JPS63500662A - 乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物 - Google Patents
乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
y ウィルスの、 を六 ボ1ベブ ド び 、;びに ウィルス感、 び の
ためのインビトロ誇本発明は乳頭腫ウィルスのDNA、より特定的にはこれらの
乳頭腫ウィルスから誘導されたプローブ、並びに乳頭腫ウィルスの感染をインビ
トロで診断するために該プローブを使用する方法に係る。
「乳頭腫ウィルス」なる用語は、一般に比較的良性の皮膚又は粘膜のいぼから、
上皮内断形成及び皮t4癌に変質し得る過形成までの各段階に存在する数種類の
形態のウィルス性感染の原因であると共通に認識されている多数のウィルスを包
含する。乳頭腫ウィルス感染のうち、より特定的にはいぼ状表皮異形成が特筆さ
れ、これを以下の文中ではしばしばEVとして表す。
所定数の型の乳頭腫ウィルスが文献中に既に記載されている0本特許請求の範囲
では、いぼ又は散在斑性病変から単離され、多数の罹患患者で皮膚癌を早発させ
得る多数の型及び亜をの新規乳頭腫ウィルスについて記載する。
最近の研究の結果、各種の型のヒト乳頭腫ウィルス(HPV)について多数の免
疫因子及び・主要な機能が明らかになっており、これらの因子は、乳頭腫ウィル
ス感染病原体における各種の遺伝的因子及び放射線の機能として文献中に既に記
載されているものに加えられる。
本発明は、以下に規定するような本質的ゲノム!iiaを有する新規に単離され
た多数の乳頭腫ウィルスの相対的挙動に関して為し得た研究に基づいている。
少数のEVの例については既に研究されており、ゲノムの分子クローニングによ
り既に6種類の型のRPVが特徴付けられている(KREMSDORF、 D、
他、1982. J、Virol、 43:436−447及びKREMSDO
RF他、1983. J、Virol、 48:340−351)、これらの1
fPVは、異なる群に属するゲノム間に交差ハイブリダイゼーションが形成され
ないかあるいは非常に弱い交差ハイブリダイゼーションが形成されるかに従って
3群に分類されている。第1の群は、所定数のEV罹患患者及び一般集団に観察
される扁平いぼに関連するHPV3a及び10から成り、HPV3aのDNA配
列に属するDNA配列はEV罹患患者の癌に見出だされた。第2の群は、HPV
5.8及び12を含んでおり、HPV5及び8のゲノムはEV罹患患者の癌に検
出された。第3の群は、今日までの処ではただ一種類のウィルス1lPV9から
構成されている、免疫抑制した腎同種移植片を移植されており、11PV5に感
染していることが明白であった者を除き、第2及び第3群のウィルスはEV罹患
患者にしが検出されておらず、これらの患者の大部分は数種類のウィルスに感染
していた。
ここで留忘すべき点として、文献(追って示す参考文献1−5゜8.9,13,
14,16.18−20)に実際に挙げられている14種類の型のRPVのうち
4種類の型は、稀な症例であるEVに特異的に関連付けられることが分かった。
本発明に至る研究により、多数の新規型及び亜をの乳頭腫ウィルスを単離するこ
とができたので、より高度なインビトロ診断法が予想できる。より特定的には本
発明は、例えば病変部又は生検切片から得られた乳頭腫の改良された同定方法を
提供するものであり、より正確な診断を実現することができ、従って、該当病変
に予想される進行に間し°C改良された予後診断を下゛すことができる。
一般に、乳頭腫ウィルスは非常に多くの種類があるが、7000〜8000のオ
ーダの塩基対の寸法を有していることが注目される。一方、該ウィルスのゲノム
はある程度の相同性を有し得る。以下の記載では、種々の型及び亜をの乳頭■ウ
ィルス間の相同百分率を数的に表現するが、この相同百分率は所謂非庶酷もしく
は非過酷条件下、又は社酪もしくは過酷条件下で実施されたハイブリダイゼーシ
ョン試験の結果として得られた値である。
乳頭腫ウィルスのうち、過酷もしくは厳酷条件下で測定された相同百分率により
特徴付けられる数種類の型の乳頭腫ウィルスについて考察しよう、このような条
件下で50%未満の相同百分率を有するす乳頭腫ウィルスは、異なる型に属する
といえよう、このため、異なる型のウィルス間の相同百分率は過酷もしくは厳酷
条件下ではゼロとさえなることが銘記されよう、この過酷もしくはi酷条件で5
0%を越える相同百分率が観察されるようなウィルスは、同−型に属すると見な
され、この同−型のうち“で異なる亜をを形成すると見なされる。
非過酷もしくは非厳酷条件のハイブリダイゼーション試験では、)IEILMA
N C,^、他、1980. J、 Virol、、 36,395−407及
びCROISSANT他、1982. C,R,^cad、 Sc、 Pari
s、 29土、581−586に記載されている条件下でウィルスの2つの単離
体から得られたDNA (ヘテロ二重鎖分子)を相互に接触させる。
は、KREMSDORF 、D、他((1982)、 J、 Virol、 4
3:436−447及び1983、 J、 Virol、 48:340−35
1)及ヒDAVIS RJ、他、1971゜Methods Enzymol、
、 21.413−428により記載されている条件下でウィルスの2つの単離
体しがら得られたDNA(ヘテロ二重鎖分子)を相互に接触させる。
概して、同−型に属する乳頭腫ウィルスは夫々の長さの全体の80〜100%に
わたってほぼ等しいヌクレオチド配列を有するハイブリダイズ可能な配列を有し
ており、これらの相同配列は異なる型の乳頭腫ウィルスでは60%、即ち同−型
の場合よりも少なくなることが注目されよう、非過酷もしくは非厳酷条件下で相
互にハイブリッド形成する異なる型の乳頭腫ウィルスの配列の同一もしくは相同
度は、同−型に属する乳頭腫ウィルスの場合よりも明らかに小さい。
発明者らが研究を進めた結果、各種の型の乳頭腫ウィルス間の遺伝子異質度は従
来予想されていたよりも大きいこと、同時に各種の型は所定の特異度を有する感
染形又は感染変異体にしばしば関連していることがわがっな。
従って本発明は、予め単離された各種の新規乳頭腫ウィルスから単離され得るD
NA及びこれらのDNAの全部又は一部から構成され得るプローブに係るのみな
らず、種々の種類の感染、即ち所定の乳頭腫ウィルスを発見された患者の危険の
程度を診断するためにより効果的に使用され得る型の乳頭腫ウィルスの混合物即
ち、「カクテル」にも係る0本明、箱書に記載されている乳頭腫ウィルスプロー
ブの個数、場合によっては予め既に単離されている乳頭腫ウィルスのゲノムDN
^から単能されたプローブ及び所定の混合物に含まれるその配合物を加えた数は
、より高度な診断を可能にし、特に、各種の型の乳頭腫ウィルスに起因するが又
はこれらの型の影響下で発生し得る各種の種類の感染をより十分に識別でき、所
定のある種の感染では、これらの感染が憂慮すべき病気に変質する危険度をより
十分に予後診断することが可能である0例えば本発明の目的は、いぼ状表皮異形
成により現わる感染の場合、これらの感染が皮M癌に進行する危険度をより十分
に予想することが可能な手段を提供することにある。
−iに、以下の説明を簡単にするために、乳頭腫ウィルスの完ゲノムは略称)I
PV−DNAで表す。
同様に解り易くするために、以下の説明は既知の乳頭腫1(PV−DNAを含む
IIPV−DNAの毒埋的制限地図から成る添付図面を参考にしている。
物理的地図は、各種の制限エンドヌクレアーゼによる切凹部位の位置を示してい
る。地図の原点は一般に単一の切長さの百分率で表しである。地図の1単位はゲ
ノムの長さの1%を表す。
本発明はまず第一に、より特定的には7000〜8000塩基対の間の寸法を有
しており、図面に示したような制限地図により特徴付けられるDNAの集合から
選択されたHPV−DNAの各々に係り、これらの図面はより特定的には、乳頭
腫ウィルスから得られ、指体HPV−2d、 tlPV−10b、 HPV44
a、 HPV−14b、HPV−15、RPV−17a、HPV17b、RPV
−19、I(PV−20、)IPV−21、RPV−22、HPV−23、HP
V−24、HPV−28、HPV−29、RPV−31及びHP V =32、
HPV−IF5及びHPV−IP4ニ相当すル1(PV−DNA?、: 1mす
るものである。
当然のことながら、本発明は上記に列挙したと同−型に属するとみなされ得るH
