JPH05506141A - DNA-binding proteins containing androgen receptors - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 アンドロゲン受容体を含むＤＮＡ結合蛋白質関連出願の相互参照 本発明は１９８９年２月２１日に出願し、現在同時係属中の米国特許申請番号０ ７／３１２．７６３の一部継続出願である；それは順番に、１９８８年１０月５ 日に出願し、明示的に放棄した米国特許申請番号０７／２５３゜８０７の一部継 続出願である；それは順番に、１９８８年３月３０日に出願し、明示的に放棄し た米国特許申請番号０６／１７６．１０７の一部継続出願である。[Detailed description of the invention] Cross-reference of applications related to DNA-binding proteins including androgen receptors The present invention was filed on February 21, 1989 and is currently co-pending U.S. Patent Application No. 0 No. 7/312.763 is a continuation-in-part application; Part-part successor to U.S. Patent Application No. 07/253°807, filed in is a continuation application; it, in turn, was filed on March 30, 1988 and expressly disclaimed. This is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 06/176.107.

発明の背景 本発明は一般的にはＤＮＡ結合調節蛋白質に関連し、より特異的にはアンドロゲ ン受容体蛋白質とＴＲ２と名付けられた新しいＤＮＡ結合蛋白質をコードするＤ ＮＡ配列に関連し、これらＤＮＡ配列の組換え発現のポリペプチド産生体に関連 し、これらのＤＮＡ配列から導かれるアミノ酸配列に基ずく配列を有するペプチ ドに関連し、これらの蛋白質とペプチドに特異的な抗体に関連し、そしてこれら の蛋白質並びにそれに５９連する核酸の検出と定量に関する方法に関連する。Background of the invention The present invention relates generally to DNA binding regulatory proteins, and more specifically to androgens. D encodes a receptor protein and a new DNA-binding protein named TR2. related to DNA sequences and to polypeptide producers of recombinant expression of these DNA sequences. and peptides having sequences based on amino acid sequences derived from these DNA sequences. related to these proteins and peptides, and related to antibodies specific for these proteins and peptides. The present invention relates to methods for detecting and quantifying proteins and nucleic acids related thereto.

ステロイドホルモンには五つの主要なりラスがある：プロゲスチン、グルココル チコイド、ミネラロコルチコイド、アンドロゲン、およびエストロゲンである。There are five main classes of steroid hormones: progestin, glucocol. ticoids, mineralocorticoids, androgens, and estrogens.

それぞれのステロイドホルモンに特異的な受容体蛋白質は、組織特異的な様式を もって標的細胞に分布し、対応する細胞内受容体と特異的複合体を形成すること ができる。Receptor proteins specific to each steroid hormone respond in a tissue-specific manner. distribution to target cells and form specific complexes with corresponding intracellular receptors. Can be done.

Ｌｉａｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｐａｇｅ　６３３　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ｏｆ　Ｈｏｒ−ｍｏｎｅｓ、Ｈ，Ｌ、　Ｊ、　Ｍａｋｉｎ、　ｅｄ、　（ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉ、　Ｐｕｂｌ。Liao, et al, page 633 in Biochemist ry of Hor-mones, H, L, J, Makin, ed, ( Blackwell Sci, Publ.

０ｘｆｏｒｄ、１９８４　）　）。ホルモンによる遺伝子発現の調節はステロイ ド受容体複合体がゲノムのある一定のセグメントと相互作用して特異的な遺伝子 転写をモジュレーホルモンの初期作用は多いが、その中には特異な細胞型におけ る遺伝子のサブセットの転写を増大させることが含まれる。Oxford, 1984)). Regulation of gene expression by hormones is a steroid The receptor complex interacts with certain segments of the genome to target specific genes. There are many early effects of hormones that modulate transcription, some of which are important in specific cell types. This includes increasing the transcription of a subset of genes.

たとえば種々のステロイド受容体をコードするｃＤＮＡをうまくクローニングす れば、ステロイドとＤＮＡとの結合に含まれるステロイド受容体の異なる領域に ついての構造的並びに機能的解析が可能になる。たとえば以下参照。For example, we have successfully cloned cDNAs encoding various steroid receptors. If so, different regions of steroid receptors involved in the binding of steroids to DNA It becomes possible to perform structural and functional analysis of For example, see below.

５　１　３　（１９８６）　；　Ｇｒｅｅｎｅ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ 、　２　３ａ１．、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、 ８３　：　９０４５（１９８６）　：Ｃｏｎｎｅｅｌｙ、ｅｔａｌ、、５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２３３　ニア　６７　（１９８７）；　Ｌａｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ。5 1 3 (1986); Greene, et al, 5science , 2 3a1. , Proc, Nat'1. Acad, Sci, (USA), 83: 9045 (1986): Conneely, etal, 5cie nce, 233 Near 67 (1987); Law, et al, Pr oc, Nat'　1. Acad.

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８４　：　２８　７７　（１９８７）　；Ｍｉｓｒａｈｉ 。Sci, (USA), 84: 28 77 (1987); Misrahi .

ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　 Ｉ　４３　ニア　４０　（１９８７）　；　Ａｒｒｉｚａ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃ ｉｅｎｃｅ。et al,,Biochem,Biophys,Res,Commun,, I 43 Near 40 (1987); Arriza, et al, 5c ience.

ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１　８　：　６４　１　（ １９８６）　；　Ｂｅｎｂｒｏｏｋ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３８　 ：　７８８（１９８７）　；ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０　： 　８８９（＋９８８）。et al, Nature (London), 31 8: 64 1 ( 1986); Benbrook, et al., 5science, 238 : 788 (1987); and Evans, 5science, 240: 889 (+988).

テストステロンのようなアンドロゲンは、男性の二次性徴の発生に関与しており 、主として精巣で合成される。Androgens, such as testosterone, are involved in the development of secondary sexual characteristics in men. , synthesized primarily in the testis.

アンドロゲン受容体（ＡＲ）に対するｃＤＮＡのクローニングは困難であった。Cloning of cDNA for androgen receptor (AR) has been difficult.

なぜなら最近に至るまでｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのＡＲ に対する単一特異性抗体が得られなかったからである。Ｇｏｖｉｎ−ｄａｎ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　［ｎｖｅｓｔ、、　１０　（ Ｓｕｐｐｌ、２）（１９８７）の抄録に報告されたところによると、ヒトステロ ン受容体に対応する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、ヒト精巣λｇｔ −１１ｃＤＮＡライブラリーから分離したヒトアンドロゲン受容体をコードする ｃＤＮＡクローンを分離したという。発現された蛋白質は高い親和性と特異性を もってトリチウム−標識したＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）と結合すること か報告されている。しかしながら、アンドロゲン受容体の全長にわたるヌクレオ チドあるいはアミノ酸配列は解析されていないし、推定されるアンドロゲン受容 体クローン全体の分離に関する記述もなされていない。Because until recently, AR for screening cDNA libraries This is because no monospecific antibody was obtained. Govin-dan, et al, J, Endocrinol, [nvest,, 10 ( As reported in the abstract of Suppl., 2) (1987), human steroids human testis λgt using a synthetic oligonucleotide corresponding to the human testis receptor as a probe. -11 encodes the human androgen receptor isolated from a cDNA library They say they have isolated a cDNA clone. The expressed protein has high affinity and specificity. Binding with tritium-labeled DHT (dihydrotestosterone) It has been reported that However, nucleosynthesis along the entire length of the androgen receptor The amino acid sequence or amino acid sequence has not been analyzed, and the androgen receptor is presumed to be There is also no description of the isolation of whole body clones.

最近、Ｃｈａｎｇ、、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０　： 　３２４（Ａｐｒｉｌ　１５，１９８８）は、これは当該発明者達も共著者であ るが、ヒト精巣およびラットの腹側前立腺ｃＤＮＡライブラリーから得られたア ンドロゲン受容体をコードするｃＤＮＡについて記載した。ヒトおよびラットア ンドロゲン受容体に関するこれらのｃＤＮＡは９４ＫＤａと７６ＫＤａの受容体 をコードするのに十分な長さをもつと報告されている。分子量は、ＤＮＡインス ペクターＩＩ（Ｔｅｘｔｃｏ　Ｗｅｓｔ　Ｌｅｂａｎｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｈａｍｐ ｓｈｉｒｅ）オーブン解読フレーム分析として知られているソフトウェアプログ ラムを用いて決定した。新しいＤＮＡインスペクターｌＩｅプログラムを用いて 、ｈＡＲ（アミノ酸９１８個）の分子量は９８．６０８．　ｒＡＲ（アミノ酸９ ０２個）の分子量は９８．１３３と見積られた。したがって、“９４ＫＤａ″Ａ Ｒと報告したものをいまは“９８Ｋａ”ＡＲと名付けている。また、２番目のＧ ／Ｍｅｔからのもので前に“７６　ＫＤａ”と報告されたｂＡＲあるいはｒＡＲ ’ポリペプチドはいまでは“７９ＫＤａ”と名づけられている。ここでも当該発 明者達が共著者になっているつぎの文献も参照のこと。Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，、ｅ ｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ。Recently, Chang, C, et al, 5science, 240: 324 (April 15, 1988), which means that the inventors are also co-authors. However, the access point obtained from human testis and rat ventral prostate cDNA libraries A cDNA encoding the androgen receptor has been described. humans and rats These cDNAs for androgen receptors are 94KDa and 76KDa receptors. It is reported to be long enough to encode Molecular weight is based on DNA Pector II (Textco West Lebanon, New Hamp software program known as Oven Decipher Frame Analysis Determined using Lamb. Using the new DNA Inspector IIe program , the molecular weight of hAR (918 amino acids) is 98.608. rAR (amino acid 9 The molecular weight of 02 pieces) was estimated to be 98.133. Therefore, “94KDa”A What was reported as R is now named "98Ka" AR. Also, the second G bAR or rAR from Met that was previously reported as “76 KDa” 'The polypeptide is now named "79KDa." Again, the issue Please also refer to the following document in which the authors are co-authors. Chang, C,,e t at, , Proc, Nat'1. Acad.

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、８５　：　７２１１　（Ｏｃｔｏｂｅｒ　５．　１９８ ８）。Sci, (USA), 85: 7211 (October 5. 198 8).

これと異なり、Ｌｕｂａｈｎ、　Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２ ４０　：　３２７　（１９８８）は、ヒト精巣上体からのライブラリーと培養ヒ ト***繊維芽細胞を用いて、サル腎臓（ＣＯ３）細胞中で発現されたヒトｃＤＮ Ａを得たが、これはサイドシル中に存在し、アンドロゲンとの結合能を存する蛋 白質を生ずる。しかし、このｃＤＮＡは概算で４１．０００の分子量をもつ一つ の受容体をコードするのに十分なだけであった。したがって、得られたｃＤＮＡ はＡＲの一部をコードするに過ぎない。Unlike this, Lubahn, D., et al., 5science, 2 40:327 (1988), a library from human epididymis and cultured human Human cDNA expressed in monkey kidney (CO3) cells using human foreskin fibroblasts A was obtained, which is a protein that exists in the side sill and has the ability to bind to androgens. Gives rise to white matter. However, this cDNA has an estimated molecular weight of 41,000. was sufficient to encode a receptor for Therefore, the obtained cDNA only encodes part of the AR.

本発明にとって興味のあるのはＹｏｕｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、。Of interest to the present invention is Young, et al.

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　１２３　：　６０１　（１９８８）であり、それに は抗ＡＲモノクローナル抗体の産生が報告されている。Endocrinol, 123:601 (1988), and has been reported to produce anti-AR monoclonal antibodies.

Ｌｉａｏ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、（ＵＳＡ）、８２：８３４５　（１９８４）（当該共同発明者の１人）中 に述べられているように、抗ＡＲ自己抗体が前立腺癌患者の血清中に同定され、 それらの力価、親和性および特異性の特性化がなされた。ひき続いて、高い抗体 力価を育する患者の血液からリンパ球を分離し、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｖウィ ルス（ＥＢＶ）でトランスフオームさせ、そして抗ＡＲモノクローナル抗体産生 のためにクローン化した。Liao, S., et al., Proc, Nat'1. Acad, S ci, (USA), 82:8345 (1984) (one of the co-inventors). Anti-AR autoantibodies were identified in the serum of prostate cancer patients, as described in Their potency, affinity and specificity were characterized. Subsequently, high antibodies Lymphocytes are isolated from the patient's blood and incubated with Epstein-Barv Wire. rus (EBV) and produce anti-AR monoclonal antibodies. cloned for.

これらのモノクローナル抗体はラット前立腺から得たアンドロゲン受容体と相互 作用することがわかった。抗体産生を増大させようと試みたが結果として抗体分 泌が減少した。トランスフオームしたＢ細胞がハイブリドーマ細胞よりも不安定 であるというのは珍しいことではない。These monoclonal antibodies interact with androgen receptors obtained from rat prostate. It was found that it works. Attempts to increase antibody production resulted in decreased antibody production. Secretion decreased. Transformed B cells are more unstable than hybridoma cells It's not uncommon to be.

Ｋｏｚｂｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、、１４． 　２３　（１９８４）、このような細胞株と関連した不安定さの故に、モノクロ ーナル抗体のソースとして代わりのものが望まれている。　こうしてアンドロゲ ン受容体蛋白質およびその他のＤＮＡ結合蛋白質の一次構造コンホメーションに 間する情報について人為的な要請があるが、この情報はヒトＤＮＡ配列およびそ れと同じものをコードする他の哺乳動物のＤＮＡ配列の知識から得られるであろ う。Kozbor, et al, Eur, J, [mmunol, 14. 23 (1984), because of the instability associated with such cell lines, monochrome An alternative source of natural antibodies is desired. This is how andro games primary structural conformations of receptor proteins and other DNA-binding proteins. There is an artificial demand for information between human DNA sequences and their knowledge of the DNA sequences of other mammals that encode the same thing. cormorant.

このようなりＮＡ配列の有用性によって、組換え法を原核および真核宿主細胞の 大規模産生に応用することを可能になるし、同じく当該蛋白質と関連する核酸の 検出、定量および／または分離のためのＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およ びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成の方法に応用することを可能にする。アンド ロゲン受容体と関連するＤＮＡ−結合蛋白質および／またはそれらのアミノ酸配 列に関する知識は、順番として、なおその上にモノクローナルおよびポリクロー ナル抗体（蛋白質フラグメントあるいはそれをモデルとした合成ペプチドに対す る抗体を含めて）の産生を可能にし、これらは体液や組織試料中の蛋白質の検出 と定量のための免疫学的方法に用いられるし、また同じように標識および治療薬 剤のような物質を蛋白質を発現している細胞に対して組織特異的に放出するのに も用いられる。The availability of such NA sequences makes recombinant methods useful for prokaryotic and eukaryotic host cells. This makes it possible to apply it to large-scale production, as well as the production of nucleic acids related to the protein in question. DNA-DNA, DNA-RNA, and and RNA-RNA hybridization methods. and DNA-binding proteins associated with gen receptors and/or their amino acid sequences Knowledge of columns includes monoclonal and polyclonal columns in sequence and on top of that. null antibodies (against protein fragments or synthetic peptides modeled on them) antibodies) that can be used to detect proteins in body fluids and tissue samples. and is used in immunological methods for quantification and as well as labeling and therapeutic drugs. for tissue-specific release of substances such as drugs to cells expressing proteins. is also used.

発明の簡潔な要約 本発明はアンドロゲン受容体蛋白質および構造的に関連した、ＴＲ２蛋白質と名 づけられ、ＤＮＡ結合（したがってＤＮＡ複製あるいは転写の調ｆｉ）能ももっ ている蛋白質をコードする、新たに精製され分離されたＤＮＡ配列を提供する。A brief summary of the invention The present invention relates to the androgen receptor protein and a structurally related protein named TR2 protein. It also has the ability to bind DNA (and thus regulate DNA replication or transcription). The present invention provides freshly purified and isolated DNA sequences encoding proteins of the same type.

現時点で好ましいとされている形では、んでいる。ゲノムＤＮＡ、およびヌクレ オチドから部分的ないし全化学合成によって作ったＤＮＡさらには欠失や突然変 異したＤＮＡのような別の形のＤＮＡもまた本発明の計画内にある。The currently preferred form is genomic DNA, and nucleic acid DNA produced by partial or total chemical synthesis from Otide, as well as deletions and mutations Other forms of DNA, such as different DNAs, are also within the contemplation of the present invention.

本発明で得られたＤＮＡ配列を、プロモーター、オペレーター、レギュレーター その他類似のものなどのような、同種または異種の種発現制１ＤＮＡ配列と会合 させると、ｉｎ　ｖｉｖｏ　およびｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写でメツセンジャー ＲＮＡが作られ、ついでこれによる翻訳によってアンドロゲン受容体とＴＲ２蛋 白質および関連するポリ−とオリゴ−ペプチドか大量に生成する。現在提起され ている本発明のＤＮＡ発現系では、ＡＲとＴＲ２をコードするＤＮＡは、作用す るに当たってウィルス（Ｔ７）調節（プロモーター’）ＤＮＡ配列と会合して無 細胞系中でｉｎ　Ｖｉｔｒｏ転写と翻訳を可能にする。これによってたとえば７ ９ＫＤと９８ＫＤヒトアンドロゲン受容体（ｈＡＲ）蛋白質、７９ＫＤおよび９ ８ＫＤラットアンドロゲン受容体（ｒＡＲ）蛋白質とこれらの蛋白質のより小さ な形、そして同じように２０ＫＤ、　５２ＫＤおよび６７ＫＤ種を含むＴＲ２蛋 白質を生成する。The DNA sequences obtained in the present invention can be used as promoters, operators, and regulators. association with species-specific DNA sequences of the same or different species, such as other similar ones; In vivo and in vitro transcription, Metsenger RNA is produced and then translated into the androgen receptor and TR2 protein. White matter and associated poly- and oligo-peptides are produced in large quantities. is currently being raised In the DNA expression system of the present invention, the DNA encoding AR and TR2 is During the process, it associates with the viral (T7) regulatory (promoter') DNA sequence and Enables in vitro transcription and translation in cell lines. For example, 7 9KD and 98KD human androgen receptor (hAR) proteins, 79KD and 9 8KD rat androgen receptor (rAR) protein and smaller versions of these proteins TR2 proteins, including the 20KD, 52KD and 67KD species, Produces white matter.

標準のトランスフォーメーションとトランスフェクション法による原核ならびに 真核宿主細胞中へのＤＮＡ配列のとりこみは、可能性として適当なウィルスと環 状ＤＮＡプラスミドを含むが、これもまた本発明の計画内にあり、従来天然のソ ースから得られなかった作用な蛋白質を量的にも提供することが期待される。本 発明により提供される系の中には、微生物保存に関するＵ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎ ｔａｎｄ　Ｔｒａｄｅｍａｒｋ　０ｆｆｉｃｅの要請に従ってＡａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ−Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋ ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ。prokaryotes and prokaryotes by standard transformation and transfection methods. Introduction of a DNA sequence into a eukaryotic host cell is possible through the use of a suitable virus and a circulatory system. DNA plasmids, which are also within the scope of the present invention and which are conventionally available in natural sources. It is expected to provide a quantitative amount of functional proteins that could not be obtained from other sources. Book Among the systems provided by the invention are U, S, Paten for microbial preservation. Aamerica as requested by Trademark Office. n Type-Culture Co11ection, 12301 Park Lawn Drive.

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２によって１９８９年１月 ２５日に保存されたトランフオームＥ、　Ｃｏ１１　ＤＨ５ａｌｌＢ胞が含まれ 、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、６７８７９　；ＥＣ−ｒＡ Ｒ２８３０、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ。Rockville, Maryland 20852 January 1989 Contains transform E and Co11 DH5allB cells preserved on the 25th. , A, T, C, C, Accession No., 67879; EC-rA R2830, A, T, C, C, No.

６７８７８　；　ＥＣ−ＴＲ２−５、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ。67878; EC-TR2-5, A, T, C, C, No.

６７８７７　、およびＥＣＴＲ２−７、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ。67877, and ECTR2-7, A, T, C, C.

Ｎｏ、６７８７６と命名された。同じくトランスフす−ムＲ２−ＩＩと命名され た。哺乳動物宿主細胞の使用により、本発明の組換え発現産物に対する最適の生 物学的活性を授与するのに必要と思われる翻訳後の修飾（たとえば裁断、グリコ ジル化およびチロシン、セリンまたはスレオニンの燐酸化）を可能にする。It was named No. 67876. It was also named transform R2-II. Ta. The use of mammalian host cells provides optimal production for the recombinant expression products of the invention. Post-translational modifications that may be necessary to confer biological activity (e.g., cleavage, glycolysis) zylation and phosphorylation of tyrosine, serine or threonine).

本発明の新しい蛋白質産物は、ＡＲおよびＴＲ２蛋白質の一次構造コンホメーシ ョン（たとえばアミノ酸配列）をもつポリペプチド、ならびにそれのペプチドフ ラグメント、およびそれのアミノ酸配列の重複として集合した合成ペプチドを含 む。本発明の蛋白質、蛋白質フラグメントおよび合成ペプチドは、治療、診断お よび予後使用を含めて多くの使用を計画しており、ＡＲおよびＴＲ２蛋白質と特 異的に免疫反応するモノクローナルおよびポリクローナル抗体作製の基礎となる 。望ましい蛋白質フラグメントおよび合成ペプチドはＤＮＡ結合機能に含まれな いＡＲとＴＲ２蛋白質の重複領域を含み、最も望−ましいのはＡＲとＴＲ２蛋白 質に対して少なくとも１個の抗原エピトープを共存するものである。The new protein product of the present invention has the primary structure conformation of AR and TR2 proteins. (e.g. amino acid sequence), as well as its peptide form. fragment, and synthetic peptides assembled as overlapping amino acid sequences thereof. nothing. The proteins, protein fragments and synthetic peptides of the invention are useful for therapeutic, diagnostic and Many uses are planned, including prognostic and prognostic uses, and the AR and TR2 proteins and Provides the basis for producing monoclonal and polyclonal antibodies that are differentially immunoreactive. . Desired protein fragments and synthetic peptides are not involved in DNA binding functions. Contains an overlapping region of the AR and TR2 proteins, and the most desirable one is the overlapping region of the AR and TR2 proteins. At least one antigenic epitope coexists with respect to the quality.

