JPS63500539A - イオン選択電極をもつセンサ− - Google Patents
イオン選択電極をもつセンサ−Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
イオン選択電極をもつセンサー
説明
背景
イオン選択電極
イオン選択電極は液中の特定イオン種に対して優先的ま文は選択的に応答する。
それらは液体試料中のイオンの活量の電位差的測定においてしはしは使用される
。電位差測定は液と接触の状態で電気化学的セルを形成する二つの電極の間の電
位の差を測定する。一方の電極−参照電極−の半電池電位は本質上一定であり、
他方の電極−指示電極−のそれは分析されつつある液体のイオン活量とともに変
る。電極を横切る電位はイオン選択電極が応答するイオンの活量の対数に比例す
る。ネルンスト式はこの対数関係を記述している。その電位差は電位計のような
電位差測定装置を使って測定できる。
イオン選択電極のいくつかの種類が利用でき、例えば、研究室において広く使わ
れるpH測定用の慣用ガラス電極が含まれる。ガラス電極はアルカリイオン珪酸
塩組成物を基礎にしている。pH測定用の電極は珪酸リチウムガラスあるいは硼
珪酸塩ガラスでつくることができ、そfLけ水素イオン(H+)に対して透過性
であるがアニオンまfcは他のカチオンに対して透過性でない。H+に対して選
択的透過性のガラス薄膚ヲ異なるH+濃度の二つの溶液の間に置く場合には、H
+イオンはガラスを横切って高濃度の溶液から低H+ 一度の溶液へ移動する。
そのような移動は低u+ 濃度の溶液への正イオンの付加をもたら℃、ガラスの
反対側で負イオンを残し、ガラスを横切る電位を生成する。pHと無関係の参照
電極を溶液中へ浸漬すると回路を完成し、電位差が測定できる。
イオン選択電極のもう一つの種類は液状イオン交換体を使用し、酢酸セルロース
あるいはポリビニルクロライドのフィルムのような不活性ポリマーによって担持
される。この種類の電極の重要な例は油溶性燐酸のジエステルのカルシウム塩を
基本とするCa 一応答電極である。米国特許3,429.785;3.438
.886;および3,445.365#′i、2価カチオン(例えばc !L2
+ 、 M g 2 + ) K対して選択的に応答するイオン交換有機液体
で以て満たされ次多孔質不活性物質で以てつくつ次層をもつ、イオン選択電極も
記載している。
1価および2価の両力チオンについての中性担体ベースのセンサーはイオン交換
体をベースとする電極と類似である。両者どもイオン交換部位を含み、特に媒介
物質(mediator )からもたらされる負の可動性部位、あるいは担体物
質の加水分解からおこる負の固定部位、を含む。中性担体け、それらは環状鎖ま
7’(は開放類であることができるが、一般的には、カチオンとの疎水性錯体形
成剤である。そのような化合物はK”、H&“およびCa に対して選択的抽出
、従って選択的透過性、をもたらし、それらのイオンdそうでない場合には単純
無機塩として農相中に溶解しない。その種の担体の例はパリノマイシンであり、
それはに+に対して選択的に応答する電極の中で使用できる。
液体試料のH+含量の測定用電極は他の人々によって記述されてき友。それらは
共通的に、イオン選択性成分(イオン透過担体(1onophore )とその
イオン選択性成分を溶解することができる溶剤/可塑剤化合物とをもつプラスチ
ック膜を含んでいる。Hイオンに対して選択的透過性のガラスのはかに。
酸化的燐酸化の脱共役剤の脂肪親和性誘導体および脂肪親和性三級アミンのよう
な水素イオン透過担体が使用されてきた。
シモンらは例えばトリドデシルアミン” ’12H!5)N3またはトリラウリ
ルアミン)を水素イオン透過担体として含むミクロpH1f極を述べている。人
nalytical Chemistry53:2267−2270(1981
)。その著者らはこの電極が5.5と12の間のpH変化に対してすぐれた応答
を与えることを報告l、ている。Lかし、少くとも二つの重要な欠点が、適切に
機能させるためには農相は溶解二酸化炭素を含まねばならないという事実から生
ずる。第一には、電極性能(すなわち、CO□含t)ti湿温度圧力の変化によ
ってひどく影響を受ける。
第二には、製造を注意深く制御さf′Lfc条件で実施せねはならないので量産
