed that 2 The results shown in Table 1 are obtained.

この表においては、結果が５００残基あたりのアミノ酸残基の数（±２０％）で表わされている（６０ｋｄサブユニツトあたり５００残基として計算）。In this table, the results are expressed as the number of amino acid residues per 500 residues (±20%). (calculated as 500 residues per 60 kd subunit).

（以下余白）表−土アスパラギン酸（Ａｓｐ＋Ａｓｎ）　２７．０　１４．０”グルタミン酸（Ｇ１ｕ＋Ｇｌｎ）　２１，３　３６．８セリン（Ｓｅｒ）　３２．１　３７．４グリシン（Ｇｌｙ）　４７．５　４７．２ヒスチジン（Ｈｉｓ）　１０．３　１３．２アルギニン（Ａｒｇ）　３８．７　３５．１スレオニン（Ｔｈｒ）　２６．２　２４．４アラニン（Ａｌａ）　５１．０　４８．０プロリン（Ｐｒｏ）　２５．２　２２．１チロシン（Ｔｙｒ）　２１．０　２５．０バリン（Ｖａｌ）　３７．７　３７．４メチオニン（Ｍｅｔ）　８．６　６．６イソロイシン（ｌｉｅ）　３２．５　２７．２０イシン（Ｌｅｕ）　４８．７　５４．６フエニルアラニン（Ｐｈｅ）　２５．０　３０．０リジン（Ｌｙｓ）　３４．６　３６．２システイン（Ｃｙｓ）　２．０　、　４．６精製レセプターのアミノ酸組成は、５００個のアミノ酸あたり４．６個のシスティン残基を有することを示し、これは成熟レセプター中に存在することを予測された５個のシスティン残基とよ（一致する。システィンが奇数個であることは、レセプターサブユニットを互いに結合する分子間ジスルフィド結合を反映していることがわかる。(Margin below) Top soil Aspartic acid (Asp+Asn) 27.0 14.0” Glutamic acid (G1 u+Gln) 21,3 36.8 Serine (Ser) 32.1 37.4 Gln Syn (Gly) 47.5 47.2 Histidine (His) 10.3 13. 2 Arginine (Arg) 38.7 35.1 Threonine (Thr) 26.2 24.4 Alanine (Ala) 51.0 48.0 Proline (Pro) 25 ．． 2 22.1 Tyrosine (Tyr) 21.0 25.0 Valine (Val) 3 7.7 37.4 Methionine (Met) 8.6 6.6 Isoleucine (lie ) 32.5 27.20 Isin (Leu) 48.7 54.6 Fenilara Nin (Phe) 25.0 30.0 Lysine (Lys) 34.6 36.2 Stein (Cys) 2.0, 4.6 The amino acid composition of the purified receptor is 5 It shows that it has 4.6 cysteine residues per 00 amino acids, which is Coincident with the five cysteine residues predicted to be present in mature receptors. do. Odd number of cysteines binds receptor subunits together It can be seen that this reflects intermolecular disulfide bonds.

上記のデータは、天然型のレセプターを構成している２つのサブユニットが同一であるか、あるいは実質的に同一（すなわち、９０％〜９５％の相同性を有する）であることを示す。The above data shows that the two subunits that make up the native receptor are identical. or substantially identical (i.e., having 90% to 95% homology) ).

これらサブユニットは同一であると予想され、このことは天然型のペプチド、　ｃＤＮＡ、またはゲノムクローンをさらに配列決定することにより確かめられ得る。These subunits are expected to be identical, which suggests that the naturally occurring peptide, This can be confirmed by further sequencing the cDNA, or genomic clone. Ru.

上記のデータは、ここで述べたＡＮＰレセプターがホモダイマーであり、天然型のサブユニットは約６０．５００の分子量を有するが、グリコジル化されていないサブユニットは約５６，０００の分子量を有することを示す。いくつかの証拠は、約１２０，０００および７０，０００の分子量を有する天然型のＡＮＰ結合タンパクも存在し得ること、そしてこれらタンパクの各々には異なった機能があり得ることを示す。例えば、完全な還元条件下で見られる１２０ｋｄのポリペプチドは、グアニル酸シクラーゼ活性と最も密接に関係している。ここで述べる６０．５ｋｄポリペプチドと異なり、切形のＡＮＰ類似物とはあまりよく結合しない。The above data indicate that the ANP receptor described here is a homodimer, and the native type The subunit has a molecular weight of about 60.500 but is not glycosylated. The small subunit is shown to have a molecular weight of approximately 56,000. some evidence are native ANP conjugates with molecular weights of approximately 120,000 and 70,000. We know that proteins can also exist, and that each of these proteins has a different function. show that it is possible. For example, the 120 kd polypeptide found under fully reducing conditions Tide is most closely associated with guanylyl cyclase activity. 6 described here Unlike the 0.5kd polypeptide, it does not bind very well to truncated ANP analogs. stomach.

これは１２０ｋｄのレセプターがグアニル酸シクラーゼ活性の促進に関与し得るが、　６０．５ｋｄのレセプターは他の作用様式；例えばレセプターの排除、を有することを示唆する。しかし。This may involve the 120 kd receptor in promoting guanylyl cyclase activity. However, the 60.5 kd receptor may have other modes of action; e.g., receptor exclusion. Suggests that it has. but.

出願人はこの仮説に束縛されることはない。分子量および活性が異なるにもかかわらず、観察されたＡＮＰレセプタータンパクの全ての種は同一遺伝子または実質的に同様の遺伝子系統でコードされており、観察される違いは転写後または翻訳後のプロセッシングの違いから生じ得る。Applicant is not bound by this assumption. Despite their different molecular weights and activities, However, all species of ANP receptor proteins observed are from the same gene or plant. are encoded by qualitatively similar gene lineages, and the observed differences are post-transcriptional or translational. This may arise from differences in post-translation processing.

哺乳動物の血管の６０．５ｋｄ　ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットのアミノ酸配列は、哺乳動物の種および異なる組織間で高度に保持されている。例えば、ウシとヒトの配列は少なくとも約９５〜９７％の相同性を有する。ここで、ヒトの配列は腎臓および胎盤のｃＤＮＡで決定されたものである。一般に、他の種および／または組織から単離された天然型のＡＮＰレセプタータンパクサブユニット（または関連タンパクの結合領域）は、ウシまたはヒトの血管のＡＮＰレセプタータンパクサブユニットと少なくとも約７５％のアミノ酸相同性を有しており。The amino acid of the 60.5 kd ANP receptor protein subunit of mammalian blood vessels. Noic acid sequences are highly conserved among mammalian species and different tissues. for example , the bovine and human sequences have at least about 95-97% homology. Here, The sequence was determined from kidney and placenta cDNA. Generally other species and/or native ANP receptor protein subunits isolated from tissues. (or related protein binding region) is the ANP receptor in bovine or human blood vessels. has at least about 75% amino acid homology with the protein subunit the law of nature.

そして一般的には少なくとも約８５％の相同性を有する。相同性が約９０％から約９５％あるいはそれ以上であり得る場合もある。従って、他の天然型のＡＮＰレセプタータンパクは、相同性を有するタンパクサブユニットを含む。これらの他の可溶化ＡＮＰレセプタータンパクは、高い親和性でＡＮＰペプチドを結合させる能力によって、さらに特徴付けられ得る。例えば。and generally have at least about 85% homology. Homology from about 90% In some cases it can be about 95% or more. Therefore, other natural forms of ANP Receptor proteins contain homologous protein subunits. these Other soluble ANP receptor proteins bind ANP peptides with high affinity. can be further characterized by the ability to for example.

ＡＮＰ（４−２８）は、　１０〜２０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下のＬ値を有する。ＡＮＰレセプタータンパクは、ＡＮＰ（４−２８）に対して１ｎＭ以下の相対的なに、値を有することが特に好ましい。ANP (4-28) has an L value of 10 to 20 nM or less, preferably 5 nM or less. have ANP receptor protein is less than 1 nM for ANP(4-28) It is particularly preferred to have a relative value of .

合成ＡＮＰレセプターはまた。ウシまたはヒトの血管のＡＮＰレセプターに対して、アミノ酸組成に少し違いがある。例えば１発現ベクターを遺伝子操作する場合１本質的ではない（すなわち、レセプター機能を損なわないような）領域におけるアミノ酸残基の交換または除去は、しばしば都合のよい手段である。ＡＮＰへの結合親和性を変化させるためにアミノ酸配列を故意に変更することも望ましい。一般に１合成レセプタータンパク（４−２８）に対する親和性（Ｋ、）は、　１０ｎＭ以下であるべきである。ウシまたはヒトの血管のＡＮＰレセプターに対する合成レセプターのアミノ酸配列相同性は、少な（とも（例えば、融合タンパクにおけるように）除去または交換されない領域に対しては、一般に天然型のＡＮＰレセプターについて上述した範囲内にある。Synthetic ANP receptors also. for ANP receptors in bovine or human blood vessels. However, there is a slight difference in the amino acid composition. For example, when genetically manipulating an expression vector. 1. In areas that are not essential (i.e., do not impair receptor function) Replacing or removing amino acid residues is often a convenient means. ANP It may also be desirable to intentionally alter the amino acid sequence to alter the binding affinity for stomach. In general, the affinity (K, ) for one synthetic receptor protein (4-28) is It should be below 10 nM. to ANP receptors in bovine or human blood vessels. The amino acid sequence homology of synthetic receptors to For areas that are not removed or replaced (as in parks), natural within the ranges described above for ANP receptors.

細胞からのＡＮＰレセプタータンパクの精製は、基本的な３つの段階を包含する：細胞の調製、ＡＮＰレセプターの活性型かつ安定型での可溶化、およびアフィニティークロマトグラフィーによるレセプターの精製。好適な細胞の起源はウシの大動脈平滑筋細胞である。なぜならば、これら細胞が細胞あたり約２５０．０００個のＡＮＰレセプター部位を有するからである。Purification of ANP receptor protein from cells involves three basic steps. : Preparation of cells, solubilization of ANP receptor in active and stable form, and affixation. Purification of the receptor by nitty chromatography. The preferred cell origin is bovine are aortic smooth muscle cells. This is because these cells are approximately 250.0 per cell. This is because it has 00 ANP receptor sites.

培養細胞は、たいていの組織起源のものに比べて比較的プロテアーゼを含まないという、利点をさらに有する。これは活性なレセプタータンパクの安定化および精製を容易にする。Cultured cells are relatively protease-free compared to those of most tissue origins It has an additional advantage. This stabilizes active receptor proteins and Facilitates purification.

ラット胎児の胸部大動脈平滑筋の細胞系Ａｌ０（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４７６）のような、他の細胞系は当該分野で公知である。Rat fetal thoracic aortic smooth muscle cell line Al0 (ATCC CRL-1476) Other cell lines are known in the art, such as.

好適な細胞系は、　Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、　（１９８２）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。Suitable cell lines include Longenecker et al. (1982) J, Ce1 l Physiol.

１１３　：１９７−２０２に記載されているように、ウシ大動脈の移植片から確立される。平滑筋細胞系は標準操作によりローラーボトルで増殖させることができ、十分な細胞量が得られたら集める。集めた細胞を遠心分離で沈澱させて１次いで例えば乳鉢と乳棒で摩砕することによりホモジナイズする。次いで。113:197-202, from bovine aortic grafts. be erected. Smooth muscle cell lines can be grown in roller bottles using standard procedures. and collect when a sufficient amount of cells is obtained. The collected cells are precipitated by centrifugation and the primary Then homogenize by grinding, for example, with a mortar and pestle. Next.

レセプタータンパクは、カルビオケムーベーリング（サンディエゴ、　ＣＡ）から入手可能である界面活性剤Ｃ＋ｚＥａ　（オクタエチレングリコールドデシルエーテル）を用いて、このホモジナイズした細胞画分から可溶化する。ＣＩＺＥａに代えて多くの界面活性剤を試験した。しかし、ＡＮＰレセプター活性を実質的に低下させることなくレセプタータンパクを可溶化する他の界面活性剤は存在しなかった。Is the receptor protein available from Calbiochem Behring (San Diego, CA)? Surfactant C+zEa (octaethylene glycol decyl Solubilize from this homogenized cell fraction using (ether). CIZE A number of surfactants were tested in place of a. However, ANP receptor activity does not substantively reduce ANP receptor activity. Other detergents exist that solubilize receptor proteins without reducing I didn't.

可溶化ＡＮＰレセプターは、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。アフィニティークロマトグラフィーによる種々の精製方法が当業者に公知である。一般的には。Solubilized ANP receptor was purified by affinity chromatography. It will be done. Various methods of purification by affinity chromatography are known to those skilled in the art. It is. In general.

Ｃｏｏｐｅｒ、　ＴＯＯＬＳ　ＯＦ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、　ｐｐ、　２３４−２５４　（ジョンワイリー＆サンズ、　１９７７）を参照。ＡＮＰレセプタータンパクを精製する一般的な方法は、以下の通りである：（１）可溶化したレセプター画分を、ＡＮＰペプチドが結合したカラムに通す、（２）このカラムを、レセプターがＡＮＰペプチドに結合して残存する解離条件下で洗浄する。（３）レセプター／　ＡＮＰ複合体を解離させる。そして（４）過剰のリガンドを除去し、レセプターの結合活性を回復させる。　上記の操作で、血管のＡＮＰレセプタータンパクが組成物のタンパク画分の少なくとも約７５〜８０％を含有する精製された細胞非含有組成物が得られる。好ましくは、クロマトグラフィーの条件を２組成物のタンパク画分が少なくとも約９０％のＡＮＰレセプタータンパクを含有し、そして最適には少なくとも約９８％のレセプタータンパクを含有するように選択する。細胞起源を選択することにより、ウシまたはヒトのような種々のＡＮＰ　レセプタータンパクを調製し得る。一般的には、　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙｉ。Cooper, TOOLS OF BIOCHEMISTRY, pp, 2 34-254 (John Wiley & Sons, 1977). ANP receipt The general method for purifying tar proteins is as follows: (1) solubilized (2) passing the receptor fraction through a column bound to ANP peptide; is washed under dissociation conditions in which the receptor remains bound to the ANP peptide. ( 3) Dissociate the receptor/ANP complex. and (4) excess ligand. to restore binding activity of the receptor. By the above operation, the ANP level of blood vessels The receptor protein comprises at least about 75-80% of the protein fraction of the composition. A purified cell-free composition is obtained. Preferably, chromatographic The conditions are such that the protein fraction of the composition is at least about 90% ANP receptor protein. and optimally contains at least about 98% receptor protein. Select as follows. Depending on the choice of cell origin, species such as bovine or human Various ANP receptor proteins can be prepared. Generally, ANIMAL CELL CULTURE (R, 1, Freshney.

１９８６　）を参照。(1986).

精製レセプタータンパクが得られれば、当業者に公知の種々方法のいずれかにより容易に配列を決定し得る。例えば。Once purified receptor protein is obtained, it can be prepared by any of a variety of methods known to those skilled in the art. The sequence can be easily determined. for example.

レセプタータンパクのアミノ酸配列は、エドマン分解を繰り返して行い１次いでＨＰＬＣによるアミノ分析を行うことにより。The amino acid sequence of the receptor protein was determined by repeated Edman degradation. By performing amino analysis by HPLC.

精製タンパクから決定し得る。アミノ酸配列を決定する他の方法もまた当該分野に公知である。Can be determined from purified protein. Other methods of determining amino acid sequences are also known in the art. It is publicly known.

アミノ酸配列が決定されたら、決定されたアミノ酸配列の一部分に対するコドンを有するオリゴヌクレオチドプローブを調製し、そしてこのプローブを用いて、レセプタータンパクをコードする遺伝子についてＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーの調製に関する基本的方法、および核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは、一般の当業者に公知である。例えば、ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ　：第１巻（Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ’ＩＪｉＡ、　１９８５）；ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳＪ、）Ｉｉｇｇｉｎｓ　’＆、　１９８５）；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨＥＳＩＳ　（Ｍ、Ｊ。Once the amino acid sequence has been determined, codons for a portion of the determined amino acid sequence and use this probe to Screen a DNA library for genes encoding receptor proteins. ning. Regarding the preparation of oligonucleotide probes and DNA libraries. Basic methods for determining and screening them by nucleic acid hybridization These techniques are known to those of ordinary skill in the art. For example, DNA CLONING: 1st Volume (D, M, Glover'IJiA, 1985); NUCLEICACID HYBRIDIZATION (B, D, Hames and SJ,) Iigg ins’&, 1985); 0LIGONUCLEOTIDE 5YNTH ESIS (M, J.

Ｇａｔｅｍ、１９８４）；　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｓｃｈ　＆　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＋ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（１９８２）を参照。Gatem, 1984); T, Maniatis, E, F, Fr1sch & J, Sambrook + MOLECULAR CLONING: A LABO See RATORY MANUAL (1982).

