JPS63502397A - ステロイドレセプタ−タンパクの真核細胞における発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７、＠乳類細胞である。請求の範囲第６項に記載の宿主細胞。

８、を推動物の組換えＳＲを生産する方法であって、請求の範囲第６項に記載の 細胞を培養すること、および該′ＳＲタンパクを回収することを包含する。

方法。

９６細胞を破砕し、細胞破片を除去し、そして清澄な溶解物を回収することによ って前記ＳＲが回収される。請求の範囲第８項に記載の方法。

１０、請求の範囲第８項に記載の方法によって生産される。

を推動物の組換えステロイドレセプター。

１１、エストロゲンレセプターである。請求の範囲第１０項に記載のＳＲ。

１２、ヒ１−ＥＲである゛、請求の範囲第１１項に記載のＥＲ０明細書 韮」 本発明は１組換え技術を用いた所望のタンパクの生産に関する。特に２本発明は 、真核細胞の宿主、およびこれらの宿主と適合する発現系を用いたステロイドレ セプタータンパクの生産に関する。

宜景且歪 ステロイドホルモンレセプターは、真核細胞における遺伝子発現を制御すること が良く知られている。を椎動物におけるステロイドホルモンの作用は、特異的な 細胞内ステロイドレセプタータンパク（ＳＲ）とゲノムの相互作用を伴い、さら に、ステロイドホルモンおよびＳＲタンパクは、多くの事例において、腫瘍成長 の制御に関係している（Ｌｉｐｐｍａｎｎ、　Ｍ、Ｉｌ’、。

癌：　７および汐７、の　口（レイパン、　ＮＹ　１９７５）　：　Ｌｉｐｐｍ ａｎｎ。

Ｍ、Ｅ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）　２５６　：　５９２）。この相互 作用の本質および結合の位置は不明であるが、ステロイドの結合は、　ＳＲタン パクを、核ＤＮＡに強く結合する形に変換すると考えられている。

ステロイドレセプタータンパク、特にエストロゲンレセプター（ＥＲ）は２組織 に特異的な様式で分布し、このタンパクの発現は１発達段階で制御されている。

数種の起源よりＥＲが精製されており、６５〜７０ｋｄの分子量を有することが 示されている（Ｒｅｄｅｕｉｌｈ、　Ｇ、ら、　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　 （１９８０）　１０６　：　４８１　；Ｌｕｂａｈｎ＋　ｐ、Ｂ、ら、　Ｊ　Ｂ ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８５）　２６０　：　２２１５　；　Ｋａｔｚｅｎｅ ｌｌｅｎ−ｂｏｇｏｎ＋　Ｂ、Ｓ、ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８３ ）　２５８　：　３４８７　；　５ａｋａｉ。

Ｄ、ら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　（１９８４）　１１５　：　２３７９　；　 ｖａ’ｎ　、、０ｏｓｂｅｒｅｅ、　Ｔ、Ｒ。

ら、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８４）　１３６　：　３２１）。さら に、関連するヒトゲルトコルトコイドレセプター（ＧＲ）のｃＤＮＡも調製され ている（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ｍ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５） 　３１８　：　６３５）。

最近、ヒトエストロゲンレセプター（ｈＥＲ）をコードするｃＤＮＡが、ヒト乳 癌細胞系、　ＭＣＦ−７より調製し、ランダムにプライムしたλｇｔｌＯおよび λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーから単離され。

モノクローナル抗ＥＲ抗体、およびＭＣＦ−７ヒトＥＲの２つのペプチド配列に 一致する合成オリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングされた。この仕事は、 　Ｗａｉｔｅｒ、　Ｐ、ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄを１−剋盈Ａ）　 （１９８５）　皿：　７８８９−７８９３に報告されており、参照文献として、 ここに採用する。ｃＤＮＡクローンの中から、オリゴヌクレオチドハイブリダイ ゼーションによって、　２．１ｋｂ　ｃＤＮＡクローンが単離された。該ｃＤＮ Ａは、ＯＲ８と命名され、すべての他のｃＤＮＡとクロスハイブリダイズし、２ つのＥＲペプチドに対して期待される配列を含んでいた。さらに、このｃＤＮＡ は。