がきわめて困難であり、その上、溶解Co、は電極貯蔵中に拡散して逃げる。
他の種類のイオン透過担体はミトコンドリアにおける酸化的燐酸化の脱共役剤を
基本とする。例はフィンクルシュタインにより記述されている。Biochim
ica Biophysica Acta。
205:1−6(1970)。2.4−ジニトロフェノールおよび1−クロロフ
ェニルヒドラゾンメソオキサロニトリルのような弱酸性脱共役剤はH+イオン担
体として作用する。それらはしか
【1、イオン選択電極中へ組入れられる膜成分
としては、それらの一定の水溶性のために不適当である(すなわち、それらに膜
に結合して残らずかつ膜から浸出して出る)。
ブラウンらは血管内長期埋込みに適当であると主張されるpHセンサーを記述し
ている。そのpH感知要素は、疎水性で親脂性の特定的H+イオン担体の付加全
通じてイオン透過性とされるエラストマーポリマーの薄膜である。使用担体はp
−オクタデシルオキシ−m−クロロ7エールヒドラゾ/メンオキサロニトリル(
OCiPH,こf′Lは弱酸性説共役剤論−クロロフェニルヒドラゾンメソオキ
サロニトリルの高分子!同族列である)である。ブラウンと共同研究者に、0C
PH分子は各(のエラストマー中で可動性C担体とl−て作用するけれども、実
際的用途に十分良好な品質のpH応答特性は、目的に対して特別に工夫されたポ
リマーマトリックスを使用して得らnるにすぎrLいことを述べている。米国特
許A3,743,588 (1973) ;0、H,ルブラン、J、F、ブラウ
ンらのJournal of AppliedPhysxology、 40
: 644−647 (1976)60GPH分子と一緒に使用できるポリマー
の製造はヴオーンによって記述されている。米l特許扁3,189,662 (
1965) ; H,A、ヴオーンおよびJP、ゴールドベルブのpoxyri
er Letters 。
7 : 569−572 (1969)。
米11!#許3,691.047 C1972)において、ロスおよびマーチン
は電位差測定′@極用のイオン感知膜を記述している。
その膜はゲル化混合物として記述されており、その中において固相はポリマー(
flIえはセルローストリアセテート)であり、液相は有機溶剤中に溶解した有
機質イオン交換物質(例えはジオクチルフェニルホスホネート中に溶解したカル
シウム(ビス−ジブロムオレイル−ホスフェート)よ)でl・ると述べちれてい
る。そのイオン感知鴇−極は、主要成分が非揮発性有機溶剤中に溶けた有機質イ
オン交換体である膜をもつといわj2る。
米国特許4.214,968 (1980)において、バッタグリアらは液体の
イオン含量の測定に使用する乾式操作可能のイオン選択11極を記述している。
その電極に疎水性イオン選択膜と接している乾燥内部参照賃極から成るものとい
われている。その内部参照%:極は乾燥[1次金属/金属塩参照半℃池であるか
あるいは乾燥状のレドックス・カップル参府1に極であり、液体試料適用時に濡
らさfする。そのイオン選択膜はイオン押体(例えは、パリノマイシン)を含み
、それハシ水性バインダー中で分散さt″(た担体溶斉:中に溶けている。
米国%許4.J l’+ 4.9 ;(6(1980)において、ボールとババ
オグルは液体試料のイオン活■を辿:定する装置を記述【、ている。そのl&飲
に、内部奈肺蚤素(ti#液含有層、金属塩および金楓層でつくらj、ている)
と支持体の上にvr4i、シ、たイオン選択膜をもつものと(−て述べちれてい
る。その装置の二つの電極は固体であり、好まり、<け乾僑状であるといわれる
。
米国料許4,053,381 (1977N’cおいては、ハンプレンらは液中
のイオン活tを測定するもう一つの装!ii:を記述している。その装置の栖e
9素である@極は、内部参照電極がいくつかの層をもつ少くと本一つのイオン選
択重極會含む。そnらのNkは金属層、その金處の不溶性塩の層、および、好ま
しくは乾性されている鶏W、液含有層を含む。請求されている装置は固体電極を
含む。
現在では、液体のイオン含量測定に利用できる多くの種類のイオン選択電極が存
在する。しかし、こnらのイオン選択電極Fi制約をもっている。これらの制約
は、特別設計のポリマーマ) IJラックスm成される膜についての要請事狽;