さらにまた本発明が提供するものとして、ＡＲとＴＲ２蛋白質およびそれらのフ ラグメントとペプチドに対する高い免疫特異性をもって結合する能力で特徴づけ られるポリクローナルおよびモノクローナル抗体であり、これらは他の蛋白質、 とくにＤＮＡ結合蛋白質とは共通でない独特のエピトープを認識する。Furthermore, the present invention provides AR and TR2 proteins and their proteins. Characterized by the ability to bind with high immunospecificity to fragments and peptides polyclonal and monoclonal antibodies that are In particular, it recognizes unique epitopes that are not common to DNA-binding proteins.

本発明で与えられるものを例示すればＡＮＩ−６，ＡＮｌ−７，ＡＮＩ−１５と 名づけられたモノクローナル抗体がある；またハイブリドーマ細胞で産成されＨ −ＡＮｌ−６，Ｈ−ＡＮＩ−７，Ｈ−ＡＮＩ−１５と名づけられたもの；これら は微生物保存に関するＵ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔａｎｄ　Ｔｒａｄｅｍａｒｋ　 ０ｆｆｉｃｅの要請に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２によって１９８９年１月２５日にそれ ぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏｓ、　ＨＢ　Ｉ　０．０００　；　ＨＢ９．９９ ９；およびＨＢＩｏ、００１として保存されている。これらの抗体はつぎのよう な特徴を有する：（ａ）ラット腹側前立腺から得たアンドロゲン受容体およびｈ ＡＲ−ｃＤＮＡとｒＡＲ−ｃＤＮＡの構造から予測される配列をもつ合成ペプチ ドと結合する能力；（ｂ）生および変性コンホメーションをもって、天然に生じ たアンドロゲン受容体と組み換え体に対して特異的免疫活性をもち、さらに可逆 的に免疫結合する能力；および（Ｃ）ｈＡＲおよびｒＡＲ中の対応するアミノ酸 配列の残基３３１から５５７の間のアミノ酸配列重複体の全体あるいは、実質上 免疫的に重要な部分に対して特異的な免疫活性を有し、かつ可逆的に免疫結合す る能力。Examples of what is provided by the present invention are ANI-6, ANl-7, ANI-15. There is a monoclonal antibody named; it is also produced in hybridoma cells and - those named ANl-6, H-ANI-7, H-ANI-15; these U, S, Patent and Trademark related to microbial preservation American Type Culture Co. 11ection, 12301 Parklawn Drive, Rockvi lle, Maryland 20852 on January 25, 1989. Accession Nos, HB I 0.000; HB9.99 respectively 9; and HBIo, preserved as 001. These antibodies are as follows Characteristics: (a) Androgen receptors obtained from rat ventral prostate and h Synthetic peptides with sequences predicted from the structures of AR-cDNA and rAR-cDNA (b) the ability to bind naturally occurring molecules in native and denatured conformations; It has specific immunological activity against the androgen receptor and recombinant, and is also reversible. and (C) the corresponding amino acids in hAR and rAR. All or substantially all of the amino acid sequence duplication between residues 331 and 557 of the sequence It has specific immune activity against immunologically important parts and has reversible immune binding. ability to

さらにまた本発明により提供されるものはＡ−ＴＲ−２−１１ａと名付けられて いるＴＲ２蛋白質に対するモノクローナル抗体である。これらの抗体はＴＲ２蛋 白質ならびにｈＴＲ−２−ｃＤＮＡの構造から予測される配列をもつ合成ペプチ ドと結合する能力によって特徴づけられる。Further provided by the present invention is named A-TR-2-11a. This is a monoclonal antibody against the TR2 protein. These antibodies are directed against the TR2 protein. Synthetic peptide with a sequence predicted from the structure of white matter and hTR-2-cDNA It is characterized by its ability to combine with

本発明によるモノクローナル抗体はヒトまたはラットの前立腺、およびＡＲに富 む臓器や培養細胞のようなその他のソースからとったＡＲおよびＴＲ−２受容体 の親和性精製のために使用することができる。The monoclonal antibody according to the present invention is enriched in human or rat prostate and AR. AR and TR-2 receptors from other sources such as human organs and cultured cells. can be used for affinity purification of

また、本発明によって提供されるものとして、ＡＲとＴＲ２の正常、異常または 変異形、同じくそれらと関連する核酸（たとえばＤＮＡとｍ　ＲＮ　Ａ　）の検 出および／または定量のための新しい方法かある。例示すれば、本発明による抗 体は体液や組織試料中のＡＲおよびＴＲ２蛋白質の定量的検出のための既知の免 疫的方法の中で用いられるかもしれないし、また本発明によるＤＮＡ配列（とく にＤＮＡ結合蛋白質をコードする配列をもつもの）は都合よく標識されるであろ うし、これらの蛋白質をコードするｍＲＮＡの定量的検出に用いることができる かもしれない。Further, as provided by the present invention, normal, abnormal or abnormal AR and TR2 Detection of variants and their associated nucleic acids (e.g. DNA and mRNA) Are there new methods for extraction and/or quantification? For example, the anti-inflammatory agent according to the present invention The body uses known immunohistochemistry for quantitative detection of AR and TR2 proteins in body fluids and tissue samples. DNA sequences according to the invention (in particular DNA-binding protein-encoding sequences) may be conveniently labeled. Bovine, can be used for quantitative detection of mRNA encoding these proteins Maybe.

それゆえ、本発明の多面性のうち以下のものが提供できることになる：　（ａ） 　図３に示した新しいＡＲおよびＴＲ２をコードするＤＮＡ配列、同じ＜（ｂ） ここで記述した条件と本発明のｃＤＮＡの最初の分離において用いた条件と同等 ないしそれ以上の厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリッドさせたＡＲおよ びＴＲ２をコードするＤＮＡ配列、および（Ｃ）同じ対立形質変異体をコードす るＤＮＡ配列、または縮重コドンを少なくとも部分的に用いることによる類似Ａ ＲおよびＴＲ２ポリペプチド。Therefore, among the many aspects of the present invention, the following can be provided: (a) DNA sequences encoding the new AR and TR2 shown in Figure 3, same <(b) Conditions described here are equivalent to those used in the initial isolation of the cDNA of the present invention. AR and hybridized under severer or more severe hybridization conditions. and (C) DNA sequences encoding the same allelic variants. or similar A by at least partially using degenerate codons. R and TR2 polypeptides.

これに応じて提供されるものとして、このようなりＮＡ配列をとりこむウィルス または環状プラスミドＤＮＡベクターがあり、さらにこのようなりＮＡ配列によ ってトランスフオームまたはトランスフェクトされた原核および真核宿主細胞が ある。それと同時にこのような宿主の培養成長と、宿主またはそれらの培養培地 からのこれらの蛋白質の分離を通じてＡＲとＴＲ２蛋白質の組換えによる産生の ための新しい方法などがある。Viruses that incorporate such NA sequences are provided accordingly. Alternatively, there is a circular plasmid DNA vector, and furthermore, such a NA sequence The transformed or transfected prokaryotic and eukaryotic host cells be. At the same time, the culture growth of such hosts and the host or their culture medium The recombinant production of AR and TR2 proteins through the separation of these proteins from There are new ways to do this.

本発明による望ましいポリペプチド産物の中には、図３に示したように、推定さ れたそれぞれ７３４個と９１８個の残基からなるアミノ酸配列を育する約７９Ｋ Ｄ（２番目のＡＴＧ／Ｍｅｔから始まる）と９８ＫＯ（最初のＡＴＧ／Ｍｅｔか ら始まる）のｈＡＲポリペプチドが含まれる。Among the desirable polypeptide products according to the present invention are the predicted polypeptide products, as shown in FIG. approximately 79K amino acid sequences consisting of 734 and 918 residues, respectively. D (starting from the second ATG/Met) and 98KO (starting from the first ATG/Met) hAR polypeptides starting from ).

さらにまた望ましいものとしては図３に示したように、７３３個と９０２個の残 基からなる推定配列をもつ７９ＫＤと９８ＫＤ　ｒＡＲ種のポリペプチドである 。同じように望ましいものとして、図４．５および６にそれぞれ示したように、 １８４．４８３．４６７および８０３残基からなる推定アミノ酸配列をもつ２０ にり、５２ＫＤ、および６７ＫＤ種のヒトＴＲ２ポリペプチドがある。望ましい ７９ＫＤと９８ＫＤ　ｈＡＲおよびｒＡＲポリペプチドは１ｎｖｉｔｒｏで産生 されるであろうし、高い特異性でアンドロゲンと特異的に結合する能力、ならび にヒト自己免疫抗アンドロゲン受容体抗体によって免疫沈降することによって特 徴づけられる。望ましい２０ＫＤ、５２にＤおよび６７ＫＤＴＲ２ポリペプチド はｉｎ　ＶｉｔｒＯで産生されるであろうし、ＴＲ２抗体およびＤＮＡと相互作 用する能力によって特徴づけられる。Furthermore, as shown in Figure 3, what is desirable is that the remaining 733 and 902 79KD and 98KD rAR species polypeptides with predicted sequences consisting of . Equally desirable, as shown in Figures 4.5 and 6, respectively: 20 with a deduced amino acid sequence consisting of 184.483.467 and 803 residues. There are 52KD, and 67KD species of human TR2 polypeptides. desirable 79KD and 98KD hAR and rAR polypeptides produced in vitro and the ability to specifically bind androgens with high specificity, as well as by immunoprecipitation with human autoimmune anti-androgen receptor antibodies. be marked. Desirable 20KD, 52D and 67KDTR2 polypeptides will be produced in VitrO and will interact with the TR2 antibody and DNA. characterized by the ability to use

本発明のその他の視点および利点は、当該発明に関する数多くの実際の例示と、 そこで引用されている引用文献を含めた以下の詳細な記述を考慮すれば明らかに なるであろう。Other aspects and advantages of the invention include numerous practical illustrations of the invention; If you consider the detailed description below, including the cited references, it becomes clear that It will be.

図１はヒトアンドロゲン受容体ｃＤＮＡベクターを構成するときに用いた計画を 図示する。Figure 1 shows the plan used to construct the human androgen receptor cDNA vector. Illustrated.

図２はラットアンドロゲン受容体ｃＤＮＡベクターを構成するときに用いた計画 を図示する。Figure 2 shows the plan used to construct the rat androgen receptor cDNA vector. Illustrated.

図３はヒトアンドロゲン受容体（ｈＡＲ）ＤＮＡクローンに関する３７１５塩基 対ヌクレオチド配列およびそれから推定したｈＡＲ蛋白質に関する７３４個と９ １８個のアミノ酸残基の配列を示す；さらにラットアンドロゲン受容体（ｒＡＲ ）ＤＮＡクローンとそれから推定された二つのｒＡＲ種についての７３３個と９ ０２個のアミノ酸配列も示す； 図４はヒトＴＲ２ＤＮＡクローンに関する２０２９塩基対ヌクレオチド配列と、 それから推定した“ＴＲ２−５ｓ種に関する、分子量が５２．９８２ダルトンと 計算された４８３個のアミノ酸の配列、および分子量が２０゜５２８ダルトンと 計算された“ＴＲ２−７”種についての１８４個のアミノ酸の推定配列を示す。Figure 3 shows the 3715 bases for the human androgen receptor (hAR) DNA clone. 734 and 9 regarding the paired nucleotide sequence and hAR protein deduced from it. The sequence of 18 amino acid residues is shown; in addition, the rat androgen receptor (rAR ) 733 and 9 for the DNA clone and the two rAR species deduced from it. The amino acid sequence of 02 is also shown; FIG. 4 shows the 2029 base pair nucleotide sequence for the human TR2 DNA clone; From this, it was estimated that the molecular weight for the TR2-5s species was 52.982 Daltons. The calculated sequence of 483 amino acids and the molecular weight of 20°528 Daltons. The calculated 184 amino acid predicted sequence for the "TR2-7" species is shown.

図５はヒトＴＲ２ＤＮＡクローンに関する１７８５塩基対ヌクレオチド配列と、 分子量５０，８４９ダルトンと計算された“ＴＲ２−９“種に関する４６８個の アミノ酸の推定配列を示す：　ＤＮＡ結合領域中のアミノ酸配列はボックスで囲 んである。ポリアデニル化のシグナルであるＡＡＴＡＡＡには下線を施した。FIG. 5 shows the 1785 base pair nucleotide sequence for the human TR2 DNA clone; 468 for the “TR2-9” species with a calculated molecular weight of 50,849 Daltons. Deduced amino acid sequences are shown: Amino acid sequences in the DNA binding region are boxed. There it is. AATAAA, which is a polyadenylation signal, is underlined.

図６はヒトＴＲ２ＤＮＡクローンに関する２２２１塩基対ヌクレオチド配列と、 分子量６７．２２３と計算された“ＴＲ２−１１″種に関する６０３個のアミノ 酸の推定配列を示す；　ＤＮＡ結合領域中のアミノ酸配列はボックスで囲んであ る。ポリアデニル化のシグナルであるＡＡＴＡＡＡには下線を施した。FIG. 6 shows the 2221 base pair nucleotide sequence for the human TR2 DNA clone; 603 amino acids for the “TR2-11” species with a calculated molecular weight of 67.223. The deduced sequence of the acid is shown; the amino acid sequence in the DNA binding region is boxed. Ru. AATAAA, which is a polyadenylation signal, is underlined.

図７はヒトアンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラロコルチコ イド受容体、プロゲステロン受容体、エストロゲン受容体、ＴＲ２、ラットＡＲ ，ニワトリビタミンＤ受容体（ｃ−ＶＤＲ）およびトリ赤芽球症ウィルスのＶ　 −ｅｒｂＡオンコシン産物のシスティン豊富なりＮＡ結合領域のアミノ酸配列の 系列を示す。Figure 7 shows human androgen receptor, glucocorticoid receptor, and mineralocorticoid receptor. id receptor, progesterone receptor, estrogen receptor, TR2, rat AR , chicken vitamin D receptor (c-VDR) and avian erythroblastosis virus V -Amino acid sequence of cysteine-rich and NA-binding region of erbA oncosin product Indicates the series.

図８はヒトＴＲ２受容体の４個の変異体、ＴＲ２−５、ＴＲ２−７、ＴＲ２−９ とＴＲ２−Ｉｆについて図による比較を行ったものである：箱の上の番号はアミ ノ酸残基の位置を示す。ＤＮＡ結合領域（ＤＮＡ）とホルモン結合領域（ホルモ ン）を示した。ＴＲ２−５、ＴＲ２−９およびＴＲ２−１１の配列はアミノ酸番 号ｌから４６４までは同じである。Figure 8 shows four mutants of human TR2 receptor, TR2-5, TR2-7, TR2-9. and TR2-If: The numbers above the boxes indicate the The positions of amino acid residues are indicated. DNA-binding domain (DNA) and hormone-binding domain (hormone) ) was shown. The sequences of TR2-5, TR2-9 and TR2-11 are indicated by amino acid numbers. Nos. 1 to 464 are the same.

図９、】０および１１はＡＲ遺伝子の３つの異なる部分（Ｎ−末端、ＤＮＡ結合 領域およびアンドロゲン結合領域）の、ＰＡＴＨ発現ベクトルを用いたｔｒｐＥ 遺伝子のＮ−半末端へのそれぞれのフレーム内融合を示す。Figure 9, ]0 and 11 represent three different parts of the AR gene (N-terminus, DNA-binding and androgen binding region) using the PATH expression vector. The respective in-frame fusions to the N-half of the gene are shown.

詳細な説明 本発明の実施例を以下に示す。例１はヒトおよびラットアンドロゲン受容体に対 するｃＤＮＡの分離、調製および部分的構造解析に関するものである。例２はヒ トＸ−クロモワーム上にＡＲ−型ｃＤＮＡ配列が存在することの確認に関連する 。例３は異なるクローンから得られ、ＰＧＥＭ−３２プラスミド内に連結された ＡＲ−型ｃＤＮＡを含むヒトおよびラットのｃＤＮＡの調製に関連する。例４は ＡＲ−ＷｃＤＮＡプラスミドＤＮＡの転写と翻訳に関連する。例５は例４の発現 産物のステロイド結合能に関連する。例６はヒト自己抗体に対する例４の発現産 物の結合能に関連する。例７はＴＲ２−ＣＤＮＡの特性化に関連する。例８はＴ Ｒ２−ｃＤＮＡの　１ｎＶｉｔｒｏでの転写と翻訳に関連する。例９はＴＲ２− ｃ　ＤＮＡ発現産物の結合能に関連する。例１０はヒトＴＲ２受容体の４つの変 異体の因による比較を示す。例ＩＩはラット腹側前立腺中のＴＲ２ｍＲＮＡ濃度 のアンドロゲン調節に関連する。例１２は本発明の組換え発現系に関連する。例 １３は融合蛋白質の産生ならびに本発明に従ってポリクローナルおよびモノクロ ーナル抗体を産生ずる際のこれら融合蛋白質の使用に関連する。例１４は本発明 のＤＮＡプローブの使用に関連する。例１５は本発明のＤＮＡ配列を用いたトラ ンスジェニック動物の発育に関連する。detailed description Examples of the present invention are shown below. Example 1 is for human and rat androgen receptors. This paper relates to the isolation, preparation, and partial structural analysis of cDNA. Example 2 is Related to confirmation of the presence of AR-type cDNA sequences on ToX-chromoworms . Example 3 was obtained from a different clone and ligated into the PGEM-32 plasmid. Relates to the preparation of human and rat cDNAs, including AR-type cDNAs. Example 4 is AR-W cDNA Associated with transcription and translation of plasmid DNA. Example 5 is an expression of example 4 Related to the steroid binding ability of the product. Example 6 is the expression product of Example 4 against human autoantibodies. Related to the binding ability of things. Example 7 relates to the characterization of TR2-CDNA. Example 8 is T Related to 1nVitro transcription and translation of R2-cDNA. Example 9 is TR2- c.Related to the binding ability of DNA expression products. Example 10 shows four variants of the human TR2 receptor. Comparisons due to different substances are shown. Example II TR2 mRNA concentration in rat ventral prostate related to androgen regulation. Example 12 relates to the recombinant expression system of the invention. example 13 for the production of fusion proteins and for polyclonal and monoclonal production according to the invention. The present invention relates to the use of these fusion proteins in producing null antibodies. Example 14 is the invention related to the use of DNA probes. Example 15 is a test using the DNA sequence of the present invention. related to the development of susgenic animals.

これらの例は図示する目的だけのものであり、どのような方法であれ本発明の範 囲を制限するものではない。These examples are for illustrative purposes only and do not fall within the scope of the invention in any way. It does not limit the scope.

例　ｌ ヒトおよびラットアンドロゲン受容体に対するｃＤＮＡの調製と部分的構造解析 λＧＴ１１　ｃＤＮＡライブラリーを用いてヒトアンドロゲン受容体（ｈＡＲ） とラットアンドロゲン受容体（ｒＡＲ）に対するｃＤＮＡの分離を完成した。ヒ ト精巣および前立腺λＧＴＩＩライブラリーはＣ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｃｏ、。Example l Preparation and partial structural analysis of cDNA for human and rat androgen receptors Human androgen receptor (hAR) using λGT11 cDNA library completed the isolation of cDNA for rat androgen receptor (rAR). Hi The human testicular and prostate λGTII libraries are from C1ontech Co.

Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃｏ１１ｆｏｒｎｉａから人手し、Ｅ、Ｃｏ１１　ＹＩ Ｏ９０中のラット腹側前立腺λＧＴＩＩライブラリーはＣｈａｎｇ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２　：　１１９０１（１９Ｂ？ ）の記載に従って構成した。一般に、クローンは種々のステロイド受容体に特異 的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて分化させた。まずはじめにｃＤＮＡラ イブラリーを、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）　、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）お よびトリ赤芽球症ウィルスのＶ−ｅｒｂＡオンコシン産物のＤＮＡ−結合領域中 のヌクレオチド配列に相同なようにデザインされた４　１−ｂｐオリゴヌクレオ チドプローブの一組でふるい分けた。プローブの組は以下の配列を育していた； 　ＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴ／ＣＡＡＡＧＴＣ／ＡＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＧ／ ＡＧＣＡＡ／ＧＴＧＧＡＡＧＧ。Pa1o Alto, Co11fornia, E, Co11 YI The rat ventral prostate λGTII library in O90 was developed by Chang, et al. l,, J, Biol, Chem,, 262: 11901 (19B? ). Generally, clones are specific for various steroid receptors. differentiation using a unique oligonucleotide probe. First of all, cDNA library, glucocorticoid receptor (GR), estrogen receptor (ER) ), progesterone receptor (PR), mineralocorticoid receptor (MR) and and in the DNA-binding region of the V-erbA oncocin product of avian erythroblastosis virus. 4 1-bp oligonucleotides designed to be homologous to the nucleotide sequence of Sieved with a set of probes. The probe set developed the following sequences; TGTGGAAGCTGT/CAAAGTC/ATTCTTTAAAGG/ AGCAA/GTGGAAGG.

プラークをニトロセルロースフィルター上で複製させ、５′−末端！ｓｐ−標識 ４　ｔ−ｂｐオリゴヌクレオチドプローブでふるい分けた。ハイブリッド形成の 条件は３０°Ｃで２５％フォルムアミド、５倍量のＤｅｎｈａｒｄｔ　溶液（０ ，１％Ｆｉｃｏｌｌ　４００．０．１％ポリビニルピロリドン、０、１％ウシ血 清アルブミン）　、０．１％ＳＤＳ、５倍量のＳＳＣ（１倍量のＳＳＣは１５０ ｍＭ　Ｎａｃｌ　、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）、１００μｇ／ｍｌの 変性サケ***ＤＮＡおよび１μｇ／ｍｌポリＡ）であった。フィルターを３７° Ｃにおいて、０．１％ＳＤＳ、０．０５％ピロ燐酸ナトリウムおよび０．４ＸＳ ＳＣを含む溶液で洗浄した。Plaques were replicated on nitrocellulose filters and the 5'-end! sp-label Screened with 4 t-bp oligonucleotide probe. of hybridization The conditions were 25% formamide at 30°C, 5 times the volume of Denhardt's solution (0 , 1% Ficoll 400.0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% bovine blood clear albumin), 0.1% SDS, 5 times the amount of SSC (1 times the amount of SSC is 150 mM NaCl, 15mM sodium citrate), 100μg/ml denatured salmon sperm DNA and 1 μg/ml polyA). filter at 37° In C, 0.1% SDS, 0.05% sodium pyrophosphate and 0.4XS Washed with a solution containing SC.