まず最初にＤＮＡライブラリーを調製する。このライブラリーは、ヒトのような選択されだ哺乳類に由来するゲノムＤＮＡライブラリーから成り得る。ヒトのゲノムライブラリーは当該分野で公知である。例えば、　Ｌａｗｎら、　（１９７８）　Ｃｅ１ｌ　１５：１１５７−１１７４を参照。ＤＮＡライブラリーは、逆転写によりポリ−Ａ　ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）画分から調製されたｃＤＮＡからも構築し得る。例えば。First, a DNA library is prepared. This library is a human-like It may consist of a genomic DNA library derived from a selected mammal. human game Nome libraries are known in the art. For example, Lawn et al. (197 8) See Ce1l 15:1157-1174. DNA library is reverse It can also be constructed from cDNA prepared from poly-A RNA (mRNA) fraction by transcription. It can be built. for example.

米国特許第４．４４６．２３５号；第４，４４０．８５９号；第４．４３３．１４０号；第４．４３１．７４０号；第４，３７０．４１７号；第４，３６３，８７７号を参照。U.S. Patent Nos. 4.446.235; 4,440.859; 4.433.1 No. 40; No. 4,431.740; No. 4,370.417; No. 4,363,8 See No. 77.

ｍＲＮＡはレセプタータンパクを発現することが知られている細胞系または組織から単離される。ＡＮＰレセプタータンパクを発現している細胞系または組織は当該分野で公知である。mRNA is a cell line or tissue known to express the receptor protein. isolated from. Cell lines or tissues expressing ANP receptor protein are Known in the art.

ｃＤＮＡ　（またはゲノムＤＮＡ）は、ライブラリーの構築に適したベクターにクローン化する。好適なベクターは、ファージλのようなバクテリオファージベクターである。適切なライブラリーの構築は、当業者の技術範囲内である。cDNA (or genomic DNA) into a vector suitable for library construction Clone. A preferred vector is a bacteriophage vector such as phage λ. He is a master. Construction of appropriate libraries is within the skill of those skilled in the art.

ライブラリーが一度作成されたならば、ライブラリーを調べるためのオリゴヌクレオチドを調製し、所望のＡＮＰレセプタータンパク遺伝子を単離するのに用いる。オリゴヌクレオチドは適当ないずれかの方法により合成される。選択された特定のヌクレオチド配列は、既知のアミノ酸配列をコードするコドンに対応するようにレセプタータンパクから選択される。遺伝子コードは重複があるので、タンパクの特定の領域をコードする可能なヌクレオチド配列の全て、または適切な数をカバーするいくつかのオリゴヌクレオチドを合成する必要がしばしばある。Once the library has been created, the oligonuc to examine the library Reotide is prepared and used to isolate the desired ANP receptor protein gene. Ru. Oligonucleotides are synthesized by any suitable method. chosen A particular nucleotide sequence corresponds to a codon that encodes a known amino acid sequence selected from receptor proteins. Since there is overlap in the genetic code, All possible nucleotide sequences encoding a particular region of a protein, or suitable It is often necessary to synthesize several oligonucleotides covering a large number of oligonucleotides.

このように、一般に好適には、コドンが高度に縮退しているアミノ酸を含まない領域を基本として。As such, it is generally preferred that the codons do not contain highly degenerate amino acids. Based on area.

プローブの領域が選択される。しかし、ライブラリーを作成した哺乳動物に稀であるコドンを有するプローブを調製する必要はない。ある状況下では、当業者は、かなり長く、そして／または対応する核酸配列においてかなり高度に重複しているアミノ酸配列の領域を包含するプローブを調製することが望ましいことを見い出し得る。この長さおよび／または重複した領域がレセプタータンパクの大きな特徴であるならば。A region of the probe is selected. However, rare cases exist in the mammals that created the library. There is no need to prepare probes with certain codons. Under certain circumstances, a person skilled in the art may , fairly long and/or fairly highly duplicated in the corresponding nucleic acid sequences. We found that it is desirable to prepare probes that encompass regions of the amino acid sequence that I can get it out. This length and/or overlapped region is the size of the receptor protein. If it is a characteristic.

特にである。完全な遺伝子、またはゲノムの本質的な部分をカバーするプローブもまた適切であり得るが、これは期待される相同性の度合に依存する。例えば、ウシ血管ＡＮＰレセプターのｃＤＮＡを、ヒトＡＮＰレセプタータンパクについてヒトの遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために用いたのが。Especially. Probes that cover complete genes or essential parts of the genome may also be suitable, but this depends on the degree of homology expected. for example, The cDNA of bovine vascular ANP receptor was combined with human ANP receptor protein. It was used to screen a human gene library.

そのような場合である。その遺伝子の異なった領域に対応する２つのプローブ（または数組のプローブ）を１回のハイブリダイゼーシゴン実験に用いるのも望ましいことであり得る。Such is the case. Two probes corresponding to different regions of the gene ( It is also desirable to use several sets of probes in one hybridization experiment. It could be something new.

自動化されたオリゴヌクレオチド合成は、多くのプローブ群の調製を比較的簡単なものにした。一方、用いられるプローブの正確な長さは決定的に重要ではないが、一般には約１４から約２０塩基対のプローブが通常有効であることが当該技術分野で認められている。約２５から約６０塩基対の、より長いプローブもまた。使用され得る。Automated oligonucleotide synthesis makes the preparation of large groups of probes relatively easy. I made it into something. On the other hand, the exact length of the probe used is not critical However, in general, probes of about 14 to about 20 base pairs are usually effective. Recognized in the medical field. Longer probes, from about 25 to about 60 base pairs, may also be used. . can be used.

選択されたオリゴヌクレオチドプローブを、放射性ヌクレオチドまたはビオチンのようなマーカーを用いて、標準的な操作で標識する。次に標識化プローブの組をスクリーニング工程に用いる。この工程は、標準的な技術に従ってライブラリーから単離した５ｓＤＮＡに１本鎖のプローブをハイブリダイズさせることから成る。厳密なまたはゆるいハイブリダイゼーション条件のいずれが適当であるかは、プローブの長さ。Selected oligonucleotide probes can be combined with radioactive nucleotides or biotin. Label using standard procedures using markers such as . Next, a set of labeled probes is used in the screening process. This process is carried out according to standard techniques. By hybridizing a single-stranded probe to 5sDNA isolated from Become. Are strict or lenient hybridization conditions appropriate? is the length of the probe.

およびプローブがライブラリーと同一種に由来するか、または進化的に近い種に由来するか遠い種に由来するかな・どのようないくつかの因子に依存する。適当な条件の選択は、当業者の技術範囲内にある。一般には、　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（前出）、を参照されたい。基本的に要求されることは、ハイブリダイゼーション条件は選択的ハイブリダイゼーションが起こる様に十分厳密なことである；すなわち、ハイブリダイゼーションは非特異的結合とは対立するものであり、十分な核酸相同性の程度（例えば、少なくとも約７０〜７５％）による。スクリーニングしたライブラリーのクローンがハイブリダイゼーション陽性であることにより一度同定されれば、制限酵素分析およびＤＮＡの配列決定により、特定のライブラリーの挿入断片がレセプタータンパクに対応する遺伝子を含むことを確認し得る。and the probes originate from the same species as the library or are evolutionarily related. Whether it originates from a distant species or not depends on several factors. suitable Selection of suitable conditions is within the skill of those skilled in the art. Generally, NUCLEICAC Please refer to ID HYBRIDIZATION (mentioned above). basically requested This means that the hybridization conditions are such that selective hybridization occurs. It is sufficiently rigorous that hybridization is nonspecific; As opposed to binding, there is a sufficient degree of nucleic acid homology (e.g., at least about 70-75%). Clones from the screened library are hybridized. Once identified by being positive, restriction enzyme analysis and Through NA sequencing, specific library inserts are identified as receptor proteins. It can be confirmed that the corresponding gene is included.

あるいは、ＡＮＰレセプターサブユニットのＤＮＡコード配列を、配列がＡＮＰレセプタータンパクサブユニットのアミノ酸配列に対応するコドンを有する重複したオリゴヌクレオチドから合成して調製し得る。このようなオリゴヌクレオチドを標準的な方法により調製し、完全なコード配列に組み立てる。Alternatively, the DNA coding sequence of the ANP receptor subunit can be Duplication with codons corresponding to amino acid sequences of receptor protein subunits It can be synthesized and prepared from oligonucleotides obtained by Such oligonucleotides The codes are prepared by standard methods and assembled into the complete coding sequence.

例えば、　Ｅｄｇｅ、　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｒｅ　２９２ニア５６；　Ｎａｍｂａｔｒら、　（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３　：１２９９；Ｊａｙ　ら、（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５９　：６３１１を参照されたい。For example, Edge, (1981) Nature 292 Near 56; Ambatr et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311. I want to be

ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットに対応するコード配列を有するＤＮＡ分子は、適当なベクターにクローン化し得る。A DNA segment having a coding sequence corresponding to an ANP receptor protein subunit Offspring can be cloned into a suitable vector.

それによってＡＮＰレセプター遺伝子のコード配列を含まないベクター（例えば、他のライブラリーのクローン）を実質的に含有しない組成物の状態が維持される。多数のクローニングベクターが当業者には公知であり、適当なりローニングベクターの選択は任意である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよびそれが形質転換する宿主細胞には以下が包含される：バクテリオファージλ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）、　ｐＢＲ３２２（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）＋ｐＡｃＹｃ１７７　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）、　ｐＫＴ２３０　（グラム陰性バクテリア）。Thereby, vectors that do not contain the coding sequence of the ANP receptor gene (e.g. , other library clones) is maintained. Ru. Numerous cloning vectors are known to those skilled in the art and can be cloned as appropriate. The choice of vector is arbitrary. Recombinant DNA vectors and cloning and the host cells it transforms include: bacteriophage λ ( E, coli), pBR322 (E, coli) + pAcYc177 (E, coli), pKT230 (Gram-negative bacteria).

ｐＧＶ１１０６（グラム陰性バクテリア）　、　、）ＬＡＦＲＩ　（グラム陰性バクテリア）　、　ｐＭＥ２９０　（非−Ｅ、　ｃｏｌｉグラム陰性バクテリア）。pGV1106 (Gram-negative bacteria), )LAFRI (Gram-negative bacteria) bacteria), pME290 (non-E, coli Gram-negative bacteria) ).

ｐＨＶ１４（Ｅ、　ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｌ　ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）。pHV14 (E, coli and Bacillus 5ubtilis L pBD9 (Bacillus).

ｐｌＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、　ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノファージψＣ３１（針匹■亜匹並）、ＹＩｐ５　（酵母）、　ＹＣｐ１９　（酵母）、およびウシのパピローマウィルス（＠乳類細胞）。一般にはＤＮＡＣＬＯＮＩＮＧ　：　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ　＆ＩＩ、　（前出）　；　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　（前出）、を参照されたい。plJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces) es), actinophage ψC31 (needle to subhuman average), YIp5 (yeast), YCp19 (yeast), and bovine papillomavirus (@mammalian cells). general DNACLONING: VOLUMES I & II, (mentioned above); MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANU Please refer to AL (supra).

本発明のある実施態様では、ＡＮＰレセプタータンパク遺伝子からのコード配列はプロモーター、リポソーム結合部位（細胞での発現のための）、および必要に応じてオペレーター（ここではまとめてこれらを“制御”配列と呼ぶ）の制御下におかれ、そのことによってレセプタータンパクをコードするＤＮＡ配列（ここでは“′コード”配列と呼ぶ）がベクターで形質転換された宿主細胞内でＲＮＡに転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含み得るか。In some embodiments of the invention, the coding sequence from the ANP receptor protein gene is the promoter, liposome binding site (for expression in cells), and the necessary under the control of operators (collectively referred to here as “control” sequences). the DNA sequence encoding the receptor protein (here (referred to as the “coding” sequence) in a host cell transformed with the vector. transcribed into. This coding sequence includes a signal peptide or leader sequence. Do you get it?

または含み得ない。このコード配列はまた。プロＡＮＰレセプター、または成熟ＡＮＰレセプターに対応する配列のいずれかを含み得る。バクテリアでは、成熟レセプタータンパクサブユニットは、好ましくはいかなるシグナルペプチドをも有しないコード配列の発現により生産される。または、翻訳後のプロセッシングによりリーダー配列が除去される場合の系では、好ましくは、リーダー配列を含むコード配列の発現により生産される。成熟タンパクの開始点およびシグナルペプチドの終止点の決定は、成熟タンパクＮ−末端のアミノ酸配列から容易に決められる（第２図）。レセプタータンパクはまた。異質のアミノ酸配列がＮ−末端で発現する融合タンパクの形でも発現できる。例えば、米国特許第４，４３１．７３９号；第４．４２５．４３７号を参照されたい。or cannot contain it. This code sequence is also. proANP receptor, or mature It may contain any of the sequences corresponding to ANP receptors. In bacteria, mature The receptor protein subunit preferably carries any signal peptide. produced by expression of a coding sequence that does not have a Or post-translation processing In systems where the leader sequence is removed by produced by expression of a coding sequence containing The starting point and signal chain of the mature protein The termination point of peptides can be easily determined from the amino acid sequence of the N-terminus of the mature protein. (Figure 2). Receptor proteins also. a foreign amino acid sequence at the N-terminus It can also be expressed in the form of a fusion protein expressed in For example, U.S. Patent No. 4,431. No. 739; No. 4.425.437.

組換えベクターは、レセプタータンパクコード配列が適当な制御配列と共に、ベクター内に配置されるように構築される。つまり該制御配列に対するレセプターコード配列の位置と方向づけとが、該コード配列が制御配列の制御下で（すなわち、ＤＮＡ分子の制御配列に結合するＲＮＡポリメラーゼによって）転写されるような位置と方向づけとであるように構築される。この制御配列は、上述のクローニングベクターのようなベクターへの挿入の前に、コード配列に連結され得る。Recombinant vectors contain a receptor protein coding sequence along with appropriate control sequences. constructed to be placed within a vector. In other words, the receptor for the control sequence The position and orientation of a coding sequence is such that the coding sequence is under the control of control sequences (i.e. transcribed (by RNA polymerase, which binds to control sequences of DNA molecules) It is constructed such that the position and orientation are as follows. This control array is can be ligated to a coding sequence prior to insertion into a vector, such as a coding vector. .

または、上記コード配列は、既に制御配列および適当な制限部位を制御配列の下流に有する発現ベクターに直接クローン化し得る。原核生物および酵母でのレセプタータンパクコード配列の発現については、制御配列はコード配列に対して非相同性である。宿主細胞が原核生物であれば、コード配列はイントロンを含まない、つまりｃＤＮＡであることも必要である。Alternatively, the above coding sequence already has control sequences and appropriate restriction sites below the control sequences. can be directly cloned into an expression vector that has a current flow. Rese in prokaryotes and yeast For expression of the protein protein coding sequence, the control sequences are non-specific to the coding sequence. It is homology. If the host cell is prokaryotic, the coding sequence does not contain introns. In other words, it also needs to be cDNA.

選択した宿主細胞が哺乳動物細胞であるならば、制御配列はレセプタータンパクコード配列に対し非相同性または相同性であり、コード配列はイントロンを含むゲノムＤＮへまたはｃＤＮＡであり得る。ゲノムまたはｃＤＮＡコード配列のいずれも酵母で発現し得る。If the host cell of choice is a mammalian cell, the control sequences are those of the receptor protein. Non-homologous or homologous to the coding sequence, the coding sequence contains introns It can be to genomic DNA or to cDNA. Genomic or cDNA coding sequence Both can be expressed in yeast.

多（の原核生物用の発現ベクターが当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第４．４４０．８５９号；第４，４３６．８１５号；第４．４３１．７４０号；第４，４３１，７３９号；第４．４２８．９４１号；第４．４２５．４３７号；第４．４１８，１４９号；第４，４１１，９９４号：第４，３６６．２４６号；第４．３４２．８３２号を参照されたい。さらに、英国特許明細書ＧＢ第２．１２１．０５４号；ＧＢ第２，００８，１２３号；ＧＢ第２．０００７．６７５号；およびヨーロッパ特許明細書第１０３，３９５号もまた参照されたい。Many expression vectors for prokaryotes are known in the art. Permit No. 4.440.859; No. 4,436.815; No. 4.431.740 ; No. 4,431,739; No. 4.428.941; No. 4.425.437 ; No. 4,418,149; No. 4,411,994: No. 4,366.246 ; see No. 4.342.832. Furthermore, British Patent Specification GB 2. No. 121.054; GB No. 2,008,123; GB No. 2.0007.675 and European Patent Specification No. 103,395.