PV−DNAに対する効果にも及ぶ。
新規に特徴付けられたウィルスのHPV−DNAに対応する物理的地図は、黒円
で示しである。
本発明はまた、上記RPV−DNAのフラグメント又は特に過酷条件下でこれら
の)IPV−DNAとハイブリダイズ可能なフラグメントにも係る。更に本発明
は、上記HPV−DNAの各々の全部又は一部を含む組換え体DNA、より特定
的には夫々遺伝子E1、E6−E7、Ll及びL2に対応するフラグメントある
いは上記11PV−DNAの遺伝子開領域に対応する配列を含むDNAに係る。
更に本発明は、これらのHPV−DNAから又は対応するフラグメントから構成
され得るプローブ及び該プローブをインビトロで使用する診断法に係る。
ウィルスDNA調製物は、EVに罹患した6人のヨーロッパ人患者とEVにN恵
した2人の南米人患者の良性病変の掻去物から選択的に抽出した(LUTZNE
R,M、^、他、1983. Lancetii :422−424>、 HP
V)DNACi、塩化セシウム勾配中で平tii心分離により、及び/又は従来
記載されている操作方法(前出のKREMSDORF、 D、他の論文及び0R
TI(、G、他、1980. ColdSpring Harbor Con1
Ce’ll Proliferation″7:259−282)に従って臭
化エチジウムの存在下でショ糖勾配中で沈降させることにより精製した。DNA
m製物を制限エンドヌクレアーゼで処理し、消化物をアガロースゲルで電気泳動
により分離した(前出のKREM、5DORF他の論文)、患者の1人の尋常住
イgr G、1m (i HPV5.8及び12(前出〕KREMSDORF他
(7) 論文)及び0RTH,に、他、1980.Co1d Spring )
Iarbor Conf、 Ce1l Pro−l1feration″7:
259−282)が検出されたが、これ以外にDNA制限酵素による主要切断モ
デルを提供する菌株として、従、来特徴付けられている型とは異なる11個の菌
株が同定され546)に従って新規HPV型に番号を付け、亜をには番号と文字
とを付した。11種の新規HPVのゲノムを、大腸菌に12株C600でクロー
ニングした(前出ののKREMSDORF、D、他の論文(1983) ) 、
エンドヌクレアーゼBamHIにより形成されたHPV24のDNAの2つのフ
ラグメントを除き、DNAを単位長さの分子として挿入した。 DNAは、^v
al、Bamt(I及びHindllの単一切断部位を使用することによりプラ
スミドpB8322 (SUT−CLIFFE、 J、に、、 1978. N
ueleie Ac1ds Res、 5:2721−2728)に挿入するか
、又はHPV5のDNAのフラグメントHin[[Bを組み込んでおり、単一5
aeI部位と含むm換え体プラスミドに挿入した。より特定的には、RPVの[
lN^とHPV5のDNAのフラグメントHindll[Bを含む組換え体プラ
スミドpBR322とをただ一箇所でしか切断しない酵素(Sac’I)で切l
l7rf&、単位長さノDNA分子トしテ)IPV17b及び22を挿入しfi
、 HP V 14 a ノD NAは、ゲノムの長さの96.1及び3.9
%の2つのフラグメントを形成する酵素であるHindlでウィルスDNA調製
物を不完全に消化後、単位長さのDNA分子としてプラスミドpBR322に挿
入した。(ゲノムの長さの夫々83.1及び16.9%に対応する寸法を有する
)HPV24のフラグメントBaa+tlIΔ及びBは、プラスミドpBR32
2に別々に挿入した。
単離したクローン及び対応する肝Vのソースを下記第1表に示す。
第■表、クローンイ’)IPV−D晶の起・、。
組換え体プラスミドを認識するために、プラスミドにウィルス配列を挿入するた
めに使用したエンドヌクレアーゼを含む2種の制限エンドヌクレアーゼの混合物
で処理後、組換え# DNAと非クローン化)IPVのDNAとの消化物につい
て電気泳動による移動度を比較した。単離されたフラグメントの個数及び寸法を
検討した処、いずれの場合もこれらの完全なウィルスゲノムが組み込まれている
ことがわかった。
プラスミド配列からクローニングされないもしくは切り出されないIIPVのD
NAをアガロースゲルで電気泳動により分析した処、DNAの寸法は異なってい
ることが観察された(データは示さず)、 HPV14b、19.20及び21
のDNAは、flPV3a、5.8及び12の寸法(約7700ヌクレオチド対
)(前出のKREMSDORF 。
D、の論文)に類似する寸法を有しており、HPVI5.1フa、17b、22
及び23のDNへの寸法はHPV9の寸法(約7200ヌクレオチド対)(前出
のに1(EMSDORF、D、、1982及び01’1Tll、 G、、 19
80の論文)と14種の制限エンドヌクレアーゼに対するクローン化ウィルスゲ
ノムの反応性を分析し、物理的地図に第1図〜第10図)を作成した。後述する
モチーフに関する所定の図面では、所定の1lPV、DNAの制限地図を反復し
た。従来記載されている方法(9)に従って!2〜33の切断部位を位置付けし
た。
HPV14a及び14b(第4a図及び4b図)並びにHPV17a及び17b
(第゛ 5図)を除いて、これらの地図の間に明白な相同性は検出されなかった
。 HPV14aのDNへの2つのBan+Hl切断部位の一方がHPV14b
のDNAの単−BamHl切断部位と整合している場合、夫々tlPV14a及
び14b、15に位置付けされた21〜31の部位は共通であることが判明した
。同様に、単一〇aal l切断部位が相互に整合している場合、HPV17a
のDNAに配置された29の切断部位のうち21の部位は)lPV17bのDN
Aにも(26部位と共に)見出だされた。
、:、 i ラノ地図と、Evニ関連t ’) HPV(tiPV3a、5.S
、9.10及ヒ12) (8,9,16,18,20)、皮Jiii イ!Z
ニ関連するIIPV(HPVI、2.4及び7)、及び粘膜皮膚又は粘膜の病変
に関するIIPV(HPV6b。
11a、13及び16) (1,33,19)に関して従来作成されている地図
との間に、何ら明白な類似は見出だされなかった。但し[’V14aの地図は、
EVに罹患した1人の日本人患者から単離ら単離した単離体はBamB1部位及
び付加的Hindl1部位がIIPV14aと異なっており、部位^val 、
Baa)II 、 Bgl I 、EcoRI 。
HindII及び旧ndInの位置は2種のウィルス間で類似している。交差ハ
イブリダイゼーション実験により、これらの2種のウィルスが非常によく似てい
ることを確認した。
所定の部位(矢印で示した部位)は位置付けされていないことが認められる0位
置付けによるゲノムの長さの差が2%未満の切断部位は保存されていると見なさ
れる(*)、ニックを形成しない酵素は1(PV14a及び23のDNAではP
vu l 、 Sal!及びSma 1 、 H1’V14bのDNAではPv
ul 、 5acl 、 Sat I及びS+wa l 、IIPv15.17
a及び17bのDNAではBgI I 、PVLII I 、5alI及びS+
na l 、 HI’V19のDNAではBgl I 、Sac I 、’Sa
l I及びSma I 、 HPV20のflN^ではEcoRI 、 Pvu
I 、Sac I及びSea l、HPV21のDNAではSac I及びS
ia I 、 HPV22の[lN式ではBawl I、Bgl l 、 Pv
ul、 Pvu■及びSat I 、 HPV24の[lN式ではBgl I、
EcoRI 、 PvuI、 Sac I 、Sat I及びSma lであっ
た。
新規に特徴付けられたIIPVのDNAのIINA間相互の配列の相同性の存在
、更にこれらのDNAと、EVに関連するHPV(HPV3a。
5.8,9.IO及び12)、皮Jiイ41’に関連すル)IPV(t(PVI
、2.4及び7)及び粘膜病変に関連すルHPV(Hr’V6b、lla、13
及び16)ノDNAトの間の配列の相同性の存在について検討した。F紙固定に
よるハイブリダイゼーション及び飽和液相DN^−DN^ハイブ験を、上記過酷
もしくは厳酷条件下で実施した(8.9)、特に、I(PVのDNAをニックト
ランスレーションにより標識し、従来記載されているように(13)、アルカリ
ショ糖勾配(5〜20%)中で沈降により断片化した。標識したHPVのDNA
(4000cpw)を、従来記載されているように(8,9)ウシ胸腺DN^(
20純)又ハ非標w upvノDNA(0,204)ノ存在下テNaCl 0.