４１ｂｐプローブを用いた第１回目のふるい分けでは厳密さのより少ないハイブ リッド形成条件（２ＸＳＳＣ１３７℃）を用いた。ついで残りのクローンをもう 一度より厳密な条件、すなわちＳＳＣ濃度を減少させ最終的に３７°Ｃで０．４ ＸＳＳＣにすること、または温度を上げること、またはフォルムアミドの濃度を 増やすことによって条件を厳密にしてプローブした。いくつかの方法においては 、４２°Ｃで５倍量の５ＳＣ１８％の硫酸デキストランおよび２０％フォルムア ミドを用いたが、結果は０．６倍量のＳＳＣで得られたのと同じであった。The first sieve using a 41bp probe resulted in less stringent hives. Lid forming conditions (2XSSC 137°C) were used. Then add the remaining clones Once more stringent conditions, i.e. decreasing the SSC concentration and finally 0.4 at 37 °C XSSC, or increasing the temperature, or increasing the formamide concentration. The conditions were tightened by increasing the number of probes. In some ways , 5 volumes of 5SC 18% dextran sulfate and 20% forma at 42°C. The results were the same as those obtained with 0.6 times the amount of SSC.

約３ＸＩＯ＠ヒト精巣組換え体および６Ｘ１０’ラット腹鋼前立腺組換え体から 、それぞれ３０２および２１ポジテイブクローンが得られた。From approximately 3XIO @ human testis recombinant and 6X10' rat belly steel prostate recombinant , 302 and 21 positive clones were obtained, respectively.

他のステロイド受容体のＤＮＡ−結合領域に非常に高い相同性を有するシスティ ン豊富なりＮＡ結合領域をＡＲが持つであろうという仮定のちとに、第１回目の ふるい分けからのポジティブクローンを、種々のステロイド受容体に対して特異 的な５′−末端３！Ｐ−標識２４−ｂｐオリゴヌクレオチドを用いて、脱離の過 程を通じてＡＲに対するｃＤＮＡが存在する可能性についてしらべた。cysteine with very high homology to the DNA-binding regions of other steroid receptors. After assuming that the AR would have an NA-rich and NA-binding region, the first Positive clones from sieving were identified specific for various steroid receptors. 5'-end 3! The desorption process was performed using a P-labeled 24-bp oligonucleotide. Through this process, we investigated the possibility that cDNA for AR exists.

ＧＲ−ｃＤＮＡはＧＲに特異な２つの２４−ｂｐプローブで脱離された：これら のプローブはｈＧＲ−ｃＤＮＡ結合領域の５′−末端または３′−末端のすぐ近 （のヌクレオチドセグメントと同じヌクレオチド配列、すなわちＴＧＴＡＡＧＣ ＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣとＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＡ ＧＴＣＴＣＡを有していた。２４４と１４クローンはそれぞれｈＧＲ−およびｒ ＧＲ−ｃＤＮＡクローンとして脱離された。GR-cDNA was removed with two 24-bp probes specific for GR: these The probe is directly adjacent to the 5'-end or 3'-end of the hGR-cDNA binding region. The same nucleotide sequence as the nucleotide segment of (, i.e. TGTAAGC TCTCCTCCATCCAGCTC and CAGCAGGCACTACAGGA It had GTCTCA. 244 and 14 clones are hGR- and r, respectively. It was isolated as a GR-cDNA clone.

ＰＲ（ＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＡＡＡ／ＧＣＣＡＧＴ／ＣＣＡＧＡＧＣ）の５′− 末端に対する４個の２４−ｂｐプローブおよびＥＲ（ＧＣＡ／ＣＧＡＣＣＡＧＡ ＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧ）の３′−末端に対する２個の２４−ｂｐプロー ブを含む同様の方法を用いたが、ヒト精巣ライブラリー中にはＥＲ−またはＰＲ −ｃＤＮＡクローンは検出されなかった。ラット前立腺ライブラリー中にはＥＲ −ｃＤＮＡクローンは検出されなかったがｈＰＲ−特異性の２４−Ｍプローブで は一つのポジティブクローンが得られた。5'- of PR (CCGGATTCAGAAA/GCCAGT/CCAGAGC) Four 24-bp probes to the ends and ER (GCA/CGACCAGA Two 24-bp probes against the 3'-end of TGGTCAGTGCCTTG) A similar method was used involving a human testicular library, but no ER- or PR - No cDNA clones were detected. ER in the rat prostate library -cDNA clones were not detected but with the hPR-specific 24-M probe. One positive clone was obtained.

他のステロイド受容体をコードすると推察されるクローンを脱離するこのような 過程のあと、残りのクローン中のＤＮＡ挿入体を制限マツプ法で解析し、さらに 　ｄｉ−ｄｅｏｘｙ配列解析のためにＭ１３ベクターにサブクローン化した。Ｃ ｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２６２　 ：　２８２６（１９８７）を参照。ヌクレオチド配列解析により４つのクローン がｈＭＲ−ｃＤＮＡクローンと同定された。Such clones that are presumed to encode other steroid receptors are After the process, the DNA inserts in the remaining clones were analyzed by restriction mapping and further Subcloned into M13 vector for di-deoxy sequence analysis. C hang, et al, J, Biol, CheIll, 262 : 2826 (1987). Four clones were identified by nucleotide sequence analysis. was identified as an hMR-cDNA clone.

このような段階的な脱離の過程を通じて、５４のヒト精巣クローンと６つのラッ ト前立腺クローンが選択され、ついでこれらは二群に分類化された。１ｌＥ１の 群は、“ＴＲ２−型”ｃＤＮＡと命名され、オーバーラツプして２．１Ｋｂ　ｃ ＤＮＡを作る配列をもつ３０のヒト精巣クローンを含んでいる。第２の群は、“ ＡＲ型”　ｃＤＮＡと命名され、オーバーラツプして２．７　ＫｂのｃＤＮＡを 作る配列をもつ２４のヒト精巣および６個のラット前立腺クローンを含んでいる 。Through this gradual process of shedding, 54 human testis clones and 6 rat Two prostate clones were selected and these were then classified into two groups. 1lE1 The group was named “TR2-type” cDNA, with an overlap of 2.1 Kb cDNA. Contains 30 human testis clones with DNA-making sequences. The second group is “ It was named “AR type” cDNA, and it overlapped to form a 2.7 Kb cDNA. Contains 24 human testis and 6 rat prostate clones with sequences that make .

例　２ ヒトＸ−クロモワーム上にＴＲ２−型ｃＤＮＡ配列よりもＡＲ−型ｃＤＮＡ配列 が存在することの確認“ＴＲ２−型”ＣＤＮＡにおける推定ポリアデニル化シグ ナル（ＡＡＴＡＡＡ）と５′−末端の間の長さは僅か２．　Ｏｋｂであり、これ は他のステロイド受容体のｃＤＮＡのそれよりもはるかに短い。したがって、“ ＴＲ２−型”ｃＤＮＡよりは″ＡＲ−型″ｃＤＮＡがアンドロゲン受容体をコー ドすると考えられる。一層の情報を得るために、Ｋｕｎｋｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１１ニア９６１　（１９ ８３）に従って調製したヒトＸ−クロモソームライブラリ−を例１のＴＲ２−型 ｃＤＮＡとＡＲ−型ｃＤＮＡでプローブした。ＴＲ２−型ｃ　ＤＮＡフラグメン トではポジティブクローンは検出されなかったが、ヒト精巣から得たＡＲ−型ｃ ＤＮＡの１．９　Ｋｂフラグメントにより３つのポジティブクローンが得られ（ り・　ローンＡＲＩ　３２）　、これによりヒトＸ−クロモワーム上にＡＲ−型 ｃＤＮＡ配列が存在することが確認された。Example 2 AR-type cDNA sequence than TR2-type cDNA sequence on human X-chromoworm Confirmation of the existence of a putative polyadenylation signal in the “TR2-type” cDNA The length between the null (AATAAA) and the 5'-end is only 2. It is Okb and this is much shorter than that of other steroid receptor cDNAs. therefore," ``AR-type'' cDNA encodes the androgen receptor rather than TR2-type ``cDNA.'' It is thought that the For further information, see Kunkel, et al. , Nucleic Ac1d Re5earch, 11 Near 961 (19 The human X-chromosome library prepared according to It was probed with cDNA and AR-type cDNA. TR2-type c DNA fragment No positive clone was detected in human testis, but AR-type c obtained from human testis Three positive clones were obtained with a 1.9 Kb fragment of DNA ( ri・loan ARI 32), which allows AR-type on human X-chromoworms. The existence of the cDNA sequence was confirmed.

Ｘ−クロモソームはＡＲ遺伝子を含むクロモソームとみられてきており（Ｌｙｏ ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｄｏｎ）、２２７　：１２１７　 （１９７０）　；　Ｍｅｙｅｒ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ。The X-chromosome has been considered to be a chromosome containing the AR gene (Lyo n, et al, Nature (Lodon), 227:1217 (1970); Meyer, etal, Proc.

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）、７２　：１４６９　（１９７ ５）；およびＡｍｒｈｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１． 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。Nat’1. Acad, Sci (USA), 72:1469 (197 5); and Amrhein, et al., Proc, Nat' 1. Acad, Sci.

（ＵＳＡ）、７３　：８９１　（１９７６））、この情報が示唆することは、ア ンドロゲン受容体をコードしつるＤＮＡ配列を含んでいるのはおそらく“ＴＲ２ −型″ｃＤＮＡではなく、“ＡＲ−型″ｃＤＮＡであるということである。(USA), 73:891 (1976)), this information suggests that “TR2” probably contains the DNA sequence encoding the androgen receptor. This means that it is not an "AR-type" cDNA, but an "AR-type" cDNA.

オーバーラツプして２．７Ｋｂ　ｃＤＮＡを形成するＤＮＡ７１人体を含む二つ のヒトクローンはＡＲ１３２とＡＲ５と名付けられた。オーバーラツプして２． ８　Ｋｂ　ｃ　Ｄ　ＮＡを形成するＤＮＡ挿入体を含む二つのラットクローンは ｒＡＲｌとｒＡＲ４と名付けられた。制限酵素によって切断してのち、これらＡ Ｒ−型クローンからのＤＮＡセグメントを、以下の例３で述べるＰＢＲ３２２お よびＰＧＥＭ−３Ｚベクターを用いて連結し、選択し、そして増殖させた。Two pieces of DNA that overlap to form a 2.7Kb cDNA, including 71 human bodies The human clones were named AR132 and AR5. Overlap 2. Two rat clones containing DNA inserts forming 8 Kb cD NA They were named rARl and rAR4. After cutting with restriction enzymes, these A The DNA segment from the R-type clone was cloned into PBR322 or PBR322 as described in Example 3 below. and PGEM-3Z vectors, selected and propagated.

例　３ Ａ、二つの異なるクローンからのＡＲ−ＷｌｃＤＮＡを含むヒトｃＤＮＡの調製 とクローン化ベクターＰＧＥＭ−３Ｚプラスミドへの連結反応 図１は全長ｈＡＲ−ｃＤＮＡクローンの構成に用いた計画に関連する。クローン ＡＲＩ　３２のｃＤＮＡをＥｃｏＲ［で切断して１．９　Ｋｂフラグメントを得 てのち、・それをＫｐｎ　Ｉで切断してＩ　Ｋｂ　ｆ！ｃｏＲＩ−Ｋｐｎ［フラ グメントを得た。Example 3 A, Preparation of human cDNA containing AR-WlcDNA from two different clones. and ligation reaction to cloned vector PGEM-3Z plasmid Figure 1 relates to the strategy used for the construction of full-length hAR-cDNA clones. clone ARI 32 cDNA was cut with EcoR to obtain a 1.9 Kb fragment. After that, cut it with Kpn I and I Kb f! coRI-Kpn [Fura I got the message.

このＩＫｂフラグメントをクローンＡＲ５をＫｐｎ　ＩとＰｖｕＩで切断して得 た３Ｋｂフラグメントと連結した。その結果得られた４ＫｂフラグメントをＥｃ ｏＲｒとＰｖｕｌで切断したＰＢＲ３２２ベクター中に挿入し、Ｅ、Ｃｏ１１　 ＤＨ５（Ｚのインフエクトに用いた。トランスフオームしたクローンはテトラサ イクリン−抵抗性によって選択した。ＤＮＡ挿入したプラスミドをｃｌａｔとＮ ｄｅ　［で切断して２．６　Ｋｂフラグメントを得る。そのフラグメントはＥ、 　ＣｏＪｉ　ＤＮＡポリメラーゼＴでプラント末端化され、以前にＳｍａ［によ る切断でプラント末端化されたクローニングベクターＰＧＥＭ−３２プラスミド ＤＮＡ　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉ−ｓｏｎ　Ｗ［、）に連 結された。このようにして作ったプラスミド（プラスミドＰｈＡＲ３６００）で Ｅ、Ｃｏ１１　ＤＨ５（α細胞をトランスフオームし、プラスミドを含むコロニ Ｆ　−をアムビシリン抵抗性で選択し、ついで増殖させた。This IKb fragment was obtained by cutting clone AR5 with KpnI and PvuI. ligated with a 3 Kb fragment. The resulting 4Kb fragment was Insert into PBR322 vector cut with oRr and Pvul, E, Co11 DH5 (used to infect Z. The transformed clone was Selection was made based on icrin-resistance. The DNA-inserted plasmid is clat and N cleaved with de[ to obtain a 2.6 Kb fragment. The fragment is E, CoJi was plant-terminated with DNA polymerase T and previously Cloning vector PGEM-32 plasmid, plant-terminated by cleavage DNA (Promega Biotec, Madi-son W [,)] tied. The plasmid created in this way (plasmid PhAR3600) E, Co11 DH5 (transform α cells and create colonies containing plasmids) F- were selected for resistance to amvicillin and then grown.

プラスミドＰｈＡＲ３６００でトランスフオームしたＥ。E transformed with plasmid PhAR3600.

Ｃｏ１１　Ｄ　Ｈ５α細胞はＥＣ−ｈＡＲ３６００と名付けられ、Ａｃｃｅｓｓ ｉｏｎ　Ｎｏ、６７８７９としてＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１　２　３　０　１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ 。Co11D H5α cells were named EC-hAR3600 and accessed ion No. 67879 as American Type Culture Co11ection, 1 2 3 0 1 Parklawn Drive .

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２により１９８９年Ｉ月２ ５日に保存された。Rockville, Maryland 20852 January 2, 1989 Saved on the 5th.

プラスミドＤＮＡを分離し、その構造を制限酵素マツピングと配列決定によって 解析した。ＰＧＥＭａＺ中の２、６　Ｋｂ　ｈ　Ａ　ＲをＮｒｕ［−Ｂａｍ旧で 切断して得た２、０ＫｂｈＡＲをｈＨＲのほかの１．６　Ｋｂ　ＥｃｏＲＥ−Ｎ ｒｕ（フラグメントに連結して全長３７１５ＫｂのｈＡＲを得た。オープン解読 フレームは約２．８　Ｋｂで、これは９００個以上のアミノ酸からなる蛋白質を コードするのに十分である。その蛋白質の中心付近は７２個のアミノ酸配列から なるシスティン豊富領域で、この配列はＤＮＡ結合領域と考えられている他のス テロイド受容体中の領域と高い相同性をも以下に詳しく述べ図２に示すように、 僅かに変更した方法による“全長″ラットＡＲクローンの生成によって、７９Ｋ Ｄおよび９８ＫＤ蛋白質産物へと翻訳されるＲＮＡ転写体を与えるような構成が 結果として得られる。Plasmid DNA was isolated and its structure was determined by restriction enzyme mapping and sequencing. Analyzed. 2,6 Kb h AR in PGEMaZ with Nru[-Bam old The 2.0 Kb hAR obtained by cleavage was used as 1.6 Kb EcoRE-N in addition to hHR. ru (ligated to the fragment to obtain a full-length hAR of 3715 Kb. Open decoding The frame is approximately 2.8 Kb, which contains a protein consisting of more than 900 amino acids. Enough to code. The center of the protein consists of a sequence of 72 amino acids. This sequence is a cysteine-rich region that is similar to other sequences considered to be DNA-binding regions. The high homology with the region in the terrorism receptor is also detailed below and shown in Figure 2. By generation of “full-length” rat AR clones by a slightly modified method, 79K The configuration is such that the RNA transcript is translated into D and 98KD protein products. The result is:

Ｂ、ラット２．７Ｋｂ　ｃＤＮＡの調製とクローニングベクターＰＯＥＭ−３２ プラスミド中への連結反応クローンｒＡＲＩの２．４　Ｋｂ　ＥｃｏＲ［−Ｅｃ ｏＲｒ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　８人体をＸｍｎ　ｒで切断して２．３　Ｋｂフラグメ ントを得た。この２、３　Ｋｂ　Ｘｍｎ１−ＥｃｏＲｒフラグメントを、ほかの ｃＤＮＡクローン挿入体（ｒＡＲ４のＥｃｏＲ［−ＥｃｏＲ［挿入体）をＰｓｔ ［で切断して得た４００ｂｌ）フラグメントに連結した２、　７　ｋｂフラグメ ントをＳｍａｒおよびＰｓｔＩ−切断ＰＧＥＭ−３Ｚベクター中に挿入し、Ｅ、 　Ｃｏ１１　ＤＨ５αをインフエクトするのに用いた。Ｅ、　Ｃｏ１１　ＤＨ５ α細胞をプラスミドでトランスフオームさせ、プラスミドを含むコロニーをアム ビシリン抵抗性で選択してのち増殖させた。これらの細胞をＥＣ−ｒＡＲ２８３ ０と名付け、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ。B. Preparation of rat 2.7Kb cDNA and cloning vector POEM-32 Ligation reaction clone rARI into plasmid 2.4 Kb EcoR[-Ec oRr　c　DN　A　8 human bodies were cut with Xmnr and 2.3 Kb fragments were obtained. I got an asterisk. This 2-3 Kb Xmn1-EcoRr fragment was cDNA clone insert (rAR4 EcoR[-EcoR[insert)] The 2,7 kb fragment ligated to the [400 bl fragment obtained by cutting with into the Smar and PstI-cut PGEM-3Z vector, E. Co11 was used to infect DH5α. E, Co11 DH5 Transform alpha cells with the plasmid, and amplify colonies containing the plasmid. They were selected for vicillin resistance and then propagated. These cells were EC-rAR283 Name it 0 and Accession No.

６７８７８として１９８９年１月２５日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ 。AmericanType Cu1t on January 25, 1989 as 67878 ure Co11ection, 12301 Parklawn Drive .

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２により保存された。図２ に記したように、この構成によって二つのフレーム内メチオニン特異性コドン（ Ａ　Ｔ　Ｇ　ｘと命名）の第２番目から始まる翻訳された転写産物を可能にする 。Preserved by Rockville, Maryland 20852. Figure 2 As noted in , this configuration allows two in-frame methionine-specific codons ( allow the translated transcript starting from the second position of .

Ｃ，ラット２．８３にｂ　ｃＤＮＡの調製とクローニングベクターＰＧＥＭ−３ ２プラスミド中への連結反応ｒＡＲＩの２．４　Ｋｂ　ＥｃｏＲｒ−ＥｃｏＲＥ 　ｃＤＮＡ挿入体をＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断して１．６８　Ｋｂフラグメントを 得る。C, Preparation of cDNA and cloning vector PGEM-3 in rat 2.83 2.4 Kb of ligation reaction rARI into 2 plasmids EcoRr-EcoRE Cut the cDNA insert with HindIII to generate a 1.68 Kb fragment. obtain.

１、６８　Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−旧ｎｄ　［［（フラグメントを、ほかのｃＤＮＡ クローン挿入体（ｒＡＲ６）を）（ｉｎｄ　ＥｒｒとＰｓｔｒで切断して得た１ 、　Ｉ　５　Ｋｂフラグメントに連結させた。連結した２、　８３　ｋｂフグメ ントをＥｃｏＲＥおよびＰｓｔ［で切断したＰＯＥＭ−３Ｚベクター中に挿入し 、Ｅ、Ｃｏ１１　ＤＨ５（Ｚをインフエクトするのに用いた。Ｅ、　Ｃｏ１１　 ＤＨ５α細胞をプラスミドでトランスフオームし、プラスミドを含むコロニーを アムピシリン抵抗性で選択し、ついで増殖させた。図２に示したように、この構 成によって二つのフレーム内メチオニン特異性コドン（ＡＴＧ、と命名）の第１ 番目から始まる翻訳された転写産物を可能にする。1, 68 Kb EcoRI-old nd [[(Fragment, other cDNA 1 obtained by cutting the clone insert (rAR6) with )(ind Err and Pstr , I was ligated to the 5 Kb fragment. 2, 83 kb puffer fish connected into the POEM-3Z vector cut with EcoRE and Pst[ , E, Co11 DH5 (used to infect Z. E, Co11 Transform DH5α cells with the plasmid and generate colonies containing the plasmid. They were selected for ampicillin resistance and then expanded. As shown in Figure 2, this structure The first of two in-frame methionine specificity codons (named ATG) by Allows for translated transcripts starting from th.

図３はより長い“全長”ラットおよびヒトＡＲクローンのＤＮＡ配列のヌクレオ チド配列を提供し、推定アミノ酸配列を含む。第１と第２番目のメチオニン特異 的コドンはｒＡＲのアミノ酸位置ｌおよび１７０ならびにｈＡＲの位置ｌおよび １８５と命名される。Figure 3 shows the nucleotide sequence of the longer “full length” rat and human AR clones. sequence and includes the deduced amino acid sequence. 1st and 2nd methionine specific The target codons are amino acid positions 1 and 170 of rAR and positions 1 and 170 of hAR. It is named 185.

