JPS63500662A - 乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｙ　ウィルスの、　を六　ボ１ベブ　ド　び　、；びに　ウィルス感、　び　の ためのインビトロ誇本発明は乳頭腫ウィルスのＤＮＡ、より特定的にはこれらの 乳頭腫ウィルスから誘導されたプローブ、並びに乳頭腫ウィルスの感染をインビ トロで診断するために該プローブを使用する方法に係る。

「乳頭腫ウィルス」なる用語は、一般に比較的良性の皮膚又は粘膜のいぼから、 上皮内断形成及び皮ｔ４癌に変質し得る過形成までの各段階に存在する数種類の 形態のウィルス性感染の原因であると共通に認識されている多数のウィルスを包 含する。乳頭腫ウィルス感染のうち、より特定的にはいぼ状表皮異形成が特筆さ れ、これを以下の文中ではしばしばＥＶとして表す。

所定数の型の乳頭腫ウィルスが文献中に既に記載されている０本特許請求の範囲 では、いぼ又は散在斑性病変から単離され、多数の罹患患者で皮膚癌を早発させ 得る多数の型及び亜をの新規乳頭腫ウィルスについて記載する。

最近の研究の結果、各種の型のヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）について多数の免 疫因子及び・主要な機能が明らかになっており、これらの因子は、乳頭腫ウィル ス感染病原体における各種の遺伝的因子及び放射線の機能として文献中に既に記 載されているものに加えられる。

本発明は、以下に規定するような本質的ゲノム！ｉｉａを有する新規に単離され た多数の乳頭腫ウィルスの相対的挙動に関して為し得た研究に基づいている。

少数のＥＶの例については既に研究されており、ゲノムの分子クローニングによ り既に６種類の型のＲＰＶが特徴付けられている（ＫＲＥＭＳＤＯＲＦ、　Ｄ、 他、１９８２．　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４３：４３６−４４７及びＫＲＥＭＳＤＯ ＲＦ他、１９８３．　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４８：３４０−３５１）、これらの１ ｆＰＶは、異なる群に属するゲノム間に交差ハイブリダイゼーションが形成され ないかあるいは非常に弱い交差ハイブリダイゼーションが形成されるかに従って ３群に分類されている。第１の群は、所定数のＥＶ罹患患者及び一般集団に観察 される扁平いぼに関連するＨＰＶ３ａ及び１０から成り、ＨＰＶ３ａのＤＮＡ配 列に属するＤＮＡ配列はＥＶ罹患患者の癌に見出だされた。第２の群は、ＨＰＶ ５．８及び１２を含んでおり、ＨＰＶ５及び８のゲノムはＥＶ罹患患者の癌に検 出された。第３の群は、今日までの処ではただ一種類のウィルス１ｌＰＶ９から 構成されている、免疫抑制した腎同種移植片を移植されており、１１ＰＶ５に感 染していることが明白であった者を除き、第２及び第３群のウィルスはＥＶ罹患 患者にしが検出されておらず、これらの患者の大部分は数種類のウィルスに感染 していた。

ここで留忘すべき点として、文献（追って示す参考文献１−５゜８．９，１３， １４，１６．１８−２０）に実際に挙げられている１４種類の型のＲＰＶのうち ４種類の型は、稀な症例であるＥＶに特異的に関連付けられることが分かった。

本発明に至る研究により、多数の新規型及び亜をの乳頭腫ウィルスを単離するこ とができたので、より高度なインビトロ診断法が予想できる。より特定的には本 発明は、例えば病変部又は生検切片から得られた乳頭腫の改良された同定方法を 提供するものであり、より正確な診断を実現することができ、従って、該当病変 に予想される進行に間し°Ｃ改良された予後診断を下゛すことができる。

一般に、乳頭腫ウィルスは非常に多くの種類があるが、７０００〜８０００のオ ーダの塩基対の寸法を有していることが注目される。一方、該ウィルスのゲノム はある程度の相同性を有し得る。以下の記載では、種々の型及び亜をの乳頭■ウ ィルス間の相同百分率を数的に表現するが、この相同百分率は所謂非庶酷もしく は非過酷条件下、又は社酪もしくは過酷条件下で実施されたハイブリダイゼーシ ョン試験の結果として得られた値である。

乳頭腫ウィルスのうち、過酷もしくは厳酷条件下で測定された相同百分率により 特徴付けられる数種類の型の乳頭腫ウィルスについて考察しよう、このような条 件下で５０％未満の相同百分率を有するす乳頭腫ウィルスは、異なる型に属する といえよう、このため、異なる型のウィルス間の相同百分率は過酷もしくは厳酷 条件下ではゼロとさえなることが銘記されよう、この過酷もしくはｉ酷条件で５ ０％を越える相同百分率が観察されるようなウィルスは、同−型に属すると見な され、この同−型のうち“で異なる亜をを形成すると見なされる。

非過酷もしくは非厳酷条件のハイブリダイゼーション試験では、）ＩＥＩＬＭＡ Ｎ　Ｃ，＾、他、１９８０．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　３６，３９５−４０７及 びＣＲＯＩＳＳＡＮＴ他、１９８２．　Ｃ，Ｒ，＾ｃａｄ、　Ｓｃ、　Ｐａｒｉ ｓ、　２９土、５８１−５８６に記載されている条件下でウィルスの２つの単離 体から得られたＤＮＡ　（ヘテロ二重鎖分子）を相互に接触させる。

は、ＫＲＥＭＳＤＯＲＦ　、Ｄ、他（（１９８２）、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４ ３：４３６−４４７及び１９８３、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４８：３４０−３５ １）及ヒＤＡＶＩＳ　ＲＪ、他、１９７１゜Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、　２１．４１３−４２８により記載されている条件下でウィルスの２つの単離 体しがら得られたＤＮＡ（ヘテロ二重鎖分子）を相互に接触させる。

概して、同−型に属する乳頭腫ウィルスは夫々の長さの全体の８０〜１００％に わたってほぼ等しいヌクレオチド配列を有するハイブリダイズ可能な配列を有し ており、これらの相同配列は異なる型の乳頭腫ウィルスでは６０％、即ち同−型 の場合よりも少なくなることが注目されよう、非過酷もしくは非厳酷条件下で相 互にハイブリッド形成する異なる型の乳頭腫ウィルスの配列の同一もしくは相同 度は、同−型に属する乳頭腫ウィルスの場合よりも明らかに小さい。

発明者らが研究を進めた結果、各種の型の乳頭腫ウィルス間の遺伝子異質度は従 来予想されていたよりも大きいこと、同時に各種の型は所定の特異度を有する感 染形又は感染変異体にしばしば関連していることがわがっな。

従って本発明は、予め単離された各種の新規乳頭腫ウィルスから単離され得るＤ ＮＡ及びこれらのＤＮＡの全部又は一部から構成され得るプローブに係るのみな らず、種々の種類の感染、即ち所定の乳頭腫ウィルスを発見された患者の危険の 程度を診断するためにより効果的に使用され得る型の乳頭腫ウィルスの混合物即 ち、「カクテル」にも係る０本明、箱書に記載されている乳頭腫ウィルスプロー ブの個数、場合によっては予め既に単離されている乳頭腫ウィルスのゲノムＤＮ ＾から単能されたプローブ及び所定の混合物に含まれるその配合物を加えた数は 、より高度な診断を可能にし、特に、各種の型の乳頭腫ウィルスに起因するが又 はこれらの型の影響下で発生し得る各種の種類の感染をより十分に識別でき、所 定のある種の感染では、これらの感染が憂慮すべき病気に変質する危険度をより 十分に予後診断することが可能である０例えば本発明の目的は、いぼ状表皮異形 成により現わる感染の場合、これらの感染が皮Ｍ癌に進行する危険度をより十分 に予想することが可能な手段を提供することにある。

−ｉに、以下の説明を簡単にするために、乳頭腫ウィルスの完ゲノムは略称）Ｉ ＰＶ−ＤＮＡで表す。

同様に解り易くするために、以下の説明は既知の乳頭腫１（ＰＶ−ＤＮＡを含む ＩＩＰＶ−ＤＮＡの毒埋的制限地図から成る添付図面を参考にしている。

物理的地図は、各種の制限エンドヌクレアーゼによる切凹部位の位置を示してい る。地図の原点は一般に単一の切長さの百分率で表しである。地図の１単位はゲ ノムの長さの１％を表す。

本発明はまず第一に、より特定的には７０００〜８０００塩基対の間の寸法を有 しており、図面に示したような制限地図により特徴付けられるＤＮＡの集合から 選択されたＨＰＶ−ＤＮＡの各々に係り、これらの図面はより特定的には、乳頭 腫ウィルスから得られ、指体ＨＰＶ−２ｄ、　ｔｌＰＶ−１０ｂ、　ＨＰＶ４４ ａ、　ＨＰＶ−１４ｂ、ＨＰＶ−１５、ＲＰＶ−１７ａ、ＨＰＶ１７ｂ、ＲＰＶ −１９、Ｉ（ＰＶ−２０、）ＩＰＶ−２１、ＲＰＶ−２２、ＨＰＶ−２３、ＨＰ Ｖ−２４、ＨＰＶ−２８、ＨＰＶ−２９、ＲＰＶ−３１及びＨＰ　Ｖ　＝３２、 ＨＰＶ−ＩＦ５及びＨＰＶ−ＩＰ４ニ相当すル１（ＰＶ−ＤＮＡ？、：　１ｍす るものである。

当然のことながら、本発明は上記に列挙したと同−型に属するとみなされ得るＨ ＰＶ−ＤＮＡに対する効果にも及ぶ。

新規に特徴付けられたウィルスのＨＰＶ−ＤＮＡに対応する物理的地図は、黒円 で示しである。

本発明はまた、上記ＲＰＶ−ＤＮＡのフラグメント又は特に過酷条件下でこれら の）ＩＰＶ−ＤＮＡとハイブリダイズ可能なフラグメントにも係る。更に本発明 は、上記ＨＰＶ−ＤＮＡの各々の全部又は一部を含む組換え体ＤＮＡ、より特定 的には夫々遺伝子Ｅ１、Ｅ６−Ｅ７、Ｌｌ及びＬ２に対応するフラグメントある いは上記１１ＰＶ−ＤＮＡの遺伝子開領域に対応する配列を含むＤＮＡに係る。