48M−EDT^IIIH(pH6,8)中テロ8℃でインキュヘ−) シタ、
RPV(7)DNAのプローブの特異活性は5.3x 107〜zx 10”c
p…/純であった。ヌクレアーゼS1耐性フラクシヨンを測定することにより、
ハイブリダイゼーション率を決定した。数値は、10−ブの自発的自然再生を表
す修正値(4〜15%)及び相同ハイブリダイゼーションを表す100%に標準
化した値(75〜95%)を表している。略記NDは測定せずという意味である
。
上記条件下におけるIIPV−DNA間の交差ハイブリダイゼーションの相対的
な大きさは、標識したIIPV−DNAと非標mHPV [lN^との間のハイ
ブリダイゼーション(%)で表す。
肝Vl、2,4,6b、7及びllaのゲノムと新規にクローニングされ32p
で標識したEVのIIPVのDNAとの間、又は非WmEVのIIPVのDNA
と1IPV13.16及び18の特異的プローブとの間には交差ハイブリダイゼ
ーションが不在又はほぼ不在であることが認められる。同様に、HPV14aJ
4b、15,17a、17b、19,20,21゜22.23及び24のDNA
とHPVla及びllaのDNAとの間には、飽和再結合による交差ハイブリダ
イゼーションは全く又はほぼ認められなかった(第■表)、新規にクローニング
された+1PVのDNAは交差ハイブリダイゼーションを全く又はほぼ示さず、
あるいは相互間及びEVに関連する他のHPV(HPV3a、5゜8.9.10
及び12)のゲノムとの間に50%未満の交差ハイブリダイゼーションを示した
。但しHPV14a及び14bとHPV17a及び17bは強い交差ハイブリダ
イゼーションを示した0以上の結果から、新規ウィルスは9種類の新規型()I
PV14,15,17゜19 ’、zo、zx 、zz、zz及び24)ト、型
14(HPV14a及びb)及び17(IIPV、17a及びb)の2種類の゛
亜型に分類されることが確認される。
同様に、過酷な分子ハイブリダイゼーション条件下における配列の相同性(又は
相同性の不在)に基づいて各11PVを群に分類した。これらの群は八〜Hの文
字で示し、下記第■表にリストした。この表は、これらのRPV(単離体又は単
離体の組み合わせ)の保菌者で診断された疾患、及び該保菌者に認識された腫瘍
遺伝子の潜在力を示している。
HPV5,8.12 、14.19,20,21.22及ヒ23ノDNA1i
相互間ノ交差ハイブリダイゼーション率(群の相同性)が5〜38%であり、ゼ
ーション(4〜13%)を示す、従って、これらのウィルスは従来規定されてい
るEVのHPVt17)群(9)の一部をなす。
同様に、相互間の交差ハイブリダイゼーションが約20%であり1(PV9のD
NAとの間の交差ハイブリダイゼーションが約6%であるHPV9,15及び1
7のDNAは、同様に既に記載されティるEv)HPV0群(9)ニ属スル、型
13及び31(7)IIPVは、同一の群に属すると考えられる。flL後に、
他の肝Vのゲノムとの間に相同性をほとんど示さない型1,2,4.24及び3
2のHPVは、相互に異なる他の群及・び上記群の第1員を形成すると見なされ
る。
本発明は更に、より特定的には上記11PV、DNAに由来するDNAフラグメ
ント、及びより特定的には夫々遺伝子E6−E7゜El、Ll、L2及び゛それ
らの遺伝子開領域に対応するDNAフラグメントに係る。原点とみなされる部位
(第1図〜第9図)に対するこれらの各種のフラグメントの位=及び相対長さを
、下記の第■表に示した。
夙足尺
RPVのゲノムの物理的地図における主要遺伝子及びmtTx子間領域の推定位
=付け+1 P V 1のゲノムにおける遺伝子の位置付けはこのゲノムのヌク
レオチド配列から導いた(0.Da、nos、 M、Kaninka及び8゜Y
anivの特許)、過酷(Tm−29℃)又は非過1(To+−40℃)条件で
形成されたヘテロ二重鎖分子の電子顕微鏡分析r&、、HPV3゜5.8,9,
10a、12,14,15.17及び24のゲノムの物理的地図を、HPVIの
物理的地図及び遺伝子地図に対して繋合させ、IIPV31のゲノムの物理的地
図を、[1PV6bの物理的地図及び遺伝子地図に対して整合させた(E、Se
hwarz他、EMBO,J、、 1983,2゜2341−2348)。
第■表に示した座標の値は、第1図〜第9図の物理的地図における遺伝子E6及
びE7.El、L2及びLlの相同ゲノムのセグメントの5′及び3°末端、及
びHPVlaのゲノムに対する遺伝子開領域、又は)lPV31の場合には1I
PV6bのゲノムに対する遺伝子開領域の位置を示している。
非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異なる群に属する型のRPVのゲノム間
、又は過酷ハイブリダイゼーション条件下で同−郡に属する型のIIPVの大部
分のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子ぽ微鏡分析にした場合、(調
節成分を含む)遺伝子開領域及び隣接遺伝子E6及びE7(腫瘍中に発現される
主要トランスフォーメーション遺伝子に対応すると思われる)は、検出可能な配
列相同性を示さない、非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異なる群に属する
型のHPVのゲノム間、又は過酷ハイブリダイゼーション条件下で同一群に属す
る1(PVのゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖を分析した場合、遺伝子El(
主にウィルスDNAの複製に関与する)及び遺伝子Ll(ピリオンの主要抗原決
定基を有するウィルスキャプシドの主要タンパクをコードする)は、検出可能な
配列の相同性な示す。
領域E1及びLlを含む組換え体プラスミドがら(I製されたプローブは、場合
によっては過酷又は非過酷条件下で実施される分子ハイブリダイゼーションの実
験により最大数のHPV型を検出することが理論的に可能である。遺伝子開領域
及び遺伝子E6及びE7を含む組換え体プラスミドから作製されたプローブは、
所定のHPV型又は同刹のHPV型を特異的に検出することが可能である。
領域L2(ウィルスキャプシドの微量構成成分をコードする)は、異なる型のH
PV間で可変のヌクレオチド配列保存率を有する。
以下、ウィルス)IPV−IPZ及びFIPV−IF5を単離した条件、次いで
これらのウィルスからHPV−DNAを得た条件についてより明確に説明する。
一″′ン び54: ’ ル”ノ1lPV HPV IPZ ノ’−ローニン
び、 ・(
非過酷条件下で1lPV16型の特異的放射性プローブを使用するハイブリダイ
ゼーションにより、子宮頚部の癌から抽出したDNAには新規型のHPvが露呈
された。過酷ハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを実施した
場合には交差ハイブリダイゼーションは検出できなかった。
数種類の制限酵素に対するこのlIr’VのDNAの反応性を調べたわかった。
腫瘍から抽出したDNAをエンドヌクレチーゼBgl■で消化後、5kb(乳頭
腫ウィルスのゲノムの寸法)のDNA分子を含んでいるフラクションを、ショ糖
勾配中で遠心分離により精製した。 8kbの分子をBglII部位で1ラスミ
ドPL15.5から成るベクター(BglIl及びBamHIによる単一切断部
位を含む)に挿入し、該ベクターはBan旧部位でλバクテリオファージL47
,1のDNAに挿入した0組換え体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌(大腸
菌、芋株LΔ101)への恐染後、非過酷条件下で放射性)HPVI6のDNA
で恣染紹凹培養物のレプリカハイブリダイゼーションを実施した処、岨換え体フ
ァージに対応する溶苗プラークが検出された。ウィルス配列全体を含んでいる数
個の組換え体バクテリオファージが単離され、挿入酵素Bglllによるファー
ジDNAの切断は非過酷条件でHPV16プローブとハイブリダイズする8kb
のフラグメントを形成し、酵素BglI[及びPst lの混合物による組換え
体ファージのDNAと元の腫瘍のDNAとの切断は、乳頭腫ウィルスのゲノムの
寸法に等しい総分子量を有する同一の5つのフラグメントを形成する。新規11
PVのDNAを組換え体バクテリオファージのDNAから切出し、電気溶離によ
り精製し、プラスミドPL15.5内で再クローニングした。18個の制限エン
ドヌクレアーゼに対するこのDNAの反応性に基づいて、ウィルスDNAの制限
地図を作成し、21個の切断部位を位置付けすることができたく第9図)、こう
して作成した地図は今日までに同定されているHPVのゲノムの地図とは異なっ
ている。新規)IPVのDNAと従来同定されているRPVのDNAとの間の配
列の相同性を、過酷条件で実施したレプリカ分子ハイブリダイゼーション実験に
より分析した。検出された相同性は常に5%未満であり、最大の相同性はHPV
I6のゲノムで検出された。子宮2部の癌から特徴付けられた新規ウィルスは、
従って新規型のHPVを構成しており、これをHPVIP2と仮称する。