例　４ ウサギ網状赤血球溶解産物系におけるヒトＡＲ−型ｃＤＮＡプラスミドの転写と 翻訳 例３に記述したように、２．６Ｋｂ　ｈＡＲＤＮＡセグメントを含むＰＧＥＭ− ３２ベクター（２０μｇ）を制限酵素８ａｍＨＩで直線化し、フェノール／クロ ロホルムで抽出、ついでエタノールで沈澱させた。直線化プラスミドを以下の成 分を含む反応液中で転写させた：４０ｒｎＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５， ６ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、２１１Ｍスペルミジン、ｌＯａ＋Ｍ　ＮａＣ１、ＩＯｍＭ ＤＴＴ、それぞれ５００　μＭ（７）ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ、１ ６０単位のりボヌクレアーゼ阻害剤、５μｇプラスミド、３０単位のＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼ（Ｐｒｏｔｎｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＩＩ） および最終容積を１００μｍにするためのジエチルピロカルボネー）　（ＤＥＰ Ｃ）−処理水。プラスミドＤＮＡの転写にはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。Example 4 Transcription of human AR-type cDNA plasmids in the rabbit reticulocyte lysate system and translation As described in Example 3, a PGEM- 32 vector (20 μg) was linearized with restriction enzyme 8amHI and phenol/chlorinated. It was extracted with loform and then precipitated with ethanol. Linearized plasmids were made into Transferred in a reaction solution containing: 40rnMTris-HCI, pH 7.5, 6mM MgCIz, 211M spermidine, IOa+M NaCl, IOmM DTT, 500 μM each (7) ATP, GTP, CTP and UTP, 1 60 units glue bonuclease inhibitor, 5 μg plasmid, 30 units T7 RNA Polymerase (Protnega Biotec, Madison, II) and diethylpyrocarbonate to bring the final volume to 100 μm) (DEP C) - Treated water. T7 RNA polymerase was used for transcription of plasmid DNA.

というのはＳＰ６プロモーターよりもＴ７プロモーターの方が連結したＡＲ−ｃ ＤＮＡの５′−末端の前部に見出されたからである。This is because AR-c linked to the T7 promoter is stronger than the SP6 promoter. This is because it was found in front of the 5'-end of DNA.

反応は４０°Ｃで２時間進行させた。ＲＱＩＤＮａｓｅ［（５単位）を加え、つ いで４０℃で１５分間反応を継続させた。The reaction was allowed to proceed for 2 hours at 40°C. Add RQIDNase [(5 units) and add The reaction was continued for 15 minutes at 40°C.

反応混合物をフェノール／クロロホルム（１：　ｌ）で抽出し、ついでクロロホ ルムで抽出した。３Ｍ酢酸ナトリウムＯ，Ｉ容積とエタノール２．５容積を加え てＲＮＡ産物を沈澱させ、０．５　Ｍ　ＮａＣｌ中に再懸濁し、ついで２．５容 積で沈澱させた。転写されたＲＮＡを分離し、ついでウサギ網状赤血球溶解産物 系で翻訳させた。The reaction mixture was extracted with phenol/chloroform (1:1) and then with chloroform. Extracted with rum. Add 3M sodium acetate O,I volume and 2.5 volumes of ethanol. The RNA product was precipitated and resuspended in 0.5 M NaCl, then diluted with 2.5 vol. It was precipitated in a pile. Transcribed RNA was isolated and then rabbit reticulocyte lysate I translated it using the system.

ＲＮＡの翻訳は、Ｂｕｇ　ｍＲＮＡ、４０μＣｉの（”Ｓ）メチオニン（８００ Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌ：　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏ、。RNA translation was performed using Bug mRNA, 40 μCi of (“S)methionine (800 μCi) Ci/mmol: Amersham Co.

ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ、ｒＬ）およびメチオニンを除く各アミノ酸それぞれ１００ μＭの存在下、ミクロコツカスヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血球溶解産物（Ｐ ｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄ−ｉｓｏｎ、　Ｗｌ）を前もって混合し たキット（１００μＩ）中で実施した。反応は３０℃で１時間進行させた。放射 性メチオニンの取り込みを定量するために、反応混合液３μｌを１．５％Ｈ２Ｏ ２，１ｍＭメチオニンおよび０．０４％ウシ血清アルブミンを含む１ｍｌのＩＭ 　ＮａＯＨに加えた。その混合物を３７°Ｃで１５分間インキュベートして（” Ｓ）メチオニンをチャージしたｔＲＮＡを加水分解した。放射性蛋白産物を２５ ％トリクロロ酢酸ｌ０１１を加えて沈澱させ、沈澱物中の放射能を定量した。100 each of each amino acid except ArliArlln, rL) and methionine Micrococcus nuclease-treated rabbit reticulocyte lysate (P romega Biotec, Mad-ison, Wl) in advance. The test was carried out in a kit (100 μl). The reaction was allowed to proceed for 1 hour at 30°C. radiation To quantify methionine incorporation, 3 μl of the reaction mixture was diluted with 1.5% H2O. 1 ml IM containing 2.1 mM methionine and 0.04% bovine serum albumin Added to NaOH. The mixture was incubated at 37°C for 15 minutes (" S) Hydrolyzed tRNA charged with methionine. 25 radioactive protein products % trichloroacetic acid was added to cause precipitation, and the radioactivity in the precipitate was quantified.

Ｓａｌｔｚｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２：４３２ （１９８７）に述べられている通りに実施した５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（８％アクリ ルアミドゲル）分析によって７９ＫＤ蛋白質は翻訳された産物の８５％以上を含 むことがわ合成アンドロゲンに対する７９ＫＤ　ｈＡＲ蛋白質の結合能 クローン化ｃＤＮＡでコードされた蛋白質のステロイド結合能をしらべるために 、新たに合成された蛋白質を含む、例４の綱状赤血球溶解産物を、高い親和性で ＡＲと結合する強力な合成アンドロゲンである１７α〔３Ｈ〕−メチル−１７β −ヒドロキシ−エストラ−４゜９．１１−トリエン−３−オン（（’ＨＪＲＩ８ ８１）（Ｌｉａｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、２４８ 　：　６１５４（１９７３））とインキュベートした。Saltzman et al., J. Biol. Chem., 262:432 (1987) 5DS-PAGE (8% acryl 79KD protein contains more than 85% of the translated product. Binding ability of 79KD hAR protein to Mutokawa synthetic androgens To examine the steroid binding ability of the protein encoded by the cloned cDNA , the shrunken erythrocyte lysate of Example 4, containing the newly synthesized protein, was purified with high affinity. 17α[3H]-methyl-17β, a potent synthetic androgen that binds to the AR -Hydroxy-estra-4゜9.11-trien-3-one (('HJRI8 81) (Liao, et al, J. Biol, Chew, 248 : 6154 (1973)).

特別に、クローン化ｃＤＮＡから転写したＲＮＡを例４に述べたように、ウサギ 網状赤血球溶解産物系中で翻訳させ、ついで溶解産物の一定分量を非放射性ステ ロイドの２５βＭ、５０βＭまたは２５０μＭの存在または非存在下で５μＭ　 （’Ｈ）　Ｒ１８８１（８７Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌ）とインキュベートシた。最終イ ンキュベーション容量は１００μｍであった。放射性のアンドロゲン結合量をＬ ｉａｏ、　Ｓ、。Specifically, RNA transcribed from cloned cDNA was isolated from rabbits as described in Example 4. Translation in the reticulocyte lysate system, and then aliquots of the lysate were treated with non-radioactive steroids. 5μM in the presence or absence of 25βM, 50βM or 250μM of ('H) Incubated with R1881 (87 Ci/mmol). Final i The incubation volume was 100 μm. The amount of radioactive androgen binding is L iao, S,.

ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２０　：　１１　（１ ９８４）に記載されたヒドロキシルアパタイト−フィルター法により測定した。et at, , J, 5teroid Biochem, , 20: 11 (1 It was measured by the hydroxylapatite filter method described in 984).

結果を追加の非放射性ステロイドなしで対照管（５０００ｄｐｍ）中で結合した 放射活性の百分率として表わした。Results were combined in a control tube (5000 dpm) without additional cold steroids. Expressed as a percentage of radioactivity.

表１に示すように、活性な天然アンドロゲン、１７β−ヒドロキシ−５α−アン トロスタン−３−オン（５α−ジヒドロ−テストステロン）は（’Ｈ）Ｒ１８８ １結合とよく競合したが、不活性な５β−異性体は〔３Ｈ〕Ｒ１８８１とはよく 競合せず、これはＡＲと強固に結合しないことを示唆している。結合能はステロ イド特異的であった；すなわち７９ＫＤ蛋白質との結合に関してデキサメタシン 、ハイドロコーチシン、プロゲステロンおよび１７β−ニステラジオールは放射 性アンドロゲンとうまく競合しなかった。同様のステロイド結合特異性がクロー ン化ｃＤＮＡによってコードされたｒＡＲについても観察されている。Ｃｈａｎ ｇ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ＩＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ ＵＳＡ）、８５　：　７２１１−７２１５　（１９８８）。As shown in Table 1, the active natural androgen, 17β-hydroxy-5α-an Trostan-3-one (5α-dihydro-testosterone) is (’H)R188 1 bond, but the inactive 5β-isomer competed well with [3H]R1881. There was no competition, suggesting that it does not bind tightly to AR. Binding ability is stero i.e., dexamethacin in binding to the 79KD protein. , hydrocortiscin, progesterone and 17β-nisterradiol are radioactive It did not compete well with sexual androgens. Similar steroid binding specificity It has also been observed that rARs encoded by encoded cDNAs. Chan g, C,, et al, Proc, Nat'IAcad, Sci, ( USA), 85: 7211-7215 (1988).

」−± クローン化ｃＤＮＡによりコードされたｈＡＲのアンドロゲン−特異的結合 ＲＩ８８１　１３　１０　１ １７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ　９１　９１　８８Ｐｒａｇｅｓｔｅｒａｎｅ　１ ００　９１　９２Ｄｅｘａｗｅｔｈａｓｏｎｅ　１００　９３　９３Ｈｙｄｒｏ ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ　９６　９０　９０Ｔｅｓｔａｓｔｅｒａｎｅ　３Ｂ　２８ 　Ｎｏｔ　ｅｅｓｔｅｄヒドロキシルアパタイトフィルターアッセイ法を用いて 、リガンドの飽和濃度において溶解産物から得られた１１Ｓ−標識７９ＫＤ蛋白 質の約１分子がトリチウム化アンドロゲンの約１分子と結合することが観察され た。スキャッチャードブロフト解析により、見かけの解離定数は０、３１　ｎＭ となり、これはＳｃｈｉｌｌｉｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ−■１ ム５：５８１　（１９８４）で報告されたような、ラット腹側前立腺のＡＲに関 して前に報告された結合定数（０，６５ｎＭ）と一致した。”−± Androgen-specific binding of hAR encoded by cloned cDNA RI881 13 10 1 17β-Estradiol 91 91 88Pragesterane 1 00 91 92 Dexawethasone 100 93 93 Hydro cortisone 96 90 90 Testasterane 3B 28 Using the Not eested hydroxyl apatite filter assay method , 11S-labeled 79KD protein obtained from lysate at saturating concentration of ligand. It has been observed that about one molecule of tritiated androgen binds to about one molecule of tritiated androgen. Ta. By Scatchard Broft analysis, the apparent dissociation constant was 0.31 nM So, this is Schilling, et al,, The Pro-■1 5:581 (1984) regarding the AR of the rat ventral prostate. The binding constant was consistent with the previously reported binding constant (0.65 nM).

例　６ ヒト自己抗体に対する７９ＫＤ蛋白質の結合能以前から報告されているところに よると（Ｌｉａｏ、　ｅｔヒト自己抗体が認識する能力がしらべられた。例４の 溶解産物系中で作られた受容体蛋白質を（”Ｈ）Ｒ１８８１とインキュベートし て放射性アンドロゲン−アンドロゲン受容体（Ａ−ＡＲ）複合体を形成させ、つ いで血清含有自己抗体と混合した。Example 6 The binding ability of the 79KD protein to human autoantibodies has been previously reported. According to (Liao et al., the recognition ability of human autoantibodies was investigated. Example 4) The receptor protein produced in the lysate system was incubated with ("H)R1881. to form a radioactive androgen-androgen receptor (A-AR) complex, and and mixed with serum-containing autoantibodies.

翻訳ＡＲを含む網状赤血球溶解産物を例４に述べたように［８）Ｒ１８８１とイ ンキュベートし、ついでＡＲに対する抗体（抗−ＡＲ血清）を含むヒト男性血清 ５μｍの存在または非存在下で再度４℃で４時間インキュベートした。ついで、 抗−ヒトイムグロビン（Ａｎｔｉ−［ｇＧ）を含むウサギ血清を第２番目の抗体 として添加した。The reticulocyte lysate containing the translated AR was purified with R1881 as described in Example 4 [8]. human male serum containing antibodies against AR (anti-AR serum). The cells were incubated again at 4° C. for 4 hours in the presence or absence of 5 μm. Then, Rabbit serum containing anti-human immunoglobin (Anti-[gG) was used as a second antibody. Added as.

４℃で１８時間インキュベージコンを行った後、混合体を遠心し、沈渣に含まれ る放射活性を測定した。抗−へＲ抗体を含まないヒト女性の血清も比較のために 用いた。After incubation at 4°C for 18 hours, the mixture was centrifuged to remove the The radioactivity was measured. For comparison, human female serum that does not contain anti-HeR antibodies was also used. Using.

下の表２に示した結果は、高力価ヒト血清とウサギ抗−ヒトイムノグロブリンＩ ｇＧの両方が存在するときの放射性Ａ−ＡＲ複合体の定量的免疫沈降を示す。５ ＤＳ−ＰＡＧＥによって、免疫沈降蛋白質は７９ＫＤ蛋白質であることも観察さ れた。The results shown in Table 2 below demonstrate that high titer human serum and rabbit anti-human immunoglobulin I Quantitative immunoprecipitation of radioactive A-AR complexes when both gG and G are present. 5 It was also observed by DS-PAGE that the immunoprecipitated protein was a 79KD protein. It was.

表−２ クローン化ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡの翻訳によって作られたｈＡＲの抗− ヒトイムノグロブリン−依存沈降ＭｌｃｏｄｅｉｂｙｄｌＮＡ”　Ｎｙｎｅ　３ ２、　＋　Ａｎｔｉ−ＡＲｓｅｒｍ　＋　Ａｎｔｉ−Ｔｉ　８２１２十Ｆｅｍ１ ｅ　５ｅｎｎ　＋　Ａｎｔｉ−ｆｇＧ　４３０＋　Ａｎｔｉ（ｇＧ　８ Ｈｅａｔｅｄ　ＡＲ”　＋　Ａｎｔｉ−Ａｆ？　５ｅｎｓ＋　＋　Ａｎｔｉ−ｆ ｇＧ　４！ＥｉＪｌ−１ｙｓａｔｅ’　＋　Ａｎｔｉ−ＡＲ５ｅｎｓ　＋　Ａｎ ｔｉ−（ｇＧ　２０４ａ、　作製した８５００ｄｐａ＋の放射性ＡＲ複合体を使 用した。Table-2 Anti-hAR antibody produced by translation of RNA transcribed from cloned cDNA Human immunoglobulin-dependent precipitated MlcodeibydlNA” Nyne 3 2, + Anti-ARserm + Anti-Ti 82120Fem1 e 5enn + Anti-fgG 430 + Anti(gG 8 Heated AR” + Anti-Af? 5ens+ + Anti-f gG 4! EiJl-1ysate' + Anti-AR5ens + An ti-(gG 204a, using the prepared 8500dpa+ radioactive AR complex used.

ｂ、ＡＲを含む網状赤血球溶解産物を５０”Ｃで２０分間加熱して受容体を不活 化し、抗血清の添加前に結合していた放射性アンドロゲンを遊離させた。b. Receptor inactivation by heating reticulocyte lysate containing AR at 50”C for 20 min. to release the radioactive androgen that was bound before the addition of the antiserum.

ｃ、ａｉ状赤血球溶解産物翻訳系において、クローン化ｃＤＮＡから転写したＲ ＮＡの代わりにＢｒｏｔｔｒｅ　Ｍｏ５ａｉｃウイルスＲＮＡを用いた。c, R transcribed from cloned cDNA in the AI erythrocyte lysate translation system. Brottre Mo5aic viral RNA was used instead of NA.

例　７ 例１に記載されている３０を含めて得られる４０以上ＧとターミネイターＴＡＡ の間の転写解読枠は分子量計算値５２ＫＤを有する４８３ケのアミノ酸で暗号化 することができる。推定上のＤＮＡ結合領域はアンダーラインを付した。推定上 のイニシエーターＡＴＧは活性開始コドンのためのＫｏｚａｋの共通配列とよく マツチした（Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０８　：　２４１　（ １９８４）参照〕。このＡＴＧコドンの二つのトリブレットアブストリームは枠 内ターミネイター（ＴＡＡ）であり、ＡＴＧのためのイニシエイター機能を保持 している。Example 7 40 or more G and terminator TAA obtained including 30 described in Example 1 The open reading frame between is encoded by 483 amino acids with a calculated molecular weight of 52KD. can do. Putative DNA binding regions are underlined. Presumably The initiator ATG of Matched (Kozak, M,, Nature, 308: 241 ( (1984)]. The two triplet Abstreams of this ATG codon are in the frame Internal terminator (TAA) and holds initiator function for ATG are doing.

ＴＲ２−７と命名されているクローンにより示されている様に、例１の３０のＴ Ｒ２タイプクローンの内１１はヌクレオチド配列６６９と６７０（図４でアステ リスクで示した如く）の間に４２９ｂ９の内部挿入を育している。この内部挿入 は転写解読枠を分子量計算値２０ＫＤを育する１８４のアミノ酸に低下させるタ ーミネイションコドンＴＡＧ　（挿入配列脚注にアンダーラインで示した）をも たらしている。これら１１のＴＲ２クローンの結果を表わしている様に思われる 。３′−非翻訳領域には真核性ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡかＴＲ２−５ク ローンのヌクレオチド配列２０００と２００７の間に存在する。30 T of Example 1, as shown by the clone designated TR2-7. Eleven of the R2 type clones have nucleotide sequences 669 and 670 (asterisks in Figure 4). 429b9 internal insertion during the period (as shown in Risk). This internal insert is a tag that reduces the transcription frame to 184 amino acids, giving a calculated molecular weight of 20 KD. The termination codon TAG (underlined in the insert sequence footnote) is also included. It's dripping. This appears to represent the results of these 11 TR2 clones. . The 3'-untranslated region contains the eukaryotic polyadenylation signal AATAAA or TR2-5. It lies between the nucleotide sequences 2000 and 2007 of Lorne.

ＴＲ２−９レセプターｃＤＮＡはヒト前立膝ｃＤＮＡライブラリーから分離され 、１７８５ｂｐを存している（図５）。最初のＡＴＧからＴＡＡへの転写解読枠 は分子量計算値５０，８４９を有する４６７のアミノ酸を暗号化している。TR2-9 receptor cDNA was isolated from a human knee prostrate cDNA library. , 1785 bp (Fig. 5). First ATG to TAA transcription reading frame encodes 467 amino acids with a calculated molecular weight of 50,849.

ＴＲ−２は２２２１ｂｐで短い５′−非翻訳領域を育する（図６）。転写解読枠 は分子量計算値６７．２２３を存する６０３のアミノ酸から成るポリペプチドの 暗号を示している。これ等二つのｃＤＮＡ配列の予想されていたイニシエイター ＡＴＧは活性開始コドンについてのＫｏｚａｋの共通配列とよくマツチしている （　Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、。TR-2 grows a short 5'-untranslated region of 2221 bp (Figure 6). transcription reading frame is a polypeptide consisting of 603 amino acids with a calculated molecular weight of 67.223. It shows the code. The predicted initiators of these two cDNA sequences ATG matches well with the Kozak consensus sequence for the activation initiation codon. (Kozak, M.

Ｎａｔｕｒｅ、３０８　：　２４１−２４６　（１９８４））、そして各ｃＤＮ Ａ配列にはイニシエイシコンＡＴＧの枠内終止コドンＴＡＧアップストリームが ある。３′−非翻訳領域には真核性ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡがＴＲ２− ９レセプターには１７１０〜１７１５に、又ＴＲ２−１ルセブターには２１８０ 〜２１８５に存在する。Nature, 308: 241-246 (1984)), and each cDNA The A sequence contains an in-frame stop codon TAG upstream of the initiator ATG. be. In the 3'-untranslated region, the eukaryotic polyadenylation signal AATAAA is present in the TR2- 1710 to 1715 for 9 receptors and 2180 for TR2-1 luceptor. ~2185.

推定上のリガンド結合領域に於いて転写解読枠を育する他のＴＲ−２変体が新ら しいホルモン又は細胞エフェクター用レセプターのために暗号化するかも知れな い。Other TR-2 variants that develop open reading frames in putative ligand-binding regions are emerging. may encode for new hormones or receptors for cellular effectors. stomach.

ＴＲ２−ｃＤＮＡ配列の知識が他の細胞レセプター、その遺伝子、及び正常及び 病的器官に於いて細胞の成長及び機能を調整することのできるリガンド（内生又 は医療用物質）の分離及び構造分析に利用される事が期待されている。Knowledge of the TR2-cDNA sequence has been linked to other cellular receptors, their genes, and normal and Ligands (endogenous or It is expected that this method will be used for the separation and structural analysis of medical substances).

ＴＲ２レセプター及びステロイドホルモンレセプターにはＤＮＡ結合分域が保存 されている。ＴＲ２レセプターの推定上のＤＮＡ結合分域は他のステロイドレセ プター及びＴＲ３レセプターの相同と５０〜６０％を分は合っている（　Ｃｈａ ｎｇ、　Ｃ，、Ｋｏｋｏｎｔｉｓ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｌｉａｓ、　Ｓ、。DNA binding domains are conserved in TR2 receptors and steroid hormone receptors has been done. The putative DNA binding domain of the TR2 receptor is similar to that of other steroid receptors. There is a 50-60% homology with the homologous receptor and TR3 receptor (Cha ng, C., Kokontis, J., and Lias, S.