しかし、好ましい発現ベクターは、真核生物系で用いられるベクターである。例えば、共同出願である１９８５年１２月１６日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ第８０９．１６３号を参照されたい。その開示内容はここに述べられている。酵母発現ベクターは当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第４．４４６．２３５号；第４，４４３．５３９号；第４，４３０，４２８号を参照されたい。さらに、ヨーロッパ特許明細書筒１０３．４０９号；第１００．５６１号；第９６．４９１号もまた。However, preferred expression vectors are those used in eukaryotic systems. example For example, joint application U, S, S, N No. 809., filed December 16, 1985. See No. 163. That disclosure is set forth here. Yeast expression vector are known in the art. For example, U.S. Patent No. 4.446.235; No. 4,443.539; No. 4,430,428. Furthermore, yo -Roppa Patent Specification No. 103.409; No. 100.561; No. 96.491 Also the number.

参照されたい。その他の好ましい発現ベクター系はｐＨ５１であり、このベクターはチャイニーズハムスターの卵巣細胞を形質転換する。このベクターの利用は、共同出願である１９８５年１２月４日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、第８０４　、６９２号に記載されており、その開示内容はここに述べられている。Please refer. Another preferred expression vector system is pH51; transforms Chinese hamster ovary cells. How to use this vector , joint application filed on December 4, 1985, U, S, S, N, No. 804, 6 No. 92, the disclosure of which is set forth herein.

組換えＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ＡＮＰレセプタータンパクが生産される条件下で、増殖させることにより生産し得る。次いで、ＡＮＰレセプタータンパクを宿主細胞から単離し、精製する。発現系がＡＮＰレセプタータンパクを増殖培地に分泌する場合には、レセプタータンパクは細胞を含まない培地から直接精製し得る。分泌を行わせるには、一般的にレセプターの膜結合部分に対応するコドンを欠失させる必要がある。レセプタータンパクが分泌されない場合は、これを細胞溶解産物から単離する。適当な増殖条件および回収方法の選択は、当業者の技術範囲内にある。Recombinant ANP receptor protein subunit was transformed with the above expression vector. The transformed host cells are grown under conditions that produce ANP receptor protein. It can be produced by The ANP receptor protein is then extracted from the host cell. Isolate and purify. When the expression system secretes ANP receptor protein into the growth medium In some cases, the receptor protein can be purified directly from cell-free medium. secretion This is typically done by deleting a codon that corresponds to the membrane-bound portion of the receptor. There is a need. If the receptor protein is not secreted, use this as a cell lysate. isolated from Selection of appropriate growth conditions and harvest methods is within the skill of those skilled in the art. Ru.

天然型または合成のＡＮＰレセプタータンパクのいずれも。Any natural or synthetic ANP receptor protein.

ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体生産に使用し得る。ポリクローナル抗体が所望である場合には、精製レセプタータンパクが選択された哺乳類（例えば、マウス。It can be used for both polyclonal and monoclonal antibody production. Polychrome If a neutral antibody is desired, purified receptor protein can be obtained from the mammalian protein of choice. (e.g. mouse.

ウサギ、ヤギ、ウマなど）を免疫するのに用いられる。免疫した後の動物から血清を集め、公知の操作に従って処理する。used to immunize rabbits, goats, horses, etc. Blood from the animal after immunization The supernatant is collected and processed according to known procedures.

レセプタータンパクのほかに種々の抗原に対するポリクローナル抗体を含有する組成物は、該組成物をＡＮＰレセプターが結合しているカラムに通すことにより、抗−ＡＮＰレセプタータンパク抗体ではない抗体を実質的に含まないものとすることができる。洗浄後、ＡＮＰレセプターに対するポリクローナル抗体をカラムから溶出させる。モノクローナル抗−ＡＮＰレセプタータンパク抗体もまた当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体生産の一般方法論は公知である。永久抗体生産性細胞系もまた。Ｂリンパ球の発癌ＤＮＡによる直接の形質転換、またはエプスタイン・バー・ウィルスでのトランスフェクションのような融合以外の方法で創製し得る。例えば、　Ｍ、　５ｃｈｒｅｉｅｒら、　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　（１９８０）　；Ｈａｍｍｅｒｌ　ｉｎｇ　ら、　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＡＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬ　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ　（１９８１）　；　Ｋｅｎｎｅｔｔら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＢＳ（１９８０）を参照されたい。Contains polyclonal antibodies against various antigens in addition to receptor proteins The composition is prepared by passing the composition through a column to which ANP receptors are bound. , substantially free of antibodies that are not anti-ANP receptor protein antibodies. can be done. After washing, a polyclonal antibody against ANP receptor was applied. elute from the sample. Monoclonal anti-ANP receptor protein antibodies are also of interest. It can be easily produced by a commercial vendor. Monoclonal antibody production by hybridoma The general methodology of is known. Also permanent antibody producing cell lines. Carcinogenesis of B lymphocytes D Direct transformation with NA or trans-transformation with Epstein-Barr virus. It can be created by methods other than fusion such as fection. For example, M, 5chr eier et al., HYBRIDOMATECHNIQUES (1980); H ammerling et al. MONOCLONAL ANTIBODIESA ND T-CELL HYBRIDOMAS (1981); Kennet See t et al., MONOCLONALANTIBODIBS (1980). .

ＡＮＰレセプタータンパク（天然型または合成の）を、モノクローナル抗体生産のために永久増殖化したＢ−細胞の起源細胞を免疫する際に、抗原として用いることにより、レセプタータンパク分子の異なった部位でエピトープを認識するモノクローナル抗体のパネルを得ることが可能である。レセプタータンパクの結合領域におけるエピトープをＬ’Ｑ’ｔｈする抗体は。ANP receptor protein (natural or synthetic) for monoclonal antibody production Used as an antigen when immunizing B-cell origin cells that have permanently proliferated for This allows models to recognize epitopes at different sites on the receptor protein molecule. It is possible to obtain a panel of noclonal antibodies. Binding of receptor proteins Antibodies that L'Q'th epitope in the region.

抗体とＡＮＰとの間の拮抗分析で容易に同定し得る。このような抗体は、ＡＮＰペプチド結合に関連した生理学的応答を促進することなく、インビボにおいて該抗体がＡＮＰのレセプターへの結合を阻害し得れば、治療効果を有する可能性がある。They can be easily identified by competition analysis between antibodies and ANP. Such antibodies are ANP in vivo without promoting physiological responses associated with peptide binding. If antibodies can inhibit ANP binding to receptors, they may have therapeutic effects. be.

レセプタータンパク上の部位を認識する抗体も有用である。Antibodies that recognize sites on receptor proteins are also useful.

例えば、細胞溶解産物または醗酵培地からのＡＮＰレセプタータンパクの精製、およびレセプタータンパクの特徴付けにおいて有用である。一般に、当該分野で公知であるように、抗ＡＮＰレセプター抗体は、カラムまたはラテックスビーズのような固体支持体に固着（固定化）シ、レセプタータンパクを含有する溶液と接触させ、該溶液から分離する。次いで、固定化抗体に結合したレセプタータンパクを溶出させる。For example, purification of ANP receptor protein from cell lysates or fermentation media; and is useful in characterizing receptor proteins. Generally, in the field As is known, anti-ANP receptor antibodies can be applied to columns or latex beads. The solution containing the receptor protein is fixed (immobilized) on a solid support such as contact and separate from the solution. Next, the receptor protein bound to the immobilized antibody Elute the pack.

以下の実施例は例示の目的のみのために示すものであり。The following examples are presented for illustrative purposes only.

いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。It is not intended to limit the scope of the invention in any way.

（以下余白）実ｌｌ吐１この実施例は、血管組織のＡＮＰレセプタータンパクの精製およびその物性的特徴付けを目的としている。(Margin below) Real vomit 1 This example describes the purification of ANP receptor protein from vascular tissue and its physical properties. It is intended for recruiting purposes.

ウシ大動脈平滑筋（ＢＡＳＭ）細胞系はＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒらにより最初に確立され、　（１９８２）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１１３　：１９７ −２０２に記載されている。この方法に従って確立され０−２と名付けられたウシ大動脈平滑筋細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、　１２３０１パークローン　ドライブ、ロックビル、メリーランド、Ｕ、Ｓ、Ａに受託番号ＣＲＬ−９０８８で寄託されている。組織培養物中における初期増殖とそれに続くクローニングの後、蓄積した細胞を液体窒素で凍結させた。ＡＮＰレセプタータンパクの精製に用いる細胞は、この細胞を４〜１５代にわたって継代培養した後に得た。この細胞は１００個のローラーボトル（各８５０ａｆｉ　）中に１５％ウシ血清とダルベツコの改変イーグル培地を入れた標準条件下で増殖させた。５ＩｉＭ　ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　５０−で２回すすぐことにより細胞をローラーボトルから回収した。次いで、１０ μｇ／ｌｎｌのエラスターゼおよび２５μｇ／ｍｆｌのコラゲナーゼを含有する同様の緩衝液をそれぞれのローラーボトルに添加した。一様に回転させて８〜１０分間インキュベーションした後、遊離した細胞をプールして水中に移し、ウシ血清を５％（Ｖ／Ｖ）になるまで添加した。この細胞を５．ＯＯＯＸｇで１０分間、４°Ｃで遠心分離した。沈澱を２５０ｄのＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁し、同様に遠心分離した。この沈澱を４°Ｃのホモジナイズ用緩衝液（５０ｍＭ　）リスＨＣ１，ｐＨ７，５；　５ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ；　１１００ＯＩ　ＮａＣｌ：　０．２５Ｍスクロース；０．１ｗＭフェニルメチルスルホニルフルオライド；２５μｇ／ｄアプロチニン；２５μｇｏｄロイペプチン）３０Ｉｄにもう一度再懸濁した。The bovine aortic smooth muscle (BASM) cell line was first developed by Longenecker et al. (1982) J, Ce1l Physiol, 113:197 -202. A virus established according to this method and named 0-2 The aortic smooth muscle cell line is from the American Type Culture Collection (ATCC). ), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U, S , A under accession number CRL-9088. Early stage in tissue culture After expansion and subsequent cloning, the accumulated cells were frozen in liquid nitrogen. A The cells used for purification of NP receptor protein are grown for 4 to 15 generations. obtained after subculture. The cells were packed in 100 roller bottles (850 af each). i) Standard conditions with 15% bovine serum and Dulbecco's modified Eagle's medium It was grown in Phosphate buffered saline (PBS) containing 5IiM EDTA 5 Cells were harvested from roller bottles by rinsing twice with 0-. Then 10 Contains μg/lnl elastase and 25μg/mfl collagenase A similar buffer was added to each roller bottle. Rotate uniformly 8-1 After 0 min incubation, the released cells were pooled and transferred to water and Serum was added to 5% (V/V). 5. This cell. 10 minutes with OOOXg The mixture was centrifuged at 4°C. The precipitate was resuspended in 250 d of PBS/EDTA and Centrifuged similarly. This precipitate was added to homogenization buffer (50mM) at 4°C. HC1, pH 7,5; 5IIIM EDTA; 1100OI NaCl: 0.25M sucrose; 0.1wM phenylmethylsulfonyl fluoride; 25 μg/d aprotinin; 25 μg/d leupeptin). Suspended.

細胞を水中で、すりガラス乳棒を１０回通してホモジナイズした。ホモジナイズした細胞を１００．０００Ｘ　ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。その沈澱をホモジナイズ用緩衝液に再懸濁し、上述のように再びホモジナイズした。この物質を再び１００．０００　Ｘｇで３０分間、４℃で遠心分離した。最終的に得られた沈澱を１０Ｊｄのホモジナイズ用緩衝液に再懸濁し、タンパク含有量をブラッドフォードの方法で測定した。（１９７６）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。Cells were homogenized in water by passing through a ground glass pestle 10 times. homogenization The cells were centrifuged at 100.000×g for 30 minutes at 4°C. the precipitate Resuspend in homogenization buffer and homogenize again as described above. this thing The cells were centrifuged again at 100.000 xg for 30 minutes at 4°C. finally got Resuspend the precipitate in 10 Jd of homogenization buffer and check the protein content. It was measured by the method of David Ford. (1976) Anal, Biochem.

７２：２４Ｂ−２５１゜膜は、ホモジナイズ用緩衝液を添加することにより、５ ■タンパク／ｒｄとなるように調整した。この画分のレセプター結合活性は、　５ｃｈｅｎｋら＋（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。72:24B-251° membrane was prepared by adding homogenization buffer. ■Adjusted to protein/rd. The receptor binding activity of this fraction is 5chenk et al. (1985) Biochem, Biophys.

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１２７　：４３３−４４２に記載されているように、　”’Ｉ−ＡＮＰ（２−２８）を用いて検出した。この両分により示される濃度 −依存結合は、精製のこの段階で８０％の細胞表面レセプター活性が残存していることを示唆していた。As described in Res, Commun, 127:433-442. Detected using ``'I-ANP (2-28).The concentration indicated by these two components -dependent binding occurs when 80% of cell surface receptor activity remains at this stage of purification. It suggested that.

ＡＮＰレセプター活性を示す膜画分を当量のＰＢＳ／ＥＤＴＡで希釈し。The membrane fraction showing ANP receptor activity was diluted with an equivalent volume of PBS/EDTA.

次いでＣＩ！Ｅｌｌ界面活性剤（２０■／−）を含有する溶液をＣ，ｔＦｉｓの最終濃度が４■／ｄとなるまで１０分間以上かけて徐々に添加した０次いで、この溶液をＬＯＯ，０ＯＯＸ　ｇで１時間、４°Ｃで遠心分離し、上清を保持した。上述したような結合に関する研究によると、膜における全ＡＮＰ結合部位の６５％がこの方法により可溶化された。この調製物の可溶化したＡＮＰレセプターは、極めて安定であり、４°Ｃで２週間または一２０″Ｃで３力月間保存した後も結合活性の変化しないことが認められた。Next, CI! A solution containing Ell surfactant (20/-) was added to C, tFis. 0 was added gradually over 10 minutes until the final concentration was 4/d. The solution was centrifuged at LOO,0OOX g for 1 hour at 4°C, and the supernatant was retained. . According to the binding studies described above, 6 of the total ANP binding sites in the membrane 5% was solubilized by this method. Solubilized ANP receptor of this preparation is extremely stable and after storage for 2 weeks at 4°C or 3 months at -20"C. However, no change in binding activity was observed.

親和性マトリックスは、製造業者により記述されているように４０■のヒトＡＮＰ（４−２８）を４ｄのアフィーゲル１０（バイオ−ラド）に結合させることにより調製した。可溶化したＡＮＰレセプターを１０ｍＭ　ＣａＣ１□およびＭｇＣ１ｚで調整し、０．２μ台フィル（ター（ＧＥ型、ミリボア）に通して濾過した。この濾液をＡＮＰ−アガロースカラムにより、流速０．５ｄ／ａ＋ｉｎ、　２１°Ｃでクロマトグラフした。このカラムは、結合用緩衝液（１００ｎＩＭ　）リスＩｆＣ１゜ｐ）！７．５０；　１００ａ＋Ｍ　ＮａＣｌ；　４　ｍｇ／ｌｄ　Ｃ＋ｚＥ＊；　１０ｏ＋Ｍ　ＣａＣ１ｚ：および１０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ）を用いて、溶出液がＡｔ５ｏ＝０．０００となるまで洗浄した。次いで、６．０ｄの溶離緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム。The affinity matrix contained 40 μm of human AN as described by the manufacturer. In binding P(4-28) to 4d Affigel 10 (Bio-Rad) It was prepared from Solubilized ANP receptor was added to 10mM CaCl□ and Mg. Adjust with C1z and filter through a 0.2μ filter (GE type, Millibore). Ta. This filtrate was passed through an ANP-agarose column at a flow rate of 0.5 d/a+in. Chromatographed at 21°C. This column was prepared using binding buffer (100 nIM ) Squirrel IfC1゜p)! 7.50; 100a+M NaCl; 4 mg/l d　C+zE*; 10o+M　CaC1z: and 10mM　MgCIz) was used to wash the eluate until At5o=0.000. Then 6.0d Elution buffer (10mM sodium acetate.

ｐＨ５，ｏＯ：　１０抛Ｍ　ＮａＣ１：　４　ｍｇ／　！ＩＩＣ＋Ｊａ；　１０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ：１０ｎＭ　ＭｇＣｈ）を添加し、そしてその溶出液は水中に移し、直ちに３７％（Ｖ／Ｖ）アセトンとなるように調整した。この溶液を４．０００Ｘｇで１゜分間、４°Ｃで遠心分離し、上滑を完全に吸引除去した。沈澱は３．０　ｍの結合用緩衝液に再懸濁し、純度、レセプター結合活性、およびアミノ酸配列について分析した。pH5, oO: 10M NaC1: 4mg/! IIC+Ja; 10 mM CaClz: 10 nM MgCh) was added, and the eluate was poured into water. The solution was immediately adjusted to 37% (V/V) acetone. Add this solution to 4. Centrifugation was performed at 4°C for 1° at 000×g, and the supernatant was completely removed by suction. precipitation resuspended in 3.0 m binding buffer to determine purity, receptor binding activity, and binding buffer. The amino acid sequences were analyzed.