６．２ｋｂポリＡ　ＲＮＡと選択的にハイブリダイズし、該ポリＡ　ＲＮＡは　 ３５Ｓ−メチオニンの存在下でインビトロ翻訳すると、少量の免疫反応性の４６ ｋｄタンパクと共に、免疫反応性の６５ｋｄ　ｈＥＲの合成をコードしているこ とが示された。ＯＲ８ｃＤＮＡ挿入断片は、　６５ｋｄタンパクのコード配列全 体を含むのに十分な長さであった。

本発明では、　ＯＲ８ｃＤＮＡクローンを哺乳類宿主細胞に適合する発現系に成 功裏に組み入れ、そして形質転換した哺乳類細胞培養物を用いて２組換えｈＥＲ を生産した。ｈＥＲおよび他のステロイドレセプタータンパクの発現系の有用性 は、大量の精製ステロイドレセプタータンパクを生産する能力を与えることであ り、その真核細胞宿主における生産は、翻訳後のプロセッシングおよび折りたた みを確実にし、天然で生産される細胞内タンパクと非常に類似した材料を再生産 し得る。

文皿夏皿丞 本発明は、ヒトエストロゲンレセプタータンパク（ｈＥＲ）をコードする完全な りＮＡ配列を、推定されるアミノ酸配列とともに与える。この配列情報の有用性 は、グルココルトコイドレセプター、およびｖ−ｅｒｂ−Ａ　（ＡＥＶ）腫瘍遺 伝子生産物のような関連レセプタータンパクとの比較を可能にすることである。

さらに、適当なコード配列を真核宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞で機能する発現 系に組み入れた。これにより、適当なる。そして、一般に作用化合物および拮抗 化合物の設計、ステロイド結合タンパクの作用機構の研究に役立ち、　ＳＲタン パクそれ自身、またはそれに対して生じる抗体の診断検定に用いられる。多くの タンパクが与えられる。

従って、ある局面では２本発明は、真核宿主細胞において。

これらの配列を発現させ得る制御配列に作動可能なように結合した。レセプター タンパクをコードするＤＮＡを含む、を椎動物のステロイドレセプタータンパク の発現系に関する。さらに別の局面では１本発明は９本発明の発現系を含む組換 え宿主真核細胞、これらの細胞を用いてステロイドレセプタータンパクを生産す る方法、およびこのようにして生産された。

これらのステロイドレセプタータンパクに関する。

則ｎη驚肌 第１図は、ヒトエストロゲンレセプタータンパクをコードするｃＤＮＡ配列、お よび推定されるアミノ酸配列を示す。

第２図は、　ｈＥＲ、ヒ）ＧＲ，および推定のＡＥＶ腫瘍遺伝子タンパクに関す るアミノ酸配列の比較を示す。

第３図は、　ＣＨＯＫ−１細胞において、　ＯＲ８ｃＤＮＡにより発現されるヒ トエストロゲンレセプターの沈降分析を示す。

“発現系”とは、連続的に示された構成要素の集合を意味し、特に制御配列、さ らにエンハンサ−に結合したこれらの配列、・あるいは、これらの配列、および 発現に関連する他のＤＮＡ配列を含むベクターに作動可能なように結合したコー ド配列のみを含み得る。

“ヒトメタロチオネイン−■”プロモーター（ｈＭＴ−ＩＩ　）とは、ヒトＭＴ −ｎ遺伝子またはその機能的同等物に由来する制御配列を意味する。この遺伝子 の制御配列は、　Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、ら。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９　：　７９７−８０２によって詳細に述べ られている。

°′チャイニーズハムスター卵巣”（ＣＨＯ”）細胞には、標準細胞系ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１、およびその誘導体だけでなく、同じ組織源から単離されたその近 縁体が含まれる。誘導体は、遺伝的または表現的に元の系とは異なる系の変異体 であるが、意図的または偶然の変異によって得られる。