塩基で以て事前中和を行なって膜感度を改善し応答時間を減らすことを必要とす
るイオノオアの利用;よく制御された条件の下で貯蔵する必要性;および、貯蔵
中の感度および信頼性の低下:t−含む。
さらに、pH沖、1定に現在利用できるイオン選択電極は正確な操作の食めKは
比較的大きい試料(すなわち1.0ml+またはそれ以上)を必要とし、かつコ
ストのかかるガラスで以てつくられ、きわめて少量f)試料の自動的処理に適す
る電極の中へ組入れることができない。
現在利用で會るものよりも小さい試料(例えばマイクロリットル程度の大きさの
)のイオン含tv正確迅速に測定するのに使用できるイオン選択′@極をめるニ
ーズが存在する。また。
現在利用できる電極で以て可能であるよりも小さい試料の他の構成成分を正確で
かつより迅速に測定できるイオン選択電極をめるニーズも存在し、ている。
示差的測定技法
示差的電位差測定の技法は塩橋によって分離され友異なる活量の溶液中に浸漬し
几2個の同等の電気化学的半電池の間でおこる電位差に依存している。この二つ
の半電池は一緒になって濃淡電池を構成する。この場合においては、一方の半電
池の活量(ILl)F!固定されており(8M)、一方、他方の活f(aり(試
料)はそのa度電池のelか次のとおり定義されるよう。
変動する:
ここに、m59.1mv、(298°Kにおいて5m=1につF
ついて)であり。
l、=参照半電池のemf
E、=試料牛電池のamf
34o=標準参照電極電位
R2モルガス恒数;8,314ボルトeクーロン70に丁 =絶対温度 Ox
n =イオン上の電荷
F =ファラデー恒数;96,493クーロンa1およびa、=参照試料のイオ
ン活量カリウム(K+)のようなカチオンの場合にη・では、半電池のa、が参
照半電池として定義されかつゼロ電位を割当てられる場合には、その濃度電池の
emfはa、)a、ならば正であり、a ! < a tならば負である。、t
Llは固定されているので、電池電位についての式F11個だけの未知数(a、
)’e含み、 Kcel’1を測定すると、式はhについて解くことができる。
示差的測定技法はナトリウム(Na”)、カリウム(K”)、カルシウム(Ca
++ )および塩化粋(C−!−) のような他のイオンを含めて、H+以外の
生物学的液体の成分の濃度または活量を間接的に測定するのに用いらnてきた。
さらに、その種の技法はしばしばバイオセンサーまたは酵素電極を利用するが、
それらは生物学的触媒反応の生成物ま友は補基質に対して敏感な電極へ結合され
た生物学的触媒(例えば、固定化酵素、細胞、組織層)を含む。酵素または基質
の濃度は示差的測定技法を使って決定できる。例えば、多くの酵素反応り酸ま几
は塩基の生放をもたらす。その酸または塩基のイオン化けこんどけH+の放出と
取込みおよび溶液のpH変化をもたらす。H+濃度またばpHの測定された変化
は水素イオンを放出まfcは取込む基質(例えば、プルコース、尿素、など)の
濃度の化学量論的測定についての基礎であることができる。
示差的pH測定の場合には、各半電池はp)I!極を含む。
a1#tli池の水素イオン活量は固定され、−1(試料)のそれに試料のpH
に応じて変動する。電位計によって電池を横断して測定されるemfけ次Ka、
の水素イオン活量を計算するのに用いることができる。
酵素を必要とする示差的測定の場合には、その酵素を一方の半電池または両方の
半電池の中に置き、試料を両方の半電池へ添加するか、あるいけ試料を一方の半
電池へ添加しかつ検量体(calibrator )を他方の半電池へ添加する
。その結果、酵素は試料中で基質と反応するとき、pHの上昇または低下がおこ
シ;その変化の大きさは試料中の基質の葉と直接的に比例する。同様に、基質を
酵素と置換え、その電池を与えられた試料の酵素活量を測定するのに用いること
ができる。
例えは、ニルンンと共同研究者は、水素イオンガラス電極を溶液中のグルコース
、尿素およびペニシリンを測定する酵素−pH電極をつくるのく用いる、酵素電
極の開発を述べている。
この測定に用いる酵素はそれぞれ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、およ
びペニシリナーゼである。ニルンン、H0らの%Biochimiaa et