還元条件下および非還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％のポリアクリルアミド濃度）により分析を実施した。非還元条件下では、　１２５ｋｄに単一のタンパクバンドが見られた。精製されたレセプターを１０ｍＭジチオスレイトールで処理した。5DS-PAGE (10% polyacrylate) under reducing and non-reducing conditions. The analysis was carried out according to the concentration of Under non-reducing conditions, 125kd has a single protein bands were seen. Purified receptor was added to 10mM dithiothreate. Processed with a tool.

このジチオスレイトールはシスチンをシスティンに還元する試薬であり、この処理の結果、　６０．５ｋｄに単一のタンパクバンドが認められた。このデータは、　ＡＮＰ　レセプタータンパクが本質的に純粋であり、大動脈平滑筋細胞由来の活性レセプターカシスルフィド結合により結合された２つの同一サブユニットからなる二量体であることを示している。This dithiothreitol is a reagent that reduces cystine to cysteine; As a result of analysis, a single protein band was observed at 60.5 kd. This data is , the ANP receptor protein is essentially pure and derived from aortic smooth muscle cells. active receptor of two identical subunits connected by a cassisulfide bond This shows that it is a dimer consisting of

種々のＡＮＰペプチドに対する”Ｉ−ＡＮＰ（４−２８）の精製レセプターへの拮抗的結合を第１図に示す。試験したＡＮＰペプチドは、　ｈＡＮＰ（４−２８）、　ｈＡＮＰ（７−２８）およびアトリオペブチンＩを包含していた。ガンマ −メラニン細胞刺激ホルモン（γ−ＭＳＲ）は負のコントロールとして用いた。“I-ANP (4-28) to purified receptors for various ANP peptides” Competitive binding is shown in FIG. The ANP peptide tested was hANP (4-28 ), hANP(7-28), and atriopbutin I. gamma - Melanocyte stimulating hormone (γ-MSR) was used as a negative control.

結合に関するデータのコンピューター分析（プログラムＲ５−１；Ｂｏｌｔ、Ｂｅｒａｎｅｋ＆Ｎｅｗｍａｎ。Computer analysis of binding data (program R5-1; Bolt, B eranek & newman.

ボストン、　ＭＡ）は、レセプター結合に対するＢ。Ｘが５．７ｎｍｏｌ／■タンパク（ｋ４・０．３ｎＭ）であることを示した。これは、レセプタータンパクに対するＡＮＰの化学量論が１：３ｋｄサブユニツト、または０．７：１．０／ホロレセプターであることに対応する。Boston, MA) B for receptor binding. X is 5.7 nmol/■ta protein (k4・0.3nM). This is a receptor protein The stoichiometry of ANP is 1:3 kd subunit, or 0.7:1.0/ Corresponds to being a holoreceptor.

ＡＮＰペプチドを用いた別の研究を実施した。　ＡＮＰ　（４−２８）については０．３ｎＭ、　ＡＮＰ（７−２８）については１．１ｎＭ、そしてＡＮＰ（５ −２５）については１１−１２ｎという相対的なに、値は、前に報告した細胞表面のレセプターについてのデータと一致している。Another study was conducted using ANP peptide. About ANP (4-28) 0.3 nM for ANP(7-28), and 1.1 nM for ANP(5 -25), the relative values of 11-12n are based on the previously reported cell table values. This is consistent with the data for surface receptors.

２５μｇの精製ＡＮＰ　レセプターは、繰り返しエドマン分解法にかけ１次いでアプライド　バイオシステムダ４フ０Ａ気相タークネーター（ｇａｓ−ｐｈａｓｅ　５ｅｑｕｎａｔｏｒ）にょるＨＰＬＣを用いたアミノ酸分析を行った。分析は唯一のアミノ酸配列を示した。25 μg of purified ANP receptor was subjected to repeated Edman degradation and then Applied Biosystem DA 4F 0A Gas Phase Turkinator (gas-phas) Amino acid analysis was performed using HPLC (Equator). analysis showed a unique amino acid sequence.

この配列およびこの配列に対応するヌクレオチド配列を第２図Ａに示す。This sequence and the nucleotide sequence corresponding to this sequence are shown in Figure 2A.

実施ｔＬこの実施例は、ウシＡＮＰレセプターの完全コード配列を得るためのプロトコルを意図する。Implementation tL This example describes a protocol for obtaining the complete coding sequence of the bovine ANP receptor. intended.

プローブは、実施例■で推論されたＡＮＰレセプター〇Ｎ−末端配列に基づいて設計された。配列は第２図Ａに示す。オリゴヌクレオチド配列は３′から５′で表されている。プローブは、　（１）２４倍に縮退した工４ヌクレオチドのプローブ、　（２）４８倍に縮退した１４ヌクレオチドのプローブ、および（３）５１ヌクレオチドのプローブであり、ウシの好適なコドン選択を用いて設計されている。４つの異なった型のプローブ３は、セリンに対してＴＣＸコドンの代わりにＡＧＡ／Ｇコドンが用いられた場合、および真核生物のゲノムにおいて表現さレルシヌクレオチドであるＣｐＧがレセプターの０ＩＲＮＡ中に存在しない場合に調製された。従って、枠で囲んだヌクレオチドは両方の位置に八が存在するか、または両方の位置にＧが存在するかのいずれかであることを示している。星印は、５１ヌクレオチドのプローブと得られたレセプターｃＤＮＡの配列とにおいて一致していない箇所を示している（第２図Ａを参照）、ハイブリダイゼーション用プローブを合成しくアプライド　バイオシステムズ　モデル３８０ａ）　、ゲル電気泳動法により精製し、そして［γ”Ｐ　］　ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを用いて放射標識した。The probe was based on the ANP receptor N-terminal sequence deduced in Example designed. The sequence is shown in Figure 2A. The oligonucleotide sequence is 3' to 5' represented. The probe consists of (1) a 24-fold degenerate four-nucleotide protein; (2) a 48-fold degenerate 14-nucleotide probe; and (3) a 5-nucleotide probe. A single nucleotide probe designed using bovine preferred codon selection. There is. Four different types of probe 3 replace the TCX codon for serine. If the AGA/G codon is used in When CpG, which is a resinucleotide, is not present in the 0I RNA of the receptor was prepared. Therefore, does the boxed nucleotide have eight in both positions? , or the presence of G in both positions. Asterisk is the sequence and smell of the 51-nucleotide probe and the obtained receptor cDNA. (see Figure 2A), hybridization Applied Biosystems Model 380a) to synthesize probes for Purified by gel electrophoresis and [γ”P]ATP and T4 polynucleotide Radiolabeling was performed using tidokinase.

ｃＤＮＡは、　ＢＡＳＭ細胞から以下のように調製した。膜結合性ポリゾームは、実質的に［５ｅｂｂａｔｎ、Ｒ，ら（１９８３）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。cDNA was prepared from BASM cells as follows. Membrane-bound polysomes are , substantially [5ebbatn, R, et al. (1983) J. Biol, Chem.

Ｚ祁−：　３２９４−３３０３　］の記載に従ってＢＡＳＭ細胞から精製し、２末鎖ｃＤＮＡは、　Ｌａｎｄら（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：２２５１−２２６６の方法により合成した。セファクリル５４００　（ファーマシア）で分画したｃＤＮＡは　ＥｃｏＲＩアダプターに連結させ、 λｇｔｌｏにクローン化した［Ｗｏｏｄら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３１２：３３０−３３３コ。約９×１０ｂの組換え体ファージのライブラリーを得た。プラークを取り出すには、５１ヌクレオチドのプローブを組み合わせて用いて、　２０％ホルムアミドに６　Ｘ５ＳＣ（０，９Ｍ　ＮａＣ１，０，０９Ｍクエン酸ナトリウム）、１０％デキストラン硫酸、０．１％ＳＯＳ、　５　Ｘデンハート溶液（それぞれ０．１％のウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、およびフィコール）、および１００μｇ／ｒｒｄｌの酵母リポソームＲＮＡを加えた溶液中で、初期温度５５°Ｃ９その後４０°Ｃに下げて一晩放置してハイブリダイゼーションを行うことによりスクリーニングした。−ハイブリダイゼーションの徴候が陽性であるクローンは、プローブ１およびプローブ２にハイブリダイゼーションすることにより確認し、プラークを精製した。約３００，０００プラークから２つのクローン（ｐＡＮＰＲｃ−１およびｐＡＮＰＲｃ−２）が得られた。Z Qi-: 3294-3303] was purified from BASM cells, and 2 The terminal strand cDNA was obtained from Land et al. (1981) Nucleic Ac1ds Re. Synthesized by the method of J.S., 9:2251-2266. Sephacryl 5400 The cDNA fractionated with (Pharmacia) was ligated to an EcoRI adapter, λgtlo [Wood et al. (1984) Nature 312: 330-333. A library of approximately 9 x 10 b recombinant phages was obtained. P To extract Lark, a combination of 51-nucleotide probes was used to 6X5SC (0.9M NaCl, 0.09M citric acid) in 20% formamide sodium), 10% dextran sulfate, 0.1% SOS, 5X Denhart solution (0.1% each of bovine serum albumin, polyvinylpyrrolidone, and Ficoll) and a solution containing 100 μg/rrdl yeast liposomal RNA. Hybridization was carried out in a solution at an initial temperature of 55°C9, then lowered to 40°C and left overnight. Screening was carried out by conducting analysis. -Hybridization Clones with positive signs hybridize to probe 1 and probe 2. The plaques were confirmed by PCR and purified. Approximately 300,000 plaques Two clones (pANPRc-1 and pANPRc-2) were obtained.

配列の一部をＭ１３法、　Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ″７４：５４６３−５４６９；　Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：２６９−２７６により決定した後、別のプローブ（縮退していない２４ヌクレオチド）を調製し、同じｃＤＮＡライブラリーからクローンｐＡＮＰＲｃ−４，１２，１３，１４および１５を得るために使用した。ｐＡＮＰＲｃ−６を得るためにはｐＡＮＰＲｃ−４配列を基本とするプローブを用い、　ｐＡＮＰＲｃ−９および１０を得るためにはｐＡＮＰＲｃ−６配列を基本とするプローブを用いた。種々のプローブで検出されたｃＤＮＡライブラリーにおけるＡＮＰ　レセプタークローンの全頻度は、　２０．０００個あたり約１個であった。A part of the sequence was subjected to the M13 method, Sanger et al. (1977) Proc, Natl, Acad, Sci, USA''74:5463-5469; Messing et al. 1982) Gene 19:269-276, then another probe (24 non-degenerate nucleotides) was prepared from the same cDNA library. used to obtain clones pANPRc-4, 12, 13, 14 and 15. . To obtain pANPRc-6, a probe based on the pANPRc-4 sequence was used. To obtain pANPRc-9 and 10, the pANPRc-6 sequence was A basic probe was used. cDNA library detected with various probes The total frequency of ANP receptor clones in There was one.

ＡＮＰレセプターのｃＤＮＡクローンは、第２図Ｂに整理した配列として示す、　ＡＮＰレセプターをコードしている部分（オーブンリーディングフレーム）を太い線で示すとともに、その下方にそれぞれのクローンの配列を示す。破線は配列の分析が不完全な領域を示している。全体的には、これらクローンはｍＲＮＡの配列の３５５８ヌクレオチド以上を明らかにしている。ANP receptor cDNA clones are shown as organized sequences in Figure 2B. The part that encodes the ANP receptor (oven reading frame) It is indicated by a thick line, and the sequence of each clone is shown below it. The dashed line Column analysis shows areas where it is incomplete. Overall, these clones are mRNA More than 3558 nucleotides of the sequence have been revealed.

オーブンリーディングフレームは１６１１ヌクレオチドの長さである。これは第２図ＡのＮ−末端アミノ酸配列をコードする枠内部分を含んでいる。クローンｐＡＮＰＲｃ−２，ｐＡＮＰＲｃ−１２，およびｐＡＮＰＲｃ−１５の５′末端の配列は同一であるが、　ｐＡＮＰＲｃ−１３およびｐＡＮＰＲｃ−１４の５′末端の配列は、それぞれ４および３ヌクレオチドだけ異なっている。ＡＮＰ　レセプターｍＲＮＡの５′末端は、このように４６５個の非コードヌクレオチドを有することがわかる。約１５００ヌクレオチドの非コード３′末端配列が得られ、その５００個以上のヌクレオチドはさらに部分配列およびｐＡＮＰＲｃ−９のマツピングにより特定されている。ｎ＋ＲＮＡの３′末端を示すポリ（Ａ）配列を有するクローンは存在しないが、ポリ（Ａ）配列となり得る２つの付加的シグナル（ＡＡＵＡＡＡ）が２４４０および３１９７ヌクレオチドに存在する。それゆえ、レセプターは大きな（＞４０００ヌクレオチド）ｏ＋ＲＮＡの５′末端をコードすることがわかる。これはポリペプチドに対する他のレセプターのｍＲＮＡの構造に類似している。The open reading frame is 1611 nucleotides long. This is the first It contains the in-frame portion encoding the N-terminal amino acid sequence of Figure 2A. clone p The 5′ end of ANPRc-2, pANPRc-12, and pANPRc-15 Although the sequences are the same, the 5' ends of pANPRc-13 and pANPRc-14 The terminal sequences differ by 4 and 3 nucleotides, respectively. ANP reception The 5' end of the protein mRNA thus contains 465 non-coding nucleotides. I understand that. A non-coding 3' end sequence of approximately 1500 nucleotides was obtained; Its more than 500 nucleotides are further subsequenced and mapped to pANPRc-9. Identified by Tuping. The poly(A) sequence indicating the 3' end of n+RNA is There are no clones with this, but there are two additional signals that can be poly(A) sequences. (AAUAAA) is present at nucleotides 2440 and 3197. That's it Well, the receptor co-locates the 5' end of the large (>4000 nucleotides) o+ RNA. It can be seen that the code is coded. This is the mRNA of other receptors for the polypeptide. The structure is similar to that of

ＡＮＰレセプター全体をコードする領域を有するクローンは。A clone containing the entire ANP receptor encoding region.

ｐＡＮＰＲｃ−１およびｐＡＮＰＲｃ−４に共通のＮｃｏ　Ｉ制限部位を利用して。Using the Nco I restriction site common to pANPRc-1 and pANPRc-4, hand.

この両者を結合することにより、　ｐＧＥＭｌ（プロメガ　バイオチク）で構築した。得られたクローンｐＡＮＰＲｃ−１／４は、　２２９０塩基対のＤＮＡ挿入断片を有しており、　該ＤＮＡ挿入断片は、完全なオーブンリーディングフレーム、２３３ヌクレオチドの５′末端の非コード領域、および１９０ヌクレオチドの３′末端非コ一ド配列を有する。３′プラスミド／ｃＤＮＡ連結体をＥｃｏＲＩで制限分解し９次いでＳＰ６ボリメラーゼで転写することにより。By combining these two, it is constructed with pGEMl (Promega Biochiku). did. The obtained clone pANPRc-1/4 contains a 2290 base pair DNA insert. The DNA insert has a complete oven-reading frame. a 5′ non-coding region of 233 nucleotides, and a 190 nucleotide non-coding region. It has a 3'-terminal non-cod sequence. The 3' plasmid/cDNA ligation was by restriction digestion with RI followed by transcription with SP6 polymerase.

約２３００ヌクレオチドの合成ＲＮＡを得た。塩基数はアガロースゲル電気泳動により決定された。A synthetic RNA of approximately 2300 nucleotides was obtained. Base number is determined by agarose gel electrophoresis determined by.