〜に由来する”とは、それが１例えばＤＮＡまたはタンパク配列に関係する場合 ９構造的に類似している≧とを意味し。

必ずしも物理的な誘導を意味するものではない。

“精製されたパまたは“″純粋の′”とは、それが天然の状態において見い出さ れる通常の共存物質から分離された材料であることを意味する。従って、″純粋 な”ＳＲとは５例えばヒト細胞における。それ自身の環境に通常関係する物質を 含まないＳＲを意味する。もちろん、“°純粋なＳＲは、それと特異的に共存す る物質９例えば糖残基を含む。

“作動可能なように結合した”とは、構成要素が通常の機能を果たすように配置 される近位状態を意味する。従って。

コード配列に作動可能なように結合した制御配列またはプロモーターは、コード 配列の発現を行い得る。

“制御配列”とは、ＤＮＡ配列、または所望のコード配列に正しく結合させた場 合に、このような配列に適合し得る宿主において発現を行゛い得る配列を意味す る。このような制御配列には、プロモーターおよび終止コドンが含まれる。エン ハンサ−のような１発現を行うのに必要であるか、または有用である付加的な因 子もまた同定され得る。ここで用いられているように、“′制御配列”とは、単 に、用いた特定の宿主において発現を行うのに必要とされるあらゆるＤＮＡ配列 を意味する。

“細胞”または“細胞培養”、あるいは“組換え宿主細胞”または“宿主細胞” ′は、その前後関係から明らかなように。

しばしば同意語として用いられる。これらの用語は、直接の対象細胞、およびも ちろん、その子孫細胞をも包含している。

偶然の変異または環境の差によって、必ずしもすべての子孫細胞が親細胞と正確 に同一であるというわけではないことは理解されている。しかしながら、最初に 形質転換した細胞に与えられた特性に関連する特性を、その子孫細胞が保持して いる限り、このように変化した子孫細胞は、これらの用語に包含される。

（以下余白） Ｂ−二１■Ｊオ週 本発明は、天然生産物を模倣することを導く環境条件下におけるステロイドレセ プタータンパクの最初の発現をここに開示する。このような発現を行うために、 所望のを推動物の°ステロイドレセプタータンパクをコードするｃＤＮＡ、ゲノ ムＤＮＡ　。

または他のＤＮＡは２発現のための真核細胞中で作動し得る制御配列の制御下に 置かれる。本発明は、ヒトエストロゲンレセプターに関して、以下に説明する； しかし、詳細に説明されている発現系を包含する本発明の発現系を用いることに より、他のステロイドレセプターが成功裏に生産され得ることが認識される。

天然タンパクの効果的な構造を得るために、生産は真核宿主において行われるの が望ましい。通常の真核宿主は、酵母と哺乳類細胞を包含する。哺乳類細胞に対 する特定の発現系は、以下に説明される；しかし、他の発現系もまた利用でき。

適当なステロイドレセプターをコードする配列の発現を得るために適切な修飾を 施し得る。

真核微生物は、＠乳類培養物に比べるとあまり望ましくないが、宿主として用い られ得る。多くの他の酵母株が一般に利用されるが、サツカロミセス　セレビシ ェ、パン酵母の実験株が最も使われている。例えば、　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　 Ｒ，、Ｍａｔｈ　Ｅｎｚ（１９８３）　１０１：３０７の２μ複製起点を用いる ベクター、あるいは複製起点と適合し得る他の酵母（例えば、　Ｓｔｉｎｃｈｃ ｏｍｂら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）　２８２：３９．　Ｔｓｃｈｅｍｐｅ　 ら、　Ｇｅｎｅ（１９８０）、刊：１５７およびＣ１ａｒｋｅ、　Ｌ、　ら、　 Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ（１９８３）　１０１：３００を参照）が用いられ得る。酵母 ベクターの制御配列は、解糖系酵素合成のためのプロモーターを含む（ｌｅｓｓ ら、　Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｒｅ　（１９６８）　７　：１４９　ＨＨｏ １ｌａｎｄ　ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９７Ｂ）　１７：４９００） ’、、当日亥分野で知られている付加的なプロモーターとしては、３−ホスホグ リセレートキナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、　Ｊ　ＢｉｏｌＣｈ ｅｗ　（１９８０）　２５５　：２０７３）、および他の解糖系酵素のプロモー ターを含む。成長条件によって転写が制御されるという付加的長所を有する他の プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２．イソチトクロームＣ２ 酸性ホスフアターゼ。