更に本発明は、これらのＨＰＶ−ＤＮＡから又は対応するフラグメントから構成 され得るプローブ及び該プローブをインビトロで使用する診断法に係る。

ウィルスＤＮＡ調製物は、ＥＶに罹患した６人のヨーロッパ人患者とＥＶにＮ恵 した２人の南米人患者の良性病変の掻去物から選択的に抽出した（ＬＵＴＺＮＥ Ｒ，Ｍ、＾、他、１９８３．　Ｌａｎｃｅｔｉｉ　：４２２−４２４＞、　ＨＰ Ｖ）ＤＮＡＣｉ、塩化セシウム勾配中で平ｔｉｉ心分離により、及び／又は従来 記載されている操作方法（前出のＫＲＥＭＳＤＯＲＦ、　Ｄ、他の論文及び０Ｒ ＴＩ（、Ｇ、他、１９８０．　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｃｏｎ１ 　Ｃｅ’ｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ″７：２５９−２８２）に従って臭 化エチジウムの存在下でショ糖勾配中で沈降させることにより精製した。ＤＮＡ ｍ製物を制限エンドヌクレアーゼで処理し、消化物をアガロースゲルで電気泳動 により分離した（前出のＫＲＥＭ、５ＤＯＲＦ他の論文）、患者の１人の尋常住 イｇｒ　Ｇ、１ｍ　（ｉ　ＨＰＶ５．８及び１２（前出〕ＫＲＥＭＳＤＯＲＦ他 （７）　論文）及び０ＲＴＨ，に、他、１９８０．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　） Ｉａｒｂｏｒ　Ｃｏｎｆ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏ−ｌ１ｆｅｒａｔｉｏｎ″７：　 ２５９−２８２）が検出されたが、これ以外にＤＮＡ制限酵素による主要切断モ デルを提供する菌株として、従、来特徴付けられている型とは異なる１１個の菌 株が同定され５４６）に従って新規ＨＰＶ型に番号を付け、亜をには番号と文字 とを付した。１１種の新規ＨＰＶのゲノムを、大腸菌に１２株Ｃ６００でクロー ニングした（前出ののＫＲＥＭＳＤＯＲＦ、Ｄ、他の論文（１９８３）　）　、 エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより形成されたＨＰＶ２４のＤＮＡの２つのフ ラグメントを除き、ＤＮＡを単位長さの分子として挿入した。　ＤＮＡは、＾ｖ ａｌ、Ｂａｍｔ（Ｉ及びＨｉｎｄｌｌの単一切断部位を使用することによりプラ スミドｐＢ８３２２　（ＳＵＴ−ＣＬＩＦＦＥ、　Ｊ、に、、　１９７８．　Ｎ ｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　５：２７２１−２７２８）に挿入するか 、又はＨＰＶ５のＤＮＡのフラグメントＨｉｎ［［Ｂを組み込んでおり、単一５ ａｅＩ部位と含むｍ換え体プラスミドに挿入した。より特定的には、ＲＰＶの［ ｌＮ＾とＨＰＶ５のＤＮＡのフラグメントＨｉｎｄｌｌ［Ｂを含む組換え体プラ スミドｐＢＲ３２２とをただ一箇所でしか切断しない酵素（Ｓａｃ’Ｉ）で切ｌ ｌ７ｒｆ＆、単位長さノＤＮＡ分子トしテ）ＩＰＶ１７ｂ及び２２を挿入しｆｉ 　、　ＨＰ　Ｖ　１４　ａ　ノＤ　ＮＡは、ゲノムの長さの９６．１及び３．９ ％の２つのフラグメントを形成する酵素であるＨｉｎｄｌでウィルスＤＮＡ調製 物を不完全に消化後、単位長さのＤＮＡ分子としてプラスミドｐＢＲ３２２に挿 入した。（ゲノムの長さの夫々８３．１及び１６．９％に対応する寸法を有する ）ＨＰＶ２４のフラグメントＢａａ＋ｔｌＩΔ及びＢは、プラスミドｐＢＲ３２ ２に別々に挿入した。

単離したクローン及び対応する肝Ｖのソースを下記第１表に示す。

第■表、クローンイ’）ＩＰＶ−Ｄ晶の起・、。

組換え体プラスミドを認識するために、プラスミドにウィルス配列を挿入するた めに使用したエンドヌクレアーゼを含む２種の制限エンドヌクレアーゼの混合物 で処理後、組換え＃　ＤＮＡと非クローン化）ＩＰＶのＤＮＡとの消化物につい て電気泳動による移動度を比較した。単離されたフラグメントの個数及び寸法を 検討した処、いずれの場合もこれらの完全なウィルスゲノムが組み込まれている ことがわかった。

プラスミド配列からクローニングされないもしくは切り出されないＩＩＰＶのＤ ＮＡをアガロースゲルで電気泳動により分析した処、ＤＮＡの寸法は異なってい ることが観察された（データは示さず）、　ＨＰＶ１４ｂ、１９．２０及び２１ のＤＮＡは、ｆｌＰＶ３ａ、５．８及び１２の寸法（約７７００ヌクレオチド対 ）（前出のＫＲＥＭＳＤＯＲＦ　。

Ｄ、の論文）に類似する寸法を有しており、ＨＰＶＩ５．１フａ、１７ｂ、２２ 及び２３のＤＮへの寸法はＨＰＶ９の寸法（約７２００ヌクレオチド対）（前出 のに１（ＥＭＳＤＯＲＦ、Ｄ、、１９８２及び０１’１Ｔｌｌ、　Ｇ、、　１９ ８０の論文）と１４種の制限エンドヌクレアーゼに対するクローン化ウィルスゲ ノムの反応性を分析し、物理的地図に第１図〜第１０図）を作成した。後述する モチーフに関する所定の図面では、所定の１ｌＰＶ、ＤＮＡの制限地図を反復し た。従来記載されている方法（９）に従って！２〜３３の切断部位を位置付けし た。

ＨＰＶ１４ａ及び１４ｂ（第４ａ図及び４ｂ図）並びにＨＰＶ１７ａ及び１７ｂ （第゛　５図）を除いて、これらの地図の間に明白な相同性は検出されなかった 。　ＨＰＶ１４ａのＤＮへの２つのＢａｎ＋Ｈｌ切断部位の一方がＨＰＶ１４ｂ のＤＮＡの単−ＢａｍＨｌ切断部位と整合している場合、夫々ｔｌＰＶ１４ａ及 び１４ｂ、１５に位置付けされた２１〜３１の部位は共通であることが判明した 。同様に、単一〇ａａｌ　ｌ切断部位が相互に整合している場合、ＨＰＶ１７ａ のＤＮＡに配置された２９の切断部位のうち２１の部位は）ｌＰＶ１７ｂのＤＮ Ａにも（２６部位と共に）見出だされた。

、：、　ｉ　ラノ地図と、Ｅｖニ関連ｔ　’）　ＨＰＶ（ｔｉＰＶ３ａ、５．Ｓ 、９．１０及ヒ１２）　（８，９，１６，１８，２０）、皮Ｊｉｉｉ　イ！Ｚ　 ニ関連するＩＩＰＶ（ＨＰＶＩ、２．４及び７）、及び粘膜皮膚又は粘膜の病変 に関するＩＩＰＶ（ＨＰＶ６ｂ。

１１ａ、１３及び１６）　（１，３３，１９）に関して従来作成されている地図 との間に、何ら明白な類似は見出だされなかった。但し［’Ｖ１４ａの地図は、 ＥＶに罹患した１人の日本人患者から単離ら単離した単離体はＢａｍＢ１部位及 び付加的Ｈｉｎｄｌ１部位がＩＩＰＶ１４ａと異なっており、部位＾ｖａｌ　、 　Ｂａａ）ＩＩ　、　Ｂｇｌ　Ｉ　、ＥｃｏＲＩ　。

ＨｉｎｄＩＩ及び旧ｎｄＩｎの位置は２種のウィルス間で類似している。交差ハ イブリダイゼーション実験により、これらの２種のウィルスが非常によく似てい ることを確認した。

所定の部位（矢印で示した部位）は位置付けされていないことが認められる０位 置付けによるゲノムの長さの差が２％未満の切断部位は保存されていると見なさ れる（＊）、ニックを形成しない酵素は１（ＰＶ１４ａ及び２３のＤＮＡではＰ ｖｕ　ｌ　、　Ｓａｌ！及びＳｍａ　１　、　Ｈ１’Ｖ１４ｂのＤＮＡではＰｖ ｕｌ　、　５ａｃｌ　、　Ｓａｔ　Ｉ及びＳ＋ｗａ　ｌ　、ＩＩＰｖ１５．１７ ａ及び１７ｂのＤＮＡではＢｇＩ　Ｉ　、ＰＶＬＩＩ　Ｉ　、５ａｌＩ及びＳ＋ ｎａ　ｌ　、　ＨＩ’Ｖ１９のＤＮＡではＢｇｌ　Ｉ　、Ｓａｃ　Ｉ　、’Ｓａ ｌ　Ｉ及びＳｍａ　Ｉ　、　ＨＰＶ２０のｆｌＮ＾ではＥｃｏＲＩ　、　Ｐｖｕ 　Ｉ　、Ｓａｃ　Ｉ及びＳｅａ　ｌ、ＨＰＶ２１のＤＮＡではＳａｃ　Ｉ及びＳ ｉａ　Ｉ　、　ＨＰＶ２２の［ｌＮ式ではＢａｗｌ　Ｉ、Ｂｇｌ　ｌ　、　Ｐｖ ｕｌ、　Ｐｖｕ■及びＳａｔ　Ｉ　、　ＨＰＶ２４の［ｌＮ式ではＢｇｌ　Ｉ、 ＥｃｏＲＩ　、　ＰｖｕＩ、　Ｓａｃ　Ｉ　、Ｓａｔ　Ｉ及びＳｍａ　ｌであっ た。

新規に特徴付けられたＩＩＰＶのＤＮＡのＩＩＮＡ間相互の配列の相同性の存在 、更にこれらのＤＮＡと、ＥＶに関連するＨＰＶ（ＨＰＶ３ａ。

５．８，９．ＩＯ及び１２）、皮Ｊｉイ４１’に関連すル）ＩＰＶ（ｔ（ＰＶＩ 、２．４及び７）及び粘膜病変に関連すルＨＰＶ（Ｈｒ’Ｖ６ｂ、ｌｌａ、１３ 及び１６）ノＤＮＡトの間の配列の相同性の存在について検討した。Ｆ紙固定に よるハイブリダイゼーション及び飽和液相ＤＮ＾−ＤＮ＾ハイブ験を、上記過酷 もしくは厳酷条件下で実施した（８．９）、特に、Ｉ（ＰＶのＤＮＡをニックト ランスレーションにより標識し、従来記載されているように（１３）、アルカリ ショ糖勾配（５〜２０％）中で沈降により断片化した。標識したＨＰＶのＤＮＡ （４０００ｃｐｗ）を、従来記載されているように（８，９）ウシ胸腺ＤＮ＾（ ２０純）又ハ非標ｗ　ｕｐｖノＤＮＡ（０，２０４）ノ存在下テＮａＣｌ　０． ４８Ｍ−ＥＤＴ＾ＩＩＩＨ（ｐＨ６，８）中テロ８℃でインキュヘ−）　シタ、 ＲＰＶ（７）ＤＮＡのプローブの特異活性は５．３ｘ　１０７〜ｚｘ　１０”ｃ ｐ…／純であった。ヌクレアーゼＳ１耐性フラクシヨンを測定することにより、 ハイブリダイゼーション率を決定した。数値は、１０−ブの自発的自然再生を表 す修正値（４〜１５％）及び相同ハイブリダイゼーションを表す１００％に標準 化した値（７５〜９５％）を表している。略記ＮＤは測定せずという意味である 。

上記条件下におけるＩＩＰＶ−ＤＮＡ間の交差ハイブリダイゼーションの相対的 な大きさは、標識したＩＩＰＶ−ＤＮＡと非標ｍＨＰＶ　［ｌＮ＾との間のハイ ブリダイゼーション（％）で表す。