Biophygica Acta、 320 : 529−534(1973)
。
モス力と共同研究者はまた示差的pH測定によるグルコースの泗・定全記述して
いる。その技法はグルコースとATPとの間のへキソキナーゼ触媒反応によって
つくり出さねるpHf化の測定を基礎としている。彼らF12個の1mlの水性
試料間のpHの差を測定するのに有用であるといわれる二つの系を述べている。
グルコースの濃度はそれらの著者によって誘導された式によってその測定pH変
化から計算される。そスカ、A、らのAnalytical Biochsmi
stry 、 112 : 287−294(1981)。全血および血漿中の
グルコースを測定するためのpHの示差的測定とそれを行なう自動化系はその後
このグループによって述べられている。ルツアナ1M、らのC11nicalC
h s m18 try I 29 : 80 85 (198A )。
同じ装置と示差的pH技法とが血清、血漿および十二指臆分泌液のような生物学
的液体のリパーゼ活量の測定に使用するのに記述されている。カリオツタF、ら
のC11nical Chemistry。
31 ;257−260 (1985)。この示差的pH測定技法の精密化は血
漿および全血中の尿素、クレアチニンおよびグルコースの測定のための基礎とし
て役立つといわれる。酵素、ウレアーゼ、クレアチニンイミノヒドロラーゼ、お
よびヘキソキナーゼ、はそnぞn、それらの測定に用いられる。この三つの基質
の濃度は反応がおこってしまったのちの溶液のpHの観測される変化を基に計算
される。
米国特許4,353,867 (1982)において、ルツアナは生物学的溶液
(例えば、血液、血清、尿)の中のグルコース、尿素、および酵素のような塗質
を測定する装置と方法を記述している。その方法は示差的pH測定を用いるもの
であり、その場合、21向のガラスpH電極が別々の溶液中に置かれており。
試薬が添加さfたのちの溶液中のpH変化が測定され、関心物質の濃度は観察p
Hf化から計算さnる。その装置は試料キュベツト、2個のガラス毛管電極をも
つセル、この二つの電極におけるpHを測定する手段、および、そのpH測定か
ら物質濃度を計算する電子的手段、から成る。
免疫センサー(itnmunosensor )電気化学的免疫センサーは電位
差的測定として、あるいけ電流的測定として、のいずfかで記述されてよい。電
位差的免疫センサーは抗体または抗原のいずれかを測定するのに用いることがで
きる。七nらは直接ま穴ケ間接のどちらかとして記述してもよく、膜または固体
電極のどちらかであることができる。
抗原測定用の直接的電位差的免疫センサンの例はヤマモトらによって述べられて
いる。抗体、抗hcc、がチタニウム線上で固定化さjる。その抗hcG[極と
参照電極とを緩g!溶液中に置く。抗原、hCJ f添加し、抗原がその固定化
抗体へ結合するので、その二つの電極間の電位差は平波に達するまで変化する。
その平衡@位差は抗原素度に直接比例する。ヤマモトらのC11nical C
hemistry 、26 : 1 569−1 572(1980)。
電位差的応答の正確な性質は十分には理解さ九ていないが、表面電荷の中和まf
J:、け再分配置(関係すると一般的には認識されて(〜る。
抗体測定用の直接的電位差的免疫センサーのもう一つの例はキーティングおよび
レヒニツッにより述べられている。このタイプの免疫センサーは、マーカーイオ
ンによって固定さ4る背景1位のg胴f逆じて、電位変化が抗体一度に比例する
よ5な会式で、特定的抗体に応答する。ジゴキシン抗体測定用の免疫センサーが
記述されており、その廖合、ジゴキシンはマーカーイオン担体分子ベンゾ−15
−クラウン−5へ結合する。生成する複合体がポリビニルクロライド膜の中へ組
人jら1Lる、キーティング、ijY、およびレヒニツッ、G、のAnalyt
icalChe+++igtry 、 56 :801−806(1984)。
抗体測定用の抗体−選択的電位差計電極がま友しヒニツツおよびツルスキーによ
り米国特許4,402.819において述べられている。この方法の日常臨床的
使用に対する重大な制約はマーカーイオンの一定の背景水準を維持することが必
要であり、従って、生物学的試料カニ分析的に透析されねばならないことである
。