窒素代謝にともなう分解酵素、およびマルトースやガラクトースの利用に必要な 酵素のプロモーター領域がある。ターミネータ−配列がコード配列の３゛末端に あることが望ましいということも考えられる。このようなターミネータ−は、酵 母由来の遺伝子中のコード配列に続＜３゛末端非翻訳領域に見い出される。

酵母の形質転換は、　Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ、ら、　Ｊ　Ｂａｃｔ　 （１９７７）１３０　：９４６または、　Ｈｓｉａｏ、　Ｃ，Ｌ、ら、　Ｐｒｏ ｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ）（１９７９）７６　：　３８２９の 方法に従って実施され得る。

しかしながら、＠乳類の宿主細胞での発現が好ましく、このような発現について の一般的な技術は知られている。例えば、　１ｊｘｅｌらの第４，３９９．２１ ６号を参照のこと。これらの系は。

インドロンをスプライスし得るという付加的な長所を存してができる。有用な宿 主細胞系は、　ＶＥＲＯおよび■ｅＬａ細胞、およびチャイニーズハムスター卵 巣（ＣＨＯ）細胞を包含する。このような細胞の発現ベクターは２例えば１通常 使用されるシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）の初期および後期プロモーター （Ｆｉｅｒｓら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）　２７３：１１３）　、あるいは ポリオーマ、アデノウィルス２．ウシパピローマウィルス、またはアビアンサル コーマウィルス由来のプロモーターのような他のウィルスのプロモーターのよう な、＠乳類細胞に適合したプロモーターや制御配列を通常含む。制御可能なプロ モーター１１１１Ｔ　ｌｌ［（Ｋａｒｉｎ。

ｈ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）　２９９ニア９７−８０２）もまた用いら れ得る。“エンハンサ−”領域が最適な発現に重要であるということもまた。今 日明らかであり；これらは一般的に、非コードＤＮＡ領域のプロモーター傾城の 上流側あるいは下流側にみられる配列であり；これらも、以下で説明されている 。必要であれば、複製起点は、ウィルス材料から得られうる。しかし、染色体へ の組み込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製に対する普通の機構である。哺乳類 細胞については、必要に応じてＷｉｇｌｅｒ。

ｈ、ら、釦旦（１９７９）　１６　：　７７７−７８５により改変されたＧｒａ ｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　亘匹圏■（１９７８）５２　：　５４６ のリン酸カルシウム沈澱法が用いられ得る。

真核宿主において所望の発現を行うために、遺伝子配列を適当な制御配列に連結 し、適合し得る宿主細胞へ形質転換し。

そして細胞培養物を適当な条件下で成長させる。制御配列が誘導性のプロモータ ーを含んでいる場合には、適当な誘導条件が供給される。ステロイドレセプター タンパクは細胞内性であるので、シグナル配列を欠き１通常メチオニン開始コド ンが先行する。このコドンを欠き、このタンパクを宿主から分泌させ得る異質の シグナル配列を含む別の構築物も、また構築し得る。例えば、レニン、成長ホル モン、またはインシュリンのような９通常分泌される哺乳動物タンパクからのシ グナル配列が当該分野で知られており、用いられ得る。酵母における発現の場合 には、α因子にともなうシグナル配列のような、酵母のシグナル配列が用いられ 得る。

Ｃ−肌凪比 充分な量の精製ステロイドレセプタータンパクの有用性は。

診断検定、およびステロイドが仲介する代謝を制御する手段を設計する際に有利 なことにある。前者に関しては、ステロイドが調節する代謝の乱れに対する診断 手段として１種々の組織に存在するレセプターのレベルを推定すること、および ステロイド供給の調節による制御に対する種々の腫瘍の感受性を推定すること、 が望まｈる。さらに、ステロイドレセプターに特異的な抗体を生ずることが可能 であり、大量の抗原の利用はそれらの分析を容易にしている。