肝Ｖｌ、２，４，６ｂ、７及びｌｌａのゲノムと新規にクローニングされ３２ｐ で標識したＥＶのＩＩＰＶのＤＮＡとの間、又は非ＷｍＥＶのＩＩＰＶのＤＮＡ と１ＩＰＶ１３．１６及び１８の特異的プローブとの間には交差ハイブリダイゼ ーションが不在又はほぼ不在であることが認められる。同様に、ＨＰＶ１４ａＪ ４ｂ、１５，１７ａ、１７ｂ、１９，２０，２１゜２２．２３及び２４のＤＮＡ とＨＰＶｌａ及びｌｌａのＤＮＡとの間には、飽和再結合による交差ハイブリダ イゼーションは全く又はほぼ認められなかった（第■表）、新規にクローニング された＋１ＰＶのＤＮＡは交差ハイブリダイゼーションを全く又はほぼ示さず、 あるいは相互間及びＥＶに関連する他のＨＰＶ（ＨＰＶ３ａ、５゜８．９．１０ 及び１２）のゲノムとの間に５０％未満の交差ハイブリダイゼーションを示した 。但しＨＰＶ１４ａ及び１４ｂとＨＰＶ１７ａ及び１７ｂは強い交差ハイブリダ イゼーションを示した０以上の結果から、新規ウィルスは９種類の新規型（）Ｉ ＰＶ１４，１５，１７゜１９　’、ｚｏ、ｚｘ　、ｚｚ、ｚｚ及び２４）ト、型 １４（ＨＰＶ１４ａ及びｂ）及び１７（ＩＩＰＶ、１７ａ及びｂ）の２種類の゛ 亜型に分類されることが確認される。

同様に、過酷な分子ハイブリダイゼーション条件下における配列の相同性（又は 相同性の不在）に基づいて各１１ＰＶを群に分類した。これらの群は八〜Ｈの文 字で示し、下記第■表にリストした。この表は、これらのＲＰＶ（単離体又は単 離体の組み合わせ）の保菌者で診断された疾患、及び該保菌者に認識された腫瘍 遺伝子の潜在力を示している。

ＨＰＶ５，８．１２　、１４．１９，２０，２１．２２及ヒ２３ノＤＮＡ１ｉ　 相互間ノ交差ハイブリダイゼーション率（群の相同性）が５〜３８％であり、ゼ ーション（４〜１３％）を示す、従って、これらのウィルスは従来規定されてい るＥＶのＨＰＶｔ１７）群（９）の一部をなす。

同様に、相互間の交差ハイブリダイゼーションが約２０％であり１（ＰＶ９のＤ ＮＡとの間の交差ハイブリダイゼーションが約６％であるＨＰＶ９，１５及び１ ７のＤＮＡは、同様に既に記載されティるＥｖ）ＨＰＶ０群（９）ニ属スル、型 １３及び３１（７）ＩＩＰＶは、同一の群に属すると考えられる。ｆｌＬ後に、 他の肝Ｖのゲノムとの間に相同性をほとんど示さない型１，２，４．２４及び３ ２のＨＰＶは、相互に異なる他の群及・び上記群の第１員を形成すると見なされ る。

本発明は更に、より特定的には上記１１ＰＶ、ＤＮＡに由来するＤＮＡフラグメ ント、及びより特定的には夫々遺伝子Ｅ６−Ｅ７゜Ｅｌ、Ｌｌ、Ｌ２及び゛それ らの遺伝子開領域に対応するＤＮＡフラグメントに係る。原点とみなされる部位 （第１図〜第９図）に対するこれらの各種のフラグメントの位＝及び相対長さを 、下記の第■表に示した。

夙足尺 ＲＰＶのゲノムの物理的地図における主要遺伝子及びｍｔＴｘ子間領域の推定位 ＝付け＋１　Ｐ　Ｖ　１のゲノムにおける遺伝子の位置付けはこのゲノムのヌク レオチド配列から導いた（０．Ｄａ、ｎｏｓ、　Ｍ、Ｋａｎｉｎｋａ及び８゜Ｙ ａｎｉｖの特許）、過酷（Ｔｍ−２９℃）又は非過１（Ｔｏ＋−４０℃）条件で 形成されたヘテロ二重鎖分子の電子顕微鏡分析ｒ＆、、ＨＰＶ３゜５．８，９， １０ａ、１２，１４，１５．１７及び２４のゲノムの物理的地図を、ＨＰＶＩの 物理的地図及び遺伝子地図に対して繋合させ、ＩＩＰＶ３１のゲノムの物理的地 図を、［１ＰＶ６ｂの物理的地図及び遺伝子地図に対して整合させた（Ｅ、Ｓｅ ｈｗａｒｚ他、ＥＭＢＯ，Ｊ、、　１９８３，２゜２３４１−２３４８）。

第■表に示した座標の値は、第１図〜第９図の物理的地図における遺伝子Ｅ６及 びＥ７．Ｅｌ、Ｌ２及びＬｌの相同ゲノムのセグメントの５′及び３°末端、及 びＨＰＶｌａのゲノムに対する遺伝子開領域、又は）ｌＰＶ３１の場合には１Ｉ ＰＶ６ｂのゲノムに対する遺伝子開領域の位置を示している。

非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異なる群に属する型のＲＰＶのゲノム間 、又は過酷ハイブリダイゼーション条件下で同−郡に属する型のＩＩＰＶの大部 分のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子ぽ微鏡分析にした場合、（調 節成分を含む）遺伝子開領域及び隣接遺伝子Ｅ６及びＥ７（腫瘍中に発現される 主要トランスフォーメーション遺伝子に対応すると思われる）は、検出可能な配 列相同性を示さない、非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異なる群に属する 型のＨＰＶのゲノム間、又は過酷ハイブリダイゼーション条件下で同一群に属す る１（ＰＶのゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖を分析した場合、遺伝子Ｅｌ（ 主にウィルスＤＮＡの複製に関与する）及び遺伝子Ｌｌ（ピリオンの主要抗原決 定基を有するウィルスキャプシドの主要タンパクをコードする）は、検出可能な 配列の相同性な示す。

領域Ｅ１及びＬｌを含む組換え体プラスミドがら（Ｉ製されたプローブは、場合 によっては過酷又は非過酷条件下で実施される分子ハイブリダイゼーションの実 験により最大数のＨＰＶ型を検出することが理論的に可能である。遺伝子開領域 及び遺伝子Ｅ６及びＥ７を含む組換え体プラスミドから作製されたプローブは、 所定のＨＰＶ型又は同刹のＨＰＶ型を特異的に検出することが可能である。

領域Ｌ２（ウィルスキャプシドの微量構成成分をコードする）は、異なる型のＨ ＰＶ間で可変のヌクレオチド配列保存率を有する。

以下、ウィルス）ＩＰＶ−ＩＰＺ及びＦＩＰＶ−ＩＦ５を単離した条件、次いで これらのウィルスからＨＰＶ−ＤＮＡを得た条件についてより明確に説明する。

一″′ン　び５４：　’　ル”ノ１ｌＰＶ　ＨＰＶ　ＩＰＺ　ノ’−ローニン　 び、　・（ 非過酷条件下で１ｌＰＶ１６型の特異的放射性プローブを使用するハイブリダイ ゼーションにより、子宮頚部の癌から抽出したＤＮＡには新規型のＨＰｖが露呈 された。過酷ハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを実施した 場合には交差ハイブリダイゼーションは検出できなかった。

数種類の制限酵素に対するこのｌＩｒ’ＶのＤＮＡの反応性を調べたわかった。

腫瘍から抽出したＤＮＡをエンドヌクレチーゼＢｇｌ■で消化後、５ｋｂ（乳頭 腫ウィルスのゲノムの寸法）のＤＮＡ分子を含んでいるフラクションを、ショ糖 勾配中で遠心分離により精製した。　８ｋｂの分子をＢｇｌＩＩ部位で１ラスミ ドＰＬ１５．５から成るベクター（ＢｇｌＩｌ及びＢａｍＨＩによる単一切断部 位を含む）に挿入し、該ベクターはＢａｎ旧部位でλバクテリオファージＬ４７ ，１のＤＮＡに挿入した０組換え体ＤＮＡのキャプシド形成及び宿主細菌（大腸 菌、芋株ＬΔ１０１）への恐染後、非過酷条件下で放射性）ＨＰＶＩ６のＤＮＡ で恣染紹凹培養物のレプリカハイブリダイゼーションを実施した処、岨換え体フ ァージに対応する溶苗プラークが検出された。ウィルス配列全体を含んでいる数 個の組換え体バクテリオファージが単離され、挿入酵素Ｂｇｌｌｌによるファー ジＤＮＡの切断は非過酷条件でＨＰＶ１６プローブとハイブリダイズする８ｋｂ のフラグメントを形成し、酵素ＢｇｌＩ［及びＰｓｔ　ｌの混合物による組換え 体ファージのＤＮＡと元の腫瘍のＤＮＡとの切断は、乳頭腫ウィルスのゲノムの 寸法に等しい総分子量を有する同一の５つのフラグメントを形成する。新規１１ ＰＶのＤＮＡを組換え体バクテリオファージのＤＮＡから切出し、電気溶離によ り精製し、プラスミドＰＬ１５．５内で再クローニングした。１８個の制限エン ドヌクレアーゼに対するこのＤＮＡの反応性に基づいて、ウィルスＤＮＡの制限 地図を作成し、２１個の切断部位を位置付けすることができたく第９図）、こう して作成した地図は今日までに同定されているＨＰＶのゲノムの地図とは異なっ ている。新規）ＩＰＶのＤＮＡと従来同定されているＲＰＶのＤＮＡとの間の配 列の相同性を、過酷条件で実施したレプリカ分子ハイブリダイゼーション実験に より分析した。検出された相同性は常に５％未満であり、最大の相同性はＨＰＶ Ｉ６のゲノムで検出された。子宮２部の癌から特徴付けられた新規ウィルスは、 従って新規型のＨＰＶを構成しており、これをＨＰＶＩＰ２と仮称する。

種々の条件下でＨＰＶＩＰ２のＤＮＡとＩＩＰＶＩのＤＮＡとの間に形成された ヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析した処、これらの２種のゲノムの物理的地 図を整合させることができ、ＨＰＶＩＰ２のＤＮＡがもっている異なる遺伝子の 理論的位置と決定することができた。

このゲノムの地図における主要遺伝子及びＨＰＶ−ＩＦ５の遺伝子開領域の推定 値に付は 末端座標 ５′３′ Ｅ６−Ｅ７　６２　７１．５ Ｅｌ　７１　９５ Ｅ２　９５．５　１］、、５ Ｌ２　１１　３０．５ Ｌｌ　３１．５　．５２ 遺伝子間領域　５２　６３．５ 精製されたＨＰＶＩＰ２のＤＮＡから作製した放射性プローブをることができた 。　ＩＩＰＶＩＰＺのＤＮＡが認識されたのは、１４件の調査対象のうち外部生 殖器官の退形成丘疹の１例、５１件の調査対象のうち２件の子宮頚部の侵入性癌 、及び２８件の調査対象のうちの子宮頚部の上皮的新形成の１例であった。