レセプターの一次構造は、すべてのクローンの配列の分析により決定された。ｃＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列を第３図に示す。右端の番号は配列におけるヌクレオチドの位置を示す。プレプロレセプターの予想されるアミノ酸配列は、連続したコード領域のコドンの下部に示す。ＭＥＴ　（００１）で始まるアミノ酸番号を示す。異なるクローン間においていくつかの単一ヌクレオチドの相違が示されたが、これら相違のうち４つはコード領域にあった。ヌクレオチド５５２．１０１０．１４３６゜および１５５８は、それぞれｐＡＮＰＲｃ−２ではＧであり、　ｐＡＮＰＲｃ−１ではＣであり、　ｐＡＮＰＲｃ−４では八であった。この頻度は逆転写酵素と関連した誤りの頻度（Ｇｕｉｄｏｎら（１９８３）　ＭｅｔｈＪｎｚｙａ＋ｏ１．１０１　：３７０−３８６）に類似しているので、これらの違いはクローニングの産物であると思われる。第３図の配列は、それぞれの位置で少なくとも２つのクローンが一致することを示している。The primary structure of the receptor was determined by sequence analysis of all clones. c. The DNA sequence and predicted amino acid sequence are shown in FIG. The rightmost number is an array The position of the nucleotide is shown. Predicted amino acid configuration of preproreceptor Columns are shown below the contiguous coding region codons. Starts with MET (001) Amino acid numbers are shown. Some single nucleotides between different clones Although differences were demonstrated, four of these differences were in the coding region. nucleotide 552.1010.1436° and 1558 are pANPRc-2, respectively. is G, in pANPRc-1 it is C, and in pANPRc-4 it is 8. It was. This frequency is similar to the error frequency associated with reverse transcriptase (Guidon et al. (1983). ) is similar to MethJnzya+o1.101:370-386) These differences appear to be a product of cloning. The arrangement in Figure 3 is At least two clones are shown to be identical at each position.

可能性のあるシグナルペプチダーゼ分解部位（ム）、および成熟レセプター〇Ｎ −末端開始部位（↓）を示す。可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位は枠で囲み、推定される膜通過領域は下線で示す。３′末端の非コード領域において可能性のあるポリ（Ａ）付加的シグナルには、上に線を施す。Potential signal peptidase cleavage sites (MU) and mature receptor〇N −The terminal start site (↓) is indicated. Potential N-linked glycosylation sites are boxed. The estimated membrane passage area is underlined. Possible in non-coding region at 3' end Poly(A) additional signals with potential are overlined.

オーブンリーディングフレームの５３８コドンは、ウシＡＮＰレセプターの一次構造を決定する。ＡＮＰレセプターの前駆体ポリペプチドは、このように５９．７４４ダルトンの分子量を有する５３７アミノ酸から構成されると予想される。Codon 538 of the open reading frame is the primary of the bovine ANP receptor. Decide on the structure. The precursor polypeptide of the ANP receptor is thus 59. It is predicted to be composed of 537 amino acids with a molecular weight of 744 Daltons.

第３図において開始コドンとして示されるＡＴＧは、開始コドンであり得るさらに４つのＡＴＧが先行するが、後者の４つは、それぞれのリーディングフレームにおける終止コドン、およびいずれのフレームにおいてもありそうにない連続したオリゴフェニルアラニンをコードするＴに富んだ領域が後に続く。Ｋｏｚａｋ　（ＣＣＡ／Ｇ　ＣＣ）、　（１９８６）　Ｃｅ１１４４：２８３−２９２により定義されたように。ATG, shown as a start codon in FIG. 3, is a possible start codon. is preceded by four ATGs, the latter four in their respective reading frames. a stop codon in and an unlikely consecutive sequence in either frame. It is followed by a T-rich region encoding oligophenylalanine. Kozak (CCA/G CC), (1986) Ce1144:283-292 As defined.

良好な翻訳開始シグナル（ＧＣＡＣＧ）は、予想されたＡＴＧに先行し、このＡＴＧは単離されたレセプター〇Ｎ−末端配列と同じオリゴペプチド配列のフレーム内にある。レセプターの前駆体について予想されるサイズは、　ｃＤＮＡを鋳型として用いて合成したＲＮＡのインビトロでの翻訳産物の観察されたサイズ（Ｍｒ〜５８．０００）と非常に良く一致する。そして、精製されたレセプターのアミノ酸組成もまた予想される配列と良く一致する。結局、配列の特徴は、レセプターに関する公知の特徴および予想される特徴と一致する。A good translation initiation signal (GCACG) precedes the predicted ATG and this A TG is a frame of oligopeptide sequence identical to the isolated receptor N-terminal sequence. It is within the room. The expected size of the receptor precursor is The observed size of the in vitro translation product of the RNA synthesized using the template ( Mr~58.000). And the purified receptor The amino acid composition also matches well with the predicted sequence. After all, the characteristics of arrays are consistent with known and expected characteristics for

レセプターにおけるアミノ酸配列のハイドロパシシテイは。The hydropathicity of the amino acid sequence in the receptor.

ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１−Ｂｉｏｌ、１５７　：１０５−１３２の方法により計算した。局部的なハイドロバシシティの値は、残基ｘ−９からｘ＋９までについて平均した値であって、第４図に示すように残基Ｘ（アミノ酸番号）に対してプロットした。正の値は疎水性領域を示しており、負の値は親水性の領域を示す。レセプタータンパクの概略図を参考のために下に示す。黒く塗りつぶした領域はそれぞれ予想されるシグナル配列および膜通過配列を示す。点を描いた領域はシグナルペプチダーゼがおそら（切断する領域を示し、空白の領域はレセプターが成熟する間に除去される付加的なアミノ酸を示す。Kyte and Doolittle, (1982) J, Mo1-Biol, 1 57:105-132. local hydrobasicity The values are the average values for residues x-9 to x+9, as shown in Figure 4. Plotted against sea urchin residue X (amino acid number). Positive values indicate hydrophobic regions negative values indicate hydrophilic regions. Refer to the schematic diagram of the receptor protein. The details are shown below. The blacked out areas represent the expected signal sequence and The membrane passage sequence is shown. The dotted region is likely to be cleaved by a signal peptidase. The blank areas indicate additional amino acids that are removed during receptor maturation. Indicates acid.

レセプターにおける参照の配列は、システィン（Ｃ）およびＡｓｎ−Ｘ−５ｅｒ／Ｔｈｒの可能性のあるグリコジル化部位（ＣＨＯ）である。Reference sequences in the receptor are cysteine (C) and Asn-X-5er /Thr potential glycosylation site (CHO).

Ｅ、ｃｏｌｉ　（ｐＡＮＰＲｃ−１）は、微生物の寄託に関するブタペスト条約に基づき、　１９８６年５月５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、　１２３０１　パークローン　ドライブ、ロックビル、ＭＤ　２０８５２．Ｕ、Ｓ、Ａ、に寄託した。この寄託に対して受託番号６７１０５が授与されている。E. coli (pANPRc-1) is subject to the Budapest Treaty on the Deposit of Microorganisms. Based on the American Type Culture Collection, May 5, 1986. 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. U, Deposited with S.A. Accession number 67105 has been assigned to this deposit.

第２図Ａおよび第３図に示されている配列と、寄託されたクローンｐＡＮＰＲｃ −１に含まれる配列との間の不一致に対して、後者はその範囲を含むように管理されている。The sequences shown in Figures 2A and 3 and the deposited clone pANPRc −1, the latter is managed to include that range. has been done.

亥ＩＬＬ以下の実施例は、完全なヒトＡＮＰレセプターをコードする配列のクローニングを説明する。Pig ILL The following examples demonstrate the cloning of sequences encoding the complete human ANP receptor. Explain.

ヒトＡＮＰレセプターのクローンを得るために、ヒトの腎臓のｃＤＮＡライブラリーを、ウシのクローンのニックトランスレーションされたコード配列（１，４ｋｄ断片：　ｐＡＮＰＲ−１）を用いてスクリーニングした。スクリーニングされた約１×１０６個のうち、４つが陽性であった。これらのうちの３つは、独立した１０９６ｂｐ　（クローン１−１−１）　、　９２５ｂｐ　（クローン１２ −１−２）、およヒ８１３ｂｐ（クローン１６−１−１）の重複クローンであり、ウシのクローンの１０８３ｂＰＴｉＪ域および２１２１ｂＰ領域と相同性を有していた。To obtain a human ANP receptor clone, a human kidney cDNA library was used. Lee, the nick-translated coding sequence of the bovine clone (1,4 Screening was performed using the kd fragment: pANPR-1). Screened Of the approximately 1 x 106 cells tested, 4 were positive. Three of these are independent 1096bp (clone 1-1-1), 925bp (clone 12 -1-2), and a duplicate clone of 813 bp (clone 16-1-1). , has homology to the 1083bPTiJ region and 2121bP region of the bovine clone. Was.

ウシのクローンの配列と比較すると、クローン１−１−１は１８７３の位置に３ｂｐの欠損があり、示した３つのクローンは全て３′末端の非翻訳領域に同一の１２ｂｐ挿入部分を有する。３つのクローンは、いずれもｔｉｃｏＲ１部位で終わっており、ポリＡティルを有していない。When compared to the sequence of the bovine clone, clone 1-1-1 has 3 nucleotides at position 1873. bp deletion, and all three clones shown have identical 3′-end untranslated regions. It has a 12bp insert. All three clones terminate at the ticoR1 site. It has no polyA till.

約０．５　Ｘｌ０６個のヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーは、２８個のヌクレオチドからなる２つのオリゴヌクレオチド（ヒトの配列の１１１９−１１４７ｂｐおよび１１６６−１１９４ｂｐ）と、り０−７ｌ−１−１（ｐＡＮＰＨＲｃ２）のニックトランスレーションされた２４３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／　Ｓａｃ　Ｉ断片とを用いてスクリーニングする場合、ウシのクローンの９６〜１７３２ｂｐｅＪ域と相同性を有する１つの独立した１６３６ｂｐクローン（クローン４−２）を与える。このクローンは、ウシのクローンと比較すると、　５５０ｂｐの位置に１２ｂｐの挿入部分を有し得る。The approximately 0.5Xl06 human placenta cDNA library contains 28 nucleotides. Two oligonucleotides (1119-1147 bp of human sequence) and 1166-1194bp) and ri0-7l-1-1 (pANPHRc2) Nick-translated 243bp EcoRI/SacI fragment of When screening using 96-1732 bpeJ of bovine clone One independent 1636 bp clone (clone 4-2) with homology to the give. This clone is located at a position of 550 bp compared to the bovine clone. It may have a 12 bp insert.

完全なコード配列を有するヒトのレセプタークローンｐＡＮＰＨＲＣ４は、クローン４−２　（ｐＡＮＰＨＲｃｌ）の約１２５０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｓａｃ　Ｉ断片およびクローン１２−１−２（ｐＡＮＰＨＲＣ３）の約７００ｂｐ　Ｓａｃ　Ｉ　／ＥｃｏＲＩ断片を、　ＥｃｏＲＩで消化し、　ＣＩＰで処理したベクターｐＵｃ９に連結することにより調製される。第５図は、このヒトのレセプタークローンの配列を示す。この配列は、５′末端の非翻訳領域。The human receptor clone pANPHRC4 with the complete coding sequence was cloned. Approximately 1250bp of EcoRI/SacI of 4-2 (pANPHRcl) Approximately 700 bp Sac of fragment and clone 12-1-2 (pANPHRC3) A vector in which the I/EcoRI fragment was digested with EcoRI and treated with CIP. -pUc9. Figure 5 shows this human receptor. The sequence of the clone is shown. This sequence is the untranslated region at the 5' end.

シグナル配列、開始Ｎｅｔ、コード領域、３′末端の非翻訳領域、そしてウシの配列とのアミノ酸の差異を有する。Signal sequence, initiation Net, coding region, 3' untranslated region, and bovine It has amino acid differences from the sequence.

Ｅ、ｃｏｌｉ（ｐＡＮＰＨＲｃｌ）およびＥ、ｃｏｌ　ｉ　（ｐＡＮＰＨＲＣ３）は、微生物の寄託に関するブタベスト条約に基づき、　１９８７年５月８日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。これらの寄託に対して、それぞれ受託番号６７４０１および６７４０２が授与されている。第５図に示されている配列と、これらの寄託されたクローンに含まれる配列との間の不一致に対して、後者はその範囲を含むように管理されている。E. coli (pANPHRcl) and E. coli (pANPHRC3 ) was established on May 8, 1987 under the Butapest Treaty on the Deposit of Microorganisms. Deposited in the American Type Culture Collection. For these deposits, They have been awarded accession numbers 67401 and 67402, respectively. Shown in Figure 5 due to discrepancies between the sequences contained in these deposited clones and those contained in these deposited clones. On the other hand, the latter is managed to include that range.

実隻開Ｎここに述べられているＡＮＰ　レセプターが、　ＡＮＰ結合を示すことが知られている組織部分に見出されることを以下に示す。Real ship open N The ANP receptor described here is known to exhibit ANP binding. The following is what is found in the tissue parts of the body.

クローン化された配列が、　ＡＮＰ　レセプターを有することが知られている組織および細胞において発現されたがどうかを調べるために、ノーザンプロット分析を行った。細胞系は。The cloned sequence is a group known to have an ANP receptor. Northern blot analysis was performed to determine whether the protein was expressed in tissues and cells. We conducted an analysis. The cell line.

１０％Ｃ）２とともに１０％ウシ胎児血清を含有するダルベツコの改変イーグル培地中、３７°Ｃで集密的となるまで増殖させた。Dulbecco's Modified Eagle containing 10% Fetal Bovine Serum with 10% C)2 Grow to confluence in culture medium at 37°C.

ポリ（Ａ）　ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアナート法＋　Ｃｈａｒｇｗｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：５２９４−５２９９により単離し、引続きオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーを行った。ＲＮＡは、５０’Ｃでホルムアミドおよびホルムアルデヒドで変性させ９次いでホルムアルデヒドを含有する１、４％アガロースゲルで分離し。Poly(A) RNA was obtained using the guanidine isothiocyanate method + Chargwin (1979) Biochem, 18:5294-5299 and subsequently Oligo (dT) cellulose chromatography was performed. RNA is 50'C denatured with formamide and formaldehyde 9 and then formaldehyde was removed. Separated on a 1.4% agarose gel containing

ニトロセルロースに移した。このフィルターは、　５０％ホルムアミドに５ｘｓｓｃを加えた溶液中で、ニックトランスレーションにより放射活性としたｐＡＮＰＲｃ−１挿入ＤＮＡにハイブリダイズさせた。フィルターを０．１％ＳＤＳを加えたＩｘｓｓｃ中、６５°Ｃで洗浄し、オートラジオグラフィーにがけた。Transferred to nitrocellulose. This filter is 5xs in 50% formamide. pAN made radioactive by nick translation in a solution containing sc. Hybridized to PRc-1 insert DNA. Filter with 0.1% SDS The cells were washed in added Ixssc at 65°C and subjected to autoradiography.

クローン化された配列との相同性を有するポリ（１）含有ＲＮＡは、　ＡＮＰレセプターを有する３つのウシ初代細胞系における別々の種として存在する。これら３つの細胞系は、大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）　、副腎皮質細胞（ＢＡＣ）、および大動脈平滑筋細胞（ＢＡＳＭ）であって、　ｃＤＮＡクローンはこれらの細胞から誘導された。Poly(1)-containing RNA with homology to the cloned sequence is an ANP receptor. It exists as separate species in three primary bovine cell lines with septa. this These three cell lines are aortic endothelial cells (BAE), adrenocortical cells (BAC), and and aortic smooth muscle cells (BASM), and cDNA clones are derived from these cells. derived from cells.

腎臓および副腎組織はどちらもＡＮＰレセプターを発現するので、これらの組織から単離したポリ（Ａ）　ＲＮＡを分析した。ウシ腎１１ｉ　ＲＮＡは９本質的に同一のパターンを示す分画された乳頭および皮質のクローン化された配列との相同性を有する別々のＲＮＡ種を有することが見出された。これらの結果は、　ＵＶ−フォトアフィニティ標識化の研究と一致し、　Ｍｒ〜６０．０００のＡＮＰ結合サブユニットが腎臓の糸球体および腎髄質集合管内部の領域の両方に存在するということを示す。し力）しなめえら。Kidney and adrenal tissues both express ANP receptors, so these tissues Poly(A) RNA isolated from was analyzed. Bovine kidney 11i RNA is 9 essential with cloned arrays of fractionated papilla and cortex showing identical patterns to It was found to have distinct RNA species with homology. These results are Consistent with UV-photoaffinity labeling studies, an AN of Mr~60.000 P-linked subunits are present in both the renal glomerulus and the region within the renal medullary collecting duct. Show that you will. Shiriki) Shinameera.

この分析では副腎全体から得たＲＮＡ中にレセプターのメツセージを検出することが出来なかった。This analysis detects receptor messages in RNA obtained from whole adrenal glands. I couldn't do it.

ノーザン分析の結果は、培養細胞内に少な（とも４種類の別々のＲＮＡ種が存在するということである。ＢＡＣ細胞およびＢＡＥ細胞のＲＮＡにおいて明白である主要なレセプターＲＮＡ　Ｌよ。The results of the Northern analysis showed that there were only a few (4 different types of RNA) in the cultured cells. That is to say. evident in the RNA of BAC and BAE cells. The main receptor RNA L.