従って、純粋な組換えヒトエストロゲンレセプターや他のステロイドホルモンレ セプターを得ることを所望することは。

いくつかの面を有する。第１に、この方法を使用して、ミリグラム量の該物質が 得られる。ミリグラムの量はＸ線回折とコンピューター解析による３次元構造研 究のための結晶化を可能にする。これにより分子の形が解り、従ってホルモンの 作用物質および拮抗物質として用い得る物質の適当な形が決まる。作用物質およ び拮抗物質は、ステロイドにより仲介される代謝を調節するのに極めて重要であ り、これらの代謝は生殖機能、炎症応答、血圧、および二次性徴を包含する。ス テロイドに対するいくつかの腫瘍の依存性もまた知られているが、ヒトＥＲ，グ ルココルトコイドレセプター、および推定されるｖ−ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子生産 物との間に部分的な相同性があるという１本発明の開示によって確かなものとさ れる。

ＥＲおよび他のステロイドレセプターは、ＤＮＡとステロイド結合ドメインを有 する。そしてステロイド活性に対する作用物質および拮抗物質は、　ＳＲの特定 の領域と能動的かつ特異的に相互作用する物質の能力を上昇させるために、その ＳＲとの相互作用が３次元構造の形により安定化される物質である。

この錠と鍵の空間配置は２本発明の結晶化したＥＲまたは他のステロイドレセプ ターの表面形状と相補的になるように設計された分子によりもたらされる。“表 面”には、内側に面し得る回旋状部分（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）が含まれ、詳 細には相互作用の正常な部位とこれらの部位で起こる内部構造の両者を含むこと と理解される。さらに、“相補的”とは、“適合する”空間配置に加えて、レセ プターとその表面形状に適合する分子との間の相互作用が吸引的で正であるとい うことを意味すると理解される。これらの相互作用は、水素結合、イオン的。

または疎水的親和力であり得る。拮抗物質および作用物質は。

３次元構造に相補的な修飾ステロイドである。

第２に、３次元構造決定の補助がなくても９本発明の精製レセプターは、評価を 行うための特別な方法として、インビトロで作用物質および拮抗物質をスクリー ニングする試薬として重要なものである。現在利用できる純粋でないレセプター 調製物は、試験結果に対して不純物の影響によるデータの混乱を生ずる。例えば 、ステロイドに対する作用物質または拮抗物質自身であると判明する混入物は、 評価を妨害する。

従って１作用物質および拮抗物質に対する現在のスクリーニング技術の実質的な 改良は、精製されたヒトレセプタータンパクを用いることにより行われる。

さらに、タンパクの遺伝子組換えによる生産のための材料の有用性は９例えば部 位特異的変異によって配列を改変し得るので、リガンド結合特異性のような、生 産物であるレセプターの特性を改変し得る。従って１本発明の組換えベクターは 、加工変換スペクトルに対する一連の改変レセプターを得るための出発材料を提 供する。

最後に１本発明の組換えベクターは、生物試料中のヒトレセプタータンパクに対 する特異的かつ感度の良い診断分析を提供する。このような分析は９例えば、ス テロイド代謝に対する腫瘍の感受性の診断に重要である。精製された組換えヒト レセプターの有用性は、直接イムノアッセイの標準化および校正の材料を提供す る。

Ｄ、ス」１外 次に示すのは１組換えヒトエストロゲンレセプター生産に有効な発現系の構築で ある。この実施例は本発明を限定するために示されるのではない。

災施拠上 ヒトエストロゲンレセプターをコードするｃＤＮＡの特Ｈａｌｔｅｒ、　ｐ、ら （前出）に述べられた方法で得られたＯＲ８ｃＤＮＡをＭ１３　ｍｐ９のＥｃｏ ＲＩ部位にサブクローン化した。そして、　ｃＤＮへの両方向を含むクローンを 単離し、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、　Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　 （ＵＳＡ）　（１９７７）　７４　：　５４６３　；　５ｃｈｒｅｉｒｅｒ、　 Ｐ、Ｈ，ら。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９７９）　１２９　：　１６９の方法により配列決 定した。