従って、ＩＰＶＩＰ２は頻度がＨＰＶ１８よりもやや低く且つＨＰＶ１６よりも 著しく低い腫瘍形成潜在力を有する生殖器向性）ＨＰＶ型である。生殖器新形成 、特に子宮頚部癌の発生の危険を孕むＨＰＶ型を診断又は早期発見するためには 、分子プローブの作製に使用される）ＩＰＶのＤＮＡのあらゆる混合物にＩＩＰ ＶＩＰＺを混入させる必要がある。

ノ″″ｉＦ　ｍ”４ｍ　’　ル）ＩＰＶＦＩ　１（ＰＶＩＰ４　ノローニング、 び−Ｊ一番 過酷条件下でＨＰＶ５，８及び１４型の特異的放射性プローブを用いて混合物で 分子ハイブリダイゼーションを実施すると、皮膚前癌性病変である紫外線角化症 の生検から抽出したＤＮＡに新規型）ｆ（ＰＶが露呈されり、１，２，３，７， １０，１３，１６，１８，２８゜ＩＰＩ（ｉｆｆ出〕１ｌＰＶ３１）、ＩＦ５及 びＩＦ５（前出）ＨＰＶ３２）型の特異的７”ローブでハイブリダイゼーション を実施した場合、交差ハイブリダイゼーションは何も見出だされなかった。

数種類の制限配素に対するこの肝ＶのＤＮＡの反応性を調べた処、酵素ＥｃｏＲ ＩはウィルスＤＮＡを一箇所切断することがわかった。生検から抽出されたＤＮ ＡをエンドヌクレアーゼＥｃ。

ＲＩにより消化後、８ｋｂ（乳頭腫ウィルスのゲノムの寸法）のＤＮＡ分子を含 むフラクションを、ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。　８ｋｂの分子を ＥｃｏＲ１部位でバクテリオファージλｇｔ　ｗｅｓ、λＢのＤＮＡに挿入した 。！ｔＱえ体ＤＮＡのキャプシド形成及び宿主細菌（大腸菌、苗株Ｌ＾１０１） への感染後、非過酷条件下でＨＰＶ８及び１４のＤＩＪΔの放射性混合物で感染 細苗培簑物のレプリカハイブリダイゼーションを実施した処、北換え体ファージ に対応する溶面ブラータが検出された。

ウィルス配列全体を含む数ａ顕の組換え体バクテリオファージが単離され、挿入 酵素ＥｃｏＲＩによるファージＤＨへの切断リダイズする８ｋｂのフラグメント を形成し、酵素ＥｃｏＲｌ及びＰｓｔ　Ｉの混合物によるｘＷ　ｆｉＡえ体ファ ージのＤＮＡと元の病変部のＤＮＡとの切断は、乳頭腫ウィルスのゲノムの寸法 に等しい総分子量を有する同一の６個のフラグメントを形成する。新規１１ＰＶ のＤＮ／ｌ’、ｒ組換え体バクテリオファージのＤＮＡから切り出し、電気溶出 により精製し、プラスミド°ｐＳＰ６５内で再クローニングした。１５個の制限 エンドヌクレアーゼに対するこのＤＮへの反応性に基づいて、ウィルスＤＮＡの 側限地図を作成し、こうして２３の切断部位を位置付けすることができた（第１ ０図）、こうして作成した地図は今日までに同定されているＩＩＰＶのゲノムの 地図とは異なっている。過酷条件下で実施されたレプリカ分子ハイブリダイゼー ション実験により、新規ＨＰＶのＤＮＡと今日まで同定されているＨＰＶのＤＮ Ａとの間の配列の相同性を分析した。新規ＲＰＶのＤＮＡといぼ状表皮異形成病 変中に従来同定されている所定の型のＨＰＶ（ＩＩＰＶ５，８，１２，１４，１ ９，２０．２１及び２５）ノＤＮＡ　ト１７）　間Ｃ，ｍ　４ｉ　５０％未満の 相同性が検出されたが、その他の型の肝Ｖとの間には相同性は何も検出されなか った。従って、紫外線角化症から特徴付けられるｇＴ規ウィルスは、ＩＩＰＶ− １１’４と仮称され、　る新規型のＨＰＶを構成する。

精製したＨＰＶＩＰ４のＤＮＡから作製された放射性プローブを使用した処、Ａ 査したいぼ状表皮異形成に罹患した１７人の患者の４２％、及び分析した紫外線 角化症生検のｘ／ｙに■ＰＶＩＰ４を露呈させることができた。　ＨＰＶＩＰ４ は、皮Ｊ２癌のａ発により特徴付けられる疾患であるいぼ状表皮異形成に罹患し た患者に頻度が高く、皮膚の有しＳ［胞癌の前駆体とみなされる紫外線角化症の 病変のフラクションに閏述付けられるので、腫瘍形成潜在力を有する度広向性Ｈ ＰＶ型であると判断できる、皮膚の前癌又は癌の病変の発生の危険を孕むＩＩＰ Ｖ型を診断又は早期発見するためには、分子プローブの作製に使用されるＩＩＰ ＶのＤＮへの全混合物に肝ＶＩＰ４型を混入することが必要である。

本発明はより特定的には、乳頭腫ウィルスの感染の容重の形態の総合的診断を実 施するため、特に感染の可能な進行を予後診断するために組み合わせて使用し得 る各種のＲＰＶ−ＤＮＡの混合物即ち、カフデル（又はこれらの［１ＰＶ−ＤＮ Ａ又はこれらのＤＮＡ配列を含むプローブ）にも係る０本発明の好適な混合物を 下記第Ｖ表に示した。

夏■六 乳頭腫ウィルス感染のウィルス学的診断に使用可能なＨＰＶ−ＤＮＡの混合物の 特徴１）プローブ混合物の構成に含まれる新規ＨＰＶ型は星印で示した。

この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を使用することにより診断さ れ得る疾患の性質も示している。

第１図〜第９図の側限地図の区分は第７表の「構成」の１でに示した区分と一致 していることが銘記されよう、また、このために所定のプローブは各添付図面で 数回縁り返している。

これらの混合物の各々は、本発明の新規プローブの少なくとも１つを含むものと 規定できる。換言するなら、本発明の診断用組成物は、 １）少なくとも１ＩＰＶ２＃）　ＤＮＡ、２）ＨＰＶｌｏｂ、２８及び２９（７ ）　ＤＮＡノ’Ｊ？　す＜　トモ１ｍ、３）ＨＰＶ１７，２４ノＤＮＡノ少なく とも１種、４）ＨＰＶ１４，１５，１７，１９，２０，２１．２２及び２３ノＤ ＮＡノ少なくとし１種、５））ｌＰＶ１５及び１７ノＤＮＡノ少す＜　）ニー　 ６１種、６）ＨＰＶ２４ノＤＮＡ、 ７）肝Ｖ１４，３２ノＤＮＡ、 ８）ＨＰＶ３１のＤＮＡ、 ９）ｌＩＰＶ３２のＤＮＡ を含むものと規定できる。尚、上記９群のり、ＮＡ＋よ相互に異なる全状況で選 択される。

種々のいぼ形態又は他の皮膚もしくは粘膜病変部から単離され得るＩ（ＰＶは非 常に多種に及ぶことを考慮すると、他の肝Ｖ−ＤＮＡも同−型の疾患の発生に関 与し得ると認められるので、表に示した各型の疾患を診断するためには、１種又 は２種より多くのＨＰＶ−ＤＮＡを含む混合物を使用することが好ましい、感染 の性質及び可能な進行の診断は、使用され°るプローブの数が多いほど有効であ る。更に、プローブの各混合物を使用してハイブリダイゼーション試験を実施す ると、忍者が罹忌している病気の性質なより高い確率で二側する鑑別診断が可能 になる。

第７表では、発明者の実験車で単にしたＨＰＶ、−ＤＮＡから形成したプローブ しか示していない、上記に述べた理由により、他の実験室で得られたＩＩＰＶに 由来するＤＮＡも同−型に感染した患者に繰り返して認められるので、各混合物 にこれらのＤＮＡを追加できることは言うまでもない０例えば混合物７には、上 皮内断形成及び皮膚癌に変質する危険を孕むいぼ状表皮異形成に認識される他の 全）ＩＰＶ−ＤＮＡを追加することができる。第Ｖ表中、所定の混合物は診断す べき同一れよう、一方、各混合物は癌化の危険の低い感染と癌化の危険の高いＳ 染とを議別する０例えば、混合物７で診断した患者からのウィルス調製物のハイ ブリダイゼーションは、混合物３でハイブリダイゼーションを形成する場合より も支店癌化の危険が大きいことが立証されよう。

同様に、混合物５により検出されるＥＶは混合物６により検出されるＥＶより癌 化の危険が大きいことがわかる。混合物４は、混合物５により検出されるよりも 危険度の高いＥＶを検出する。

以下、乳頭腫ウィルスの各Ｓ染形態の総合診断を実施するために、場合によって は感染の可能な進行を予後３断するために組み合わせて使用され得る種々の肝Ｖ −ＤＮＡから成る他の混合物即ち、カクテル（又はこれらのＨＰＶ−ＤＮＡを又 は該ＤＮＡの配列を含むプローブ）について更に説明する。

本発明の好適な混合物は、上記第Ｖ表に示した。

この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を使用することにより診断さ れ得る疾患の性質も示している。

もう一度ことわっておくが、この表に示される他の）ＩＰＶ−ＤＮＡの制限ど° 図は第１図〜第９図に含まれている。

）ＩＰＶ−ＩＦ５は生殖器新形成、特に子宮頚部癌の発生の危険を検出するため に使用可能なプローブな特定的に表すとみなされ得ることに留意されたい。

従って、本発明はより特定的には表中「混合物の指称」の（コに１〜１０の番号 を付けた少なくとも１０訂を含む診断用箱又は「キット」にも係る。

以上の説明ではクローニングした完全なＩＩＰＶ−ＤＮＡをプローブとして使用 する場合について特に考察した。もっとも、該ＤＮＡの代わりにこれらの各ＤＮ Ａのクローン化フラグメント、特に遺伝子Ｅ１又はＬｌ及び遺伝子ＥＧ−Ｅ７を 使用してもよい。

ＲＰＶ−ＤＮＡをインビトロで検出する基本原理は、当然過酷又は非過酷条件で 操作されるハイブリダイゼーションを使用するものである０例えば以下に述べる ように操作すればよいが、２叙されている診断試験は当然本発明のプローブ又は プローブ混合物の使用条件を限定するものと見なすことはできない。

クローン化！１ＰＶのＤＮＡの混合物から作製したプローブを使用する試験の目 的は、生検中、病変部の掻去により得られた紺胞中、又はＣａｒｎｏｙ混合物（ エタノール、クロロホルム、酢１７６：３：１）により形成され且つパラフィン に含有される生検の切片中でＨＰＶ　’Ｑ露呈させ且つＨＰＶ型を同定すること である。試験は、既知の原則の方法に従って採取物のＤＮＡを予め抽出する必要 があり、ＩＩＰＶのＤＮＡの混合物から作製した（３２Ｐ又はｚｓ５で標識した ）放射性プローブを使用して、過酷実験によりこのＤＮＡの分析を行う、各試験 では、一般に１０−ブの数種類の混合物を使用する必要がある。