長さが約８０００ヌクレオチドであるが、約３１００ヌクレオチドのＲＮＡも検出され、約４０００ヌクレオチドと約５０００ヌクレオチドの小さなバンドも見られる。８０００ヌクレオチドのＲＮＡは、スプライシングされていないｐｒｅ −ｍＲＮＡではない。というのは。Although the length is approximately 8,000 nucleotides, RNA of approximately 3,100 nucleotides has also been detected. Small bands of about 4000 nucleotides and about 5000 nucleotides were also observed. It will be done. The 8000 nucleotide RNA consists of an unspliced pre -Not mRNA. I mean.

このＲＮＡが、核ＲＮ＾を除去するために分画されたＲＮＡに見出されるからである。小さいＲＮＡは別々の分解産物でもなし）ようである。というのは、これらのＲＮＡが、５′末端とポリ（Ａ）テイルの両方を有するからである。このことは、これらのＲＮＡが、５′コード領域または３′コード領域に対するプローブを用いて同様に検出され、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーにより単離されたという事実から明らかである。This RNA is found in the RNA that is fractionated to remove nuclear RNA^. be. It appears that the small RNAs are not separate degradation products. This is because This is because their RNAs have both a 5' end and a poly(A) tail. this child means that these RNAs contain probes for the 5' or 3' coding region. was similarly detected using This is clear from the fact that it is more isolated.

ＡＮＰレセプターｍＲＮＡの不均一性は、異なる遺伝子の選択的スプライシングまたは転写の結果であり得る。異なる遺伝子種は、ハイブリダイゼーション洗浄の厳密性を増加させることによっては区別され得ないので、それらは比較的拡散した遺伝子の産物ではない。また、ヒト組織では単一のｍＲＮＡ種（約５６００ヌクレオチド）のみが検出されていることがわかっているので、ウシにおけるレセプターｍＲＮＡの不均一性は機能的に重要な意味があるのかどうか疑わしい。ANP receptor mRNA heterogeneity may be due to alternative splicing of different genes. or may be the result of transcription. Different genospecies hybridization wash They are relatively diffuse since they cannot be distinguished by increasing the stringency of It is not the product of a gene that has Furthermore, in human tissues, only a single mRNA species (approximately 5,600 Since it is known that only nucleotides (nucleotides) have been detected, the It is doubtful whether the heterogeneity of Scepter mRNA has any functional significance.

レセプターｍＲＮＡ間で遺伝子種の長さの不均一性が頻繁に観察されるが、これ番よ。Genospecies length heterogeneity is frequently observed among receptor mRNAs; It's your turn.

ＩＬ−２レセプターａ＋ＲＮＡについて示されているように、３′末端の非コード領域の長さの相違によるものであり得る。上記データ、およびＡＮＰ　レセプタークローンの３′末端の非コード領域における２つの可能性のあるポリ（Ａ）付加シグナＪしの存在は、　ＡＮＰレセプターｍＲＮＡの長さの相違が３′末端の非コード領域の長さの相違によるものであるということを示唆している。As shown for IL-2 receptor a+ RNA, the 3'-end non-coding This may be due to the difference in the length of the code region. The above data and ANP receipt Two possible poly(A)s in the non-coding region at the 3′ end of the turclone The presence of the additional signal J is due to the difference in length of ANP receptor mRNA at the 3' end. This suggests that this is due to the difference in the length of the non-coding region.

（以下余白）実新Ｉ津ｙこの実施例では、異種哺乳類動物細胞における組換えＡＮＰレセプターの発現、およびへＮＰレセプターｍＲＮへのインビトロでの転写について述べる。(Margin below) Real new Itsuy In this example, expression of a recombinant ANP receptor in xenogeneic mammalian cells; and in vitro transcription into NP receptor mRNA.

ｐＡＮＰＲｃ−１／４が実際にＡＮＰレセプターをコードしていることを証明するために、異なった系（ツメガエル（ｋ匹匹と）の卵母細胞）において特異的なＡＮＰ結合誘発能力をテストした。We demonstrate that pANPRc-1/4 actually encodes an ANP receptor. In order to The ability to induce ANP binding was tested.

ｐＡＮＰＲｃ−１／４からのレセプターコード配列をｐＧＥＭＩ（プロメガ。The receptor coding sequence from pANPRc-1/4 was transferred to pGEMI (Promega.

マジソン、訂）にクローン化し、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを調製した。Madison, ed.) and RNA was prepared according to the manufacturer's instructions.

卵母細胞の調製および注入は、実質的にＧｕｒｄｏｎら（１９８３）、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１：３７０−３８０．に記載された方法により行なった。典型的には、各卵母細胞に５０ｎ　１の合成ＲＮＡを含む５０ｎ　ｌを注射し、修正パース生理食塩水中で２１゛Ｃにて４８時間インキュベートを行なった。粗製膜を調製し、レセプター結合バッファー（２■／　ｍｌ　Ｃｌ２Ｅｌ＋、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍｇｃｔ、。Oocyte preparation and injection were performed substantially as described by Gurdon et al. (1983), Met h, Enzymol, 101:370-380. Performed by the method described in became. Typically, each oocyte receives 50nl containing 50n1 of synthetic RNA. injection and incubation for 48 hours at 21°C in modified Perth saline. It was. Prepare a crude membrane and add receptor binding buffer (2 ml/ml Cl2El +, 100mM NaCl, 10mM Mgct.

１０ｍＭ　ＣａＣ］□および１００＋ｎＭ　）リス：　ＨＣｌ、ｐＨ７，５）に溶解させた。10mM CaC]□ and 100+nM) Lis: HCl, pH 7,5) Dissolved.

０．５ｄの膜懸濁液〔１０ｎｇのタンパクと、２　ＸＸ１０５ｃｐの（＋２５ｔ）ｒＡＭＰ　（Ｉ　Ｘ］、Ｏ’ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）および標識されていないＡＮＰ類似物の指示された濃度とを含有する〕を２１°Ｃにて３０分間インキュベートした後に、結合を測定した。反応を終結させ、結合物からアセトン（最終濃度４０％ｖ／ｖ）沈澱により、Ｔｉ離のタンパクを分離した。標識していないリガンドが存在しない場合の計数値は２０４８±３７４ｃｐｍであり、他方、非特異的結合（２０ｎＭ　ｒＡＮＰの存在下で結合させたときの計数値）は５９２±８９ｃｐｍであった。ボンベシン（ベニンシュララボス）は、１００μＨにおいてさえも結合に関しての効果はなかった。0.5d membrane suspension [10ng protein and 2XX105cp (+25t ) rAMP (IX], O'cpm/fmol) and unlabeled AN containing the indicated concentrations of P analogues] for 30 minutes at 21°C. Binding was measured after loading. Terminate the reaction and remove the conjugate with acetone (final concentration Proteins isolated from Ti were separated by precipitation (40% v/v). unmarked riga The count value when there is no index is 2048 ± 374 cpm, while binding (counted value when binding in the presence of 20 nM rANP) was 592 ± 8 It was 9 cpm. Bombesin (Veninsula Labos) at 100μH There was no effect on binding.

注入しない、もしくは擬似物を注入した卵においては、膜において、低レベルで非特異的結合が検知されただけであった。しかし９合成ｍＲＮＡが注入された卵母細胞の可溶化膜において、放射標識ＡＮＰの飽和性特異的結合は証明されなかった。In eggs that were not injected or injected with simulants, low levels were observed in the membranes. Only non-specific binding was detected. However, eggs injected with 9 synthetic mRNA Saturable specific binding of radiolabeled ANP was not demonstrated in solubilized membranes of mother cells. It was.

ｒＡＮＰ　（４−２８）　、および切形の類似物であるｒＡＮＰ　（４−２８）を結合に用いた。実験で得られた見かけのＩ、は２両者の類似物においていずれも０．２７ｎＭであった。ボンベシン（無関係のテトラデカペプチド）が結合に競合しなかったため、結合はＡＮＰ類似物に特異的であった。ｐＡＮＰＲｃ−１／４のＡＮＰレセプターコード領域のインビトロでの転写および、それに続く、細胞を含まない網状赤血球ライゼート中での翻訳により次のことが証明された。rANP (4-28), and its truncated analog rANP (4-28) was used for binding. The apparent I obtained in the experiment is was also 0.27 nM. Bombesin (an unrelated tetradecapeptide) binds Binding was specific for ANP analogs as there was no competition. pANPRc-1 In vitro transcription of the ANP receptor coding region of /4 and subsequent Translation in cell-free reticulocyte lysate demonstrated that:

つまり、　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により判定されるように２合成ＲＮへは２機能性ｍＲＮＡをコードするＭｒ〜５８，０００のポリペプチドであることが証明された。That is, as determined by 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis, 2 Synthetic RN contains Mr ~ 58,000 polypeptides encoding bifunctional mRNAs It was proven that.

尖旋開且この実施例は、実施例■、■または■により得られたコード配列の発現に有用なプロトコルについて述べる。Apical rotation open and This example describes the methods useful for expressing the coding sequences obtained in Examples Describe the protocol.

上述のように、ＡＮＰレセプタータンパクをコードするｃＤＮ＾クローンは１種々の宿主において組換え体タンパクを生産するのに最も都合よ（用いられる。しかし、＠乳類系における発現が最も好ましい。なぜなら、天然に生産されるタンパクがプロセッシングされるのに類似して、宿主は、翻訳後ブロセッシングを行うことができるためである。従って、　ｃＤＮＡまたはゲノム配列が使用され得る。As mentioned above, there is only one type of cDN^ clone encoding the ANP receptor protein. The most convenient (used) method for producing recombinant proteins in various hosts. Expression in mammalian systems is most preferred. Because naturally produced tan Similar to how proteins are processed, the host carries out post-translational processing. This is because it can be done. Therefore, cDNA or genomic sequences may be used. Ru.

完全長のｃＤＮＡ　（実施例■または■）またはゲノム（実施例■）　ＡＮＰレセプターをコードするクローンが、宿主ベクターに挿入されるために、調製される。クローン化された挿入物は。Full-length cDNA (Example ■ or ■) or genome (Example ■) A clone encoding the receptor is prepared for insertion into a host vector. Ru. The cloned insert.

該挿入物がそれ自身にＥｃｏＲＩ部位を有する場合には、　ＥｃｏＲＩで部分分解し、切断される。必要に応じて、他の適当な酵素が用いられ得、該挿入物にＥｃｏＲＩ　リンカ−が供給される。次に、切断された挿入物は、後述のように、宿主ベクターｐＨ３１に組み込まれる。If the insert has an EcoRI site of its own, it can be partially segmented with EcoRI. unraveled and severed. Other suitable enzymes may be used, if desired, to infect the insert with E. A coRI linker is provided. The cut inserts are then cut, as described below. Incorporated into host vector pH31.

プラスミドｐＨ５１は、挿入されたＤＮＡを哺乳類宿主中で発現させるのに適切である。このプラスミドは、　ｐ８４Ｈ（Ｋａｒｉｎら。Plasmid pH51 is suitable for expressing inserted DNA in mammalian hosts. It is. This plasmid is p84H (Karin et al.

（１９８２）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９９：８０２）からのｈＭＴ−ＩＩ配列の８４０ｂｐを含有する。この８４０ｂｐは、ｈｌ’１Ｔ−ＩＩ遺伝子の一７６５位の旧ｎｄＩ［［部位から＋７０のＢａｍ旧切断部位におよぶ。ｐＨ５１を構築するために。(1982), Nature 299:802) of the hMT-II sequence. Contains 40bp. This 840bp is at position 1765 of the hl'1T-II gene. Extends from the old ndI[[ site to the Bam old cleavage site at +70. Build pH51 In order to

プラスミドｐ８４ＨをＢａｍＨＩで完全に分解し、エキソヌクレアーゼＢＡＬ− ３１で処理し、末端のヌクレオチドを除去し２次に旧ｎｄ■で分解した。所望の５４ｏｂｐ断片をｐＵｃ８　（Ｖｉｅｉｒａら、　（１９８２）。Plasmid p84H was completely digested with BamHI and treated with exonuclease BAL- 31 to remove the terminal nucleotides, and then digested with old nd■. desired The 54 obp fragment was converted into pUc8 (Vieira et al. (1982)).

Ｇｅｎｅ１９：２５９−２６８）　（Ｈｉｎｄ　Ｉ［Ｉおよび１ｌｉｎｃＩＩ分解で開環させたもの）に連結させた。この連結混合物を、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換してＡｍｐＲとするのに使用し、そして、候補となるひとつのプラスミド（１１）ＩｓＩと命名する）を単離し、ジデオキシ法で配列決定した。ｐＨ５１は、ポリリンカー（都合のよい制限部位を含む）の上流に、ｈＭＴ −Ｉ［制御配列を含む。Gene19:259-268) (Hind I[I and 1lincII min. (ring-opened by solution). This ligation mixture was combined with E, coli H used to transform BIOI into AmpR, and one candidate A plasmid (11) named IsI) was isolated and sequenced using the dideoxy method. Ta. pH51 contains hMT upstream of the polylinker (containing convenient restriction sites). -I [contains control sequences.

上記にて調製したＡＮＰレセプターサブユニットコード配列を、　ＥｃｏＲＩ分解ｐＨ５１に連結し、連結混合物はＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１を形質転換しＡｍｐ”とするために用いた。成功裏に得られた形質転換体は、制限分析によってスクリーニングされる。所望のプラスミドを含む菌株、　ｐＭＴ−ＡＮＰｒをさらに増殖させて。The ANP receptor subunit coding sequence prepared above was The ligation mixture was transformed into E. coli MC1061. Amp”. Successfully obtained transformants were analyzed by restriction analysis. will be screened. A bacterial strain containing the desired plasmid, pMT-ANPr Let it grow even more.

大量のプラスミドＤＮＡを調製する。Prepare a large amount of plasmid DNA.

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）のに１細胞を、　Ｆ１２培地およびＤＭＥ培地の１：１の混合物（ウシ胎児血清を１２％の割合で含有する）で培養する。被感染能力を有する細胞をｐ？ＩＴ−＾ＮＰｙおよびｐＳＶ２　：　ＷＥＤ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、（１９８２）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。One Chinese hamster ovary (CHO) cell was placed in F12 medium and DM. Culture in a 1:1 mixture of E medium (containing 12% fetal bovine serum) . Cells that have the ability to be infected are p? IT-^NPy and pSV2: WED( Southern et al. (1982), J. Mo1. Appl.

Ｇｅｎｅｔ、工：３２７−３４１）により共形質転換する。ｐＳＶ２：ＮＥＯは、ネオマイシン類似物Ｇ４１８に対する耐性を与える機能性遺伝子を含有する。Genet, Eng.: 327-341). pSV2:NEO is , contains a functional gene that confers resistance to the neomycin analog G418.

形質転換においては、５００ｎｇのｐＳＶ２−ＮＥＯおよび５ｌｇのｐＭＴ−ＡＮＰｒを、直径１６ｍｍのディツシュ中の細胞（Ｗｉｇｌｅｒら、　＜１９７０）　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７−７８５のプロトコルによるリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱物中）に加える。このとき、該ＤＮＡに４時間さらした後、１５％のグリセロールと２分間インキュベートして°′ショック”を与える。１日後に、この細胞を１■／ｄの６４１８と処理し、　Ｇ４１８抵抗性コロニーのプールを得る。このプールはＡＮＰレセプターの産生について検定され、クローンが取り出される。For transformation, 500 ng pSV2-NEO and 5 lg pMT-A NPr was cultured in cells in a 16 mm diameter dish (Wigler et al., <1970 ) Calcium phosphate-D according to the protocol of Ce1l 16:777-785 (in NA co-precipitate). At this time, after 4 hours of exposure to the DNA, 15% Give “shock” by incubating with glycerol for 2 minutes. After 1 day, These cells were treated with 1 μ/d of 6418 to generate a pool of G418-resistant colonies. obtain. This pool was assayed for ANP receptor production and clones were selected. Served.

ｐＭＴ−ＡＮＰｒの遺伝形質を安定に有する成功裏に得られた形質転換体を、クローン分離株を得るために、低密度で播種する。The successfully obtained transformant stably carrying the genetic trait of pMT-ANPr was cloned. Seed at low density to obtain lawn isolates.

これらの分離株を、ＡＮＰレセプター産生の簡便な検定のため。These isolates were used for a convenient assay of ANP receptor production.

１０−　’Ｍ塩化亜鉛にさらした後、マルチウェルプレートで増殖させる。ＡＮＰレセプターの定量は、抗血清に対する標準ＥＬＩＳＡまたは放射免疫測定法により行なわれる。上記抗血清は、標準的な方法を用いて、適当なＡＮＰレセプタータンパクに対して調製される。所望のＡＮＰレセプターを大量に生産するクローン分離株が選択される。After exposure to 10-'M zinc chloride, grow in multiwell plates. AN Quantitation of P receptors can be performed by standard ELISA or radioimmunoassay against antisera. It is done more. The above antisera can be isolated using standard methods to target the appropriate ANP receptor. – Prepared for proteins. A clone that produces large quantities of the desired ANP receptor. isolates are selected.