間接的電位差的免疫センサーは酵素結合的のものであり、酵素−基質反応の生成
*−を測定するのに電気化学的センサーを用いること以外には、酵素免疫検定法
と同類である。均質および不均質の両方の電位差測定的酵素免疫検定かに述さf
lat、例えば、ボアチオ−および共同研究者はエストラジオールの測定につい
て不均質系の電位差的酵素結合免疫検定を記述している。
ボアチオ−らのC11nical Chemica Acta 、 113 、
175−182(x981)、 エストラジオールに対する抗体は多孔質ゼラチ
ン膜上へ固定化される。その膜をペルオキシダーゼ標識化エストラジオールと遊
離エストラジオールと一緒に保温する。
洗滌後、膜を沃化管感知電極上に固定する。ベルオキダーゼ活量は過酸化水素と
沃化物イオンの存在下において測定される。
沃化管選択性電極電位はエストラジオール濃度の関数である。
ヒトのIgGについての均質系の電位差的酵素免反検定はフオノングおよびレヒ
ニツッによって述べられている。その方法ij、XgG抗体へ複合したクロロペ
ルオキシダーゼによって触媒される。ベーターケトアジピン醇によるCO□ 生
成と、IgGによって閉止することに基づいている。フォノングおよびレヒニツ
ッ、G、のAnalytical chemistry 、 56 :2586
−2590(1984)。こ(D酵素−xgeQ合体を、酵素基質との反応前の
抗原(IgG ) を含む試料と一緒に保温する場合には、電位差測定的CO2
ガス感知電極で以て測定されるCO,放出の観察さする速夏が減少する。活量の
減少は試料中のIgG一度に比例する。
11流測定的酵素免疫センサーは、電流測定的センサー、通常は@素電極、が酵
素活量を測定するのに使われること以外は。
電位差的免疫センサーと類似である。例えば、アイザヮ、モリ才力、およびスズ
キhm瘍抗原アルファー7エト蛋白質(AFP)の測定の之めの電流測定式免疫
センサーを記載している。アイザワらのAnalytica Chimica
ActlL、 15 : 6−67(1980)。 抗体ムFPは多孔質膜上で
共有結合的に固定化される。膜をカタラーゼ標識化AFPおよび遊離AFPと一
緒に保温する。競争的結合後、膜をカタラーゼ活量について、過酸化水素添加後
の酸素の電流測定によって検査する。類似の方式で、ボアチオ−と共同研究者は
肝炎8表面抗原の測定用の電流測定式の酵素免疫検定を述べている。ボアチオ−
らのC11nic&l Chemistry、25:318−321 (197
9)。
酵素結合性の電流測定式センサーの限界は酵素合体合成の必セ性と酸素電極のよ
うな現在入手できる電流測定式センサが高価であることとである。
発明の開示
本発明はイオン選択電極を使用することによって試料のイオン含量または活量と
試料の他成分の濃度を電位差測定する几めのセンサーである。このセンサーは、
生物学的液体の水素イオン含量ま7tけpH;生物学的液体の他のイオンの一度
;および、示差的pH測定または免疫検定の技法による、生物学的液体の他成分
(例えば、グルコース、尿素、トリグリセリド、尿酸、アスパルテートアミノト
ランスフェラーゼ(ACT)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、
アミラーゼ、クレアチニンキナーゼ(Cに)、アルカリ性ホスファターゼ、のれ
は自動化された取扱いまたは処理にとって特に有用である。
このセンサーはイオン選択電極から成り、それらの電極は一つの枠の中で保持さ
れかつそれらの間に多孔質物質(例えば、ボレツクス・チクノロシーズ社によっ
て製造されるような多孔質ポリエチレン)をもっている。この多孔質皆質は試料
が−たん電極へ施用されると電極間のイオン性流れの几めの手段を提供する。こ
れらのイオン選択電極Fiaptが測定されるべきイオンまたは他の物質に対し
て選択透過性である膜と参照電極とから成る。膜は使用前の事前調整を必要とし
ない。
選択性透過膜はイオン選択性化合物(あるいけイオン透過担体)と熱可塑性樹脂
または可塑性物質から成り、そfiはすべて有機溶剤中で溶解可能である。その
上、膜はまた可塑剤を含むことができる。pHセンサー用のイオン迦択性成分は
次の一般式
をもつ化合物であり、式中、
R,、R,およびR1は孤立に選ばれ、各々が】)ハロゲン:2ン 炭素原子数