数種類のハイブリダイゼーション法を使用することができる０例えばプロットハ イブリダイゼーション法を使用することができる。この方法は、ＤＮＡの変性後 、膜にトロセルロース又は（：ｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓ）にアリコート量の ＤＮＡを堆積させ、通常条件で各膜をプローブの混合物でハイブリダイゼーショ ンし、膜をＸＢ、写真フィルムと接触させることにより放射性ハイブリッドを検 出することから成る。レプリカハイブリダイゼーション法を使用してもよい、こ の方法は、制限酵グによるＤＮＡの処理後に形成されたＤＮＡのフラグメントを アガロースゲル；気泳動で分にし、アルカリ変性後、膜（ニトロセルロース、に ｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓ）にフラグメンｌ−を移し、これらのフラグメント を通常条件でプローブの各混合物でハイブリダイゼーションすることから成る。

放射性ハイブリッドの形成は、股をＸｆｆ１写真フイルムと接触後に検出される 。

放射性プローブは、「ニックトランスレーション」法により標識した）ＩＰＶの ＤＮＡから構成されるか、例えばＳＦ５型のベクターに挿入されたウィルスＤＮ Ａの転写により作成されたＲＮＡから構成される。放射性プローブを使用すると ５度が大きいという利点があるが、相互に標識された抗体又はそれ自体酵素、蛍 光等のマーカーを有する抗体により認識された抗体により認識され得る例えばビ オチニル化した非放射性プローブを使用する場合はこのような利点は得られない 。

プローブの選択は、採取物の性質に依存する０例えばＥＶに罹患している疑いの ある患者の場合、混合物１，２，３，４，５゜６及び７が使用される。混合物１ 及び２は、ＥＶと皮膚いぼとの間の鑑別診断が可能である。病気に関連する３群 のＨＰＶの各々の最も高頻度で検出された群を含むプローブ３、及びＥＶの癌に 開運する型のＨＰＶのＤＮＡを含むプローブ７は、ＥＶの殆どの症例を診断する ことができ、特に、癌の発生の危険のあるＨＩ’Ｖ型に感染した患者を認識する ことができる。混合物４．５及び６を使用すると、同一患者に感染する）ＨＰＶ 型を確従って、更に本発明は上記に示したような複数のプローブ、即ち 一上記１９種の型及び亜をのＲＰＶ−ＤＮＡの各々の典型、又は１０一ブ混合物 を含む容器もしくは「キット」に係り、これらの「キット」は、患者から得られ たウィルス調製物と各種の群又は混合物との間のハイブリダイゼーションにより 「インビｌ〜ロＪ１７ｒ７Ａ査に使用される。

当然のことながら既に示したように、本発明は特定的に述べた適用例及び実施例 に限定されず、あらゆる変形例を包含し、特に図面に示した制限地図の）ＩＰＶ −ＤＮＡが対応するように請求の範囲の項で所定の数字と共にＤＮＡ−ＲＰＶに 付した参照符号は、これらの請求の範囲が上述の規定に従って同−型に分類され 得るこの特定の肝Ｖ　−Ｄ　Ｎ＾と共通の全Ｈｒ’Ｖ−ＤＮＡ、更に同−亜をに 属するＨＰＶ−ＤＮＡに及ぶことを意味するものと見なされる。　゛ より特定的には、図面に示したＨＰＶ−３２から誘導したＤＮＡは、＾ｖａｌ　 、Ｂａ　Ｉ　Ｉ、Ｂａｍ１ｌＩ、Ｃ１ａｌ、ＥｃｏＲＩ　、Ｈ１ｎｄｌＩＩ、Ｎ ｄｅＩ、Ｎｒｕｌ　、Ｐｖｕｌ、ＰｖｕＩＩ　、５ａｃｌ、５ａｌｌ、Ｓｍａｌ 、ＴＬｈｌｌＩ　、Ｘｍａｌにより切断されていないことも注目される。

以下に示すＭｉ換え体ＤＮＡは、１９８４年１１月３０日付けでＣ，Ｎ、Ｃ。

Ｍ、（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ 　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａ−ｎｉｓｍｅｓ　ｄｅ　ｌ’１ＮｓＴＩＴＵＴ　 ＰＡＳＴＥＵＲｄｅ　Ｐａｒｉｓ）に下記の番号で寄託されている。

ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２ｄ−−−−・＝　−−・＝　Ｎｏ　、　ｌ−３７９ｐ　 Ｂ　Ｒ３２２１’　ＩＩ　Ｐ　Ｖ　１０　ｂΔ−＝−−−−Ｎｏ、　ｌ−３８０ ｐＢＲ３２２／１ｌＰＶ１０ｂ８−−−−−−−−−　Ｎｏ　、　ｌ−３８１ｐ ＢＲ３２２／ＨＰＶ１４ａ−−Ｎｏ、ｌ−３８２ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１４ｂ− −・＝　＝−−Ｎｏ、ｌ−３８３ｐＢＲ３２２／ｌｌｒ’Ｖ１５−−−−−−　 Ｎｏ　、　ｌ−３８４ｐＢＲ３Ｚ２／ＨＰＶ１７ａ−・−・・・・・・・・・・ −Ｎｏ、ｌ−３８５ｐ１１ＰＶ５ＨｉｎｄＸｉｌＢ／ＨＰＶ１７ｂ＝・−・・　 Ｎｏ、ｌ−３８（ｉｐＢＲ３２２／ＨＰＶ１９−−−−−−−−−−　Ｎｏ、ｌ −３８７ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２０−−−−−−　Ｎｏ　、　ｌ−３８８ｐＢＲ ３２２／ＨＰＶ２１．−−・−−−−−−−＝　−−−−−−Ｎｏ、ｌ−３８９ ｐＨＶ５　ＨｉｎｄＩ［［Ｂ／１ＩＰＶ２２−−　Ｎｏ、ｌ−３９０ｐ）３Ｒ３ ２２／［ＩＰＶ２３−−−−−−　Ｎｏ　、　ｌ−３９１ｐ８Ｒ３２２／ＨＩ’ Ｖ２４ａ−−Ｎｏ、！−３９２ｐＢＲ３２２／１（ＰＶ２４１）−−＝　Ｎｏ、 ｌ−３９３ｐＢＲ３２２／ｌｌＪ’Ｖ２８−−−−−−　Ｎｏ　、　Ｉ’−３９ ４ｐＢＲ３２２／ＨＰＶ２９・・・・・・・・・・・・・・・・・・Ｎｏ、ｌ− ３９５ｐＢＲ３２２／１ｌＰＶ３１−−　・＝−−−Ｎｏ、ｌ−３９６ｐＳＰ６ ４／ＨＰＶ３２−−−　Ｎｏ、ｌ−３９７ｐＬ１５５／ＩＰ２・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・　Ｎｏ、Ｔ−４５０ｐＳＰ６５／ｒＰ４・・・・・ ・・・・・・・・・・・旧・・Ｎｏ、ｌ−４４９゜本発明はより特定的には、上 記に言及した異なる乳頭腫ウィルスの遺伝子Ｅ６、Ｅ７及び特にＬ２の発現生成 物に係る。

これらの発現生成物は、所定の生物採取物中の乳頭腫ウィルス又は該ウィルスの 発現生成物を検出するため、及び乳頭腫ウィルスが属する型又は亜をに従って乳 頭腫ウィルスを同定するためにそれ自体使用され得る。これらの発現生成物が得 られる条“件については、特に乳頭腫ウィルス）ＩＰＶの配列し２の発現に関し て以下の記載中に説明するが、同様の方法を利用して他の型の乳頭腫ウィルスに 由来する遺伝子配列Ｌ２（又はＥ６．Ｅ７又はＬｌ）の発現を誘導してもよい。

以下の説明は例外を除き、配列又は遺伝子Ｌ２についてより特定的に述べている が、場合によっては遺伝子Ｌ２の発現生成物に関する教示を他の該当遺伝子の発 現生成物に置き換えてもよい、配列し２の発現生成物は、異なる型の乳頭腫ウィ ルスではなく対応する乳頭■ウィルスにより侵された生物採取物中で遺伝子Ｌ２ の発現生成物を認議し得る抗体をインビボで産生させるために使用できるという 点で特に有利であり、より特定的には、該当する類の調製物が予め固定されてい る場合に特に有利である。以下に述べる本発明の新規実施例は、重度を推定し且 つ採用すべき治療を選択するために、調査された病変物中に存在している；乳頭 腫ウィルスの型を決定することの可能な別個の手段を提供するものである。遺伝 子Ｌ２の各種の型の発現生成物に対して産生される抗体は、ハイブリダイゼーシ ョンプローブに関して先に記載した混合物に対応する混合物に分類され得る。

従って本発明は、複数の異なる抗体を含んでおり且つ新規に単離されたｙ１頭腔 中ィルスの検出、場合によっては同定又は分類の連続試験を実施することが可能 な容器もしくは「キット」も提供する６例えば、本発明の容器もしくはキラＩ〜 は、抗体又は異なる抗体の混合物から構成される複数の試薬、例えば以下のよう に分類される乳頭腫ウィルスの遺伝子Ｌ２の発現生成物に対して形成された抗体 を夫々含む試薬から構成される。

１）少なくともＩ（ＰＶ２ｃｌ、 ２））Ｉｒ’Ｖ１０ｂ、２８及び２９ノ少なくとも１捕、３）ＨＰＶ１７，２４ ノ少なくとも１種、、４）ＨＰＶ１４，１５，１７，１９，２０，２１．２２． ２３及びＩＰ２４ノ少なくとも１種、５）Ｉ（ＰＶ１５及び１７の少なくとも１ 種、’６）ＵＰＶ２４． ７）　１ｌＰＶ１４，３２及びＩＰ４ノ少なくとも１種、８）ＨＰＶ３１． ９）ｌＩＰＶ３２． １０）ＨＰＶ１６，１８及びＩＦ５の少なくとも１揮。

尚、以上１０群の抗体は、１０群の各々が語群を構成している抗体のただ１種に 限定される限り、相互に異なる全状況にあるように選択される。

遺伝子Ｌ２の発現生成物（又は遺伝子Ｌ２の発現生成物の免疫特性を変化させな い追加ポリペプチド、特に安定化ポリペプチドと融合されたこれらの発現生成物 を含む組換え体タンパク）に対して形成された抗体は、罹患した被験者の体内の 乳！１Ｉｒｔ１ウィルスにより誘導された病変部に由来する組蒜病理切片中でウ ィルスを直接検出するために使用可能である。有利には、検出は例えば前出のＣ ＡＲＮＯＹ溶媒もしくは混合物（Ｌ、ＬＩＳＯＮのＶＳｎ旧ｓｔｏｃｂｉｍｉｅ 　ｅＬ　ｃｙＬｏｃｈｉｍｉｅａｎｉｍａｌｅｓ”にも記ｎされている）を使用 して、解離条件下で予め固定された調製物に対して実施される。

場合によっては固定された抗し２抗体は、この抗体に対して形成された別の抗体 により認識され得、これらの別の抗′体は好ましくは非放射性の適当なマーカー を含んでｂ）る。

これらのマーカーは例えば酵素又は蛍光性質を有する。

本発明は当然のことながら、乳頭■ウィルスの遺伝子Ｌ２を発現させるポリペプ チド自体にも係る。これらの発現生成物は上記記載で既にＬ２タンパクと呼称し ている６本発明は更に、このＬ２タンパクがＬ２タンパクの免疫特性な本質的に 変化させないような他のポリペプチド配列と融合されて。