種々の条件下でHPVIP2のDNAとIIPVIのDNAとの間に形成された
ヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析した処、これらの2種のゲノムの物理的地
図を整合させることができ、HPVIP2のDNAがもっている異なる遺伝子の
理論的位置と決定することができた。
このゲノムの地図における主要遺伝子及びHPV−IF5の遺伝子開領域の推定
値に付は
末端座標
5′3′
E6−E7 62 71.5
El 71 95
E2 95.5 1]、、5
L2 11 30.5
Ll 31.5 .52
遺伝子間領域 52 63.5
精製されたHPVIP2のDNAから作製した放射性プローブをることができた
。 IIPVIPZのDNAが認識されたのは、14件の調査対象のうち外部生
殖器官の退形成丘疹の1例、51件の調査対象のうち2件の子宮頚部の侵入性癌
、及び28件の調査対象のうちの子宮頚部の上皮的新形成の1例であった。
従って、IPVIP2は頻度がHPV18よりもやや低く且つHPV16よりも
著しく低い腫瘍形成潜在力を有する生殖器向性)HPV型である。生殖器新形成
、特に子宮頚部癌の発生の危険を孕むHPV型を診断又は早期発見するためには
、分子プローブの作製に使用される)IPVのDNAのあらゆる混合物にIIP
VIPZを混入させる必要がある。
ノ″″iF m”4m ’ ル)IPVFI 1(PVIP4 ノローニング、
び−J一番
過酷条件下でHPV5,8及び14型の特異的放射性プローブを用いて混合物で
分子ハイブリダイゼーションを実施すると、皮膚前癌性病変である紫外線角化症
の生検から抽出したDNAに新規型)f(PVが露呈されり、1,2,3,7,
10,13,16,18,28゜IPI(iff出〕1lPV31)、IF5及
びIF5(前出)HPV32)型の特異的7”ローブでハイブリダイゼーション
を実施した場合、交差ハイブリダイゼーションは何も見出だされなかった。
数種類の制限配素に対するこの肝VのDNAの反応性を調べた処、酵素EcoR
IはウィルスDNAを一箇所切断することがわかった。生検から抽出されたDN
AをエンドヌクレアーゼEc。
RIにより消化後、8kb(乳頭腫ウィルスのゲノムの寸法)のDNA分子を含
むフラクションを、ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。 8kbの分子を
EcoR1部位でバクテリオファージλgt wes、λBのDNAに挿入した
。!tQえ体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌(大腸菌、苗株L^101)
への感染後、非過酷条件下でHPV8及び14のDIJΔの放射性混合物で感染
細苗培簑物のレプリカハイブリダイゼーションを実施した処、北換え体ファージ
に対応する溶面ブラータが検出された。
ウィルス配列全体を含む数a顕の組換え体バクテリオファージが単離され、挿入
酵素EcoRIによるファージDHへの切断リダイズする8kbのフラグメント
を形成し、酵素EcoRl及びPst Iの混合物によるxW fiAえ体ファ
ージのDNAと元の病変部のDNAとの切断は、乳頭腫ウィルスのゲノムの寸法
に等しい総分子量を有する同一の6個のフラグメントを形成する。新規11PV
のDN/l’、r組換え体バクテリオファージのDNAから切り出し、電気溶出
により精製し、プラスミド°pSP65内で再クローニングした。15個の制限
エンドヌクレアーゼに対するこのDNへの反応性に基づいて、ウィルスDNAの
側限地図を作成し、こうして23の切断部位を位置付けすることができた(第1
0図)、こうして作成した地図は今日までに同定されているIIPVのゲノムの
地図とは異なっている。過酷条件下で実施されたレプリカ分子ハイブリダイゼー
ション実験により、新規HPVのDNAと今日まで同定されているHPVのDN
Aとの間の配列の相同性を分析した。新規RPVのDNAといぼ状表皮異形成病
変中に従来同定されている所定の型のHPV(IIPV5,8,12,14,1
9,20.21及び25)ノDNA ト17) 間C,m 4i 50%未満の
相同性が検出されたが、その他の型の肝Vとの間には相同性は何も検出されなか
った。従って、紫外線角化症から特徴付けられるgT規ウィルスは、IIPV−
11’4と仮称され、 る新規型のHPVを構成する。
精製したHPVIP4のDNAから作製された放射性プローブを使用した処、A
査したいぼ状表皮異形成に罹患した17人の患者の42%、及び分析した紫外線
角化症生検のx/yに■PVIP4を露呈させることができた。 HPVIP4
は、皮J2癌のa発により特徴付けられる疾患であるいぼ状表皮異形成に罹患し
た患者に頻度が高く、皮膚の有しS[胞癌の前駆体とみなされる紫外線角化症の
病変のフラクションに閏述付けられるので、腫瘍形成潜在力を有する度広向性H
PV型であると判断できる、皮膚の前癌又は癌の病変の発生の危険を孕むIIP
V型を診断又は早期発見するためには、分子プローブの作製に使用されるIIP
VのDNへの全混合物に肝VIP4型を混入することが必要である。
本発明はより特定的には、乳頭腫ウィルスの感染の容重の形態の総合的診断を実
施するため、特に感染の可能な進行を予後診断するために組み合わせて使用し得
る各種のRPV−DNAの混合物即ち、カフデル(又はこれらの[1PV−DN
A又はこれらのDNA配列を含むプローブ)にも係る0本発明の好適な混合物を
下記第V表に示した。
夏■六
乳頭腫ウィルス感染のウィルス学的診断に使用可能なHPV−DNAの混合物の
特徴1)プローブ混合物の構成に含まれる新規HPV型は星印で示した。
この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を使用することにより診断さ
れ得る疾患の性質も示している。
第1図〜第9図の側限地図の区分は第7表の「構成」の1でに示した区分と一致
していることが銘記されよう、また、このために所定のプローブは各添付図面で
数回縁り返している。
これらの混合物の各々は、本発明の新規プローブの少なくとも1つを含むものと
規定できる。換言するなら、本発明の診断用組成物は、
1)少なくとも1IPV2#) DNA、2)HPVlob、28及び29(7
) DNAノ’J? す< トモ1m、3)HPV17,24ノDNAノ少なく
とも1種、4)HPV14,15,17,19,20,21.22及び23ノD
NAノ少なくとし1種、5))lPV15及び17ノDNAノ少す< )ニー
61種、6)HPV24ノDNA、
7)肝V14,32ノDNA、
8)HPV31のDNA、
9)lIPV32のDNA
を含むものと規定できる。尚、上記9群のり、NA+よ相互に異なる全状況で選
択される。
種々のいぼ形態又は他の皮膚もしくは粘膜病変部から単離され得るI(PVは非
常に多種に及ぶことを考慮すると、他の肝V−DNAも同−型の疾患の発生に関
与し得ると認められるので、表に示した各型の疾患を診断するためには、1種又
は2種より多くのHPV−DNAを含む混合物を使用することが好ましい、感染
の性質及び可能な進行の診断は、使用され°るプローブの数が多いほど有効であ
る。更に、プローブの各混合物を使用してハイブリダイゼーション試験を実施す
ると、忍者が罹忌している病気の性質なより高い確率で二側する鑑別診断が可能
になる。
第7表では、発明者の実験車で単にしたHPV、−DNAから形成したプローブ
しか示していない、上記に述べた理由により、他の実験室で得られたIIPVに
由来するDNAも同−型に感染した患者に繰り返して認められるので、各混合物
にこれらのDNAを追加できることは言うまでもない0例えば混合物7には、上
皮内断形成及び皮膚癌に変質する危険を孕むいぼ状表皮異形成に認識される他の
全)IPV−DNAを追加することができる。第V表中、所定の混合物は診断す
べき同一れよう、一方、各混合物は癌化の危険の低い感染と癌化の危険の高いS
染とを議別する0例えば、混合物7で診断した患者からのウィルス調製物のハイ
ブリダイゼーションは、混合物3でハイブリダイゼーションを形成する場合より
も支店癌化の危険が大きいことが立証されよう。
同様に、混合物5により検出されるEVは混合物6により検出されるEVより癌
化の危険が大きいことがわかる。混合物4は、混合物5により検出されるよりも
危険度の高いEVを検出する。
以下、乳頭腫ウィルスの各S染形態の総合診断を実施するために、場合によって
は感染の可能な進行を予後3断するために組み合わせて使用され得る種々の肝V
−DNAから成る他の混合物即ち、カクテル(又はこれらのHPV−DNAを又
は該DNAの配列を含むプローブ)について更に説明する。
本発明の好適な混合物は、上記第V表に示した。
この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を使用することにより診断さ
れ得る疾患の性質も示している。
もう一度ことわっておくが、この表に示される他の)IPV−DNAの制限ど°
図は第1図〜第9図に含まれている。
)IPV−IF5は生殖器新形成、特に子宮頚部癌の発生の危険を検出するため