適切な条件下でＡＮＰレセプターを生産することが示される細胞を２次に、１０％のウシ胎児血清が加えられた基本培地にｌ／１０量で加え、−夜インキユベートする。次に、塩化亜鉛をＩ　Ｘｌ０−’？から３　Ｘｌ０−’Ｍの範囲の濃度で加えて、ＡＮＰレセプターの産生を誘発する。ＡＮＰレセプターのレベルは、　ＺｎＣ１□が２Ｘ１０−’ＦＩ　という最適の誘発条件下において、７〜１０日間で上昇する。Cells shown to produce ANP receptors under appropriate conditions were then subjected to 10 % fetal bovine serum in 1/10 volume and incubate overnight. to Next, add zinc chloride to IXl0-'? Concentrations in the range from 3Xl0-'M In addition, it induces the production of ANP receptors. ANP receptor levels are Under the optimal induction conditions of 2X10-'FI of ZnC1□, 7-10 rises in days.

必要に応じて、培地中に分泌されるＡＮＰレセプターは、天然型タンパクに対するのと同様の上述の方法により、もしくは当該分野で既知の他の標準的な方法により精製され得る。If necessary, ANP receptors secreted into the culture medium are or by other standard methods known in the art. It can be more purified.

ス呈拠■ この実施例では、原核細胞系においてＡＮＰレセプタータンパクサブユニットをコードする。イントロンを持たない配列を発現するためのプロトコルを提供する。Based on ■ In this example, we will demonstrate how ANP receptor protein subunits are expressed in a prokaryotic system. Code. Provides a protocol for expressing sequences without introns .

発現に都合のよい宿主ベクターはｐＫＴ５２である。このｐＫＴ５２は、“ｔｒｃ”プロモーターと、それに続＜　ＡＴＧ開始コドンとを有する。ｐＫＴ５２の構築は、共同出願である米国特許出願第６１６．４８８号（１９８４年６月１日出願）に開示されており、その内容はここに述べられている。簡単に述べれば、このｔｒｃ”プロモーターは、上流部分にｔｒｐプロモーターを、そして下流のオペレーターを含む領域にはｌａｃプロモーターを有する。A convenient host vector for expression is pKT52. This pKT52 is “tr pKT52 has a “c” promoter followed by an ATG start codon. The construction is filed under jointly filed U.S. Patent Application No. 616.488 (June 1, 1984). Application), the contents of which are set forth herein. Simply put, This trc'' promoter has the trp promoter in the upstream part and the downstream part The region containing the operator has a lac promoter.

そして、この’　ｔｒｃ”プロモーターは１本来は、容易に入手し得る２つのプラスミド（ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドおよびｌａｃプロモーターを有するプラスミド）から調製された。ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩ［カセットとしてｔｒｃプロモーターを構築するために、ハイブリッドプロモーターを有する中間体プラスミドｐＫＫ１０−０を調製した。And this 'trc' promoter was originally one of two easily available proteins. lasmid (plasmid with trp promoter and lac promoter plasmid). BamHI/Hind II [cassette and to construct the trc promoter with a hybrid promoter Intermediate plasmid pKK10-0 was prepared.

ｐＫＫｌｏ−０を調製するために、　ｐＥＡ３００（Ａｍｍａｎら、　（１９８３）Ｇｅｎｅ２５：１６７−１７８）をＰｖｕ　ＩｆおよびＣ１ａ　Ｉで分解し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー）の存在下でｄＣＴＰのみを用いて充填した。To prepare pKKlo-0, pEA300 (Amman et al. (198 3) Gene25:167-178) was decomposed with PvuIf and C1aI. , filled with dCTP alone in the presence of DNA polymerase (Klenow).

次に、マングービーンヌクレアーゼを用いて分解し、大きなベクター断片を単離した。このベクター断片は、上流部分にｔｒｐプロモーターを有する。この断片を５ｓｂｐの平滑末端化Ｈｐａ　Ｉｆ　／Ｐｖｕ　Ｉ［分解物に連結する。ここで上記平滑末端化Ｈｐａ　ＩＩ　／Ｐｖｕ　ＩＩ分解物は、　ｐＧＬｌｏｌをＰｖｕ　ＩＩおよびＨｐａ　■により分解し、　ｄＧＴＰおよび標識化ｄＣＴＰの存在下で修復することにより調製されたｐＧＬｌｏｌ　（Ｌａｕｅｒら、（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、土：１３９−１４７）から切り出された。この断片はｌａｃオペレーター領域を有する。これら２つの平滑末端断片の連結生成物がｐＫＫｌｏ−０であった。Next, isolate large vector fragments by digestion using mangoo bean nuclease. did. This vector fragment has the trp promoter in the upstream part. this fragment is ligated to a 5sbp blunt-ended HpaIf/PvuI [degradation product]. here The above blunt-ended Hpa II/Pvu II digest was used to convert pGLlol into P Decomposed by vuII and Hpa■, dGTP and labeled dCTP pGLlol prepared by repairing in the presence of Lauer et al. (1999) 81) J, Mo1. From Appl, Genet, Sat: 139-147) It was cut out. This fragment contains the lac operator region. These two smooth The ligation product of the terminal fragments was pKKlo-0.

Ｂａｍ旧部位をｐＫＫｌｏ−０のｔｒｐ／ＬＡＣ（ｔｒｃ）プロモーター／オペレーターの上流に挿入した。この挿入は、　ＥｃｏＲＩによって分解し、クレノーで充填し、　ＢａｍＨＩ　リンカ−５’　−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’を挿入することによりなされた。得られたプラスミド、　ｐＫＫｌｏ−１をＰｖｕ　ＩＩで分解し、Ｎｃｏｌリンカ−５′−八ＣＣＡＴＧＧＴ−３’に連結し。The old Bam site was inserted into the trp/LAC (trc) promoter/operator of pKKlo-0. inserted upstream of the regulator. This insertion was degraded by EcoRI and and insert BamHI linker-5'-CCGGATCCGG-3'. This was done by entering. The obtained plasmid, pKKlo-1, was II and ligated to Ncol linker-5'-8CCATGGT-3'.

Ｎｃｏ　Ｉで分解し、充填し、そして次に、Ｐｓｔｌおよび旧ｎｄｌＩ［部位を含む二本鎖リンカ−（５’−ＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ−３’およびその相補体である２つの相補オリゴヌクレオチドとして示される）に連結した。Digested with NcoI, filled in, and then Pstl and old ndlI [sites a double-stranded linker (5'-GCTGCAGCCAAGCTTGG-3' and ligated to its complement (shown as two complementary oligonucleotides).

この連結混合物を、　Ｅ、　ｃｏｌｉを形質転換してＡＩＩＩｐＲとするために使用した。単離されたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよび旧ｎｄＩＩ［で分解する。電気泳動により得られたＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ｍの小断片はｔｒｃプロモーターを含む。This ligation mixture was used to transform E.coli into AIIIpR. used. The isolated plasmid DNA was digested with BamHI and old ndII. do. The small fragment of BamHI/Hindm obtained by electrophoresis was Including motor.

ｐＫ１５２を完成させるために、　ｔｒｃプロモーターを含むＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩ［断片を、　ｐＫＫｌｏ−２（Ｂｒｏｓｉｕｓ、（１９８４）　Ｇｅｎｅ　２７：１６１ｌ６１−１７２）（Ａ遺伝子および複製の起点を含む）のＢａｍＨＩ／）ｆｉｎｄ　Ｉ［１分解により得られる大断片へ連結した。得られたプラスミドｐＫＫ２３３−１をＰｖｕ　Ｉで完全に分解し９次にＢｇｌ　Ｉで部分的に分解し、　３ｓｏｂｐのＰｖｕ　Ｉ　／Ｂｇｌ　Ｉ断片に連結する。、この３６０ｂｐのＰｖｕ　Ｉ　／Ｂｇｌ　Ｉ断片は、アンピシリン耐性遺伝子に相当する部分を有するが。To complete pK152, BamHI/Hi containing the trc promoter ndI [fragment, pKKlo-2 (Brosius, (1984) Gene 27:161l61-172) (containing the A gene and origin of replication) HI/) find I[1 was ligated to the large fragment obtained by digestion. The obtained plastic Sumido pKK233-1 was completely digested with PvuI and then partially digested with BglI. and ligated to the 3sobp PvuI/BglI fragment. , these 3 The 60bp PvuI/BglI fragment corresponds to the ampicillin resistance gene. Although it has some parts.

ｐＬｌｃ８からのＰｓｔＩ部位を欠く。この連結混合物を、　Ｅ、ｃｏｌｉを形質転換するのに用いた。そして形質転換体を、スクリーニングし、ｔｒｃプロモーターの隣のＰｓｔＩ部位がただひとつ存在するものを選択した。ρＫＫ２３３ −２　（これは上記条件に合致する）をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ　ＩＩで分解し、　ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰで充填する。そしてこれを再連結し、正確な構造のｐＫＴ５２　（所望のｔｒｃプロモーター、下流のＡＴＧ開始コドン、および下流のＮｃａｌ。Lacks the PstI site from pLlc8. This ligation mixture was used to form E. coli. It was used for quality conversion. The transformants were then screened and the trc promoter The one in which only one PstI site was present next to the motor was selected. ρKK233 −2 (which meets the above conditions) is decomposed with EcoRI and Pvu II. , filled with dATP and dTTP. Then reconnect this to create the correct structure. pKT52 (desired trc promoter, downstream ATG start codon, and Ncal of flow.

ＰｓｔＩおよび旧ｎｄ１１１部位を有する）を得た。PstI and old nd111 sites) were obtained.

発現ベクターの構築については、レセプターをコードするｃＤＮＡを、　ＥｃｏＲＩまたは他の適当な酵素を用いた分解による切り出しにより、そして必要に応じて適当な断片を修飾することにより得られる。ｐＫＴ５２に挿入するために３ ′末端が調製される。この３゛末端は、終止コドンの下流を都合のよい制限部位において切断し、そしてＰｓｔｌまたは旧ｎｄＩ［［リンカ−を供給することにより調製される。５”末端は、コード配列の内部を切断し９合成りＮＡを用いて欠失コドンおよびＮｅｏ　１部位を補充することにより、または、突然変異誘発によりＮｃｏ　１部位を適切に配置することにより調製される。得られるＮｅｏ　Ｉ　／Ｈｉｎｄ　ｍまたはＮｅｏ　Ｉ　／Ｐｓｔ　Ｉ断片を９次に、ＮｃｏＩ／旧ｎｄｌｕ分解ｐＫＴ５２またはＮｃｏ　Ｉ　／Ｐｓｔ　Ｉ分解ｐＫＴ５２に連結すると、ＡＮＰレセプターをコードしＡＴＧ開始コドンを有するｃＤＮＡがリーチングフレーム中に得られる。For construction of the expression vector, the cDNA encoding the receptor was by degradative excision using RI or other suitable enzymes and optionally can be obtained by modifying an appropriate fragment. 3 to insert into pKT52 ' end is prepared. This 3' end is located downstream of the stop codon at a convenient restriction site. and Pstl or old ndI [[To supply the linker prepared from The 5” end was created by cutting the inside of the coding sequence and using 9 synthetic NA. By filling in the deleted codon and Neo1 site or by mutagenesis is prepared by appropriately positioning the Nco 1 site. Neo obtained The I/Hindm or NeoI/PstI fragment was converted into 9th, NcoI / former ndlu-digested pKT52 or Nco I / Pst I-digested pKT52 When ligated, a cDNA encoding the ANP receptor and having an ATG start codon is created. Obtained during leeching frames.

バクテリアにおける発現については、得られたベクターは。For expression in bacteria, the resulting vectors are:

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１または他の適当な宿主細胞をＡｍｐ”に形質転換するのに用いられる。そして、形質転換された細胞を１次に、１ｍＭのＩＰＴＧを含むＭ９培地で３〜５時間にわたり増殖させ。Transform E. coli MC1061 or other suitable host cells into Amp” used to do. Then, the transformed cells were first treated with 1mM IPTG. for 3-5 hours in M9 medium containing

０、Ｄ、を０．２〜０．５とする。（ここで、　ＩＰＴＧは、ｌａｃオペレーターにより制御される制御配列についての標準的な誘発物質である。−）次に、この細胞を回収し、音波処理によりもしくは５％トリクロロ酢酸との処理により溶菌させる。そして。0 and D are 0.2 to 0.5. (Here, IPTG is the lac operator is a standard inducer for regulatory sequences controlled by −) Next, this Cells were harvested and lysed by sonication or by treatment with 5% trichloroacetic acid. Let it germinate. and.

細胞抽出物を所望のＡＮＰレセプタータンパクについての検定を行なう。レセプタータンパクは、天然型タンパクに用いられる方法、もしくは当該分野で知られる他の方法により、上記抽出物から精製される。Cell extracts are assayed for the desired ANP receptor protein. receipt Proteins can be prepared using methods used for naturally occurring proteins or as known in the art. It is purified from the above extract by other methods.

実上開■ この実施例では、ヒトゲノムライブラリーをプローブし。Actually open ■ In this example, a human genomic library was probed.

ＡＮＰレセプタータンパクをコードするクローンを得る方法に１１５７−１１７４に記載されているように、λＣｈａｒｏｎ　４Ａに組み込んで調製する。ｃＤＮＡ挿入物のウシ血管ＡＮＰレセプターをコードする部分（実施例■）を、プローブとして用いるために調製する。この部分は、　ｐＡＮＰＲ−１がらｃＤＮＡを切り出し、単離された挿入物またはそのある部分をニックトランスレーションすることにより、調製される。ｃＤＮＡプローブを、実施例■で５１ヌクレオチドのプローブについて述べたのと同じように。1157-117 on a method for obtaining a clone encoding ANP receptor protein. 4A by incorporating it into λCharon 4A. cD The part of the NA insert encoding the bovine vascular ANP receptor (Example ■) was Prepared for use as a tube. This part consists of cDNA from pANPR-1. and nick-translate the isolated insert or some portion thereof. It is prepared by: The cDNA probe was prepared using 51 nucleotides in Example ①. Just like I said about the de probe.

約１００万個の組換え体ファージを含むフィルターにハイブリダイズさせる。実施例■と異なるのは、ハイブリダイゼーション混合物がホルムアミドを４０％の割合で含み、そしてフィルターを４５゛ｃで一定に一夜保ったことである。これらのフィルターを次ニ、０．１％ＳＤＳを含む２　Ｘ５ＳＣテロ５°ｃにて１時間にわたり洗浄する。ヒトＡＮＰレセプター配列を含む組換え体ファージは、プローブに強くハイブリダイズするファージである。Hybridize to a filter containing about 1 million recombinant phages. fruit The difference from Example ■ is that the hybridization mixture contains 40% formamide. and the filter was held constant at 45°C overnight. this Next, filter 2X5SC containing 0.1% SDS at 5°C for 1 hour. Wash thoroughly. Recombinant phage containing the human ANP receptor sequence This is a phage that strongly hybridizes to the lobe.

関連するレセプター遺伝子もまた。同様のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることにより同定され得る。Also related receptor genes. Similar hybridization and washing procedures It can be identified by using the following conditions.

ここで異なるのは、ハイブリダイゼーションの温度が３５°Ｃであり、洗浄温度が５０°Ｃである点である。ゲノムＡＮＰレセプクー遺伝子を含み強くハイブリダイズする陽性のものが残留する。他方、より弱くハイブリダイズするプローブは関連するレセプターであることが示される。The difference here is that the hybridization temperature is 35°C and the washing temperature is 50°C. Contains the genome ANP receptor gene and is highly hybridized. The positive ones that are soybean remain. On the other hand, probes that hybridize more weakly are shown to be related receptors.