５ｃｉｅｎｃｅ、２４０　：　３２４−３２６　（１９８８）　；Ｃｈａｎｇ。5science, 240: 324-326 (1988); Chang.

Ｃ，、Ｋｏｋｏｎｔｉｓ、　Ｊ、、　Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，Ｔ、、　ａｎｄ　Ｌｉ ａｓ、　Ｓ、。C., Kokontis, J., Chang, C., T., and Li. as, S,.

ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ、、２２　二　９６０３　（１９８７）　；Ｇｒ ｅｅｎ、　Ｓ、、　Ｗａｉｔｅｒ、　Ｐ、、　Ｋｕｍａｒ、　Ｖ、、　Ｋｒｕｓ ｔ、　Ａ、。Nucleic Acid Res, 22 2 9603 (1987); Gr een, S, Waiter, P, Kumar, V, Krus t, A,.

Ｂｏｒｎｅｒｔ、　Ｊ、Ｍ、Ａｒｇｏｓ、　Ｐ、、　ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、 　Ｐ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２０　：　１３４−１３９　（１９８６）　；　 Ａｒｒｉｚａ、　Ｊ、　Ｌ、。Bornert, J.M., Argos, P., and Chambon. P, Nature, 320: 134-139 (1986); Arriza, J.L.

Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，、Ｃｅｒｅｌｌｉ、　Ｇ、、　Ｇｌａｓｅｒ、　 Ｔ、Ｍ、、　Ｈａｎｄｅｌｉｎ。Weinberger, C., Cerelli, G., Glaser, T.M., Handelin.

Ｂ、Ｌ、　Ｈｏｕｓｍａｎ、Ｄ、Ｅ、、　ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、　Ｒ，Ｍ、、５ ｃｉｅｎｃｅ、２３７：２６８−２７５　（１９８７））。ＴＲ３レセプターは ステロイドレセプターの他のメンバーであり、マウスＮＵＲ／７７遺伝子生成物 のヒトに於ける同族体であるかも知れない（Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，、Ｌａｕ、　Ｌ 、、　Ｌｉａｓ、　Ｓ、、　ａｎｄｋｏｎｔｉｓ、　Ｊ、、　ｉｎ　ｔｈｅ　５ ｔｅｒｏｉｄ／　Ｔｈｙｓｏｉｄ　ＨｏｒｍｏｎｅＲｅｅｐｔｏｒ　Ｆａｍｉｌ ｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、　ＢｉｒｋｈａｕｓｅｒＶａｒ ｌａｇ、　Ｂａ５ｅ１．　Ｂｏｓｔｏｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、　ｐｐ、１８３−１９ ３（１９８８）　；Ｈａｚｅｌ、Ｔ、Ｇ、、Ｎａｔｈａｎｓ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｌ ａｕ、Ｌ。B, L, Housman, D, E, and Evans, R, M, 5 science, 237:268-275 (1987)). TR3 receptor is Another member of the steroid receptor family, the mouse NUR/77 gene product (Chang, C., Lau, L.). ,, Lias, S,, andkontis, J,, in the 5 teroid/Thysoid HormoneReeptor Family y and Gene Regulation, Birkhauser Var lag, Ba5e1. Boston, Berlin, pp. 183-19 3 (1988); Hazel, T.G., Nathans, D., and L. au, L.

Ｆ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　ｌ　、Ａｃａｄ、ＳｃＬ　ＵＳＡ、８　５　；　８ 　４　４４−８４４８　（１９８８））。ＴＲ２レセプターのＤＮＡ結合に於け る２６のアミノ酸はすべての知られているステロイドレセプターのＤＮＡ結合分 域のアミノ酸と同一である。残留アミノ酸残基の位置はＤＮＡ結合分域“亜鉛フ ィンガー”の形成に影響することが提案されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　 Ｃ，、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、　Ｍ、、　Ｒｏｓｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｍ。F,, Proc, Nat'l, Acad, ScL USA, 8 5; 8 4 44-8448 (1988)). In DNA binding of TR2 receptor The 26 amino acids are the DNA-binding components of all known steroid receptors. It is the same as the amino acid in the range. The positions of the remaining amino acid residues are located in the DNA binding domain “zinc fluoride”. It has been proposed to influence the formation of "fingers" (Weinberger, C., Hollenberg, S., M., Rossenfeld, M.

Ｇ、、　ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、　Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１８　：　８７Ｏ −６７２（１９８５））。G., and Evans, R.M., Nature, 318: 87O -672 (1985)).

図７はヒトアンドロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、エストロゲン レセプター、ヒトＴＲ２タンパク質、ラットＡＲ，ヒヨコビタミンＤレセプター （Ｃ−ＶＤＲ）及びトリ赤芽球症ウィルスの高システィン含有ＤＮＡ結合分域の アミノ酸配列の整列を表わしている。Figure 7 shows human androgen receptor, progesterone receptor, and estrogen. receptor, human TR2 protein, rat AR, chick vitamin D receptor (C-VDR) and the cysteine-rich DNA-binding domain of avian erythroblastosis virus. It represents an alignment of amino acid sequences.

左端の数は各レセプターのアミノ酸残基の位置を示している。共通の残基は実線 で囲われている。点線で囲まれた残基は実線で囲まれた残基と共通でないものを 示している。Ｖ−ｅｒｂＡは星じるしを付けた位置において２つ多くのアミノ酸 を有している。The numbers on the left indicate the positions of amino acid residues in each receptor. Common residues are solid lines surrounded by Residues surrounded by dotted lines are not common to residues surrounded by solid lines. It shows. V-erbA has two more amino acids at the asterisked position have.

この領域に於いてはＡＲ用ヒト及びラットｃＤＮＡは同一のアミノ酸残基を有し ている。しかしあるアミノ酸については異ったコドンが使用される。又この領域 に於いては、ヒトＡＲ又はラットＡＲと他のレセプターの相同は下記の如くであ る。グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）、７６．４％：ミネラル・コルチコ イドレセプター　（ＭＲ）、７６．４％：ブロゲステロンレセブタ−（ＰＲ）、 ７９．２％、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、５５．６％；ＴＲ２，４５，８ ％：ヒョコビタミンＤレセプター（ｃＶＤＲ）、４０．３％；トリ赤芽球症ウィ ルスのＶ−ｅｒｂＡ発癌遺伝子生成物、４０．３％、ステロイドレセプターの− ＣＯＯＨ末端の近くの約２００のアミノ酸基を有するステロイド結合の推定上領 域に於いて、ヒトＡＲ又はラットＡＲとｈＧＲ，ｈＭＲ，又はｈＰＲとの相同は 約４５〜５５％である。一方ヒトＡＲとラットＡＲ及びｈＥＲ間の相同は２０％ 以下である。よってヒト及びラットＡＲはＶ−ｅｒｂＡ又はエストロゲン、ビタ ミンＤ１甲状腺ホルモンよりもＧＲ，ＭＲ及びＰＲにより密接に関係がある様に 思われる。In this region, the human and rat cDNAs for AR have the same amino acid residues. ing. However, different codons are used for certain amino acids. Also this area In this case, the homology between human AR or rat AR and other receptors is as follows. Ru. Glucocorticoid receptor (GR), 76.4%: mineral corticosteroid Id receptor (MR), 76.4%: Brogesterone receptor (PR), 79.2%, estrogen receptor (ER), 55.6%; TR2,45,8 %: Chick vitamin D receptor (cVDR), 40.3%; rus V-erbA oncogene product, 40.3%, steroid receptor - A putative region of steroid binding with approximately 200 amino acid groups near the COOH terminus. In this area, the homology between human AR or rat AR and hGR, hMR, or hPR is It is about 45-55%. On the other hand, the homology between human AR and rat AR and hER is 20%. It is as follows. Therefore, human and rat AR have V-erbA or estrogen, vitamin MinD1 seems to be more closely related to GR, MR and PR than thyroid hormone. Seem.

ＴＲ２のＤＮＡ結合分域（アミノ酸１１１〜１８３）は下記の如くステロイドレ セプター・スーパーファミリーと高い相同を有している。レチノイン酸レセプタ ー（１９８７））６５％；甲状腺レセプター（Ｔ、Ｒ）（Ｓａｐ他、Ｎａｔｕｒ ｅ、３２４　：　６３５　（１９８７）　３　、　５９％：ミネラルコルチコイ ドレセブタ−（ＭＲ）、（Ａｒｒｉｚａ他、５ｃｉｅｎｃｅ、２３５：２６８　 （１９８７））、５４％：ビタミンＤ８　レセプター（ＶＤｚ　Ｒ）　（ＭｃＤ ｏｎｎａｌｌ他、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３５　：　１２１４　（１９８７））、 ５３％、ｈＥＲＲ１及びｈ　Ｅ　Ｅ　Ｒ２（Ｇｉｇｕｅｒｅ。The DNA-binding domain of TR2 (amino acids 111-183) is a steroid receptor as shown below. It has high homology with the Scepter superfamily. retinoic acid receptor (1987)) 65%; Thyroid receptor (T, R) (Sap et al., Natur e, 324: 635 (1987) 3, 59%: Mineralcorticoid (MR), (Arriza et al., 5science, 235:268 (1987)), 54%: Vitamin D8 receptor (VDzR) (McD onnall et al., 5science, 235: 1214 (1987)), 53%, hERR1 and hEER2 (Giguere.

ストロゲンレセブタ−（ＥＲ）、（Ｈｏｌ　Ｉｅｎｂｅｒｇ他、コルチコイド・ レセプター（Ｇ　Ｒ）　［：Ｈｏ１ｌ？ｎｂｅｒｇ他、ドロゲンレセブター（Ａ Ｒ）、５０％：プロゲステロン・レセプター（ｐＲ）、４９％；　（Ｌｏｏｓｆ ｅｌｔ他、Ｐｒｏｃ。Strogen receptor (ER), (Hol Ienberg et al., corticoid Receptor (G R) [:Ho1l? nberg et al., Drogen Receptor (A R), 50%: progesterone receptor (pR), 49%; (Loosf elt et al., Proc.

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　（ＵＳＡ）、８３：９０４５　（１９ ８６）〕。図７で述べた如く、推定上のＤＮＡ結合分域における２０のアミノ酸 （９Ｃｙｓ、３Ａｒｇ、２Ｇ１ｙ、２Ｐｈｅ、Ｉ　Ｌｙｓ、Ｉ　Ｍｅｔ、Ｉ　Ａ ｓｐ、Ｉ　Ｈｉｓ）の位置は、すべての分離甲状腺ステロイドレセプター遺伝子 間で同一である、この高度に保存されている領域はＤＮＡフィンガーの形成に影 響を与えるかも知れないという事が提案されている。Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ他、 Ｎａｔｕｒｅ、３１８　：　６７０　（１９８５）、参照。他のステロイド・レ セプター同様、ＴＲ２は甲状腺レセプターのＤＮＡ結合分域にのみ発見される２ つの余分のアミノ酸（Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｓｎ）を持っていなＴＲ２ｃＤＮＡの試 験管内転写と翻訳 クローンＴＲ２−５及びＴＲ２−７からＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ　ＲＩ　ＤＮＡ挿入 は、本質的に例３に記載した如く、分離し、試験管内転写用ＥｃｏＲＩ消化ｐＧ ＥＭ−３２ベクターに連結された。Ｅ、Ｃｏ１１　ＤＨ５α細胞はこれ等プラス ミドで形質変換され、ＥＣＴＲ２−５及びＥＣＴＲ２−７と命名され、１９８９ 年１月２５日、受入番号６７８７７及び６７８７６でＡｔｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１　２３０　１　Ｐａｒｋｌａｗ ｎ　Ｄｒｉｖｅ。Nat’1. Acad, Sci, (USA), 83:9045 (19 86)]. As mentioned in Figure 7, the 20 amino acids in the putative DNA binding domain (9Cys, 3Arg, 2G1y, 2Phe, I Lys, I Met, IA sp, I His) position in all isolated thyroid steroid receptor genes. This highly conserved region, which is identical between It has been proposed that it may have an impact. Weinberger et al. See Nature, 318:670 (1985). Other steroids Like the receptor, TR2 is found only in the DNA-binding domain of the thyroid receptor. A sample of TR2 cDNA that does not have two extra amino acids (Lys-A sn) In vitro transcription and translation EcoRI-EcoRI DNA insertion from clones TR2-5 and TR2-7 was isolated and EcoRI-digested pG for in vitro transcription essentially as described in Example 3. EM-32 vector. E, Co11 DH5α cells are these plus In 1989 Atnerican Ty on January 25th, accession numbers 67877 and 67876. peCulture Co11ection, 1 230 1 Parklaw n Drive.

Ｐｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２　ヘ供託された。Deposited in Pockville, Maryland 20852.

転写ＲＮＡは次いでラビット網状細胞溶解産物システムに翻訳された。ＳＤＳポ リアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、内部の４２９ｂｐ、挿入 を有するＴＲ２−７の主要翻訳生成物は２０ＫＤタンパク質であった。ＴＲ２− ５の主要翻訳生成物は５２ＫＤタンパク質であった。The transcribed RNA was then translated into the rabbit reticulocyte lysate system. SDS port By lyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), the internal 429 bp of the inserted The major translation product of TR2-7 was a 20KD protein. TR2- The major translation product of 5 was a 52KD protein.

具体的に例３に述べた如く、ＴＲ２−１ルセブターは分離され、試験管内転写の ためにＥｃｏＲＩ消化ｐＧＥＭ−３Ｚベクターに連結された。このプラスミドで 形質変換されたＥ、Ｃｏ１１　ＤＨ５（Ｚ細胞はＥＣＴＲ２−１１と命名され、 １９８９年１１月１４日、受入番号６８１７３でＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，に供託した。As specifically described in Example 3, TR2-1 Lucebuter was isolated and subjected to in vitro transcription. ligated into the EcoRI-digested pGEM-3Z vector. with this plasmid The transformed E, Co11 DH5 (Z cells were named ECTR2-11, Deposited with A.T.C.C. on November 14, 1989 under accession number 68173.

転写ＲＮＡはラビット網状細胞溶解産物システム中で翻訳した。ＳＤＳポリアク リルアミド・ゲル分析は６７ｋｄ近辺で主要バンドを示し、分子量計算値６７． ２２３と一致した。Transcribed RNA was translated in a rabbit reticular cell lysate system. SDS polyac Rylamide gel analysis showed a major band around 67 kd, with a calculated molecular weight of 67. It matched with 223.

これ等の翻訳タンパク質を更に特定化するために、翻訳溶解産物をＤＮＡセルロ ース・カラム上を通過させた。To further characterize these translated proteins, translation lysates were analyzed on DNA cellulose. was passed over the base column.

次いで結合生成物を溶出、濃縮させ、５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果は、 翻訳されたタンパク質が事実ＤＮＡ結合タンパク質であることを示した。The bound product was then eluted, concentrated and subjected to 5DS-PAGE. The result is We have shown that the translated protein is in fact a DNA-binding protein.

例　９ ＴＲ２−５、ＴＲ２−７及びＴＲ２−１１ｃＤＮＡ発現生成物の結合活性 ＴＲ２−５、ＴＲ２−７、及びＴＲ２−１１クローンの翻訳生成物のステロイド 結合活性を研究するために、生成物を、アンドロゲン、プロゲステロン、グルコ コルチコイド及びエストロゲンを含むすべての主要クラスのステロイドで培養し たが、上記ステロイドとの有意な結合は見られなかった。これはこれ等タンパク 質のステロイド結合機能を必ずしも除外するものではない。恐らくＴＲ２−５、 ＴＲ２−７、及びＴＲ２−１１発現生成物のステロイド結合活性はラビットの網 状細胞溶解産物システムの中にないある種の翻訳後の修飾を含むのかも知れない 。それともＴＲ２−５、ＴＲ２−７及びＴＲ２−１１翻訳タンパク質はステロイ ド非依存でヒトの１丸又はラットの前部前立腺に存在する未実証のリガンドに結 合するかも知れず、又未知のステロイド又は非ステロイドホルモンに依存するか も知れない。Example 9 Binding activity of TR2-5, TR2-7 and TR2-11 cDNA expression products Steroids of translation products of TR2-5, TR2-7, and TR2-11 clones To study the binding activity, the products were combined with androgens, progesterone, and glucosamines. Cultured with all major classes of steroids including corticoids and estrogens However, no significant binding with the steroids mentioned above was observed. This is such a protein This does not necessarily exclude a steroid-binding function of quality. Probably TR2-5, The steroid binding activity of TR2-7 and TR2-11 expression products was determined by rabbit reticulum. may contain certain post-translational modifications that are not present in the cell lysate system. . Or TR2-5, TR2-7 and TR2-11 translated proteins are steroids. It binds to an unproven ligand present in the human prostate gland or the anterior prostate gland of rats in a cell-independent manner. may be compatible with the drug, or may be dependent on unknown steroid or non-steroid hormones. I don't know.

ＴＲ２ｍＲＮＡのサイズはプローブとしてＴＲ２−５ｃＤＮＡ挿入を行う化プロ ット分析により決定した。５２ＫＤタンパク質を暗号化するために充分な配列情 報を含む１個の２．５　ｋｂバンドが検出された。ＴＲ２ｍＲＮＡ組織分布も又 ドツト雑種形成により分析した。雑種形成は放射能写真の濃度計走査により見ら れ、個々のドツトを切り取り、放射能は液体シンチレーション計数計で放射能を 測定した。Ｃｈａｎｇ他、Ｇ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、、２６２　：　２８２６ 　（１９８７）、その結果はＴＲ２ｍＲＮＡはラットの前部前立腺に最も多く存 在し、その他の組織における相対量は下記の如くであった。前立腺１００％、精 嚢９２％、毫丸４２％、顎下腺１８％、肝臓１３％、腎臓く１％、子宮〈１％。The size of TR2 mRNA was determined by the procedure for inserting TR2-5 cDNA as a probe. Determined by cut analysis. Enough sequence information to encode the 52KD protein. One 2.5 kb band containing information was detected. TR2 mRNA tissue distribution also Analyzed by dot hybridization. Hybridization was seen by densitometric scanning of radiophotographs. cut out individual dots and measure the radioactivity using a liquid scintillation counter. It was measured. Chang et al., G. Biol Chem, 262: 2826 (1987), the results showed that TR2 mRNA is most abundant in the anterior prostate of rats. The relative amounts in other tissues were as follows. 100% prostate, sperm 92% of the capsule, 42% of the capsule, 18% of the submandibular gland, 13% of the liver, 1% of the kidney, and 1% of the uterus.

例１０ ヒトＴＲ２レセプターの四変体の図式的比軟四つのＴＲ２レセプター（ＴＲ２− ５、ＴＲ２−７、ＴＲ２−９、及びＴＲ２−１１）を図８に示す。ＴＲ２−７レ セブターはヌクレオチド数６７０と６７１塩基点の間に内部の超４２９塩基点体 節を含み、ターミネイションコドンを生成し、転写解読枠を１８４のアミノ酸を 短縮する。Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，、Ｋｏｋｏｎｔｉｓ、　Ｊ、、　Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ ，、Ｉ　５５　：　９７１−９７７　（１９８８）。Example 10 Schematic representation of the four variants of the human TR2 receptor (TR2- 5, TR2-7, TR2-9, and TR2-11) are shown in FIG. TR2-7re Sebuter is a super 429 base point body between nucleotide numbers 670 and 671 base points. section, generates a termination codon, and extends the transcription frame by 184 amino acids. Shorten. Chang, C., Kokontis, J., B.B.R.C. ,, I 55: 971-977 (1988).

ＴＲ２−５、ＴＲ２−９、及びＴＲ２−１ルセブターの配列はアミノ酸数１〜４ ６４と同一である。併し此等３つのＴＲ２レセプターのＣ−末端ホルモン結合分 域は異なる。Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，、Ｋｏｋｏｎｔｉｓ、　Ｊ、、　Ｂ、Ｂ、Ｒ， Ｃ，、１５５：９７１−９７７　（１９８８）。ＴＲ２−９レセプターは、ＴＲ ２−５レセプターのヌクレオチド数１５１８と１７６３間に２４４ｂｐ挿入のた め、ＴＲ２−５レセプターと比較して１６少ないアミノ酸と３つの異なるアミノ 酸を育する。Ｅｖａｎｓ、　Ｒ，Ｍ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０　：　８８９ −８９４　（１９８８）。ＴＲ２−１１はホルモン結合分域に多くの全く異なる アミノ酸を有する。The sequences of TR2-5, TR2-9, and TR2-1 Lucebuter range from 1 to 4 amino acids. It is the same as 64. However, the C-terminal hormone-binding portion of these three TR2 receptors The areas are different. Chang, C., Kokontis, J., B.B.R. C, 155:971-977 (1988). TR2-9 receptor is TR Due to the insertion of 244 bp between nucleotide numbers 1518 and 1763 of the 2-5 receptor. 16 fewer amino acids and 3 different amino acids compared to the TR2-5 receptor Cultivate acid. Evans, R.M., 5science, 240: 889 -894 (1988). TR2-11 has many distinct hormone binding domains Contains amino acids.

甲状腺ホルモンレセプターの多くの形態の如く、ＴＲ２レセプターの変形は生物 学的機能に非常に意義かあるかも知れない。しかし、組織の特異性及び推定上Ｄ ＮＡ結合分域に於ける相同の程度に関しては差がある。変種甲状腺ホルモン・レ セプターは異なった組織に発見され、レセプターの組織特異性を示唆している。Like many forms of thyroid hormone receptors, variations of the TR2 receptor occur in organisms. It may have great scientific significance. However, tissue specificity and putative D There are differences in the degree of homology in the NA binding domain. Variant thyroid hormone The receptors are found in different tissues, suggesting tissue specificity of the receptors.