に使用可能なプローブな特定的に表すとみなされ得ることに留意されたい。
従って、本発明はより特定的には表中「混合物の指称」の(コに1〜10の番号
を付けた少なくとも10訂を含む診断用箱又は「キット」にも係る。
以上の説明ではクローニングした完全なIIPV−DNAをプローブとして使用
する場合について特に考察した。もっとも、該DNAの代わりにこれらの各DN
Aのクローン化フラグメント、特に遺伝子E1又はLl及び遺伝子EG−E7を
使用してもよい。
RPV−DNAをインビトロで検出する基本原理は、当然過酷又は非過酷条件で
操作されるハイブリダイゼーションを使用するものである0例えば以下に述べる
ように操作すればよいが、2叙されている診断試験は当然本発明のプローブ又は
プローブ混合物の使用条件を限定するものと見なすことはできない。
クローン化!1PVのDNAの混合物から作製したプローブを使用する試験の目
的は、生検中、病変部の掻去により得られた紺胞中、又はCarnoy混合物(
エタノール、クロロホルム、酢176:3:1)により形成され且つパラフィン
に含有される生検の切片中でHPV ’Q露呈させ且つHPV型を同定すること
である。試験は、既知の原則の方法に従って採取物のDNAを予め抽出する必要
があり、IIPVのDNAの混合物から作製した(32P又はzs5で標識した
)放射性プローブを使用して、過酷実験によりこのDNAの分析を行う、各試験
では、一般に10−ブの数種類の混合物を使用する必要がある。
数種類のハイブリダイゼーション法を使用することができる0例えばプロットハ
イブリダイゼーション法を使用することができる。この方法は、DNAの変性後
、膜にトロセルロース又は(:enescreenplus)にアリコート量の
DNAを堆積させ、通常条件で各膜をプローブの混合物でハイブリダイゼーショ
ンし、膜をXB、写真フィルムと接触させることにより放射性ハイブリッドを検
出することから成る。レプリカハイブリダイゼーション法を使用してもよい、こ
の方法は、制限酵グによるDNAの処理後に形成されたDNAのフラグメントを
アガロースゲル;気泳動で分にし、アルカリ変性後、膜(ニトロセルロース、に
enescreenplus)にフラグメンl−を移し、これらのフラグメント
を通常条件でプローブの各混合物でハイブリダイゼーションすることから成る。
放射性ハイブリッドの形成は、股をXff1写真フイルムと接触後に検出される
。
放射性プローブは、「ニックトランスレーション」法により標識した)IPVの
DNAから構成されるか、例えばSF5型のベクターに挿入されたウィルスDN
Aの転写により作成されたRNAから構成される。放射性プローブを使用すると
5度が大きいという利点があるが、相互に標識された抗体又はそれ自体酵素、蛍
光等のマーカーを有する抗体により認識された抗体により認識され得る例えばビ
オチニル化した非放射性プローブを使用する場合はこのような利点は得られない
。
プローブの選択は、採取物の性質に依存する0例えばEVに罹患している疑いの
ある患者の場合、混合物1,2,3,4,5゜6及び7が使用される。混合物1
及び2は、EVと皮膚いぼとの間の鑑別診断が可能である。病気に関連する3群
のHPVの各々の最も高頻度で検出された群を含むプローブ3、及びEVの癌に
開運する型のHPVのDNAを含むプローブ7は、EVの殆どの症例を診断する
ことができ、特に、癌の発生の危険のあるHI’V型に感染した患者を認識する
ことができる。混合物4.5及び6を使用すると、同一患者に感染する)HPV
型を確従って、更に本発明は上記に示したような複数のプローブ、即ち
一上記19種の型及び亜をのRPV−DNAの各々の典型、又は10一ブ混合物
を含む容器もしくは「キット」に係り、これらの「キット」は、患者から得られ
たウィルス調製物と各種の群又は混合物との間のハイブリダイゼーションにより
「インビl〜ロJ17r7A査に使用される。
当然のことながら既に示したように、本発明は特定的に述べた適用例及び実施例
に限定されず、あらゆる変形例を包含し、特に図面に示した制限地図の)IPV
−DNAが対応するように請求の範囲の項で所定の数字と共にDNA−RPVに
付した参照符号は、これらの請求の範囲が上述の規定に従って同−型に分類され
得るこの特定の肝V −D N^と共通の全Hr’V−DNA、更に同−亜をに
属するHPV−DNAに及ぶことを意味するものと見なされる。 ゛
より特定的には、図面に示したHPV−32から誘導したDNAは、^val
、Ba I I、Bam1lI、C1al、EcoRI 、H1ndlII、N
deI、Nrul 、Pvul、PvuII 、5acl、5all、Smal
、TLhllI 、Xmalにより切断されていないことも注目される。
以下に示すMi換え体DNAは、1984年11月30日付けでC,N、C。
M、(Collection Nationale des Cu1tures
de Micro−Orga−nismes de l’1NsTITUT
PASTEURde Paris)に下記の番号で寄託されている。
pBR322/HPV2d−−−−・= −−・= No 、 l−379p
B R3221’ II P V 10 bΔ−=−−−−No、 l−380
pBR322/1lPV10b8−−−−−−−−− No 、 l−381p
BR322/HPV14a−−No、l−382pBR322/HPV14b−
−・= =−−No、l−383pBR322/llr’V15−−−−−−
No 、 l−384pBR3Z2/HPV17a−・−・・・・・・・・・・
−No、l−385p11PV5HindXilB/HPV17b=・−・・
No、l−38(ipBR322/HPV19−−−−−−−−−− No、l
−387pBR322/HPV20−−−−−− No 、 l−388pBR
322/HPV21.−−・−−−−−−−= −−−−−−No、l−389
pHV5 HindI[[B/1IPV22−− No、l−390p)3R3
22/[IPV23−−−−−− No 、 l−391p8R322/HI’
V24a−−No、!−392pBR322/1(PV241)−−= No、
l−393pBR322/llJ’V28−−−−−− No 、 I’−39
4pBR322/HPV29・・・・・・・・・・・・・・・・・・No、l−
395pBR322/1lPV31−− ・=−−−No、l−396pSP6
4/HPV32−−− No、l−397pL155/IP2・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・ No、T−450pSP65/rP4・・・・・
・・・・・・・・・・・旧・・No、l−449゜本発明はより特定的には、上
記に言及した異なる乳頭腫ウィルスの遺伝子E6、E7及び特にL2の発現生成
物に係る。
これらの発現生成物は、所定の生物採取物中の乳頭腫ウィルス又は該ウィルスの
発現生成物を検出するため、及び乳頭腫ウィルスが属する型又は亜をに従って乳
頭腫ウィルスを同定するためにそれ自体使用され得る。これらの発現生成物が得
られる条“件については、特に乳頭腫ウィルス)IPVの配列し2の発現に関し
て以下の記載中に説明するが、同様の方法を利用して他の型の乳頭腫ウィルスに
由来する遺伝子配列L2(又はE6.E7又はLl)の発現を誘導してもよい。
以下の説明は例外を除き、配列又は遺伝子L2についてより特定的に述べている
が、場合によっては遺伝子L2の発現生成物に関する教示を他の該当遺伝子の発
現生成物に置き換えてもよい、配列し2の発現生成物は、異なる型の乳頭腫ウィ
ルスではなく対応する乳頭■ウィルスにより侵された生物採取物中で遺伝子L2
の発現生成物を認議し得る抗体をインビボで産生させるために使用できるという
点で特に有利であり、より特定的には、該当する類の調製物が予め固定されてい
る場合に特に有利である。以下に述べる本発明の新規実施例は、重度を推定し且
つ採用すべき治療を選択するために、調査された病変物中に存在している;乳頭
腫ウィルスの型を決定することの可能な別個の手段を提供するものである。遺伝
子L2の各種の型の発現生成物に対して産生される抗体は、ハイブリダイゼーシ
ョンプローブに関して先に記載した混合物に対応する混合物に分類され得る。
従って本発明は、複数の異なる抗体を含んでおり且つ新規に単離されたy1頭腔
中ィルスの検出、場合によっては同定又は分類の連続試験を実施することが可能
な容器もしくは「キット」も提供する6例えば、本発明の容器もしくはキラI〜
は、抗体又は異なる抗体の混合物から構成される複数の試薬、例えば以下のよう
に分類される乳頭腫ウィルスの遺伝子L2の発現生成物に対して形成された抗体
を夫々含む試薬から構成される。
1)少なくともI(PV2cl、
2))Ir’V10b、28及び29ノ少なくとも1捕、3)HPV17,24
ノ少なくとも1種、、4)HPV14,15,17,19,20,21.22.
23及びIP24ノ少なくとも1種、5)I(PV15及び17の少なくとも1
種、’6)UPV24.
7) 1lPV14,32及びIP4ノ少なくとも1種、8)HPV31.
9)lIPV32.