得られた配列を第１図に示す。１７８５ヌクレオチドを含むオープンリーディン グフレームは５９５アミノ酸に対応し、そして分子量は６６．２００であると計 算される。精製ｈＥＲからのペプチド配列はこのオーブンリーディングフレーム を通じて見出され、そして、　ＡＴＧ開始コドンの位置が（フレーム内のターミ ネータ−ＴＧＡの下流にある−５４から−５２のヌクレオチドの最初に現れるこ とから）、推定された。推定されたアミノ酸配列と、ヒトグルココルトコイドレ セプター（ＧＲ）およびｖ−ｅｒｂ−Ａ　（ＡＥＶ）腫瘍遺伝子産物の既知配列 とを比較すると、各カルボキシ末端から約３００〜３５０アミノ酸のシスティン 、リジンおよびアルギニンの多い領域に強い相同性が認められた。第２図に示す ように、これらタンパクが対応する種々の領域に高いホモロジーが見出される。

災範■又 光嬰及■檎築 宿主発現ベクターは亜鉛イオンの存在下で誘導的であるメタロチオネイン−■プ ロモーター系（ｈＭｒ−Ｉｆ　）　、　ウィルスエンハンサ−２および約６００ ｂｐのヒ４．ト成長ホルモンの３”非翻訳領域を含む。この発現ベクターは、以 下のように構築されるｐｈＧＨｇ−ＳＶ　（１０）と名付けられたベクターから 、ヒト成長ホルモンコード配列を置換することにより得られる。ｐｈＧＨｇ−３ Ｖ　（９）と呼ばれる他のベクター（これも後述）もまた、用いられ得る。

宿主ベクター配列の原料に用いられるこれらベクターの構築を以下に述べるニ ブ旦至二え二皿死 プラスミドｐＨ５１は、ｈＭＴ−ＩＩ遺伝子の−７６５の紅組■部位から＋７０ 塩基のＢａｍＨＩ切断部位にわたり、　ｐ８４Ｈ（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ。

ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９　：　２９７−３０２）からのｈＭ Ｔ−ＩＩ配列の８４０ｂｐを含む。プラスミドｐ８４ＨをＢａｍＨＩで完全分解 し、エキソヌクレアーゼＢａ１−３１で処理し末端ヌクレオチドを除き、そして 次に旧ｎｄ１１１で分解した。所望の８４０ｂｐのＨｉｎｄＩ［［／平滑末端断 片をｐＵｃ８　（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ら、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９　： 　２５９−２６８）　（ＨｉｎｄＩ［と旧ｎｃＩＩとで分解して開環しである） に連結した。この連結混合物でＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩをＡｍｐ”に形質転 換し、そしてｐ）ＩｓＩと命名した１つの候補のプラスミドを単離し、ジデオキ シ法で配列決定した。ｐＨ５１は都合のよい制限部位を含むポリリンカーの上流 にｈＭＴ−ＩＩ制御配列を含む。

観り星死 ｈＧＨをコードするゲノム配列をｐ２．６−３　（ＤｅＮｏｔｏ　ら、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）　１９　：　３７１９）から、　Ｂ ａｍＨＩ　（第１エキソンの５゛末端で切断する）およびＥｃｏＲＩ　（機能遺 伝子の３′を切断する）で分解し、ポリアクリルアミドゲルで精製することによ り、単離した。単離した断片をＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩで分解したｐＨ５１ に連結し、その連結混合物でＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１をＡｍｐ”に形質転 換した。成功裏に得られた形質転換体を制限分析法でスクリーニングし、そして 、所望のプラスミドを含む株（ｐＭＴ−ｈＧ）Ｉｇと命名された）をさらに増殖 させ、プラスミドＤＮＡを大量に調製した。