いるポリペプチドにも係る。これらの他のポリペプチドフラグメントの存在は、 殊に遺伝子工学技術を使用する繰作によりこれらのハイブリッドポリペプチドを 得る場合、使用される該ハイブリッドポリペプチドの製造方法に特に起因し得る 。有利には、本発明はβ−ガラクトシダーゼカ）ら誘導された配列を含むハイブ リ・ンドボリペプチドに係る。

このような生成物は、特にラクトースオペロンの全部ス（よ一部により修口され 且つ、所定の型の乳頭腫ウィルレスミ二由来する遺伝子Ｌ２から誘導されたヌク レオチド配列をラクトースオペロンのプロモータ（又は例えばλファージのよう な適当な池の全プロモータ）の下流に挿入させた適当なベクター（ファージ又は プラスミド）で大ＦＡＧ’ｒ形質転換することにより得られる。有利には、ラク トースオペロンのβ−のプラスミド又はファージを使用する。

本発明は異なるポリペプチドの丁にも係り、該ポリペプチドは常に上述のし２タ ンパクの一部のみに夫々対応するが、これらの各群のポリペプチドは該当する類 のＬ２タンパクの特徴的抗原部位を常に含んでいる。

本発明のポリペプチドは、精製した場合、該ポリペプチドに対応する抗体、特に これらのポリペプチドにより感作された動物の血清から得られた抗体の精製技術 で使用することができる。特に、これらのポリペプチドはアフイニテイ力ラムに 固定することができる。抗体の精製操作は、該ポリペプチドを含んでいるアフイ ニテイカラムに抗体を含んでいる血清を接触させることから成る。これらのカラ ムに選択的に固定された抗１体は、次に適当なイオン強度を有する適当な耘笥液 、例えば酢酸アンモニウムのような塩溶液を使用する抗原−抗体複合体解疏によ り回収され得る。また酸性溶液を使用してもよい。

最後に、本発明はこれらの抗ｒｙ、＜又は抗原群）及び抗体（又は抗体群）を使 用する組成物に係る。

特に、本発明は所与の型の疾患にしばしば存在すると見なされる乳頭腫ウィルス の集合から誘導された抗体の１種又は好ましくは「カクテル」を含む群に係る。

該当患者からの組織又は細胞採取物のインビトロ診断試験後に所与の疾患は臨床 診断されている筈であるし、あるいはインビトロ診断の結果、５染乳頭腫ウィル スは上記集合の乳頭腫ライあるから、これらのカクテル（適当な薬学的賦形剤と 共にこれらの抗体又は抗体群、即ち血清混合物又は精製抗体組成物を含む）はこ の場合、この疾患の治療にあたり、患者に特に非経口経路で投与することにより 使用できる。従って、これらの血清は対応する型又は亜をの乳頭腫ウィルスによ り誘導される５染を退行させ一部る。

最後に本発明は、選択された投与方法、特に対応する疾患に罹患している危険の 高い人を保護するために使用可能な非経口経路の投与方法に適合する薬学的に許 容可能な賦形剤と共に、１又は好ましくは数種のし２タンパクを含む対応するワ クチン組成物に係る。

ｆ＆後に、読者が明日Ｓを十分に理解するのに有益と忍われる限りにおいて、従 来技術の状態の説明を必要の範囲内で補う参考文献の論文を参照されたい、従っ て、これらの論文の内容は明細書の一部を形成するものとみなされるべきである 。

さて、所与の乳頭腫ウィルスの遺伝子Ｌ２の読み取り相のフラグメントを利用す るタンパクＬ２（又はこのタンパク質のフラグメント）を産生させるために好適 な方法を、まずにみ取り相のこれらのフラグメントを含むベクター構造に関して 、次に大ＦＡＭＥ中のＬ２タンパク又はこのポリペプチドの発現を誘導し得る条 件に関して工明しよう、また、タンパク又はこのポリペプチドのｆｉＴｆＪ方法 、及びこれらのタンパク又はこのポリペプチドに対する抗体を含む血清の製造に おける該精製方法の使用例についても記載する。

当業者にとっては自明のことであるが、Ｌ２の読み取り相の使用されるフラグメ ントは、使用されるベクターで常に同相で融合させるべきであり、場合によって は安定性を確保し且つこうして形成されるハイブリッドタンパク質のその後の精 製を容易にするタンパク質のコード化遺伝子が使用される。

製造順序は添付した第１１図に示しである。

扛工巳し仏功」屹 １）吐人＠文■［ ＤＮＡの組換え、プラスミドとＤＮＡフラグメントとの形成、新しい末端の形成 、酵素Ｂａ１３１による消化及び細胞のトランスフェクションに関しては、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＥＷ−ＹＯＲＫ、　Ｕ、Ｓ、＾、の著Ｚ”Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｕｅビの”Ｎｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉＢ” の章に記載されているＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、他（１９Ｅ１２）の方法を援用 した。

プラスミドＤＮＡは、大腸菌（細胞Ｃ６００）に含まれるｐＨＰＶｌ、ａ（Ｄａ ｎｏｓ他、１９８２及び１９８２年４月５日付仏国特許出願第８２０５８８７号 ）、細胞ＲＲＴ（ｑｕｅｅｎ、　１９８３）に含有されていたｐｃＱＶ２及び細 胞ＭＣ１０００（Ｃａｓａｄａｂｎｎ、１９８３）に含有されていたｐＭｃ１４ ０３から得た。

構成した遺伝子間プラスミド及びプラスミドｐＨＰＬ２を、大腸菌Ｍ８２９４の 細胞に数回通し、プラスミドｐＨＰＬ２−β−ガラクトシダーゼはβ−ガラクト シダーゼを欠失する細胞ＭＣ１０００に通した。ラクトースを含むｔ４ｅ　Ｃｏ ｎｋｃｙの寒天培地（Ｓｉｌｈａｖｙ他、１９８４．”ＥｘｐｅｒｉｍｅｎＬｓ 　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ”：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒ ｂｏｒ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＥＷ−ＹＯＲＫ）で、菌株Ｌａｃ　”を赤いコロニーの形態で検出した。

次に、１０テアーゼを欠失する菌株１ｏｎ−１ＣＡＧ１１３９（Ｇｒｏ−ｓｓ＋ ｍａｎ他、１９８３．Ｃｅ１１３２．１５１−１５９＞に、プラスミドｐＨＰＬ ２及びｐＨＰＬ２−β−Ｂａｌをトランスフェクトした。

３）、：””　の生成　び岐涜”　のドーシル硫、ナトリウムーボｌア　１ルア ミド　ル　５ＯＳ−ＰＡＧＥ−晩培養後、ｐＨＰＬ２又はｐＨＰＬ２−β−ｇａ ｌｌ１６を含む細胞ＣＡＧ１１３９をＬＢ溶媒で１５〜２０倍に希釈した０次に 光学密度０Ｄ６００が０．５〜０．９に達するまで細胞を３０℃で培養した。

次に、細胞を９０分闇で４１℃にすることによりλ−ＰＲプロモータを押割解除 し゛た。培養物を再び遠心分ス：し、沈降物を収集し、ＳＤ’Ｓ２％、グリセロ ール２６％、２Ｍの２−メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルー０ ．０３％を含有する溶ｊｙＡ６２ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ６，８に懸濁させた。

プラスミドを含んでいない細胞ＣＡＧ１１３９の溶解質を対照として使用した。

１００℃で１０分間処理後、Ｌａｃｍｌｉ（１９７０）、　Ｎａｔｕｒｅ、　２ ２７゜６８０−６８４の技術に従って、試料に対して１０％の５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動と実施した。既知の分子量を有する予め着色したＢＲＬ タンパクに対して同様に電気泳動を実施した。

「アミドブラック」の呼称で知られているｚ色剤で着色することにより、タンパ ク質のバンドを可視化させ、ニトロセルロース膜に移して所謂「ウェスタンブロ ッ１−」（ウェスタン転写）により分析した。

ルオキシダーゼに結合された抗ラット及び抗つサギ免疫グ（：ｅｎ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　６５．１３１９−１３２４に記載されているように、「ウェスタンプロッ ト」による分析を実施した。

５）抗歪ぼとた逝− ゛精製されたＨＰＶｌ、ａのウィルス粒子又は異なる型の乳頭腫ウィルスにより 誘導された病変の切片を使用することにより、従来記載されている免疫拡散、免 疫蛍光及び免疫ペルオキシダーゼ法（Ｏｒｔｂ他、１９８４及びＲｏｓｅｔｔｏ 他、１９８４）を使９１（ＰＬ２−β−ガラクトシダーゼ１１６を含有するＣＡ に１１３９の培養物をＬＤ溶媒で２００倍に＠釈し、Ｄ、０．６００が０．３２ に達するまで培養した０次に培養物を急速に４１℃にし、高温で９０分間培養し た。

細胞沈降物を溶媒Ｔｒｉｓ２０ｍＭ、ｐＨ７，５’、　ＮｇＣＩ２１０ｉＭに再 懸濁させ、超音波で細胞破壊処理した。

Ｕｉｌｒａａｎｎ（１９８４）、　Ｇｅｎｅ２９．２７−３１により記載されて いるように、調製物に可溶性の融合タンパクを、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ− チオガラクトシド（ＴＰＥに）−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラムでアフィニティクロ マトグラフィにより精製した。

上記のように精製した融合タンパクを使用してＨａｒｌｅｙ雌ラットに免疫８作 した。動物には、完全フロインドアジュバント（ＤＩＦＣＯ）の存在下で２〜３ 週間の間隔で異なる部位に約１５０円のタンパク質を３回皮下注射した。３回目 の注射から１週間後に血清を採取した。

乳」 １　Ｌ２怖み　ることのｏ　ｔブースミＬへ１１ 構造は第１図に示した。　Ｌ２読み取り枠をクローニングして大腸菌内で発現さ せた。プラスミドｐＨＰＶ１．ａは、Ｄａｎｏｓ他（ＥＭＢＯＪ、！’、ｐ、２ ３Ｌ−２３６．１９８２）によりプラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位でク ローニングされたＨＰＶｌ、ａの完全なゲノムを含んでいる。ウィルスゲノムの 後朋領域がら読み取り枠を単離するために、プラスミドｐＢＲ３２２内でプラス ミドＩ））ＩＰＶｌ、ａのフラグメントＨｉｎｄｌＩＩ−Ｈｐａｌｌをサブクロ ーニングした。

得られたプラスミドをｐＨＰＬ９とした。領域ｐＢＲ３２２における非本質的な フラグメントＢａａ＋ＨＩ−ｐＶｕｌｌを除去することにより、このプラスミド を短縮した。得られたプラスミドｐＨＰＬ９．３から、５゛末端の３１８対を除 く読み取り枠の１５２６塩基対（ｐ。