10)HPV16,18及びIF5の少なくとも1揮。
尚、以上10群の抗体は、10群の各々が語群を構成している抗体のただ1種に
限定される限り、相互に異なる全状況にあるように選択される。
遺伝子L2の発現生成物(又は遺伝子L2の発現生成物の免疫特性を変化させな
い追加ポリペプチド、特に安定化ポリペプチドと融合されたこれらの発現生成物
を含む組換え体タンパク)に対して形成された抗体は、罹患した被験者の体内の
乳!1Irt1ウィルスにより誘導された病変部に由来する組蒜病理切片中でウ
ィルスを直接検出するために使用可能である。有利には、検出は例えば前出のC
ARNOY溶媒もしくは混合物(L、LISONのVSn旧stocbimie
eL cyLochimieanimales”にも記nされている)を使用
して、解離条件下で予め固定された調製物に対して実施される。
場合によっては固定された抗し2抗体は、この抗体に対して形成された別の抗体
により認識され得、これらの別の抗′体は好ましくは非放射性の適当なマーカー
を含んでb)る。
これらのマーカーは例えば酵素又は蛍光性質を有する。
本発明は当然のことながら、乳頭■ウィルスの遺伝子L2を発現させるポリペプ
チド自体にも係る。これらの発現生成物は上記記載で既にL2タンパクと呼称し
ている6本発明は更に、このL2タンパクがL2タンパクの免疫特性な本質的に
変化させないような他のポリペプチド配列と融合されて。
いるポリペプチドにも係る。これらの他のポリペプチドフラグメントの存在は、
殊に遺伝子工学技術を使用する繰作によりこれらのハイブリッドポリペプチドを
得る場合、使用される該ハイブリッドポリペプチドの製造方法に特に起因し得る
。有利には、本発明はβ−ガラクトシダーゼカ)ら誘導された配列を含むハイブ
リ・ンドボリペプチドに係る。
このような生成物は、特にラクトースオペロンの全部ス(よ一部により修口され
且つ、所定の型の乳頭腫ウィルレスミ二由来する遺伝子L2から誘導されたヌク
レオチド配列をラクトースオペロンのプロモータ(又は例えばλファージのよう
な適当な池の全プロモータ)の下流に挿入させた適当なベクター(ファージ又は
プラスミド)で大FAG’r形質転換することにより得られる。有利には、ラク
トースオペロンのβ−のプラスミド又はファージを使用する。
本発明は異なるポリペプチドの丁にも係り、該ポリペプチドは常に上述のし2タ
ンパクの一部のみに夫々対応するが、これらの各群のポリペプチドは該当する類
のL2タンパクの特徴的抗原部位を常に含んでいる。
本発明のポリペプチドは、精製した場合、該ポリペプチドに対応する抗体、特に
これらのポリペプチドにより感作された動物の血清から得られた抗体の精製技術
で使用することができる。特に、これらのポリペプチドはアフイニテイ力ラムに
固定することができる。抗体の精製操作は、該ポリペプチドを含んでいるアフイ
ニテイカラムに抗体を含んでいる血清を接触させることから成る。これらのカラ
ムに選択的に固定された抗1体は、次に適当なイオン強度を有する適当な耘笥液
、例えば酢酸アンモニウムのような塩溶液を使用する抗原−抗体複合体解疏によ
り回収され得る。また酸性溶液を使用してもよい。
最後に、本発明はこれらの抗ry、<又は抗原群)及び抗体(又は抗体群)を使
用する組成物に係る。
特に、本発明は所与の型の疾患にしばしば存在すると見なされる乳頭腫ウィルス
の集合から誘導された抗体の1種又は好ましくは「カクテル」を含む群に係る。
該当患者からの組織又は細胞採取物のインビトロ診断試験後に所与の疾患は臨床
診断されている筈であるし、あるいはインビトロ診断の結果、5染乳頭腫ウィル
スは上記集合の乳頭腫ライあるから、これらのカクテル(適当な薬学的賦形剤と
共にこれらの抗体又は抗体群、即ち血清混合物又は精製抗体組成物を含む)はこ
の場合、この疾患の治療にあたり、患者に特に非経口経路で投与することにより
使用できる。従って、これらの血清は対応する型又は亜をの乳頭腫ウィルスによ
り誘導される5染を退行させ一部る。
最後に本発明は、選択された投与方法、特に対応する疾患に罹患している危険の
高い人を保護するために使用可能な非経口経路の投与方法に適合する薬学的に許
容可能な賦形剤と共に、1又は好ましくは数種のし2タンパクを含む対応するワ
クチン組成物に係る。
f&後に、読者が明日Sを十分に理解するのに有益と忍われる限りにおいて、従
来技術の状態の説明を必要の範囲内で補う参考文献の論文を参照されたい、従っ
て、これらの論文の内容は明細書の一部を形成するものとみなされるべきである
。
さて、所与の乳頭腫ウィルスの遺伝子L2の読み取り相のフラグメントを利用す
るタンパクL2(又はこのタンパク質のフラグメント)を産生させるために好適
な方法を、まずにみ取り相のこれらのフラグメントを含むベクター構造に関して
、次に大FAME中のL2タンパク又はこのポリペプチドの発現を誘導し得る条
件に関して工明しよう、また、タンパク又はこのポリペプチドのfiTfJ方法
、及びこれらのタンパク又はこのポリペプチドに対する抗体を含む血清の製造に
おける該精製方法の使用例についても記載する。
当業者にとっては自明のことであるが、L2の読み取り相の使用されるフラグメ
ントは、使用されるベクターで常に同相で融合させるべきであり、場合によって
は安定性を確保し且つこうして形成されるハイブリッドタンパク質のその後の精
製を容易にするタンパク質のコード化遺伝子が使用される。
製造順序は添付した第11図に示しである。
扛工巳し仏功」屹
1)吐人@文■[
DNAの組換え、プラスミドとDNAフラグメントとの形成、新しい末端の形成
、酵素Ba131による消化及び細胞のトランスフェクションに関しては、Co
1d Spring Harbor Labo−ratory、 Co1d S
pring Harbor、 NEW−YORK、 U、S、^、の著Z”A
Laboratory Hanueビの”No1ecular cloniB”
の章に記載されているManiatis、 T、他(19E12)の方法を援用
した。
プラスミドDNAは、大腸菌(細胞C600)に含まれるpHPVl、a(Da
nos他、1982及び1982年4月5日付仏国特許出願第8205887号
)、細胞RRT(queen、 1983)に含有されていたpcQV2及び細
胞MC1000(Casadabnn、1983)に含有されていたpMc14
03から得た。
構成した遺伝子間プラスミド及びプラスミドpHPL2を、大腸菌M8294の
細胞に数回通し、プラスミドpHPL2−β−ガラクトシダーゼはβ−ガラクト
シダーゼを欠失する細胞MC1000に通した。ラクトースを含むt4e Co
nkcyの寒天培地(Silhavy他、1984.”ExperimenLs
with gene fusions”:Co1d Spring I(ar
bor LaboraLory、 Co1d Spring Harbor。
NEW−YORK)で、菌株Lac ”を赤いコロニーの形態で検出した。
次に、10テアーゼを欠失する菌株1on−1CAG1139(Gro−ss+
man他、1983.Ce1132.151−159>に、プラスミドpHPL
2及びpHPL2−β−Balをトランスフェクトした。
3)、:”” の生成 び岐涜” のドーシル硫、ナトリウムーボlア 1ルア
ミド ル 5OS−PAGE−晩培養後、pHPL2又はpHPL2−β−ga
ll16を含む細胞CAG1139をLB溶媒で15〜20倍に希釈した0次に
光学密度0D600が0.5〜0.9に達するまで細胞を30℃で培養した。
次に、細胞を90分闇で41℃にすることによりλ−PRプロモータを押割解除
し゛た。培養物を再び遠心分ス:し、沈降物を収集し、SD’S2%、グリセロ
ール26%、2Mの2−メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルー0
.03%を含有する溶jyA62mM Tris、 pH6,8に懸濁させた。
プラスミドを含んでいない細胞CAG1139の溶解質を対照として使用した。
100℃で10分間処理後、Lacmli(1970)、 Nature、 2
27゜680−684の技術に従って、試料に対して10%の5DS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動と実施した。既知の分子量を有する予め着色したBRL
タンパクに対して同様に電気泳動を実施した。
「アミドブラック」の呼称で知られているz色剤で着色することにより、タンパ
ク質のバンドを可視化させ、ニトロセルロース膜に移して所謂「ウェスタンブロ
ッ1−」(ウェスタン転写)により分析した。
ルオキシダーゼに結合された抗ラット及び抗つサギ免疫グ(:en、 Viro
l、 65.1319−1324に記載されているように、「ウェスタンプロッ
ト」による分析を実施した。
5)抗歪ぼとた逝−
゛精製されたHPVl、aのウィルス粒子又は異なる型の乳頭腫ウィルスにより
誘導された病変の切片を使用することにより、従来記載されている免疫拡散、免