、互２カ受拳駈ヨ区処 ＭＴ−ＩＩｎプロモーター作動可能に結合したＳＶ４０エンハンサ−およびｈＧ Ｈの３°非翻訳配列を含む１対の宿主発現ベクターを次のように構築した。つま り、　１１２０ｂｐの５Ｖ４０ＤＮＡ断片をｐＭＴ−ｈＧＨｇ中のＭＴ−Ｉｌプ ロモーター配列の手前のＨｉｎｄｎＩ部位に挿入することにより構築した。この ５Ｖ４０ＯＮＡ断片はＳＶ４０の複製起点にわたっており、そしてヌクレオチド ５１７１からヌクレオチド５２４３　（起点）、ヌクレオチド１０７〜２５０か らの重複７２ｂｐの繰り返し配列を含み、そして後期ウィルスｍＲＮＡの５′末 端を含む起点側のヌクレオチド１０４６まで続く。この旧ｎｄ　ｍ　１１２０ｂ ｐ断片を、　ＳＶ４０　ＤＮＡ　（Ｂｕｃｈｍａｎ＋　Ａ、Ｒ，ら、　ＤＮＡ　 Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　２ｄｅｄ　（Ｊ、　Ｔｏｏｚｅ＋　ｅｄ、）、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　ＮｅｗＹ ｏｒｋ　（１９８１）、　ｐｐ、　７９９−８４１）の旧ｎｄｌ［Ｉ分解で得、 そしてｐＢＲ３２２にクローン化し、増幅した。このクローニングベクターを旧 ｎｄｌｎで切断し、そしてその１１００ｂｐ　ＳＶ４０　ＤＮＡ断片をゲル電気 泳動で単離しｒ　（Ｈｔｎｄｌｌで分解し、　ＣＩＰで処理した）　ｐＭＴ−ｈ ＧＨｇに（１０）と命名する）は、ＭＴ−ｎプロモーターの手前に逆方向に入っ た断片を含む。ｐｈＧＨｇ−ＳＶ　（９）においては、このエンハンサ−は５’ 　ｍＲＮＡ開始部位から約１６００ｂｐにあり；逆向きでは、５′…ＲＮＡ開始 部位から約９８０ｂｐにある。両方向とも作動し得るが。

エンハンサ−配列が開始部位に近接する方向のものがより高い発現レベルを与え る。エンハンサ−を転写開始点の上流２５０〜４ｏｏｂｐに位置させる欠失が好 適であると考えられる。

町又ｊ卦人凶丼ノ、 上記のように調製したｐｈＧＨｇ−５Ｖ（１０）をＢａｍＨＩとＳｍａ　Ｉとで 分解し、　ｈＧＨコード配列を除去した。（ＢａＩＩＩ）ｌ　Ｉはポリリンカー 配列内で開裂させ、ＳｍａｉはｈＧＨの３゛非翻訳領域内で開裂させ、ベクター 断片の約６００ｂｐを残す。）そして、エストロゲンレセプターを含む上記平滑 末端化ＥｃｏＲＩ２．１ｋｂ　ＯＲ８断片と連結した。得られたベクター（ｐｈ ＥＲ−ＳＶ　（１０）と命名する）をＥ、　ｃｏｌｉ　にクローン化し２次いで Ｃｌ０−Ｋｌ　細胞に形質転換し、そして成功裏に形質転換体を単離した。

実見±主 ■換え」旺勿■ 成功裏に得られた形質転換コロニーを、亜鉛を添加したＩＩＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ 　Ｆ−１２培地（Ｈａｍ、　Ｒ，Ｇ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ　Ｓｃｉ 　（ＵＳＡ）　（１９６５）　５３　：　２８８）で単層培養し、それを採取し てＥＤＴＡで放出させ、そして１０ｍＭ　）リス（ｐ’Ｈ７，４）および２０ｍ Ｍモリブテン酸ナトリウムを含む緩衝液中で、ポリトロン破砕器を用いてホモジ ナイズした。ホモジネートを２５０，０ＯＯＸ　ｇにて３０分間遠心分離し、上 清画分を次いで０．５ｎＭエストラジオール（５７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　（２００ 倍過剰の非放射活性対照エストラジオールまたはジエチルスチルベルチロールを 含むもしくは含まない）で４°Ｃにて６０分間標識化した。

別の実験では、標識化抽出液の一蔀（２００ａ　ｌ　）を、ラットモ・ツクロー ナルＥＲ抗体（最終容量２２０７１．ｅ中に１０μｇのＤ７５Ｐ３．。

Ｄ５４７Ｓｐ、　、またはＨ２２２ＳＰ、　）の存在または不在下で４°Ｃにて ６０分間インキヱベートした。

・沈降分析については、標識化抽出液または反応液の２００μ２を、１０ｍＭ） リス、　１０ｍＭモリブテン酸ナトリウム、　１．５ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ７，４および１０ｍＭ　ＫＣＩ　（低塩）または４００ｍＭ　ＫＣＩ　（高 塩）のいずれかで調製した１０−３０％蔗糖直線勾配（３，５ｄ）上に重層１、 、　ソＬＴ　Ｏ’Ｃニア１５時間、　２５３，０ＯＯＸ　ｇ　Ｔ：遠心分離した 。