ｂ、）を含むフラグメントＸｈｏ　Ｉ［−Ｘｍｎ　Ｉを単菊した。

Ｌ２−３２み取り枠の終止コドンを保存した。

得られたＬ２フラグメント３次に、非本質的なフラグメン１−Ｂａｍ１ｉ１−Ｐ ｖｕｉｌの代わりに、ＣＱＶ２発現ベクター（ｑｕｅｅｎ１９８３）に挿入した 。こうして、Ｌ２読み取り枠は、開始＾ＴＧコドン及びλファージのｃｒｏｍ伝 千の配列５Ｄ（Ｓｈｉｎｅ及びＤａｒｇａｒｎｏ　。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７１．　ｐ、１３４２−１３ ４６．１９７４）に直接隣接しており、λＰＲプロモータの制御下にある。プロ モータは温度に敏感な抑制剤Ｃｌ８５７により調節されるので、Ｌ２の発現生成 物の産生を制御することができる。こうしてＬ２読み取り枠のＣ末端部の１２０ ６塩基対がλファージのｅｒｏの開始＾ＴＧコドンと同相であるようなプラスミ ドｐＩＩ　Ｐ　Ｌ　２が得られた。解・読相については、Ｂａ１ＩＩＨＩ　／Ｂ ｇｌ　ＩＩの交差点における制限部位ＸｂｏＩＩの存在により立証した。

大腸菌内で合成されたＬ２タンパクを安定化させ、該タンのβ−ガラクトシダー ゼと融合したハイブリ・ノドタンノくりと同様に該タンパクを発現させることに 決定した。

このためには、ＢｓｔＥ　Ｉ［部位でプラスミドｐＨＰＬ２を直線状にしてから 酵素Ｂａ１３１で消化させ、１２５，３始コドンを除去した。

、遺伝子Ｌ２と転写及び翻訳信号を供給する配列とを含むこのＤＮＡを、ｒ’ｓ ＬＩによる消化によってＭｌし、フラグメントＰｓＬＩ−Ｓｔｅａｌの代わり° にプラスミドｐＭｃ１４０３（Ｃａｓａｄａｂａｎ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、ｉｎ　ｃｔ＋ｚｙｍｏｌｏｇｙ　１００．ｐ、２９３−３０８ ．１９８３）に挿入した。

ＰＭＣＩ４０３は、プロモータを含まないＩａｃオペロンと、β−ガラクトシダ ーゼの遺伝子の読み取り相の最初の２２　：Ｈ基対とを含んでいる０組換え体を 細胞ＭＣ１００Ｏ，１ａｃ−４こトランスフェクトした。クローン中で高温でβ −ガラクトシダーゼを産生させると、Ｌ２とβ−ガラクトシダーゼと力τ同相で あるようなプラスミドｐＩＩ　Ｐ　Ｌ　２βｇａｌを、Ｍｃ、Ｃｏｎｄｅｙラク トース寒天培地（Ｓｉｌｈａｖｅｚ他、Ｃｏ１ｄ、Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎ、Ｙ、１９８４）で選択することができた。

このような方法に従って選択されたクローンｐＨＰＬ２゜βｇａｌｌ１６を後で 調査した。

ＤＮＡの配列（その結果についてはここでは示さない）を検討した処、Ｌ２読み 取り枠の最後の２個のＣ末端アミノ酸のみがＢａ１３１による消化の過程で失わ れていること、及びＬ２読み取り枠により発現される生成物はプロリンを介して β−ガラクトシダーゼの９番目のアミノ酸に結合されていることがわかった。

プラスミドｐＨＰＬ２は、約５１．２Ｋｄのし２タンパクをコードし。

及び約１６７Ｋｄのハイブリッドタンパク質のｐ　ＩＩ　Ｐ　Ｌ−βｇａｌの容 量を有している。

これらのプラスミドによるタンパク質の産生を検討するために、まずプロテアー ゼを欠失する大ＥｊｉＣＡ（：１１３９１ｏｎ−の菌株にこれらのプラスミドを トランスフェクトした８次に細胞を３０°Ｃ５次に４１°Ｃで培養し、λＩ’Ｒ ブロモークの制御下でクンバク質の産生を誘導した。得られた細菌溶解質に対し て、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動な実施した。

抗ウィルスＨＰＶ１．ａ抗体を使用して所謂「ウェスタンプロ・７ト」法に従っ て分析した処、ウィルスＨＰＶ１．ａと同種のタンパク質が認識された。３０℃ にした培養物の分析結果は、ブーラスミドを含むが又は含まない細胞については 同様であったが、４１℃にした細胞の場合、トランスフエフｌ−した細胞中にタ ンパク質の特異的バンドが示され、≦：ｉ換え体ｐ　１１　Ｐ　Ｌ　２−βｇａ ｌｌ１６でトランスフ三クトした細胞から単離されたタンパク質のうち、融合タ ンパクＬ２β−ガラクトシダーゼ（Ｌ２−βｇａｌ）に対応する約１３６Ｋｄの 期待分子量を有する主要なバンドと、恐らくタンパク分解の結果であると考えら れる約５８Ｋｄの分子ヱの数個の小さいバンドとが単離された。

構造ｐＨＰＬ２については、約７２Ｋｄのタンパク質のバンドが見出だされた。

この分子量は５１．２Ｋｄの予想分子量よりも大きい、この差の意味については 解明の余地がある。

次に、大肌苗中で産生されたクンバク質の抗原性を検討するために、熱誘導培養 株の細口溶解質の生成物Ｌ２−βｇａｌをＴＲＥ（ニー５ＥＰ）ＩＡＲＯＳＥカ ラム（Ｕｌｌｍａｎ、　Ｇｅｎｅ　２９．　ｐ、２７−３１．１９８４＞でアフ ィニティクロマトグラフィによりτ１７裂した。カラムから溶離された夕〉・バ ク質を５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。「アミドブラック」で着色 した処、３個の主要なタンパク質のバンド、即ちＬ２−βｇａｌハイブリッドタ ンパクに対応すると思われる高分子量バンドと、精製したβ−ガラクトシダーゼ と共に移動する第２のバンドと、約６０Ｋｄの分子量を有する第３のバンドとが 認められた。

分子量の小さいこのタンパク質は汚染物に対応し得る。

ＨＰＶｌ、ａ型の特異抗体を使用する「ウェスタンプロット」法による分析の結 果、発現生成物Ｌ２−βＨａｌに対応する高分子量の主要なバンドと、数個の二 次的なバンドとが認められた（第３ｂ図）。

ノー成、Ｌ２−ａｌのへ戸締 融合タンパクの免疫性を試験するために、２匹のラットに溶荒物を注射した。３ 回目の注射後に血清を収集した。

得られた血清を、夫々プラスミドｐＨＰＬ２−βｇａｌｌ１６又はプラスミドｐ 　ＩＩ　Ｐ　Ｌ　２を含む熱誘導培養株の細口溶解質中で「ウェスタンプロット 」分析により、融合タンパクＬ２−βｇａｌ又は生成物Ｌ２と同様に移動するバ ンドと反応さぜな。

２種類の型の細胞溶解質で、血清は対照溶解質ＣＡＧ１１３９にも見出だされる タンパク質（約６０及び５５Ｋｄ）を；２ムした。これらのタンパク質°の少な くとも一種は、融合タンパクＬ２−βｇａ１及びβガラクトシダーゼと同時に生 成されたタンパク質に対応するように思われる。

血清は、解にされたウィルス調製物ＨＰＶ１．ａ（デタージエント処理）及びＨ ＰＶ　Ｉ　、ａにより誘導されたいぼの抽出物中で、約８０Ｋｄのタンパク質を 認識した。

免疫拡散試験において、得られたラット血清は抗原として使用された未処理のウ ィルス粒子肝Ｖ１．ａを沈降させず、従って、免疫トランスファー法で血清によ り認識されるウィルス抗原はピリオンの表面では得られないこと、及び血清は沈 降しないことが更に判明した。

ピリオン及びウィルスポリペプチドの天然高次ｔｇ　Ｗを保存するために知られ ている凍結いぼ切片ＨＰＶ１．ａでは、Ｌ２の発現生成物から得た血清は反応し なかった。この結果から、抗体は配座抗原に向けられていないことがわかる。

血清は、ＢＯＵＩＮ溶媒に固定された）ＩＰＶｌ、ａに５染したｂ：ぼ切片とは ほとんど反応しながった（８釈度１１５０）　、この結果から、ウィルスにＳ染 しており且っＢＯｔｌｌＮ溶媒に固定された切片でより強い抗原−抗体反応を生 じる群の抗原に対して該当型の抗原の特異的′１８徴が確認される。

一方、ＣＡＲＮＯＹ溶媒により切片を観察した処、抗原型及び抗原群のどちらも 正の反応が認められた。特に、切片が試験で使用された抗体の起源である抗原を 提供したと同−型のウィルスを含んでいた場合、ラットの血清は非常に強い抗原 −抗体反応（１／１０００の希釈度）をもたらすことが確認された。これに対し て、被調査血清を別の型に居するウィルスを含む切片と接触させた場合、交差免 疫反応は何も認められなかった。

銘記すべき点どして、抗原に予想される型は、２種の異なる乳頭腫ウィルスのゲ ノムの相互ハイブリダイゼーション能力に関して上述したような型と常に一致し ている必要はない。

’ｉ’Ｌ頭■ウィルスに存在する抗原として特に２種頭、即ち、一完全ビリオン の注入後に得られる抗体を使用することにより、６揮の乳頭腫ウィルス間の交差 抗原反応の不在により特徴付けられる型の抗原、及び 一本質的にピリオン中に３匡蔽されており、解乱されたウィルス粒子の注入後に 抗体により露呈される類の抗原、に区別される。

抗原−抗体反応試験で異なる型に属する乳頭腫ウィルスは、好ましくは夫々の相 同領域を欠＜Ｌ２コード配列が夫々の抗体で抗原−抗体交差反応を生じさせない ポリペプチドをコードするような乳頭腫ウィルスである。

好適な型の抗原は、特に該当するし２領域の長さの１７４にわたってＮ末端領域 を欠く遺伝子Ｌ２の読み取り枠によりコードされた抗原である。

最後に本発明は、異なる型に属するウィルス中で、交差反応を生じないし２領域 によりコードされたポリペプチドの型をめるために実施される試験にも係る。こ れらのポリペプチドは、Ｃａｒｎｏｙ溶媒に固定された組織又は細胞切片に含ま れるウィルスと効果的に反応する抗体を含むが、［ｔｏｕｉｎ溶媒により固定さ れている同一切片とは不十分にしか反応しないかあるいは全く反応しないような ポリペプチドとして規定され得る。

本発明は更に、既知の７Ｌ頭腫ウィルスに対して新規乳頭腫ウィルスを分類する 方法にも係る。この方法は、明５６ｇの一部を特徴とする請求の範囲第８項に規 定されている。

更に、本発明は場合によっては患者の体内に存在している感染ウィルスの型の同 定を含む診断方法にも係り、該方法は、異なる型に属するウィルスに対して予め 得られた抗原を、試験すべき患者からの生物採取物、特に血清と反応させること から成る。

血清採取物とこの同−型に仄する乳頭腫ウィルスからの抗原との間に抗原−抗体 反応が観察されるなら、感染ウィルスは所定の型に属するものと見なされる。こ の診断試験は、例えばＥｌ、ＩＳＳ性法使用することにより実施され得る。