疫蛍光及び免疫ペルオキシダーゼ法(Ortb他、1984及びRosetto
他、1984)を使91(PL2−β−ガラクトシダーゼ116を含有するCA
に1139の培養物をLD溶媒で200倍に@釈し、D、0.600が0.32
に達するまで培養した0次に培養物を急速に41℃にし、高温で90分間培養し
た。
細胞沈降物を溶媒Tris20mM、pH7,5’、 NgCI210iMに再
懸濁させ、超音波で細胞破壊処理した。
Uilraann(1984)、 Gene29.27−31により記載されて
いるように、調製物に可溶性の融合タンパクを、p−アミノフェニル−β−D−
チオガラクトシド(TPEに)−SEPHAROSEカラムでアフィニティクロ
マトグラフィにより精製した。
上記のように精製した融合タンパクを使用してHarley雌ラットに免疫8作
した。動物には、完全フロインドアジュバント(DIFCO)の存在下で2〜3
週間の間隔で異なる部位に約150円のタンパク質を3回皮下注射した。3回目
の注射から1週間後に血清を採取した。
乳」
1 L2怖み ることのo tブースミLへ11
構造は第1図に示した。 L2読み取り枠をクローニングして大腸菌内で発現さ
せた。プラスミドpHPV1.aは、Danos他(EMBOJ、!’、p、2
3L−236.1982)によりプラスミドpBR322のBamH1部位でク
ローニングされたHPVl、aの完全なゲノムを含んでいる。ウィルスゲノムの
後朋領域がら読み取り枠を単離するために、プラスミドpBR322内でプラス
ミドI))IPVl、aのフラグメントHindlII−Hpallをサブクロ
ーニングした。
得られたプラスミドをpHPL9とした。領域pBR322における非本質的な
フラグメントBaa+HI−pVullを除去することにより、このプラスミド
を短縮した。得られたプラスミドpHPL9.3から、5゛末端の318対を除
く読み取り枠の1526塩基対(p。
b、)を含むフラグメントXho I[−Xmn Iを単菊した。
L2−32み取り枠の終止コドンを保存した。
得られたL2フラグメント3次に、非本質的なフラグメン1−Bam1i1−P
vuilの代わりに、CQV2発現ベクター(queen1983)に挿入した
。こうして、L2読み取り枠は、開始^TGコドン及びλファージのcrom伝
千の配列5D(Shine及びDargarno 。
Proc、Natl、^cad、Sci、USA 71. p、1342−13
46.1974)に直接隣接しており、λPRプロモータの制御下にある。プロ
モータは温度に敏感な抑制剤Cl857により調節されるので、L2の発現生成
物の産生を制御することができる。こうしてL2読み取り枠のC末端部の120
6塩基対がλファージのeroの開始^TGコドンと同相であるようなプラスミ
ドpII P L 2が得られた。解・読相については、Ba1IIHI /B
gl IIの交差点における制限部位XboIIの存在により立証した。
大腸菌内で合成されたL2タンパクを安定化させ、該タンのβ−ガラクトシダー
ゼと融合したハイブリ・ノドタンノくりと同様に該タンパクを発現させることに
決定した。
このためには、BstE I[部位でプラスミドpHPL2を直線状にしてから
酵素Ba131で消化させ、125,3始コドンを除去した。
、遺伝子L2と転写及び翻訳信号を供給する配列とを含むこのDNAを、r’s
LIによる消化によってMlし、フラグメントPsLI−Stealの代わり°
にプラスミドpMc1403(Casadaban。
Methods、in ct+zymology 100.p、293−308
.1983)に挿入した。
PMCI403は、プロモータを含まないIacオペロンと、β−ガラクトシダ
ーゼの遺伝子の読み取り相の最初の22 :H基対とを含んでいる0組換え体を
細胞MC100O,1ac−4こトランスフェクトした。クローン中で高温でβ
−ガラクトシダーゼを産生させると、L2とβ−ガラクトシダーゼと力τ同相で
あるようなプラスミドpII P L 2βgalを、Mc、Condeyラク
トース寒天培地(Silhavez他、Co1d、Spring Harbor
Laboratory。
N、Y、1984)で選択することができた。
このような方法に従って選択されたクローンpHPL2゜βgall16を後で
調査した。
DNAの配列(その結果についてはここでは示さない)を検討した処、L2読み
取り枠の最後の2個のC末端アミノ酸のみがBa131による消化の過程で失わ
れていること、及びL2読み取り枠により発現される生成物はプロリンを介して
β−ガラクトシダーゼの9番目のアミノ酸に結合されていることがわかった。
プラスミドpHPL2は、約51.2Kdのし2タンパクをコードし。
及び約167Kdのハイブリッドタンパク質のp II P L−βgalの容
量を有している。
これらのプラスミドによるタンパク質の産生を検討するために、まずプロテアー
ゼを欠失する大EjiCA(:11391on−の菌株にこれらのプラスミドを
トランスフェクトした8次に細胞を30°C5次に41°Cで培養し、λI’R
ブロモークの制御下でクンバク質の産生を誘導した。得られた細菌溶解質に対し
て、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動な実施した。
抗ウィルスHPV1.a抗体を使用して所謂「ウェスタンプロ・7ト」法に従っ
て分析した処、ウィルスHPV1.aと同種のタンパク質が認識された。30℃
にした培養物の分析結果は、ブーラスミドを含むが又は含まない細胞については
同様であったが、41℃にした細胞の場合、トランスフエフl−した細胞中にタ
ンパク質の特異的バンドが示され、≦:i換え体p 11 P L 2−βga
ll16でトランスフ三クトした細胞から単離されたタンパク質のうち、融合タ
ンパクL2β−ガラクトシダーゼ(L2−βgal)に対応する約136Kdの
期待分子量を有する主要なバンドと、恐らくタンパク分解の結果であると考えら
れる約58Kdの分子ヱの数個の小さいバンドとが単離された。
構造pHPL2については、約72Kdのタンパク質のバンドが見出だされた。
この分子量は51.2Kdの予想分子量よりも大きい、この差の意味については
解明の余地がある。
次に、大肌苗中で産生されたクンバク質の抗原性を検討するために、熱誘導培養
株の細口溶解質の生成物L2−βgalをTRE(ニー5EP)IAROSEカ
ラム(Ullman、 Gene 29. p、27−31.1984>でアフ
ィニティクロマトグラフィによりτ17裂した。カラムから溶離された夕〉・バ
ク質を5OS−ポリアクリルアミドゲルで分析した。「アミドブラック」で着色
した処、3個の主要なタンパク質のバンド、即ちL2−βgalハイブリッドタ
ンパクに対応すると思われる高分子量バンドと、精製したβ−ガラクトシダーゼ
と共に移動する第2のバンドと、約60Kdの分子量を有する第3のバンドとが
認められた。
分子量の小さいこのタンパク質は汚染物に対応し得る。
HPVl、a型の特異抗体を使用する「ウェスタンプロット」法による分析の結
果、発現生成物L2−βHalに対応する高分子量の主要なバンドと、数個の二
次的なバンドとが認められた(第3b図)。
ノー成、L2−alのへ戸締
融合タンパクの免疫性を試験するために、2匹のラットに溶荒物を注射した。3
回目の注射後に血清を収集した。
得られた血清を、夫々プラスミドpHPL2−βgall16又はプラスミドp
II P L 2を含む熱誘導培養株の細口溶解質中で「ウェスタンプロット
」分析により、融合タンパクL2−βgal又は生成物L2と同様に移動するバ
ンドと反応さぜな。
2種類の型の細胞溶解質で、血清は対照溶解質CAG1139にも見出だされる
タンパク質(約60及び55Kd)を;2ムした。これらのタンパク質°の少な
くとも一種は、融合タンパクL2−βga1及びβガラクトシダーゼと同時に生
成されたタンパク質に対応するように思われる。
血清は、解にされたウィルス調製物HPV1.a(デタージエント処理)及びH
PV I 、aにより誘導されたいぼの抽出物中で、約80Kdのタンパク質を
認識した。
免疫拡散試験において、得られたラット血清は抗原として使用された未処理のウ
ィルス粒子肝V1.aを沈降させず、従って、免疫トランスファー法で血清によ
り認識されるウィルス抗原はピリオンの表面では得られないこと、及び血清は沈
降しないことが更に判明した。
ピリオン及びウィルスポリペプチドの天然高次tg Wを保存するために知られ
ている凍結いぼ切片HPV1.aでは、L2の発現生成物から得た血清は反応し
なかった。この結果から、抗体は配座抗原に向けられていないことがわかる。
血清は、BOUIN溶媒に固定された)IPVl、aに5染したb:ぼ切片とは
ほとんど反応しながった(8釈度1150) 、この結果から、ウィルスにS染
しており且っBOtllN溶媒に固定された切片でより強い抗原−抗体反応を生
じる群の抗原に対して該当型の抗原の特異的′18徴が確認される。