これに対して、ＴＲ２−ＩＩレセプターｃＤＮＡはヒト前立腺ｃ　ＤＮＡライブ ラリーから分離されたが、その他のすべてのＴＲ２レセプターｃＤＮＡ　（ＴＲ ２−５、ＴＲ２−７及びＴＲ２−９）はヒト来丸ｃＤＮＡライブラリーから分離 され、少くとも一つのヒト組織における共同発現を示唆している。甲状腺レセプ ターのＤＮＡ結合分域における不完全相同は差次的目的遺伝子の特異性に寄与す るかも知れない。これに対して、ＴＲ２レセプターの推定上のＤＮＡ結合分域は 同一であり、同一の目的遺伝子に作用することを示唆している。変種ＴＲ２レセ プターは異種遺伝子の生成物であるかも知れない。一方ＲＮＡスプライシングは 多くのホルモン結合分域をもったＴＲ２レセプターを暗号化するメツセージを発 することが出来る。この場合、ＲＮＡスプライシングレベルに於ける調整が、ホ ルモン依存器官／腫瘍のホルモン非依存器官／腫瘍への転換の間重要であるかも 知れない。又もし異なったホルモン結合分域を有するＴＲ２レセプターが異なる 自然のリガンド、又は異なる親和力を有する同一のリガンドに結合することかで きるならば、異種レセプターの共発現はレセプター間のリガンドの競争を準備す るかも知れない。そして目的遺伝子の活性レベルは異なる変種レセプターの発現 比を調整することによって調整することかできる。この発現比は組織特異性又は 発達段階特異性により変化する。ラットに於いては、ＴＲ２レセプタ−ｍＲＮＡ はアンドロゲン感受性前部前立腺に最も多く存在する（Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，、Ｋ ｏｋｏｎｔｉｓ、　Ｊ、、　Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，、ｌ　５５　：　９７１−９７７ 　（１９８８）。変体ＴＲ２レセプターの正常、腫瘍、過形成前立腺組織におけ る発現比を試験し、前立腺成長及び発展に於ける可能な役割を研究する事は興味 あることである。ＴＲ２レセプター遺伝子と自然ＴＲ２レセプター・リガンドの ゲノム構造の決定は変体レセプターが生成されるメカニズムやステロイドホルモ ン・レセプター・スーパーファミリーの新らしいメンバーの細胞機能を解明に導 くかも知れない。In contrast, TR2-II receptor cDNA is derived from human prostate cDNA. However, all other TR2 receptor cDNAs (TR 2-5, TR2-7 and TR2-9) were isolated from the human Kurimaru cDNA library. , suggesting co-expression in at least one human tissue. thyroid reception Incomplete homology in the DNA-binding domains of these genes may contribute to the specificity of differential target genes. Maybe. In contrast, the putative DNA binding domain of the TR2 receptor is They are identical, suggesting that they act on the same target gene. Variant TR2 Receiver Pter may be the product of a foreign gene. On the other hand, RNA splicing It emits a message that encodes the TR2 receptor, which has many hormone binding domains. You can. In this case, adjustments at the RNA splicing level are may be important during the transformation of lumon-dependent organs/tumors into hormone-independent organs/tumours I don't know. Also, if the TR2 receptors with different hormone binding domains are different whether by binding to the natural ligand or to the same ligand with different affinities. If possible, coexpression of heterologous receptors could set up competition for ligands between receptors. Maybe. And the activity level of the target gene is determined by the expression of different variant receptors. This can be adjusted by adjusting the ratio. This expression ratio is tissue specific or Varies depending on developmental stage specificity. In rats, TR2 receptor mRNA is most abundant in the androgen-sensitive anterior prostate (Chang, C., K. okontis, J, B, B, R, C,, l 55: 971-977 (1988). Variant TR2 receptors in normal, tumor, and hyperplastic prostate tissues It would be of interest to examine the expression ratio of It is a certain thing. TR2 receptor gene and natural TR2 receptor ligand Determination of the genome structure is based on the mechanism by which mutant receptors are produced and steroid hormones. Elucidating the cellular functions of a novel member of the protein receptor superfamily It might be.

例１１ ラット前立腺腹側部におけるＡＲならびにＴＲ２メツセンジヤーＲＮＡのアンド ロゲンによる制御の分析 ラット前立腺腹側部はアンドロゲンに敏感な器官であり、最大量のＡＲおよびＴ Ｒ２のメツセンジャーＲＮＡを含んでいるので、アンドロゲンの涸渇と置換のメ ツセンジャーＲＮＡ量に対する影響をＲＮＡドツトハイブリッド形成とノーザン プロット分析によって検討した。全％　ＲＮＡを正常ラット、去勢ラット、あら かじめ去勢してＬ　５α−ジヒドロテストステロン（１７β−ハイドロキシ−５ α−アントロスタン−３−オン）で処理した前立腺腹側部から抽出した。ＤＮＡ 単位量あたりのＡＲメツセンジャーＲＮＡ量は去勢２日後以内に正常ラットの２ ０；　Ｏから３００％まで増加した。去勢ラットに５−ジヒドロテストステロン （５ｍｇ／ラット／日）を投与するとＡＲメツセンジャーＲＮＡの量を正常ラッ トの値まで減少させた。ＤＮＡ単位量あたりのＴＲ２メツセンジヤーＲＮＡ量は 去勢２日後以内に正常ラットの１７０％まで増加した。去勢ラットに５α−ジヒ ドロテストステロン（５ｍｇ／ラット／日）を注射するとＴＲ２メツセンジヤー ＲＮＡは正常ラットの水準まで減少した。興味深いことに、同じ時期において前 立腺全ＲＮＡ水準は正常水準の４０％に減少した。前立腺のメツセンジャーＲＮ Ａ水準に対するアンドロゲンの作用はフリタミドの注射実験−によってさらに確 認された。去勢ラットにおける前立腺腹側部に対する５α−ジヒドロテストステ ロンの作用に拮抗する抗−アンドロゲンであるフルタミド（Ｎｅｒｉら、Ｉｎｖ ｅｓｔ、　Ｕｒｏｌ、、ＩＯ；　１２３　（１９７２））を正常ラットに２日間 から６日間注射した。それからＴＲ２メツセンジヤーＲＮＡを上述の如くドツト ハイブリッド形成によって測定した。その結果、フルタミド注射は、去勢と同様 にＴＲ２メツセンジヤーＲＮＡ水準を増加した。ＡＲやＴＲ２蛋白質の水準の変 化は、メツセンジャーＲＮＡの安定性と利用における変化が、遺伝子転写の制御 における変化のためかもしれない。同一の器官において特定の遺伝子かアンドロ ゲンによって異った程度に活性化されたり不活性化されたりすることは、アンド ロゲンが標的細胞における遺伝子発現のパターンの構築に関与していることを示 唆していると思われる。また、アンドロゲンによって媒介される遺伝子抑制機序 が前立腺の成長に関連づけられるならば、そのときは、さらにその遺伝子、抑制 されたＡＲおよびＴＲ２ｍＲＮＡの機序と構造をさらに研究することにより、正 常または異常な前立腺、ならびに他のホルモン感受性器官におけるアンドロゲン の作用のよりよい理解が得られると思われる。Example 11 AR and TR2 messenger RNA in the ventral prostate of rats Analysis of control by rogens The ventral rat prostate is an androgen-sensitive organ, containing the greatest amounts of AR and T. Contains R2 metsenger RNA, which serves as a mechanism for androgen depletion and replacement. RNA dot hybridization and Northern It was investigated by plot analysis. Total % RNA from normal rats, castrated rats, and Pre-castrated L5α-dihydrotestosterone (17β-hydroxy-5 was extracted from the ventral prostate treated with α-antrostan-3-one). DNA The amount of AR metsenger RNA per unit amount was 2% in normal rats within 2 days after castration. 0: Increased from O to 300%. 5-dihydrotestosterone in castrated rats (5mg/rat/day) decreases the amount of AR metsenger RNA in normal rats. It was reduced to the value of The amount of TR2 messenger RNA per unit amount of DNA is It increased to 170% of normal rats within 2 days after castration. 5α-dihi to castrated rats Injection of dorotestosterone (5 mg/rat/day) reduces TR2 RNA decreased to normal rat levels. Interestingly, during the same period Standing total RNA levels were reduced to 40% of normal levels. Metsenger RN for prostate The effect of androgens on A levels was further confirmed by experiments with fritamide injections. It has been certified. 5α-dihydrotestosterone on the ventral prostate in castrated rats Flutamide (Neri et al., Inv. est, Urol, IO; 123 (1972)) to normal rats for 2 days. injection for 6 days. Then dot the TR2 messenger RNA as described above. Measured by hybridization. As a result, flutamide injections are similar to castration. TR2 messenger RNA levels were increased. Changes in AR and TR2 protein levels changes in the stability and utilization of metsenger RNA may lead to regulation of gene transcription. This may be due to changes in specific genes or androgen in the same organ The fact that different genes are activated or inactivated to different degrees We show that rogens are involved in establishing patterns of gene expression in target cells. seems to be suggesting it. Also, gene repression mechanisms mediated by androgens If a gene is associated with prostate growth, then that gene, suppressed By further studying the mechanism and structure of AR and TR2 mRNA, Androgens in the normal or abnormal prostate gland, as well as other hormone-sensitive organs It is believed that a better understanding of the effect of

また、ＡＲやアンドロゲン感受性遺伝子の構造における鋏陥、そして／またはこ れらの遺伝子産物の産生と機能の制御の喪失は、前立腺癌のようなアンドロゲン 感受性または非感受性癌の異常成長の原因となり得る。したがって、この線に沿 った研究は、患者に対して新しい診断法と治療法をデザインするのに役立つ。Also, defects in the structure of AR and androgen sensitivity genes and/or this Loss of control over the production and function of these gene products is associated with androgen-related diseases such as prostate cancer. Can cause abnormal growth of sensitive or non-sensitive cancers. Therefore, along this line This research will help design new diagnostics and treatments for patients.

例１２ クローニングしたＡＲ−遺伝子とアンドロゲン感受性遺伝子の原核および真核生 物細胞におけ発現クローニングされた遺伝子が、哺乳類、酵母、バクテリア細胞 に導入されたときに機能する能力は、遺伝子の機能と調節機構を理解する上で極 めて価値があることか分っている。組換え体技術は、天然資源から容易には得ら れない遺伝子発現産物（蛋白質）を大量に供給することかできる。バクテリア系 は、最適の生物活性のために翻訳後の少からぬ修飾を必要としない蛋白質の大規 模生産には極めて有用であるが、真核生物系は発現された蛋白質をそれらの機能 形に正しく修飾する能力かあるために格別の利点がある。Example 12 Prokaryotes and eukaryotes of cloned AR-genes and androgen-sensitive genes The cloned genes are expressed in mammalian, yeast, and bacterial cells. The ability to function when introduced into a gene is extremely important for understanding gene function and regulatory mechanisms. I know it's worth it. Recombinant technology is not easily obtained from natural resources. It is possible to supply a large amount of gene expression products (proteins) that are not available. bacterial type is a major modification of proteins that does not require significant post-translational modification for optimal biological activity. Although extremely useful for imitation production, eukaryotic systems are capable of directing expressed proteins to their functions. There is a particular advantage to having the ability to properly modify shapes.

よく知られた技術を用いて、ＡＲ−ｃＤＮＡとＴＲ２−ｃＤＮＡは遺伝子産物の 大量生産に容易に使用することができる。この目的のために、最も効率的な転写 単位を、種々の宿主細胞において機能することができるｇｒｉｍシグナルを持っ たウィルスの、および非ウィルス性のベクターを使用して構築することができる 。ＳＶ４０．ＰＳＶ２、アデノウィルス、ならびにウシパピローマウィルスＤＮ Ａは真核細胞に多くの真核生物の遺伝子を導入するのに首尾よく使用され、制御 された遺伝的環境における発現を可能にしている。これら、および類似の系は、 ＡＲ−とＴＲ２−遺伝子の発現について適切であることが予想される。遺伝子の トランスファーを助けるために、２゛つの最も広く用いられている方法である　 “リン酸カルシウム沈澱法′と“ＤＥＡＥ−デキストラン技術”を使用すること ができる。遺伝子を、３日間迄発現が続く一時的にか、もっと恒久的に安定して 形質転換された細胞系を形成するために細胞内に導入することができる。発現蛋 白質はアンドロゲン結合検定か抗体検定によって検出することができる。Using well-known techniques, AR-cDNA and TR2-cDNA are isolated from the gene products. Can be easily used for mass production. For this purpose, the most efficient transcription The unit has a grim signal that can function in a variety of host cells. can be constructed using viral and non-viral vectors. . SV40. PSV2, adenovirus, and bovine papillomavirus DN A has been successfully used to introduce many eukaryotic genes into eukaryotic cells, and the control This allows for expression in a unique genetic environment. These and similar systems are It is expected that the expression of AR- and TR2- genes will be appropriate. genetic There are two most widely used methods to aid in transfer. Using “calcium phosphate precipitation method” and “DEAE-dextran technology” Can be done. Genes can be expressed either temporarily, where expression lasts for up to 3 days, or more permanently and stably. It can be introduced into cells to form transformed cell lines. expressed protein White matter can be detected by androgen binding assays or antibody assays.

クローニングしたＡＲ−遺伝子の発現は、真核生物系において以下の如く達成す ることができた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞、すなわち、ＮＩＨスイスマウスの胚から確 立された接触阻害を受けた細胞をＧｏｒｍａｎ、“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　 。Expression of the cloned AR-gene is achieved in eukaryotic systems as follows. I was able to NIH3T3 cells, i.e., confirmed from NIH Swiss mouse embryos. Gorman, “DNA Cloning” cells that have undergone contact inhibition .

２　：　１　４　３　−　１　９　０　Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　ａｄ　°　： 　（０ｘｆｏｒｄ。2: 1 4 3 - 1 9 0 D, M, Glover ad °: (0xford.

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，ｌ　９８５　）によって記述された如くｈＡ ＲｃＤＮＡをｐＢＰＶＭＴＨベクター中に挿入してコトランスフエクトした。ト ランスフェクトした細胞をクローニングし、多穴細胞培養プレート中で成育させ た。hA as described by Washington, D.C.l. 985) R cDNA was inserted into pBPVMTH vector and co-transfected. to Transfected cells were cloned and grown in multiwell cell culture plates. Ta.

約１００の個別の細胞系が分離された。これらのうち６は、ｐＳＶ２単独で、す なわちｈＡＲｃＤＮＡ配列なしでトランスフェクトした細胞の活性の少くとも４ 倍のＭＨ）Ｒ１８８１−結合活性を示した。Approximately 100 individual cell lines were isolated. Six of these were pSV2 alone; i.e. at least 4% of the activity of cells transfected without the hAR cDNA sequence. MH) R1881-binding activity.

原核細胞系中でＡＲｃＤＮＡを発現するために、ｐｉｌｌ？。To express AR cDNA in a prokaryotic system, pill? .

λＧＴＩ　ｌ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−２、ｐＬＥＸ、ｐＡＴＨｉ、 ｐＡＴＨ２、ｐＡＴＨｌｏ、およびｐＡＴＨｌｌを含む多数の発現ベクター中に 、ｈＡＲとｒＡＲのｃＤＮＡｓを挿入した。ＡＲｃＤＮＡの挿入部を有するベク ターを用いてＥ、Ｃｏ１１の株（ＪＭ１０９、ＤＨ５α、Ｙ１０８９、ＪＭＩ０ ５、およびＲＲＩ）を感染させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析による と、感染バクテリアは、ＡＲｃＤＮＡ挿入部によってコードされたＡＲフラグメ ントを合成することができる。λGTI　l, pKK223-3, pKK233-2, pLEX, pATHi, in a number of expression vectors including pATH2, pATHlo, and pATHll. , hAR and rAR cDNAs were inserted. Vector with AR cDNA insert E, Co11 strains (JM109, DH5α, Y1089, JMI0 5, and RRI). By polyacrylamide gel electrophoresis analysis and the infecting bacteria contain the AR fragment encoded by the AR cDNA insert. can be combined.

これらのＡＲポリペプチドのうちの若干は培養中分解される。例１３において記 述されるように、アミノ末端、ＤＮＡ−結合性、およびアンドロゲン結合領域を 使用してこれらの領域を表す融合蛋白質を構築した。Some of these AR polypeptides are degraded during culture. In Example 13, amino-terminal, DNA-binding, and androgen-binding regions as described. were used to construct fusion proteins representing these regions.

例１３ ＡＲに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生 アンドロゲン感受性器官から有意な量だけＡＲを分離することは極めて困難であ る。したがって例１２において示されているｈＡＲまたはｒＡＲのｃＤＮＡｓの 高水準の発現は、ＡＲの大規模産生に対する理想的な道であると期待される。そ の上、ＡＲ分子の部分の理論的に推理したアミノ酸配列と同一な配列を持ったオ リゴペプチドは、化学的に廉価に大量合成することができる。真核生物または原 核生物細胞中の発現ベクターによって産生されたＡＲも、化学的に合成されたＡ Ｒオリゴペプチドも共に、以下にもっと詳述した如くモノクローナル抗体の産生 のための抗原として使用した。一般的にＡＲについて特異的な（すなわち、ＰＹ ＧＤＭＲＬＥＴＡＲＤＨＶＬＰ　；　ＣＰＹＣ；ＤＭＲＬＥＴＡＲＤＨＶＬＰ　 ；およびＳ　ＩＲＲＮＬＶＹＳＣＲＧＳＫＤＣＩ　ＩＮＫ、’）を表すいくつか の化学的に合成されたオリゴペプチドをＢＳＡかＫＬＨ担体に結合させ、マウス を免疫するのに使用した。これらのマウスからの膵臓の細胞を骨髄腫細胞と融合 させ、ハイブリッド抗体を産生させた。４つのハイブリッド培養物の上溝のエリ ザ（エンザイム結合イムノアッセイ）分析は、ラット前立腺腹側部のＡＲと相互 作用するイムノグロブリンの存在を示すように思われた。モノクローナル抗体を 産生するこれらの細胞は、あらかしめプリスタンで処理したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ マウスに腹腔内注射することができると予想される。次に腹水を収穫し、抗体を 硫安で沈澱させることができる。Example 13 Production of polyclonal and monoclonal antibodies against AR It is extremely difficult to isolate significant amounts of AR from androgen-sensitive organs. Ru. Therefore, the hAR or rAR cDNAs shown in Example 12 High levels of expression are expected to be an ideal path to large-scale production of AR. So Above, an amino acid with the same sequence as the theoretically deduced amino acid sequence of the AR molecule. Ligopeptides can be chemically synthesized in large quantities at low cost. eukaryotes or progenitors AR produced by an expression vector in a karyotic cell is also a chemically synthesized A. Both the R-oligopeptide and the production of monoclonal antibodies are discussed in more detail below. was used as an antigen for. Generally specific for AR (i.e., PY GDMRLETARDHVLP; CPYC;DMRLETARDHVLP ; and some representing SIRRNLVYSCRGSKDCIINK,') A chemically synthesized oligopeptide was conjugated to a BSA or KLH carrier, and mouse was used to immunize. Pancreatic cells from these mice were fused with myeloma cells to produce hybrid antibodies. The superior groove lining of the four hybrid cultures The (enzyme-binding immunoassay) analysis was performed to correlate with AR of the ventral prostate gland in rats. This seemed to indicate the presence of an acting immunoglobulin. monoclonal antibody These cells that produce BAL B/C pre-treated with pristane It is expected that mice can be injected intraperitoneally. Next, harvest ascites fluid and collect antibodies. Can be precipitated with ammonium sulfate.

アンドロゲン受容体融合蛋白のＥ、　Ｃｏ１１における発現 ＡＲ遺伝子の３つの異る部分（Ｎ−末端領域、ＤＮＡ結合領域、およびアンドロ ゲン結合領域を包含している）を、それぞれ図９．ＩＯおよび１．１で示される ようにｐＡＴＨ発現ベクターを使用することによってｔｒｐ　Ｅ遺伝子（ｔｒｐ 　Ｅプロモーター−ｔｒｐＥをコードしている領域の最初の９６９塩基対−ＰＵ Ｃ１２の多重クローニング領域）のＮ末端の半分へ枠内で融合させた。Ｄｉｅｃ ｋ−ｆｆｌａｎｒ＋、　ら　・　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６０　：　１ ５１３　（１９８これらの構築の結果、Ｎ−末端領域の一部を含むＡＲのうちの ２５ＫＤａ　：　ＤＮＡ結合領域の主要部分を含むＡＲのうちの２９ＫＤａ；そ してアンドロゲン結合の部分を含むＡＲのうちの１２ＫＤａの３３ＫＤａ　ｔｒ ｐＥ蛋白質への融合を生じた。ｔｒｐ　Ｅ蛋白質は不溶性なので、部分的に精製 された誘導された融合蛋白質は、単純にＥ。Expression of androgen receptor fusion protein in E, Co11 Three different parts of the AR gene (N-terminal region, DNA binding region, and andro (including the gene-binding region) in Figure 9. Indicated by IO and 1.1 The trpE gene (trp E promoter - first 969 base pairs of the region encoding trpE - PU It was fused in frame to the N-terminal half of the C12 multiple cloning region). Diec k-fflanr+, et al., J, Biol, Chem,, 260: 1 513 (198 As a result of these constructions, the AR containing part of the N-terminal region 25KDa: 29KDa of the AR containing the main part of the DNA binding region; 33KDa tr of 12KDa of AR containing the androgen binding part A fusion to the pE protein was generated. Since the trpE protein is insoluble, it can be partially purified. The derived fusion protein is simply E.

Ｃｏ１１を溶解し、不溶融合蛋白質を沈澱させることによって得られた。５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動後、誘導蛋白質、すなわち、対照ｐＡＴ Ｈベクター（ＡＲ遺伝子挿入部分なし）中に存在しない蛋白質をゲルから切取り 、次に免疫処置に使用した。It was obtained by dissolving Co11 and precipitating the insoluble fusion protein. 5DS - After electrophoresis on a polyacrylamide gel, the induced protein, i.e. control pAT Excise the protein that is not present in the H vector (without the AR gene insertion part) from the gel. , then used for immunization.

３つの具体的に例をあげた以外の融合蛋白質もこれらの手段を使用して構築する ことができる。Fusion proteins other than the three specifically mentioned can also be constructed using these methods. be able to.