より特定的には、本発明はｆｆｌ！又は流体のようなヒト生物試料、例えば血清 中の感染乳頭腫ウィルスが所与の型の乳頭腫ウィルスに属するか否かを検出する 方法に係る。この方法は、この生物試料を、この型に属するウィルスのゲ対して 予め形成された抗体と接触させることを特徴とし、この接触は免疫反応を可能に する条件下及び時閣内で実施される。抗原−抗体複合体の形成が検出されると、 上記発現生成物の起源である型と同−又は同種の型を有する乳頭腫ウィルスの存 在が証明される。

好ましくは、Ｌ２領域又は対応部分を含むＤＮＡを、細菌例えば大腸菌のような コンピテント細胞宿主内でクローニングした。

有利には、使用されるし２領域部分は型の非特徴的Ｎ末場領域を欠失している遺 伝子Ｌ２の読み取り枠に対応する。好ましくは、このＮ末端領域はこの読み雇り 枠の４分の１に対応する。

より特定的には、本発明は上記し２領域部分（又はＬ２領域全体）を含むＤＮＡ が選択されたコンピテント細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質をコードする 核酸から形成されたハイブリッドＤＮＡであり、上記し２領域が特にインビトロ 再結合により予め取り込まれているようなこの型の検出方法に係る。

例えば細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質は、この細胞宿主が大腸菌である とき、β−ガラクトシダーゼの全部又は一部に対応する。

本発明の検出方法は、好ましくはＣａｒｎｏｙ溶媒中あるいは血清に直接固定さ れ゛たあらゆる≦■蒜切切片適用可能である。

本発明１の方法は生物試ｆ！と、同−型又は同種の型の数個のウィルス、特にＤ ＮＡプローブに対して上述の方法で再編成されたウィルスに由来するし２領域の 発現生成物、又は夫々の対応する部分に対して予め形成された抗体の「カクテル 」と、上記条件で接触させることも含む。

これらの抗体の「カクテル」を使用すると、ＤＮＡプローブに関して使用したと 同様の条件下で、検出された乳頭腫ウィルスの所与の種類への帰属と、患者が罹 ニしているか又は潜在的に危険のある病気とを相関させることができる。

最後に本発明は、上記ハイブリッドポリペプチド及び対応する抗体の各々の製造 方法にも係る。

この方法は、 一該当する乳頭腫ウィルスのゲノムのＬ２領域又は適当なベクター内の対応する 領域部分の、特にインビトロの取り込み、 −こうして修飾されたベクターで受容可能な細胞宿主、即ち上記し２領域又は対 応する部分を発現し得る宿主の形質転換、及び −Ｌ２領域又は対応部分の発現の結果として形成されるポリペプチドの回収、及 び好ましくは分に、から成り、このポリペプチドは上記条件下で乳頭腫ウィルス のタンパク質を検出することの可能な抗体をインビボで産生させることが可能で ある。

本発明は更に、動物、例えばウサギを上記ポリペプチドで５作し、形成された抗 体を回収することを特徴とする抗体の産生方法にも係る。

最後に本発明は、各乳頭腫ウィルスが属することが確認され得る各型に従って該 乳頭腫ウィルスから得られるハイ免孟づＵＩ （１）　Ｄｅｒｓｔ、Ｈ，池、１９８３．　ｒ’ｒｏｃ、ＮａＬｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾、。

８０、３８１２−３８４５゜ （２）　ＣｏＢｉｎ、Ｊ、Ｒ，、Ｊｒ、他、１９７９．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、、　３９．５４５−５４６゜ ４４３７−４４４１゜ （５）　Ｈｅｉｌｍａｎ、Ｃ，八、他、　１９８０．　Ｖｉｒｏｌ、３６．　３ ５９−４０７゜（６）　Ｊａｂｌｏｎｓｋａ、　Ｓ、他、１９７２．　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、、　３２．５８３−５８９゜（７）　Ｊａｂｌｏｎｓｋａ、　Ｓ 、他、１９８２．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　５ｃｍ１ｎ、　Ｉａｍｕｎｏ−ｐａｔｈ ｏｌ、　５．　３３−６２゜ （８）　Ｋｒｅｍｓｄｏｒｆ、　Ｄ、他、１９８２．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４ ３．４３６−４４７゜（９）　Ｋｒｅｍｓｄｏ＋（、Ｄ、他、１９８３．　Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ、　４８．３４０−３５１゜（１０）　Ｌｕｔｚｎｅｒ、Ｍ、八、 他、１９７８．　Ｂｕｌｌ、Ｃａｎｃｅｒ、６５．　１６９−１８２゜ （１１）　Ｌｕｔｚｎｅｒ、Ｍ、八、他、１９８３．Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ、４２ ２−４２４、（１３）　０ｒＬｈ、　Ｇ、他、１９８０．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｃ，ｏｎｆ、Ｃｅ１ｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、７． 　２５９−２８２゜（１４）　０ｒＬｈ、　Ｇ、他、１９８１．　Ｊ、　Ｉｎｖ ｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　７６、９７−１０２゜ （１５）　０ｒｔｈ、Ｃ，他、１９７９．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３９．１ ０７４−１０８２゜（１６）　ＯｓＬｒｏｗ、　Ｒ，Ｓ、他、１９８２．　ｔ’ ｒｏｃ、ＮａＬｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾。

７９．１６３４−１６３８゜ （１７）　Ｏｓｔｒｏｗ、　Ｒ，Ｓ、他、１９３３．　Ａｎｎ、Δｃａｄ、Ｉｌ ｅｒｍａｔｏ１．８゜３９８−４０４゜ （１８）　Ｐｆｉｓｔｅｒ、　Ｈ，他、１９８３．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　 ４３．１４’３６−１４４１゜（１９）　ＰｆｉｓＬｃｒ、　Ｈ，他、１９８３ ．　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４７．３６３−３６６゜（２０）　Ｐｒ１ｓｔｅｒ、　 Ｈ，他、１９８１．　ｆｒｌｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２７．６４５−６５ ０゜ （２１）　Ｒｕｅｄａ、Ｌ、八、他、１９７６、ＭＣｄ、Ｃｕｔ、Ｉ几、八、２ ．　１１３−１３６゜ （２２）　Ｒｕ１ｔｅｒ、　Ｍ、他、Ｊ、　ＩｎｖｅｓＬ、ＤｃｒｍａＬｏｌ、 、　４７．２４７−２５２゜（２３）　５ｕｔｃｌｉｆＩｃ、　Ｊ、Ｇ、、　１ ９７８．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　５゜２７２１−２７２８゜ （２４）　ＴｓｕＩＯｏｒｉ、　Ｔ、’他、１９８３．　Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒ ｏｌ、　６４．９６７−９６９゜■人間６３−５００６６２　（１９） ＨＰＶｊＰ２　ＨＰＶ−ＩＰ＆ 国際ｍ＊報告 １１Ｉｌ′ｔｈ＋′Ａ″”””　”’　ＰＣＴ／ＦＲ８昏１００２８８　２□、 □ｋ　ＰＣＴ／ＦＲ８６１００２８Ｂ　３ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥ ＲＮＡτｌ０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥ？０Ｒ１ＯＮ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．１）少なくともＨＰＶ２ｄ、 ２）ＨＰＶ１０ｂ、２８及び２９の少なくとも１種、３）ＨＰＶ１７、２４の少 なくとも１種、４）ＨＰＶ１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３及 びＩＰ４の少なくとも１種、 ５）ＨＰＶ１５及び１７の少なくとも１種、６）ＨＰＶ２４、 ７）ＨＰＶ１４、３２及びＩＰ４の少なくとも１種、８）ＨＰＶ３１、 ９）ＨＰＶ３２、 １０）ＨＰＶ１６、１８及びＩＰ２の少なくとも１種（但し、これら１０群のポ リペプチドは１０群の各々が各群を構成しているポリペプチドのただ１種に限定 される限り、相互に異なる全状況にあるように選択される）から夫々誘導された 乳頭腫ウイルスの遺伝子Ｅ６、Ｅ７又は好ましくはし２の全部又は一部の発現生 成物に対応するポリペプチド組成物又はポリペプチド群の集合．
2. ２．組成物が夫々藥学的に許容され得る賦形剤をポリペプチドと共に含有してお り、対応する乳頭腫ウイルスに対する予防接種用として組成物の１種又は複数種 を使用することが可能であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の集合。
3. ３．１）少なくともＨＰＶ２ｄ、 ２）ＨＰＶ１０ｈ、２８及び２９の少なくとも１種、３）ＨＰＶ１７、２４の少 なくとも１種、４）ＨＰＶ１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３及 びＩＰ４の少なくとも１種、 ５）ＨＰＶ１５及び１７の少なくとも１種、６）ＨＰＶ２４、 ７）ＨＰＶ１４、３２及びＩＰ４の少なくとも１種、８）ＨＰＶ３１、 ９）ＨＰＶ３２、 １０）ＨＰＶ１６、１８及びＩＰ２の少なくとも１種（但し、これら１０群の抗 体は１０群の各々が各群を構成している抗体のただ１種に限定される限り、相互 に異なる全状況にあるように選択される）から夫々誘導された乳頭腫ウイルスの 遺伝子Ｅ６、Ｅ７又は好ましくはＬ２の全部又は一部の発現生成物に対する抗体 又は抗体群の集合。
4. ４．組成物が夫々薬学的に許容され得る賦形剤を抗体と共に含有しており、対応 する乳頭腫ウイルスを保有する被験者に投与した場合、これらの乳頭腫ウイルス によ誘導される感染を退行させるように、組成物の１種又は数種を使用すること が可能なことを特徴とする請求の範囲第３項に記載の集合体。
5. ５．乳頭腫ウイルスを保菌し得る患者の組織又は細胞採取物中の単離可能な又は 該採取物中に含まれる乳頭腫ウイルスの性質のインビトロ診断方法であって、こ の採取物を請求の範囲第３項に記載の種々の抗体又は抗体群と接触させること、 及び採取物に固定されている抗体から乳頭腫ウイルスを検出することを特徴とす る方法。
6. ６．採取物が調製物又は固定組織切片の形態であることを特徴とする請求の範囲 第５項に記載の方法。
7. ７．組織切片がＣａｒｎｏｙ溶媒により固定されていることを特徴とする請求の 範囲第６項に記載の方法。
8. ８．新規に単離された乳頭腫ウイルスの分類方法であって、該乳頭腫ウイルスの ゲノムの非過酷条件下における既知のと 乳頭腫ウイルスの１又は数個のゲノムのＬ２領域とのハイブリダイゼーション、 あるいは場合によっては該新規乳頭腫ウイルスのゲノムの配列決定、従ってＬ２ 遺伝子に対応する読み取り枠の標識後、ゲノムから予め切り出されたこのＬ２遺 伝子の全部又は一部を構成しているフラグメントと適当なベクターとの組換え体 を形成させ、次に適当な細胞宿主又は微生物、特に大腸菌中にフラグメントの発 現を誘導し、次に場合によっては得られた発現生成物に対する抗体をインビボで 生成し、新規に単離された乳頭腫ウイルスのＬ２遺伝子の発現生成物もしくは対 応する抗体と、既知の型の乳頭腫ウイルスに対応する抗体もしくは抗原との間で 抗原抗体交差反応試験を実施し、抗原抗体交差反応が陰性の結果をもたらすか又 は陽性の結果をもたらすかに従って、既知の乳頭腫ウイルスから新規に単離され た乳頭腫ウイルス型を識別するか又はしないことを特徴とする方法。