一方、CARNOY溶媒により切片を観察した処、抗原型及び抗原群のどちらも
正の反応が認められた。特に、切片が試験で使用された抗体の起源である抗原を
提供したと同−型のウィルスを含んでいた場合、ラットの血清は非常に強い抗原
−抗体反応(1/1000の希釈度)をもたらすことが確認された。これに対し
て、被調査血清を別の型に居するウィルスを含む切片と接触させた場合、交差免
疫反応は何も認められなかった。
銘記すべき点どして、抗原に予想される型は、2種の異なる乳頭腫ウィルスのゲ
ノムの相互ハイブリダイゼーション能力に関して上述したような型と常に一致し
ている必要はない。
’i’L頭■ウィルスに存在する抗原として特に2種頭、即ち、一完全ビリオン
の注入後に得られる抗体を使用することにより、6揮の乳頭腫ウィルス間の交差
抗原反応の不在により特徴付けられる型の抗原、及び
一本質的にピリオン中に3匡蔽されており、解乱されたウィルス粒子の注入後に
抗体により露呈される類の抗原、に区別される。
抗原−抗体反応試験で異なる型に属する乳頭腫ウィルスは、好ましくは夫々の相
同領域を欠<L2コード配列が夫々の抗体で抗原−抗体交差反応を生じさせない
ポリペプチドをコードするような乳頭腫ウィルスである。
好適な型の抗原は、特に該当するし2領域の長さの174にわたってN末端領域
を欠く遺伝子L2の読み取り枠によりコードされた抗原である。
最後に本発明は、異なる型に属するウィルス中で、交差反応を生じないし2領域
によりコードされたポリペプチドの型をめるために実施される試験にも係る。こ
れらのポリペプチドは、Carnoy溶媒に固定された組織又は細胞切片に含ま
れるウィルスと効果的に反応する抗体を含むが、[touin溶媒により固定さ
れている同一切片とは不十分にしか反応しないかあるいは全く反応しないような
ポリペプチドとして規定され得る。
本発明は更に、既知の7L頭腫ウィルスに対して新規乳頭腫ウィルスを分類する
方法にも係る。この方法は、明56gの一部を特徴とする請求の範囲第8項に規
定されている。
更に、本発明は場合によっては患者の体内に存在している感染ウィルスの型の同
定を含む診断方法にも係り、該方法は、異なる型に属するウィルスに対して予め
得られた抗原を、試験すべき患者からの生物採取物、特に血清と反応させること
から成る。
血清採取物とこの同−型に仄する乳頭腫ウィルスからの抗原との間に抗原−抗体
反応が観察されるなら、感染ウィルスは所定の型に属するものと見なされる。こ
の診断試験は、例えばEl、ISS性法使用することにより実施され得る。
より特定的には、本発明はffl!又は流体のようなヒト生物試料、例えば血清
中の感染乳頭腫ウィルスが所与の型の乳頭腫ウィルスに属するか否かを検出する
方法に係る。この方法は、この生物試料を、この型に属するウィルスのゲ対して
予め形成された抗体と接触させることを特徴とし、この接触は免疫反応を可能に
する条件下及び時閣内で実施される。抗原−抗体複合体の形成が検出されると、
上記発現生成物の起源である型と同−又は同種の型を有する乳頭腫ウィルスの存
在が証明される。
好ましくは、L2領域又は対応部分を含むDNAを、細菌例えば大腸菌のような
コンピテント細胞宿主内でクローニングした。
有利には、使用されるし2領域部分は型の非特徴的N末場領域を欠失している遺
伝子L2の読み取り枠に対応する。好ましくは、このN末端領域はこの読み雇り
枠の4分の1に対応する。
より特定的には、本発明は上記し2領域部分(又はL2領域全体)を含むDNA
が選択されたコンピテント細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質をコードする
核酸から形成されたハイブリッドDNAであり、上記し2領域が特にインビトロ
再結合により予め取り込まれているようなこの型の検出方法に係る。
例えば細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質は、この細胞宿主が大腸菌である
とき、β−ガラクトシダーゼの全部又は一部に対応する。
本発明の検出方法は、好ましくはCarnoy溶媒中あるいは血清に直接固定さ
れ゛たあらゆる≦■蒜切切片適用可能である。
本発明1の方法は生物試f!と、同−型又は同種の型の数個のウィルス、特にD
NAプローブに対して上述の方法で再編成されたウィルスに由来するし2領域の
発現生成物、又は夫々の対応する部分に対して予め形成された抗体の「カクテル
」と、上記条件で接触させることも含む。
これらの抗体の「カクテル」を使用すると、DNAプローブに関して使用したと
同様の条件下で、検出された乳頭腫ウィルスの所与の種類への帰属と、患者が罹
ニしているか又は潜在的に危険のある病気とを相関させることができる。
最後に本発明は、上記ハイブリッドポリペプチド及び対応する抗体の各々の製造
方法にも係る。
この方法は、
一該当する乳頭腫ウィルスのゲノムのL2領域又は適当なベクター内の対応する
領域部分の、特にインビトロの取り込み、
−こうして修飾されたベクターで受容可能な細胞宿主、即ち上記し2領域又は対
応する部分を発現し得る宿主の形質転換、及び
−L2領域又は対応部分の発現の結果として形成されるポリペプチドの回収、及
び好ましくは分に、から成り、このポリペプチドは上記条件下で乳頭腫ウィルス
のタンパク質を検出することの可能な抗体をインビボで産生させることが可能で
ある。
本発明は更に、動物、例えばウサギを上記ポリペプチドで5作し、形成された抗
体を回収することを特徴とする抗体の産生方法にも係る。
最後に本発明は、各乳頭腫ウィルスが属することが確認され得る各型に従って該
乳頭腫ウィルスから得られるハイ免孟づUI
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- 2.組成物が夫々藥学的に許容され得る賦形剤をポリペプチドと共に含有してお り、対応する乳頭腫ウイルスに対する予防接種用として組成物の1種又は複数種 を使用することが可能であることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の集合。
- 3.1)少なくともHPV2d、 2)HPV10h、28及び29の少なくとも1種、3)HPV17、24の少 なくとも1種、4)HPV14、15、17、19、20、21、22、23及 びIP4の少なくとも1種、 5)HPV15及び17の少なくとも1種、6)HPV24、 7)HPV14、32及びIP4の少なくとも1種、8)HPV31、 9)HPV32、 10)HPV16、18及びIP2の少なくとも1種(但し、これら10群の抗 体は10群の各々が各群を構成している抗体のただ1種に限定される限り、相互 に異なる全状況にあるように選択される)から夫々誘導された乳頭腫ウイルスの 遺伝子E6、E7又は好ましくはL2の全部又は一部の発現生成物に対する抗体 又は抗体群の集合。
- 4.組成物が夫々薬学的に許容され得る賦形剤を抗体と共に含有しており、対応 する乳頭腫ウイルスを保有する被験者に投与した場合、これらの乳頭腫ウイルス によ誘導される感染を退行させるように、組成物の1種又は数種を使用すること が可能なことを特徴とする請求の範囲第3項に記載の集合体。
- 5.乳頭腫ウイルスを保菌し得る患者の組織又は細胞採取物中の単離可能な又は 該採取物中に含まれる乳頭腫ウイルスの性質のインビトロ診断方法であって、こ の採取物を請求の範囲第3項に記載の種々の抗体又は抗体群と接触させること、 及び採取物に固定されている抗体から乳頭腫ウイルスを検出することを特徴とす る方法。
- 6.採取物が調製物又は固定組織切片の形態であることを特徴とする請求の範囲 第5項に記載の方法。
- 7.組織切片がCarnoy溶媒により固定されていることを特徴とする請求の 範囲第6項に記載の方法。
- 8.新規に単離された乳頭腫ウイルスの分類方法であって、該乳頭腫ウイルスの ゲノムの非過酷条件下における既知のと 乳頭腫ウイルスの1又は数個のゲノムのL2領域とのハイブリダイゼーション、 あるいは場合によっては該新規乳頭腫ウイルスのゲノムの配列決定、従ってL2 遺伝子に対応する読み取り枠の標識後、ゲノムから予め切り出されたこのL2遺 伝子の全部又は一部を構成しているフラグメントと適当なベクターとの組換え体 を形成させ、次に適当な細胞宿主又は微生物、特に大腸菌中にフラグメントの発 現を誘導し、次に場合によっては得られた発現生成物に対する抗体をインビボで 生成し、新規に単離された乳頭腫ウイルスのL2遺伝子の発現生成物もしくは対 応する抗体と、既知の型の乳頭腫ウイルスに対応する抗体もしくは抗原との間で 抗原抗体交差反応試験を実施し、抗原抗体交差反応が陰性の結果をもたらすか又 は陽性の結果をもたらすかに従って、既知の乳頭腫ウイルスから新規に単離され た乳頭腫ウイルス型を識別するか又はしないことを特徴とする方法。
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