抗−ＡＲ抗体の産生と精製 ウサギ、ラットおよびマウスを変性融合蛋白質を含む５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲルスライスか、電気的に溶出した、５ＤＳ−不含蛋白質、ならびに他の蛋白 精製法によって得られた融合蛋白質のいずれかで免疫した。Production and purification of anti-AR antibodies Rabbits, rats, and mice were treated with 5DS-polyacrylamide containing denatured fusion proteins. 5DS-free proteins as well as other proteins electroeluted from dog gel slices. Immunization was performed with either of the fusion proteins obtained by the purification method.

抗血清中の融合蛋白質への抗体の存在はエリザによって検定した。高い力価を有 する陽性血清はさらにラットの前立腺腹側部の細胞質ゾルの（”Ｈ）ＡＲを抗原 として２重抗体沈澱法によって検定した。その結果により、ｌμｌの粗血清が１ ０から２０ｆモル（”Ｈ）ＡＲを沈澱させることか分った。租抗−ＡＲ血清を、 ｐＡＴＨベクターによって発現されたＴｒｐＥ蛋白質（挿入配列を持っているＴ ｒｐＥ蛋白質と持っていない蛋白質の両方）を含む免疫血清の差別的懸濁物によ ってアフィニティーによって精製した。ＴｒｐＥ蛋白質は不溶なので、結合した 抗体は、懸濁液から除くことができる。ｔｒｐ　Ｅ蛋白質にだけ特異的な抗体を 除いた。ＡＲについて特異的な抗体を単離し、再びエリザと二重抗体沈澱の両方 によって確認された。The presence of antibodies to the fusion protein in the antiserum was assayed by ELISA. Has high titer The positive serum further detects the antigen (“H)AR” in the cytosol of the ventral prostate of rats. It was assayed by double antibody precipitation method. According to the results, 1 μl of crude serum was It was found that 0 to 20 fmol ("H) AR was precipitated. Anti-AR serum was TrpE protein (TrpE protein with inserted sequence) expressed by pATH vector by differential suspension of immune serum containing both rpE and non-rpE proteins. It was purified by affinity. Since the TrpE protein is insoluble, the bound The antibody can be removed from the suspension. Antibodies specific only to TRP E protein Excluded. Isolate antibodies specific for AR and again perform both ELISA and double antibody precipitation. confirmed by.

モノクローナル抗−アンドロゲン受容体抗体の産生免疫したラットは、それらの 血清試験がエリザによって抗−ＡＲ抗体陽性になったとき、融合のため層殺する 機が熟したと判断された。膵臓を除去し、すりつぶして細胞をＤＭＥＭ培地（Ｄ ｕｌｂｅｃｏの改変イーグル培地）中に放出させた。ＤＭＥＭ＋Ｆｉｃｏｌｌ　 Ｈｙｐａｑｕｅを加えたＤＭＥＭを使用して一連の遠心分離によって、膵臓細胞 を分離した。Ｓ　Ｐ　２１０骨髄腫細胞を成育させ、２つに分け、２０％ＦＣ３ ，１％ＭＯＰＳおよび１ｘＬ−Ｇｌｎを加えた５０ｍ１のＤＭＥＭ＋希釈して２ 日おき、融合準備を整えた。５Ｐ２１０細胞（５Ｘ１０＠）と５ＸＩ０７の膵臓 細胞を融合に使用した。−夜インキユベートした後、融合細胞を集め、ＩＸＨ− Ｔ、ＩＸメトトレキセート、２０％ＦＣ３、およびＩＸＰＢｓを含むＤＭＥＭ中 で懸濁させ、９６穴のプレート中に分配した。プレートに６日後にＤＭＥＭと２ ０％ＦＣＳを補添した。ハイブリドーマは、Ｅｎｇｒａｌｌ　ら、Ｂｉｏ、　Ｃ ｈｅｍ、　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ＡＣＴＡ。Production of monoclonal anti-androgen receptor antibodies Immunized rats When the serum test was positive for anti-AR antibodies due to Eliza, we sacrificed for fusion. The time was deemed ripe. Remove the pancreas, mash the cells in DMEM medium (D ulbeco's modified Eagle's medium). DMEM+Ficoll Pancreatic cells were isolated by serial centrifugation using DMEM with Hypaque. was separated. Grow SP 210 myeloma cells, divide into two, and add 20% FC3 , 50 ml DMEM with 1% MOPS and 1x L-Gln + diluted to 2 Every other day, I prepared for fusion. Pancreas of 5P210 cells (5X10@) and 5XI07 Cells were used for fusion. -After night incubation, the fused cells were collected and IXH- T, IX methotrexate, 20% FC3, and IXPBs in DMEM. and distributed into 96-well plates. After 6 days on the plate DMEM and 2 0% FCS was supplemented. Hybridomas are described by Engrall et al., Bio, C. hem, et Biophys, ACTA.

２５１：４２７−４３９　（１９７１）のエリザ検定を用いて同定し、測定した 。この検定においては、プレートを抗原としてのＡＲ融合蛋白質か、ＴｒｐＥ蛋 白質でコートし、エリザリーダー上で読んだ。251:427-439 (1971) using the ELISA test. . In this assay, plates are loaded with either AR fusion protein or TrpE protein as antigen. Coated with white matter and read on Eliza Reader.

ＡＲ融合蛋白質と陽性反応を起したハイブリドーマだけを１０細胞／ｍｌの濃度 まで“限界希釈し”それから９６−穴プレートの半分に分配した。最初のウェル からの残りの細胞を２４−穴のプレートに移した。これらのプレートの各々には 胸腺フィーダ一層を有していた。胸腺フィーダ一層は、注射を行っていないラッ トから分離され１２００から１４００ラツトで照射され、２０％ＦＣ８を含むＤ ＭＥＭ中ｌＸｌＯ７細胞／ｍｌまで希釈した胸腺細胞から成立っていた。Only the hybridomas that had a positive reaction with the AR fusion protein were collected at a concentration of 10 cells/ml. The cells were "limited diluted" to a maximum and then distributed into halves of a 96-well plate. first well The remaining cells from the cell line were transferred to a 24-well plate. Each of these plates has It had a single layer of thymic feeders. The thymus feeder layer is for rats that have not been injected. D containing 20% FC8 was separated from the It consisted of thymocytes diluted to 1X1O7 cells/ml in MEM.

これらの胸腺細胞９６穴プレートからの陽性細胞は、再びエリザによって試験し た。ＡＲ融合蛋白質で試験か陽性であった細胞のみをモノクローナル抗体精製の ために成育させた。ウェルのうち３つがＡＲに対するモノクローナル抗体を産生 じた。エリザも二重抗体検定も共に陽性であった。モノクローナル抗体は、ＡＮ 　１−６、ＡＮｌ−７、およびＡＮＩ−１５と名付けられ、３つの細胞系はＨＡ ＮＩ−６、ＨＡＮｌ−７、およびＨＡＮ　１−１５と名付けられ、それぞれ寄託 番号１０，０００．９．９９９；１０，００１　でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。Positive cells from these thymocyte 96-well plates were tested again by ELISA. Ta. Only cells that tested positive for the AR fusion protein were subjected to monoclonal antibody purification. I grew it for the sake of it. Three of the wells produced monoclonal antibodies against AR. It was. Both ELISA and double antibody assay were positive. Monoclonal antibodies are AN The three cell lines, named HA 1-6, ANl-7, and ANI-15, Named NI-6, HAN1-7, and HAN1-15, each deposited Number 10,000.9.999; American Type with 10,001 　Culture Co11ection.

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ、　Ｄｒｉｖｅ　Ｒｏｏｋｖｉｌｌｅｓ、　Ｍａ ｒｙｌａｎｄ　２０８５２に１９８９年１月２５日に寄託した。12301 Parklawn, Drive Rookvilles, Ma ryland 20852 on January 25, 1989.

抗−ＡＲ抗体の特異性 蔗糖濃度勾配遠心分離を用いて３つのモノクローナル抗−ＡＲ抗体の特異性とそ れらの非変性（”Ｈ）ＡＲとの反応能力を特徴づけた。Specificity of anti-AR antibody Using sucrose gradient centrifugation to determine the specificity of three monoclonal anti-AR antibodies and their Their ability to react with non-denatured ("H)AR was characterized.

細胞質ゾルは、以下の如く去勢したラットの前立腺腹側部から調製された。ラッ トは麻酔をかけている間に陰嚢経路によって去勢した。ラットを頚椎脱臼１８時 間後に層殺し、それらの前立腺腹側部を取出し、はさみできざみ、緩衝液Ａ（５ ０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５、ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　ＤＤＴ、１０ｍ Ｍモリブデン酸ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールと１０ｍＭフッ化す １−リウム）中で洗い、そして組織量の２倍量の緩衝液Ａ十〇、］ｍＭバシトラ シン、１ｍＭ　ＰＭＳＦおよびアプロチニン（Ｉ　Ｔ　Ｉ　Ｕ／ｍｌ）中でホモ ジナイズした。ホモジネートを５．０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離し、ｌＯ ｎＭ３Ｈ−アンドロゲンに調節し、２２５．０００Ｘｇて４５分間遠心分離にか けた。そして、デキストランでコートした炭素で処理した。３Ｈ−Ａ−ＡＲ複合 体を含む１００μｌの原形質ゾルを、１００μｍの精製抗原受容体モノクローナ ル抗体、ＡＮＩ−６（組織培地で２０倍にした）とともに６時間インキュベート した。３．８　ｍｌの２０ｎ＋Ｍ）リス−塩酸、ｐＨ７，５、Ｉ　ｍＭ　Ｅ　Ｄ 　Ｔ　Ａ　、Ｉ　ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、および０ ．４　Ｍ　ＫＣＩを含む５〜２０％（ｖ／ｖ）の線形蔗糖濃度勾配上で、４°Ｃ １２５７゜０００Ｘｇで１６時間遠心分離を行った。勾配を分画し、底から番号 をつけ、０．２　ｍｌの画分づつ集めた。得られた結果から３つのモノクローナ ル抗体、ＡＮ　Ｉ　−６、ＡＮｌ−７およびＡＮｌ−１５、すべてが放射活性漂 識アンドロゲン受容体（〔３Ｈ：＋　ＡＲ）を認識し、効果的に結合した。Cytosol was prepared from the ventral prostate of castrated rats as follows. Rat The animals were castrated by the scrotal route while under anesthesia. Cervical dislocation of rat at 18:00 After that, the ventral parts of the prostate glands were removed, chopped with scissors, and buffered with buffer A (55%). 0mM sodium phosphate, pH 7.5, mMEDTA, 2mM DDT, 10m M sodium molybdate, 10% (v/v) glycerol and 10mM fluoride. 1-mM Bacitra) and 2 times the amount of tissue in Buffer A syn, 1mM PMSF and aprotinin (ITIU/ml). Genized. The homogenate was centrifuged for 10 min at 5.000 Adjust to nM3H-androgen and centrifuge at 225,000Xg for 45 minutes. I got it. It was then treated with dextran-coated carbon. 3H-A-AR composite 100 µl of plasmasol containing 100 µm purified antigen receptor monoclonal antibody, ANI-6 (20x in tissue culture medium) for 6 hours. did. 3.8 ml of 20n+M) Lis-HCl, pH 7.5, ImM E D T A, I mM D T T, 10% (v/v) glycerol, and 0 ．． on a 5-20% (v/v) linear sucrose concentration gradient containing 4 M KCI at 4°C. Centrifugation was performed at 1257°000×g for 16 hours. Fractionate the gradient and number from the bottom and collected 0.2 ml fractions. Three monoclonals were determined from the obtained results. antibodies, ANI-6, AN1-7 and AN1-15, all radioactive It recognized and effectively bound to the androgen receptor ([3H:+ AR).

（’Ｈ）ＡＲとその他のステロイド受容体の複合体は０、４　Ｍ　ＫＣＩを含む 蔗糖濃度勾配培地巾約４−５８の沈降計数を育していた。抗−ＡＲ抗体はラット 肝の〔３Ｈ〕グルココルチコイド受容体、ＭＣＦ細胞のニスｌ　トローゲン受容 体複合体、およびＴ４７０細胞のプロゲステロン受容体複合体についての４−５ ３の沈降係数を変化させないか、ラット前立腺腹側部の（’Ｈ）Ａ−ＡＲ複合体 の沈降係数を４８から９−１２Ｓ以上の単位へとシフトさせる。ＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動分析によって、ヒトおよびラットＡＲｃＤＮＡのすへて の主な転写／翻訳産物は、抗−ＡＲ抗体によってイムノ沈澱させることかできる ことも見出された。The complex of ('H)AR and other steroid receptors contains 0, 4 M KCI The sucrose gradient medium width was developing a sedimentation count of approximately 4-58. Anti-AR antibody is rat Liver [3H] glucocorticoid receptor, MCF cell Nitrogen receptor 4-5 on the body complex and the progesterone receptor complex of T470 cells. ('H)A-AR complex in the ventral prostate of rats without changing the sedimentation coefficient of 3. shift the sedimentation coefficient from 48 to 9-12 S or higher units. SDS polyac Determination of human and rat AR cDNA by lylamide gel electrophoresis analysis. The main transcription/translation products of can be immunoprecipitated by anti-AR antibodies. It was also discovered that

例１４ ヒトおよび動物の器官と癌細胞の異常の研究におけるＡＲｃＤＮＡ、！−ＴＲ２ ｃＤＮＡのプローブとしての使用 転移性前立腺癌患者は、当初は、アンドロゲン除去治療（去勢または抗アンドロ ゲン処置）に対して好ましい応答を示すことか多い。しかし、大抵の患者は結局 、生存率を存意に増加すると思われる化学療法がないアンドロゲンの状態に戻る 。アンドロゲン非依存性、または非感受性癌細胞の起源がどうであっても、疾患 細胞におけるアンドロゲン非感受性または異常か、（ａ）ＡＲまたはＴＲ２遺伝 子、（ｂ）それらの転写、または翻訳、もしくは（Ｃ）他の細胞要因における定 性的または定量的変化によるのかどうかを理解することは重要である。これらの 検討においてＡＲｃＤＮＡ、ＴＲ２ｃＤＮＡまたはそれらの部分的切片が、特異 的プローブとして使用できる。Example 14 AR cDNA in the study of abnormalities in human and animal organs and cancer cells,! -TR2 Use of cDNA as a probe Patients with metastatic prostate cancer are initially treated with androgen deprivation therapy (castration or anti-androgen therapy). They often show a favorable response to gen treatment. However, most patients end up , returning to an androgenic state without chemotherapy, which appears to significantly increase survival. . Regardless of the origin of androgen-independent or insensitive cancer cells, the disease androgen insensitivity or abnormality in the cell; (a) AR or TR2 inheritance; (b) their transcription or translation, or (C) their determination in other cellular factors. It is important to understand whether it is due to sexual or quantitative changes. these In the study, AR cDNA, TR2 cDNA or their partial fragments were It can be used as a target probe.

ＡＲ，またはＴＲ２遺伝子の分析のためには、探的器官、癌および培養細胞から 単離された高分子量のゲノムＤＮＡは、ＡＲ遺伝子を同定し、特徴づけるのに使 用できる。異る制限酵素を用いてＤＮＡを開裂することができる。そのフラグメ ントはサザン分析（アガロース電気泳動、ニトロセルローズへの移行とＡＲＣＤ ＮＡプローブとのハイブリッド形成）によって分析できる。確認後、選ばれた断 片をクローニングし、配列決定をすることかできる。ＡＲまたはＴＲ２のｃＤＮ Ａの適切なオリゴヌクレオチドフラグメントをプライマーとして、正常または異 常器官または細胞から単離されたゲノムＤＮＡを特異的ＤＮＡポリメラーゼによ って増幅することも可能である。それから、増幅したゲノムＤＮＡを、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検定を使用して配列の異常を同定するために分析を行う ことができる。５ａｉｋｊ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．　１３５０　（１９ ８５）、　Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、。For analysis of AR, or TR2 gene, extract from target organs, cancers and cultured cells. Isolated high molecular weight genomic DNA can be used to identify and characterize the AR gene. Can be used. Different restriction enzymes can be used to cleave the DNA. that flag Southern analysis (agarose electrophoresis, transfer to nitrocellulose and ARCD) (hybridization with NA probe). After confirmation, the selected Pieces can be cloned and sequenced. AR or TR2 cDNA Using appropriate oligonucleotide fragments of A as primers, normal or Genomic DNA isolated from normal organs or cells is treated with a specific DNA polymerase. It is also possible to amplify it. Then, the amplified genomic DNA is analysis to identify sequence aberrations using PCR assay be able to. 5aikj et al., 5science, 230. 1350 (19 85), Mullis, K.B.

Ｕ、Ｓ、　ＰａｔｅｎｔＮｏ、　４．６８３，２０２　：Ｊｕｌｙ２８．Ｉ　９ ８７　；およびＭｕｌｌｉｓ、　Ｋ、　Ｂ、、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ 、　４．　６８３．　ｌ　９５　；　Ｊｕｌｙ２Ｂ、　１９８７も参照のこと。U, S, Patent No. 4.683, 202: July 28. I9 87; and Mullis, K., B., U.S., Patent No. , 4. 683. See also July 2B, 1987.

ＡＲｓまたは関連蛋白質のメツセンジャーＲＮＡの分析のためには、ドツトハイ ブリッド形成およびノーザンハイブリッド形成分析を用いてメツセンジャーＲＮ ＡとＡＲまたは受容体様分子を定量的および定性的に特徴づけることが可能であ る。これらの検討から、ＡＲ遺伝子の多数の異なる形とそれらのアンドロゲン感 受性および非感受性癌細胞における発現についての貴重な情報を得ることかでき る。For analysis of metsenger RNA of ARs or related proteins, Metsenger RN using hybridization and Northern hybridization analysis It is possible to quantitatively and qualitatively characterize A and AR or receptor-like molecules. Ru. These considerations show that there are many different forms of the AR gene and their androgenic sensitivity. Valuable information can be obtained about expression in susceptible and non-susceptible cancer cells. Ru.

アンドロゲン感受性および非感受性腫瘍および、精巣雌性化症候群を存するラッ トとヒトからの細胞系から得られたＤＮＡ５とＲＮＡ５か上記の方法によって分 析された。予備的検討は、アンドロゲン応答の異常はＡＲｓについての遺伝子に おける配列の欠失／突然変異のためであると考えられることを示していた。Androgen-sensitive and insensitive tumors and rats with testicular feminization syndrome DNA5 and RNA5 obtained from cell lines from humans and humans were isolated by the method described above. was analyzed. Preliminary studies suggest that abnormalities in androgen response are related to genes related to ARs. This suggests that this is likely due to a sequence deletion/mutation in the sequence.

例１５ 遺伝子移植動物の開発 外来遺伝子の発現のために遺伝子移植技術か使用されている。したかって、アン ドロゲン受容体鋏陥動物に対してアンドロゲン感受性を付与することか可能と思 われる。例えば、精巣の雌性化マウス、またはラットのようなアンドロゲン非感 受性動物は、鋏陥性遺伝子または鉄陥性ＡＲそのものを持っていることか知られ ている。正常なＡＲ遺伝子を含むＤＮＡを受精したマウスの胚に注射すると、遺 伝子移植マウスはその遺伝子を担い、遺伝子を発現し、アンドロゲン応答に対し て必要な機能性ＡＲを産生ずる可能性かある。ミクロ注射のためには、非感受性 の動物において発現することができるＤＮＡを含むＡＲ遺伝子を使用することが 必要である。Example 15 Development of gene transplant animals Gene transplant techniques are used to express foreign genes. I want to, Ann. We believe that it is possible to impart androgen sensitivity to animals with a dorogen receptor. be exposed. For example, testicular feminized mice, or androgen insensitivity like rats. A susceptible animal is known to have a scissor-induced gene or an iron-induced AR itself. ing. When DNA containing a normal AR gene is injected into fertilized mouse embryos, there is no residue. Gene-transplanted mice carry the gene, express the gene, and respond to androgen responses. There is a possibility that the necessary functional AR can be produced. Insensitive for microinjections It is possible to use an AR gene containing DNA that can be expressed in animals of is necessary.

ヒトＸ−染色体ライブラリーとラットゲノムＤＮＡライブラリーからの多数のゲ ノム受容体のクローンが得られ、それらの構造か分析された。ＡＲ配列を含むク ローンがエンドヌクレアーゼマツピング、サザンハイブリッド形成、およびＳｌ −ヌクレアーゼマツピングによって特徴づけられる。このようにして同定された ５′と３′の翻訳されていない領域は、ＡＲをコードする領域の組織特異的発現 のために必要と思われるＤＮＡの最小限の大きさを決定するのに役立つ。Numerous genes from human X-chromosome libraries and rat genomic DNA libraries Nomu receptor clones were obtained and their structures analyzed. Clock containing AR array Ron endonuclease mapping, Southern hybridization, and Sl -Characterized by nuclease mapping. was identified in this way The 5' and 3' untranslated regions represent tissue-specific expression of the AR-encoding region. This will help determine the minimum size of DNA likely to be needed for this purpose.

５′と３′領域の部分的配列分析は、プロモーターとポリアデニル化領域を表す 最小領域の位置を決めると思われる。ポリ（Ａ）部位から約２から５ｋｂ上流の 翻訳されない領域と０．５からｌｋｂ下流の領域をｃＤＮＡクローン（最小限の 遺伝子）と融合し、マウスの胚に注射することができる。遺伝子移植マウスは、 ミニ遺伝子特異的プローブを使用して尾を分析することによって同定されるであ ろう。Partial sequence analysis of the 5' and 3' regions reveals promoter and polyadenylation regions It seems to determine the position of the minimum area. Approximately 2 to 5 kb upstream from the poly(A) site The untranslated region and the 0.5 to 1 kb downstream region were cDNA cloned (minimal gene) and can be injected into mouse embryos. Gene-transplanted mice are The gene is identified by analyzing the tail using minigene-specific probes. Dew.

遺伝子移植マウス系の一部だけがそれらの移植遺伝子を発現することができる。Only some of the transgenic mouse lines are capable of expressing their transplanted genes.