１００Ｉｌずつの両分を採集し、そして、トリトンχ−１００）ルエンシンチレ ーション混液中で放射活性を３５％の測定効率で測定した。ＩＣ−標識化オボア ルブミン（３，６Ｓ）と″ｃ−標識化１ｇＧ　（７，０５）とを並行した勾配の 沈降マーカーとして用いた。

第３図は沈降分析の結果を示す。パネルＡは、　０．５ｎＭエストラジオー・ル で標識されたｈＥＲ形質転換細胞からの抽出物（三角印）または非形質転換細胞 からの抽出物（丸印）の低塩勾配におけるプロフィールを示す。これらの結果は 、８〜９ｓパネルＢは高塩勾配で得られた。対応するプロフィールを示す。ここ に示されるように、形質転換細胞からのエストラジオール標識化レセプタータン パク（三角印）は、今や４ｓの沈降定数を有する。これにより、　ＥＲの生産が ステロイドレセプターの診断特性と見なし得ることが実証される。このＥＲの生 産は、応答性細胞の低張抽出液中で８〜ＩＯＳの塩感受性ホルモンレセプクー複 合体の形成として示される。

さらにまた、これは第３図により実証される。このホモジネートを０．５ｎＭの 標識化ユ、ストラジオール／１１００ｎ非標識化エストラジオールで標識する（ 黒丸印）と、エストロゲンレセプター複合体が消失した。第３図はまた。該複合 体を抗レセプター抗体０７５Ｐ、とインキュベートすると（白丸印）、沈降が８ ８複合体へ移ることを示す。さらに、エストロゲンレセプター複合体の濃度は、 細胞を集める２４時間前にＩＯＴ’Ｈの亜鉛イオンを培養液に加えると２倍以上 になり、メタロチオネインプロモーターの亜鉛による誘導と一致する（データは 示さない）。前述の沈降特性は、形質転換細胞によるｈＥＲの発現と完全に一致 する。

＋、＋ｄ、　拳　９　！：　當　：＝８２　ｇ　：　：　４　ｍ　二　ｉ η仇−　−一ト　トーＩ＋１　（へ）埴偽　トー稍　門ｉ−ロ場（へ）　（へ） −１＋ｌ　ＦＩＯ噴　−−リ　リｉ萄　輔マロマー　マー　！（へ）　マＮ　Ｗ Ｎ　Ｗ（へ）−国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．脊椎動物のステロイドレセプタータンパクの発現系であって，ＳＲをコード し，真核宿主細胞に適合する制御配列に作動可能なように連結したＤＮＡ配列を 含む，発現系。
2. ２．前記宿主細胞が哺乳類細胞である，請求の範囲第１項に記載の発現系。
3. ３．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である，請求の範囲第２項に記載の発現系。
4. ４．ＳＲがエストロゲンレセプタ−（ＥＲ）である，請求の範囲第１項に記載の 発現系。
5. ５．ＥＲがヒトエストロゲンレセプタ−（ｈＥＲ）である，請求の範囲第４項に 記載の発現系。
6. ６．請求の範囲第１項に記載の発現系を含む，組換え宿主真核細胞。
7. ７．哺乳類細胞である，請求の範囲第６項に記載の宿主細胞。
8. ８．脊椎動物の組換えＳＲを生産する方法であらて，請求の範囲第６項に記載の 細胞を培養すること，および該ＳＲタンパクを回収することを包含する， 方法。
9. ９．細胞を破砕し，細胞破片を除去し，そして清澄な溶解物を回収することによ って前記ＳＲが回収される，請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．請求の範囲第８項に記載の方法によって生産される，脊椎動物の組換えス テロイドレセプター。
11. １１．エストロゲンレセプターである，請求の範囲第１０項に記載のＳＲ。
12. １２．ヒトＥＲである，請求の範囲第１１項に記載のＥＲ。