もし陽性のものが認められない場合には、適当なスクリーニングの条件を決めるのを補助するために、サザンハイブリダイゼーションが使用され得る。第１に、サザンハイブリダイゼーションは、■レーンあたり１ｏｕｇのヒトＤＮＡを用いて行なわれる。このヒトＤＮＡは９種々の制限酵素（例えば、　ＥｃｏＲＩ＋Ｐｖｕ　■、　ＢａｍＨＩおよび旧ｎｄＩ［［）で分解されている。次に、フィルターに、最も苛酷でない条件（３０％ホルムアミド）でハイブリダイズさせ、上述の苛酷でない方の洗浄条件（５０”Ｃ）で洗浄する。サザンハイプリダイゼーションのレーンが、バックグラウンドを越えるはっきりとしたハイブリダイゼーションの条痕を示さないときには、複数個のバンドが出現するまで、洗浄の温度を調整する（６５’Ｃまで）。あるバンドは強く、そしであるバンドは弱い。これらは、それぞれ相同性レセプターに対する遺伝子および関連するレセプターに対する遺伝子を示す。サチン法において先に行なったものよりも高濃度（例えば４０％）のホルムアミドがハイブリダイゼーション混合物に含有され、これを先のサチン法に用いられた温度で洗浄すると、低バツクグラウンドでありより強いバンドだけが現れる明瞭なバンドが得られる。より弱いバンドがまだ現れるならば、ホルムアミドをさらに高密度１例えば５０％。If no positive results are found, determine appropriate screening conditions. Southern hybridization can be used to assist in this process. Firstly, Southern hybridization was performed using 1 ug of human DNA per lane. It is done. This human DNA was digested with nine different restriction enzymes (e.g. EcoRI+P vu　■,　BamHI and old ndI [[) are decomposed. Then fill hybridize under the least harsh conditions (30% formamide) and Wash using the less severe washing conditions (50”C) described above. clear hybridization lanes that exceed the background If no bands appear, increase the cleaning temperature until multiple bands appear. (up to 65'C). Some bands are strong and others are weak. child These are genes for homologous receptors and related receptors, respectively. The corresponding gene is shown. Higher concentrations than previously done in the Sachin method (e.g. 40%) of formamide is included in the hybridization mixture, which is Washing at the temperature used in the sachin method has a lower background and is stronger. A clear band is obtained in which only the band appears. If weaker bands still appear For example, formamide can be added to a higher density, e.g. 50%.

に調整することができる。can be adjusted to

従って、＠乳類動物のゲノムライブラリーは、上述のサザンハイプリダイゼーション法により規定された適当な条件によりスクリーニングされ得る。上記スクリーニングで単離されたＡＮＰレセプタータンパクのゲノムコード配列は９次に。Therefore, @mammalian genome libraries are generated by the above-mentioned Southern hybridization. Screening can be carried out using appropriate conditions defined by the standard method. The above screenplay The genome coding sequence of the ANP receptor protein isolated by this method is 9th.

実施例■で述べられている発現のプロトコルに用いられ得る。The expression protocol described in Example 2 can be used.

尖旌拠■ この実施例は、ＡＮＰレセプタータンパクに対するモノクローナル抗体の生産に有用なプロトコルを提供する。Stronghold■ This example describes the production of monoclonal antibodies against the ANP receptor protein. Provide useful protocols.

ハイブリドーマは、抗原により刺激されたＢ細胞から１組織培養により調製され得る。まず、胸腺細胞−調整培地を調製する。４〜６週令の遺伝子導入マウス（例えばＢａ１ｂ／ｃおよびＣ５７）の２つの胸腺を、標準培地（１：１．　ＤＭＥＭ：ＲＰＭＩ培地に１％（ｖ／ｖ）の割合でＮｕｔｒｉｃｙｔｅ＠　（Ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ。Hybridomas are prepared by tissue culture from antigen-stimulated B cells. obtain. First, a thymocyte-conditioned medium is prepared. 4-6 week old transgenic mice ( For example, two thymus glands (Ba1b/c and C57) were grown in standard medium (1:1.DM EM: Nutricyte@(Enz ymes International.

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）が加えられた培地〕中でインキュベートする。４８時間インキュベートした後、この培地を２．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離し、細胞ベレットを廃棄する。一般的な方法については、　Ｌｕｂｅｎ　ら、（１９８０）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１７：６３５−６３９を参照されたい。Incubate in medium supplemented with San Diego). 48 hours After incubation, this medium was divided into 2. Centrifuge in OOOXg for 10 minutes to remove the cell base. Discard the let. For general methods, see Luben et al. (1980) , Molec, Immunol, 17:635-639.

胸腺−調整培地１部を２次に、Ｎｕｔｒｉｃｙｔｅ■が加えられた標準培地２部と合併し、最終容量を約ＬＭとする。Thymus - 1 part conditioned medium and 2 parts standard medium supplemented with Nutricyte■ The final capacity will be approximately LM.

次に、精製ＡＮＰレセプタータンパク０．０５〜１．０ｄｇを加える（実施例Ｉ）。この混合物を次に、　ＣＯ２−加湿インキュベーター内で３７°Ｃにて９６時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、標準的な方法により、活性化Ｂ細胞を適当な相手（例えば、　Ｐ３Ｘ６３八ｇ８．へ５３またはＳｐ２１０−Ａｇ１４　）と融合させて、ハイブリドーマを生産する。例えば、　Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４８５−４９８を参照されたい。成功裏に得られたハイブリドーマを、所望のモノクローナル抗体の産生について１通常の方法により、スクリーニングを行なう。例えば、米国特許第４，５６２．００３号を参照されたい。Next, 0.05-1.0 dg of purified ANP receptor protein is added (Example I ). This mixture was then incubated at 37°C for 96°C in a CO2-humidified incubator. Incubate for an hour. At the end of incubation, by standard methods , activated B cells to a suitable partner (e.g., P3X638g8.53 or Sp 210-Ag14) to produce hybridomas. For example, K See Ohler et al. (1975), Nature 256:485-498. I want to be illuminated. The successfully obtained hybridomas are injected with the desired monoclonal antibody. 1. Screening for production is carried out using conventional methods. For example, US patent See No. 4,562.003.

尖旌炎Ｘこの実施例は、サンプル（例えばヒトの血液）中のＡＮＰ活性を測定する定量法を提供する。Chinitis X This example describes a quantitative method for measuring ANP activity in a sample (e.g., human blood). I will provide a.

純粋なレセプターの凍結試料（実施例Ｉ）を適当な緩衝液（例えば、　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋　ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣ］、　１０ｍＭ　ＣａＣ１，。A frozen sample of pure receptor (Example I) was dissolved in a suitable buffer (e.g. 100 m M Tris+ pH7,5, 100mM NaC], 10mM CaC1, .

１０ｍＭ　ＭｇＣｚ＋　２ｍｇ／ｄ　Ｃ＋ｚＥｓ）で希釈し、　”’Ｉ−ＡＮＰ結合部位約０．５ｐモルに相当する量を試験管に分注する。次に、　”５ｌ−ＡＮＰ（４，ＯｎＭ、比放射活性−２００ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）を含む約０．５ｄの結合緩衝液を加える。種々の濃度の未標識ＡＮＰ（０，０５〜１００．ＯｎＭ）を使用して、標準曲線を描く。次に、未標識のＡＮＰＯ代わりに未知の試料を加える。遊離リガンドからのレセプター結合！２５１−ＡＮＰの分離は１次のようにして行なう。つまり、アセトンを加えて（最終容量を３７％シ／ｖ）、４°Ｃにて５００Ｘｇで１０分遠心分離し、上清を吸引することにより行なう。これらの試験管はγ線計数装置で計数され得、標準競合曲線が作成され得る（第１図参照）。Dilute with 10mM MgCz+2mg/dC+zEs) and Dispense an amount corresponding to approximately 0.5 pmol of binding sites into test tubes. Next, “5l-A About 0.5 d containing NP (4, OnM, specific radioactivity -200 cpm/fmol) Add binding buffer. Various concentrations of unlabeled ANP (0.05-100.OnM) Use to draw the standard curve. Next, add an unknown sample instead of unlabeled ANPO. I can do it. Receptor binding from free ligand! The separation of 251-ANP is first order. Let's do it. Briefly, add acetone (37% s/v to final volume) and hold at 4°C. This is done by centrifuging at 500Xg for 10 minutes and aspirating the supernatant. these test tubes can be counted in a gamma-ray counter and a standard competition curve can be constructed (see Figure 1). (see).

上記実施態様の修正は明らかに容易であり、当業者の技術範囲内にある。本発明の権利は、クレームの範囲のみにより限定される。Modifications to the embodiments described above are clearly easy and within the skill of those skilled in the art. present invention 's rights are limited only by the scope of the claims.

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Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

１．哺乳動物の心房性ナトリウム排出増加ペプチド（ＡＮＰ）レセプタータンパクサブユニットを含む細胞非含有組成物であって，該レセプタータンパクサブユニットが約６０，５００ダルトンの分子量を有し，該組成物中のタンパクの最低約７５重量％を含有する，組成物。1. Mammalian atrial natriuretic peptide (ANP) receptor protein 1. A cell-free composition comprising a subunit, the receptor protein subunit has a molecular weight of about 60,500 daltons; A composition containing at least about 75% by weight of protein in the composition.

２．前記レセプタータンパクサブユニットがウシＡＮＰレセプタータンパクサブユニットである請求の範囲第１項に記載の組成物。2. The receptor protein subunit is a bovine ANP receptor protein subunit. A composition according to claim 1, which is a unit.

３．前記レセプタータンパクサブユニットがヒトＡＮＰレセプタータンパクサブユニットである請求の範囲第１項に記載の組成物。3. The receptor protein subunit is a human ANP receptor protein subunit. A composition according to claim 1, which is a unit.

４．前記レセプタータンパクサブユニットが合成ＡＨＰレセプタータンパクである請求の範囲第１項に記載の組成物。4. the receptor protein subunit is a synthetic AHP receptor protein; The composition according to claim 1.

５．タンパク結合心房性ナトリウム排出増加ペプチド（ＡＮＰ）を含む細胞非含有組成物であって、該タンパクが，（ｉ）哺乳動物の６０．５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユニットと，アミノ酸配列に関して少なくとも約７５％の相同性を有し，（ｉｉ）二量体の形で可溶化された場合に１０ｎＭまたはそれ以下のＡＮＰ（４−２８）に対する結合親和性を示し，そして（ｉｉｉ）該組成物中のタンパクの最低約７５重量％を有する，組成物。5. Cell-free containing protein-bound atrial natriuresis peptide (ANP) A composition comprising: the protein is (i) a mammalian 60.5 kd ANP receptor protein subunit; and (ii) have at least about 75% homology in terms of amino acid sequence with Nit. 10 nM or less ANP(4-28) when solubilized in dimeric form and (iii) at least about 7 of the proteins in the composition. 5% by weight of the composition.

６．天然型のＡＮＰレセプタータンパクを精製する方法であって：（ｉ）ＡＮＰレセプターを有する哺乳動物細胞から調製される膜含有細胞画分を与えること；（ｉｉ）該膜画分中のＡＮＰレセプタータンパクをＣ１２Ｅ８界面活性剤を用いて可溶化し，該ＡＮＰレセプタータンパクを含有する上清を調製すること；および（ｉｉｉ）該上清を，固定化ＡＮＰを含有するクロマトグラフィーカラムに，該ＡＮＰレセプタータンパクが該固定化ＡＮＰに結合するような条件下で通過させ，次いで結合したＡＮＰレセプタータンパクを該カラムから溶離し，精製されたＡＮＰレセプタータンパクを与えることによって，該上清からＡＮＰレセプタータンパクを精製すること，を包含する方法。6. A method for purifying a native ANP receptor protein, the method comprising: (i) Membrane-containing cell fraction prepared from mammalian cells having ANP receptors to give; (ii) ANP receptor protein in the membrane fraction was isolated using C12E8 surfactant. and preparing a supernatant containing the ANP receptor protein; Beauty (iii) Transfer the supernatant to a chromatography column containing immobilized ANP. Passage under conditions such that the ANP receptor protein binds to the immobilized ANP. , then the bound ANP receptor protein was eluted from the column and purified ANP receptor protein is extracted from the supernatant by providing ANP receptor protein. A method involving purifying proteins.

７．ＡＮＰレセプタータンパクをコードするＤＮＡ配列を単離する方法であって：（ｉ）哺乳動物の細胞源から調製されたＤＮＡライブラリーを与えること；（ｉｉ）ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットの選択された領域との祖同性を有するアミノ酸配列のコドンを含むオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションすることによって，該ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること；および（ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチドが選択的にハイブリダイズするＤＮＡ分子を該ＤＮＡライブラリーから単離すること，を包含する方法。7. A method for isolating a DNA sequence encoding an ANP receptor protein, the method comprising: : (i) providing a DNA library prepared from a mammalian cell source; (ii) homology with selected regions of ANP receptor protein subunits; Hive using an oligonucleotide probe containing codons for the amino acid sequence with The DNA library is screened by redization. that; and (iii) a DNA molecule to which the oligonucleotide selectively hybridizes; Isolating from a DNA library.

８．組換えベクターを含有する組成物であって，該ベクターが哺乳動物の６０．５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み，該ＤＮＡ配列を含まない組換えベクターを実質的に含有しない，組成物。8. A composition comprising a recombinant vector, the vector being a mammal. Amino acid sequence with homology to 5kdANP receptor protein subunit contains a DNA sequence encoding A composition substantially free of recombinant vectors that do not contain said DNA sequence.

９．哺乳動物の６０．５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子であって，該アミノ酸配列をコードしないＤＮＡ分子を含まない，ＤＮＡ分子。9. Homology with mammalian 60.5 kd ANP receptor protein subunit A DNA molecule encoding an amino acid sequence having A DNA molecule that does not include a DNA molecule that does not encode said amino acid sequence.

１０．選択された宿主細胞を形質転換し得る組換えＤＮＡベクターであって，哺乳動物の６０．５ｋｄＡＮＰレセプタータンパクサブユニットとの相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡコード配列を含み，該コード配列が，該ベクターによって形質転換される宿主細胞内で転写されるように，該ベクターにおいてＤＮＡ制御配列に関連して位置決めされている，組換えＤＮＡベクター。10. A recombinant DNA vector capable of transforming a selected host cell, the vector comprising: Has homology to the mammalian 60.5 kd ANP receptor protein subunit. comprising a DNA coding sequence encoding an amino acid sequence, The coding sequence is transcribed in a host cell transformed by the vector. , the recombinant vector is located in relation to the DNA control sequences in the vector. DNA vector.

１１．前記宿主細胞が原核生物細胞である請求の範囲第１０項に記載のベクター。11. The vector according to claim 10, wherein the host cell is a prokaryotic cell. .

１２．前記宿主細胞が真核生物細胞である特許請求の範囲第１０項に記載のベクター。12. The vector according to claim 10, wherein the host cell is a eukaryotic cell. Tar.

１３．請求の範囲第１１項に記載のベクターによって形質転換された原核生物細胞，またはその子孫。13. A prokaryotic cell transformed with the vector according to claim 11. or its descendants.

１４．請求の範囲第１２項に記載のベクターによって形質転換された真核生物細胞，またはその子孫。14. A eukaryotic cell transformed with the vector according to claim 12. or its descendants.

１５．請求の範囲第１２項に記載のベクターによって形質転換された哺乳動物細胞，またはその子孫。15. A mammalian cell transformed with the vector according to claim 12. or its descendants.

１６．ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを生産する方法であって，請求の範囲第１３項に記載の細胞を，ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを含むペプチドが発現される条件下で増殖させること，および該ペプチドを回収すること，を包含する方法。16. A method for producing an ANP receptor protein subunit, the method comprising: The cell according to claim 13 is treated with an ANP receptor protein subunit. growing under conditions in which the peptide containing the peptide is expressed; and Recovering the peptide.

１７．ＮＮＰレセプタータンパクサブユニットを生産する方法であって，請求の範囲第１４項に記載の細胞を，ＡＮＰレセプタータンパクサブユニットを含むペプチドが発現される条件下で増殖させること，および該ペプチドを回収すること，を包含する方法。17. A method for producing an NNP receptor protein subunit, the method comprising: The cell according to claim 14 is treated with an ANP receptor protein subunit. growing under conditions in which the peptide containing the peptide is expressed; and Recovering the peptide.

１８．抗ＡＮＰレセプタータンパク抗体を含有し，他の抗体を実質的に含有しない組成物。18. Contains anti-ANP receptor protein antibody and is substantially free of other antibodies. beautiful composition.

１９．請求の範囲第１８項に記載の抗体を生産する哺乳動物の永久増殖性細胞系列。19. A permanently proliferating mammalian cell line producing the antibody of claim 18. Column.

２０．ＡＮＰレセプタータンパクを精製する方法であって：（ａ）該レセプタータンパクを含有する溶液を与えること；（ｂ）該溶液を，請求の範囲第１１項に記載の固定化抗ＡＮＰ抗体と接触させること；（ｃ）該接触工程の後に，該溶液から該固定化抗体を分離すること；および（ｄ）該分離工程の後に，該固定化抗体からＡＮＰレセプタータンパクを回収すること，を包含する方法。20. A method for purifying an ANP receptor protein, comprising: (a) the receptor; (b) providing a solution containing the protein; (b) providing the solution as defined in claim 11; contacting with the described immobilized anti-ANP antibody; (c) separating the immobilized antibody from the solution after the contacting step; and (d) recovering ANP receptor protein from the immobilized antibody after the separation step; A method that encompasses things.