移植遺伝子は、阻害配列の存在、外来遺伝子の転写不活性な染色体の位置ての統 合、もしくは、該移植遺伝子と内生エンハンサ−との並列のために不活性である 可能性がある。その上、アンドロゲン非感受性は、種々の他の要因のためであっ て、ＡＲ遺伝子やその発現における異常のためてはないことがある。Transplanted genes are affected by the presence of inhibitory sequences and the location of the foreign gene on a chromosome where transcription is inactive. or is inactive due to the juxtaposition of the transplanted gene and the endogenous enhancer. there is a possibility. Moreover, androgen insensitivity may be due to a variety of other factors. However, it may not be due to an abnormality in the AR gene or its expression.

前述の実例は、アンドロゲン受容体とＴＲ−２を含むＤＮＡ結合蛋白質をコード するヒトおよびラットｃＤＮΔＳの単離に関し、さらに、とりわけ、相当するｃ ＤＮＡｓの転写と無細胞系における相当するメンセンジャーＲＮＡの翻訳を記述 している。本発明は、具体的な方法と組成物によって記述されているか、本発明 について考察するとき、この技術分野に熟達した人々に変法や修飾法か思い浮ぶ ことは明かである。The above examples encode DNA binding proteins including the androgen receptor and TR-2. Regarding the isolation of human and rat cDNA ΔS, in particular the corresponding cDNA Describes the transcription of DNAs and the translation of the corresponding mensenger RNA in a cell-free system are doing. The present invention is described in terms of specific methods and compositions; When considering this, variations and modifications come to mind for those skilled in this field. That is clear.

したかって、添付した請求の範囲には、請求された発明の範囲内に入るこのよう な同等な変形物をすへて網羅するよう意図されている。Accordingly, the appended claims contain such claims that fall within the scope of the claimed invention. It is intended to cover all equivalent variations.

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ト・　■ ロ〉 殉 む 也 イ　φ υ・　参　日 Ｕ、：Ｆ　、、　・・ べ″　Ｑ−？： ε Ｑ−七ｓ　ｇ’＝　ｕｃ ａ＞　ＣＪｌ、、１ 手＃！補正書（賎） 特許庁長官殿　１成４″８月６Ｂ アンドロゲン受容体を含むＤＮＡ結合蛋白質氏名（名称ン アーチ　ディベラップメント　コーポレイシ３ン４−代理人 ６、補正により増加する請求項の数 ７、補正の対象 明細書及び請求の範囲翻訳文 明細書及び請求の範囲翻訳文の浄書（内容に変更なし）手　続　補　正　書（方 式］ １−事件の表示 アンドロゲン受容体を含むＤＮＡ結合蛋白質アーチ　ディベラップメント　コー ポレイシ３ン６−−Ｎｌｌ正により増加する請求項の数７−補正の対象 図面の翻訳文 国際調査報告 −一一一一＾伸−−１観ＰＣＴ八Ｆｉ９０１０６０１５□□０ベゴｌ四匍ｌ復ハ １５ −−”−”Ａｍ１ｍ　陶　ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６０１５ＰＣＴ／ＵＳ９０１０ ６０１５ １、　Ｃ１１ｉｒｒｎ　ｉ　−７，Ｉ　Ｆｒ　１９．４０１Ｉｎｄ　４２．　ｄ ｒａｗｎ　ｔｏ　１ｎｄｒ兇ｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＤＭ`。・　■ B> martyrdom nothing Also A φ υ・　date　　day U, :F,,... Be″ Q-?: ε Q-7s g’= uc a>CJl,,1 hand#! Amendment (Ji) Commissioner of the Patent Office 1st 4th August 6th B Name of DNA-binding protein including androgen receptor Arch Development Corporation 3-4-Agent 6. Number of claims increased due to amendment 7. Subject of correction Description and claims translation Translation of the specification and claims (no change in content); formula] 1-Display of incident DNA binding protein arch development code containing androgen receptor Polarity 3 - Number of claims increased due to Nll correction 7 - Subject of amendment translation of the drawing international search report -1111^shin--1viewPCT8Fi90106015□□0Begorl4spoulback 15 --”-”Am1m Ceramic PCT/US90106015PCT/US9010 6015 1, C11irrn i-7, I Fr 19.401Ind 42. d raw to 1ndr receptor DM`.

ｐｌａｓｍｉｄ、　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｆ　ｕｓｅ　ｏｒ 　ｔｈｅ　ＤＭＡ、　Ｃ１５ｓｓ　４３５．５ｕｂｃ田憤６D２４０．２゜ ２５２３ｓｎｄ３冨７．１．ａｎｄＣ１ａｓ！５３６．５ｕｈｃｌｉｓｓ２７Ｉ １．　Ｃｌａｉｍｓ　、１１５．１６−１９．４１　ａｎｄ　４２．　ｄｒｍｖ ｎ　ｔｏ　ＴＲ２ＤＭＡ、　ｐｌａｓｍｉｄ、　ｃｅｌｌ＊ｎｒｌ　ｚ　ｍｅｔ ｈｎｄ　ｎｒ　ｕｓｅ　ｔｙ（ｔｈｅ　ＤＭＡ、ＣＩａｕ　４３５．５ｕｂｃｌ ａｓｓｅｓ　６．２づ０．２．２５２D３　ａｎｄ １１月、　ａｎｄ　Ｃ１ｕｓ　５３６．５ｕｂｃｌ＊ｓｓ　２７ＩＩ１．Ｃｌａ ｉｍｓ２０．２１．２４−２６１１ｎｄ３３．ｃｌｒａｖｎＩｏｍｎｄｒ＊ｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｐｎｌｙｐｅｐｌｉｄｅ−ｓ　ａｎｄ　ＩＩ　ｍｅｔｈｎｄ　 ｒｌ　＋ｋｉｎｌｌ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ、　Ｃ１１ｓｌｅ！　５３０　ａｎｄ@ ４３５、 ＝ｎｈＣｌａ；＝＝ｇ３５（Ｉ　ｓｎｄ　６９１．ｒＰｓｐｅｔｔ＋ｖｅｌｙＩ Ｖ、Ｃｌａｉｍｓ２２．２３．２７−３２ａｎｄ３３．ｄｒａｖｎＩｏ丁Ｒ２ｐ ｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｍｒｎ＝ｔｈｎｄ　ｏ［ｍ＊ｋｉｎＩＩＩｈｅ　 ｓａｍｅ、ＣｌｓＣ１５ｓ　５３０　ａｎｄ　４３５．ｓυｈｃｌ＊ｇｓｅツ３ ５０　ａｎｄ@６９　電。plasmid, cell and a method cf use or the DMA, C15ss 435.5ubc Denen 6D240.2゜ 2523snd3tomi7.1. andC1as! 536.5uhcliss27I 1. Claims, 115.16-19.41 and 42. drmv nto TR2DMA, plasmid, cell*nrl z met hnd nr use ty (the DMA, CIau 435.5ubcl asses 6.2 0.2.252D3 and November, and C1us 536.5ubcl*ss 27II1. Cla ims20.21.24-2611nd33. clravnIomndr*en receptorpnlypeplide-s and II methnd rl +kinll the same, C11sle!　530　and@ 435, =nhCla;==g35(I snd 691.rPspett+veryI V, Claims22.23.27-32and33. dravnIo Ding R2p olypeptidesandmrn=thnd　o[m＊kinIIIhe　 same, ClsC15s 530 and 435. sυhcl＊gsetsu3 50 and @ 69 den.

ｒｅｓｐ譬ｃｌｉｖｅｌｙ Ｖ、（Ｉａｉｍ！　３イー３８．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａｎ　ｌ１ｌｎｔ市ｏｄｙ 　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｖｉ＋ｈ　ｓｎｄｒａｇｅｎｒｅ【〕ごｒ＋ｆｆｓ　ａｎ ｄ　ｓ　ｍｅｔｈｏｄ　Ｏ「ｕ！Ｉｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇａｍｅ、Ｃ１ａｓｓｅｓ 　５３０　ｓｎｄ　イ３５．ｙ浮ｂモ撃≠唐唐■■ １１３７　ａｎｄ　７．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＶｌ、ＣＩ＋１１ｍｇ３ＩＩ 、３７　ａｎｄ　３９．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｓｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｄ ｉｖｅ　ｖ曲丁Ｒ２ｐｎｌｖｐｅｐ電１ｄｅｓ　ｓｎｄ　ｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ａ （ｕｓｉｎｇ　ｌｈｅＶｓａｍｅ、Ｃ１ｕｓｅｓ　５３０　ａｎｄ　イ３５゜（ υトｃｌ＋Ｉ＠ｅ２５３８７　ａｎｄ　７．　ｒｅ＝ｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。resp parable clively V, (Iaim! 3E38.drawn to an l1lnt city ody reactive vi+h sndragenre []go r+ffs an ds method O “u! Iing the game, C1asses 530 snd A35. y floating b mo attack ≠ tang tang ■■ 1137 and 7. RespectivelyVl, CI+11mg3II , 37 and 39. drawn to sn antibody resd ive v track R2pnlvpep den1des snd s method a (using lheVsame, C1uses 530 and i35゜( υtocl+I@e25387 and 7.　re=pectively.

合衆国６０６３７　イリノイ州シカゴ、サウス　ノ１−ノ（−アSouth No. 1-No., Chicago, Illinois, United States 60637

Claims (42)

【特許請求の範囲】[Claims] １．アンドロゲン受容体ポリペプチドをコードする精製され、単離されたＤＮＡ 配列。1. Purified and isolated DNA encoding an androgen receptor polypeptide array. ２．ヒトアンドロゲン受容体ポリペプチドをコードする請求項１によるＤＮＡ配 列。2. A DNA sequence according to claim 1 encoding a human androgen receptor polypeptide. Column. ３．ラットアンドロゲン受容体ポリペプチドをコードする請求項１によるＤＮＡ 配列。3. DNA according to claim 1 encoding a rat androgen receptor polypeptide array. ４．請求項１により、そして図３で明かにされているＤＮＡ配列。4. The DNA sequence as disclosed in claim 1 and in FIG. ５．ｃＤＮＡ配列である請求項１によるＤＮＡ配列。5. A DNA sequence according to claim 1 which is a cDNA sequence. ６．ゲノムＤＮＡ配列である請求項１によるＤＮＡ配列。6. A DNA sequence according to claim 1 which is a genomic DNA sequence. ７．部分的に合成ＤＮＡ配列である請求項１によるＤＮＡ配列。7. A DNA sequence according to claim 1 which is a partially synthetic DNA sequence. ８．ＴＲ２ポリペプチドをコードする精製され単離されたＤＮＡ配列。8. A purified and isolated DNA sequence encoding a TR2 polypeptide. ９．ｃＤＮＡ配列である請求項８によるＤＮＡ配列。9. A DNA sequence according to claim 8 which is a cDNA sequence. １０．ゲノムＤＮＡ配列である請求項８によるＤＮＡ配列。10. A DNA sequence according to claim 8 which is a genomic DNA sequence. １１．部分的に合成ＤＮＡ配列である請求項８によるＤＮＡ配列。11. A DNA sequence according to claim 8, which is a partially synthetic DNA sequence. １２．ＴＲ２−５をコードし、図４で明かにされている請求項８によるＤＮＡ配 列。12. The DNA arrangement according to claim 8 encoding TR2-5 and revealed in FIG. Column. １３．ＴＲ２−７をコードし、図４で明かにされている請求項８によるＤＮＡ配 列。13. The DNA arrangement according to claim 8 encoding TR2-7 and revealed in FIG. Column. １４．ＴＲ２−９をコードし、図５で明かにされている請求項８によるＤＮＡ配 列。14. The DNA arrangement according to claim 8 encoding TR2-9 and revealed in FIG. Column. １５．ＴＲ２−１１をコードし、図６で明かにされている請求項８によるＤＮＡ 配列。15. DNA according to claim 8 encoding TR2-11 and revealed in FIG. array. １６．請求項１または８によるＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトし た原核または真核生物宿主細胞。16. transformed or transfected with the DNA sequence according to claim 1 or 8. prokaryotic or eukaryotic host cells. １７．以下のように名付けられ、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号：ＥＣ−ｈＡＲ３６ ００，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．６７８７９；ＥＣ−ｒＡＲ２８３０，Ａ．Ｔ．Ｃ ．Ｃ．Ｎｏ．６７８７８；ＥＣ　ＴＲ２−５，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．６７８７７；Ｅ Ｃ　ＴＲ２−７，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．６７８７６，ａｎｄ　ＥＣ　ＴＲ２− １１，Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．６８１７３．に相当するＥ．Ｃｏ１ｉ　ＤＨ５α 細胞である請求項１６による原核生物形質転換細胞。17. Named as follows, A. T. C. C. Deposit number: EC-hAR36 00,A. T. C. C. No. 67879; EC-rAR2830,A. T. C ．． C. No. 67878; EC TR2-5, A. T. C. C. 67877;E C TR2-7, A. T. C. C. No. 67876, and EC TR2- 11,A. T. C. C. No. 68173. E. Co1i DH5α 17. The prokaryotic transformed cell according to claim 16, which is a cell. １８．請求項１または請求項８によるＤＮＡ配剤を含むウィルス性のまたは円形 のプラスミド。18. Viral or circular containing a DNA formulation according to claim 1 or claim 8 plasmid. １９．さらに該ＤＮＡ配列と機能作用上関連している発現制御ＤＮＡ配列を含む 請求項によるウィルス性のまたは円形ＤＮＡのプラスミド。19. Furthermore, it contains an expression control DNA sequence that is functionally related to the DNA sequence. Viral or circular DNA plasmids according to the claims. ２０．以下を含むアンドロゲン受容体ポリペプチドの生産の方法。すなわち： 請求項１によるＤＮＡ配列で形質転換されたか、トランスフェクトされた宿主細 胞を培養において成育させること；そして、 該宿主細胞または、培養物から該ＤＮＡ配列の発現ポリペプチド産物を単離する こと。20. A method of producing an androgen receptor polypeptide comprising: i.e.: A host cell transformed or transfected with a DNA sequence according to claim 1. growing the cells in culture; and Isolating the expressed polypeptide product of the DNA sequence from the host cell or culture. thing. ２１．以下を含むアンドロゲン受容体ポリペプチドを産生する方法。すなわち： 請求項１によるＤＮＡ配列を、無細胞系の転写および翻訳系中で処理すること； そして、 該ＤＮＡの発現ポリペプチド産物を該システムから単離すること。21. A method of producing an androgen receptor polypeptide comprising: i.e.: processing the DNA sequence according to claim 1 in a cell-free transcription and translation system; and, isolating the expressed polypeptide product of said DNA from said system. ２２．以下を含むＴＲ２ポリペプチドを産生する方法。 すなわち： 請求項８によるＤＮＡ配列で形質転換、またはトランスフェクトされた宿主細胞 を培養において成育させること；そして、 該ＤＮＡ配列のポリペプチド産物を、該宿主細胞または培養物から単離すること 。22. A method of producing a TR2 polypeptide comprising: i.e.: A host cell transformed or transfected with a DNA sequence according to claim 8. growing in culture; and isolating a polypeptide product of said DNA sequence from said host cell or culture. . ２３．以下を含むＴＲ２ポリペプチド産生する方法。：請求項８によるＤＮＡ配 列を、無細胞転写、翻訳系中で処理すること；そして、 該ＤＮＡ配列の発現ポリペプチド産物を、該システムから単離すること。23. A method of producing a TR2 polypeptide comprising: : DNA sequence according to claim 8 processing the sequence in a cell-free transcription, translation system; and Isolating an expressed polypeptide product of said DNA sequence from said system. ２４．請求項１によるＤＮＡ配列のｉｎ　ｖｉｔｒｏ，またはｉｎ　ｖｉｖｏ発 現ポリペプチド産物。24. In vitro or in vivo generation of the DNA sequence according to claim 1 current polypeptide product. ２５．図３に提案されたアミノ酸配列。25. Figure 3 shows the proposed amino acid sequence. ２６．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる９８ＫＤと７９ＫＤの分子量とアンドロゲンに結 合する能力を特長とする請求項２４のポリペプチド産物。26. Molecular weight of 98KD and 79KD by SDS-PAGE and association with androgens 25. The polypeptide product of claim 24, characterized by the ability to combine. ２７．請求項８によるＤＮＡ配列のｉｎ　ｖｉｔｒｏ，またはｉｎ　ｖｉｔｒｏ のポリペプチド産物。27. In vitro or in vitro of the DNA sequence according to claim 8 polypeptide products. ２８．ＴＲ２ポリペプチド28. TR2 polypeptide ２９．図４中に提示されてある、そしてＴＲ２−５を含むアミノ酸配列。29. Amino acid sequence presented in Figure 4 and comprising TR2-5. ３０．図４中に提示してある、そしてＴＲ２−７を含むアミノ酸配列。30. Amino acid sequence presented in Figure 4 and comprising TR2-7. ３１．図５中に提示してあるアミノ酸配列。31. Amino acid sequence presented in Figure 5. ３２．図６中に示してあるアミノ酸配列。32. Amino acid sequence shown in Figure 6. ３３．ＤＮＡ結合に関与していない蛋白質の領域内のアンドロゲン受容体、ある いはＴＲ２蛋白質中に存在するアミノ酸配列を複製していて、アンドロゲン受容 体、またはＴＲ２蛋白と少くとも１この抗原性エピトープを共有している合成ペ プチド。33. androgen receptor, within a region of the protein that is not involved in DNA binding. It also duplicates the amino acid sequence present in the TR2 protein, and is capable of accepting androgen. synthetic protein that shares at least one antigenic epitope with the TR2 protein. Petite. ３４．アンドロゲン受容体ポリペプチド、またはＴＲ２ポリペプチドの、そのＤ ＮＡ結合機能領域内のエピトープ以外の少くとも１このエピトープと特異的に免 疫反応性である抗体。34. androgen receptor polypeptide, or TR2 polypeptide, its D At least one epitope other than the one in the NA-binding functional region is specifically immunoimmunized with this epitope. Antibodies that are infectious. ３５．請求項３４による、モノクローナル抗体。35. Monoclonal antibody according to claim 34. ３６．請求項３４による、ハイブリドーマ細胞系Ｎｏｓ．ＨＢ１０，０００；Ｈ Ｂ９，９９９とＨＢ１０，００１によって生産されるモノクローナル抗体。36. Hybridoma cell line Nos. according to claim 34. HB10,000;H Monoclonal antibodies produced by B9,999 and HB10,001. ３７．請求項３４によるポリクローナル抗体。37. Polyclonal antibody according to claim 34. ３８．アンドロゲン受容体の請求項３４による抗体との免疫学的反応に基くアン ドロゲン受容体の定量的検出。38. An antibody based on an immunological reaction with the antibody according to claim 34 of the androgen receptor Quantitative detection of drogen receptors. ３９．ＴＲ２受容体の請求項３４による抗体との免疫学的反応に基いたＴＲ２受 容体の定量的検出法。39. TR2 receptor based on immunological reaction with the antibody according to claim 34 of TR2 receptor Quantitative detection method. ４０．該核酸の請求項１によるＤＮＡ配列とのハイブリッド形成に基くアンドロ ゲン受容体をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの定量的検出法。40. android based on hybridization of said nucleic acid with the DNA sequence according to claim 1. A method for quantitatively detecting DNA or RNA encoding a gene receptor. ４１．該核酸の請求項８によるＤＮＡ配列とのハイブリッド形成に基くＴＲ２受 容体をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの定量的検出法。41. TR2 receptor based on hybridization of said nucleic acid with the DNA sequence according to claim 8. Quantitative detection method for DNA or RNA encoding a substance. ４２．ＡＲまたはＴＲ２に特異的な遺伝子配列、もしくは以下の段階を含む試料 中に存在する配列の定量的または定性的検出法： （ａ）オリゴヌクレオチドプライマーがそれに対してハイブリッドを形成する各 配列の各ストランドについて、各核酸のストランドに対して補助的である各プラ イマーの伸長産物が合成されるような条件で該試料を該特異的配列について各ス トランドのための１つのオリゴヌクレオチドで処理すること。その場合において 、該プライマーまたはブライマースは、１つのプライマーから合成された伸長産 物が、その相補体から分離するとき、他方のプライマーの伸長産物の合成のため にテンプレートとして役立つことができるようにそれとハイブリッドを形成する 各特異的配列の各ストランドに対し十分相補的であるように選ばれる。 ｂ）該配列か、検出されるべき配列が存在するならば、プライマー伸長産物をそ れらのテンプレートから分離するために該試料を変性条件で処理すること。 ｃ）プライマー伸張産物が段階（ｂ）において産生された一本鎖のそれぞれを使 用して合成されるようにオリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理すること。 その結果、特異的核酸配列（単数）か、もし存在すれば特異的核酸配列（複数） の増幅が行われる。 ｄ）検出される各配列が、該配列か、その突然変異体とハイブリッド形成を行う ことができるように段階Ｃの産物に標識オリゴヌクレオチドプローブを加えるこ と；そして ｅ）該ハイブリッド形成が起ったかどうかを決定すること。42. Samples containing gene sequences specific for AR or TR2 or the following steps: Methods for quantitative or qualitative detection of sequences present in: (a) Each oligonucleotide primer hybridizes to For each strand of the sequence, each platinum that is complementary to each strand of nucleic acid The sample is run in each step for the specific sequence under conditions such that an extension product of the imer is synthesized. Treating with one oligonucleotide for the trand. In that case , the primer or primer is an extension product synthesized from one primer. When a substance separates from its complement, due to the synthesis of the extension product of the other primer form a hybrid with it so that it can serve as a template for It is chosen to be fully complementary to each strand of each specific sequence. b) If the sequence or the sequence to be detected exists, add the primer extension product to it. treating the sample under denaturing conditions in order to separate it from these templates; c) Primer extension products use each of the single strands produced in step (b). Treating the sample with oligonucleotide primers to be synthesized using As a result, the specific nucleic acid sequence(s) or, if present, the specific nucleic acid sequence(s). is amplified. d) each sequence detected hybridizes with the sequence or a mutant thereof; Adding a labeled oligonucleotide probe to the product of Step C so that and; and e) determining whether said hybridization has occurred.