が4−18個のアルキル基;3)ハロゲン置換アルキル基:4)アルコキシ基:
5)ハロゲン置換アルコキシ基; 6)40.RKよって代表されR4が1−1
8個の炭素をもつアルキルである酸基: 7)−COR,にょって代表されR3
がR4について定義され九基から選ばれるケト基:あるいは。
8)水素原子;であることができる。
本発明の一つの具体化において、膜ij有機プラスチックマトリックス、ポリビ
ニルクロライド(pvc)から成り、七詐はイオン選択性化合物2−オフタデク
ルオキシ−5−カルブエトキシフエニルヒドラゾンメソオキサロニトリルを含む
。このイオン選択性化合物、pvc、および本具体化における2−ニトロフェニ
ルオクチルエーテルである可塑剤、はすべで溶剤テトラヒトCI7ラン(THF
)中で可溶である。これらの成分は膜の処方を構成する。
好ましい具体化においては、膜は重責で約10−40チのpvcから成り、その
厚さri1ミルより大きい。特に好ましい具体化においては、@け重量で約20
−354のPvCでつくられ、約3−15ミルの厚さである。記述される膜は本
発明のイオン選択電極の一構成部材として用いちれる。そ?lはまた商業的に入
手できる電極体の中へ組入れることもできる。
本発明のセンサーはまた内部参照要素または物質をもち、そfiは襄it桓り定
すべき試料成分の既知良度を含む。
図IFiイオン選択軍極と把手とをもつセンサーの上面の透視図であり、その把
手はチーターが記録される磁気ストライプ(5tripe )?もっている。
図1jイオン選択電極と把手をもつセンサーの下面の透視図であり、その把手は
データーが記録さn;h磁気ストライプをもっている。
図3は試料の水素イオン活f(pH)または試料中の他のイオンの濃度″t−測
定するのに用いることができるセンサーの個々の構成部分を示す透視図である。
図4はイオン選択電極配置の模を的表現である。
図5#′i商業的に入手できるバレ/L/型電極の中へ挿入さ詐た本発明のイオ
ン選択膜を示す。
図6Vi示差的測定技法により試料の成分の活量または一度を測定するのに用い
ることができるセンサーの個々の構成部品を示す透視図である。
本発明の主題であるセンサーは試料のイオン含量ま7tは試料の他の成分の濃度
の電位差的抽1定に用いられる。それは生物学的液体(例えは血液)の水素イオ
ン活1iicまたはpH)ま几は他のイオンの濃度の迅速測定に−そして生物学
的液体の中の他の成分(例えば、グルコース、尿素、トリグリセリド、尿酸。
酵素例えばアスパルテートアミノトランスフェラーゼ(AST)。
アラニンアミノトランフェラーゼ(ALT)、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ
(CK)、アルカリ性ホスファターゼ)の濃度の測定に、特に有用である。試料
成分に対して選択的でありかつこの種のセンサーのイオン選択膜の中へ組入fL
ちれるイオン透過担体もま九本発明の主題である。
このセンサーをここに図を参照しながらさらに説明する。
図1から図3はイオン選択電極とデーターが2脅される磁気ストライプをもつ把
手と?もつセンサーを示している。これらの図の中で示されるセンサーは試料の
水素イオン含量またにpH1あるいは試料中の他のイオンの一度を測定するのに
使用できる。これらの図は試料の水素イオン含量の測定に用いらnるセンサーを
記述する際にここで参照する。しかし、とのセンサは他のイオンまたは他の成分
の測定にも同じく使用できることは轟然である。
一センサー30は、上部部分12と下部部分14とをもつ枠または胴体10の中
で保持されるイオン選択電極から成る。さらに、センサ−30t/′i下面上に
磁気ストライプ8をもつ把手5枠】0の上部部分12F14個の開口4とそれら
開口間に配置された3個の溝6をもっている。枠lOの下部部分14は4個の開
ロアとそれら開口間に位置する3個の溝(図示せず〕とをもつ。上部1部分12
と下部部分14a開口4と開ロアとが一線に列び、上部部分中の溝6と下部部分
内の溝とが一線になるような関係にある。その結果、開口4と7は4個の開口1
1を形成し、上部部分の溝6と下部部分中の溝とけ開口11のうちの3個の間の
空間を規定する。上部部分12は開口4の間に位置する小さい穴15をもつ。穴
15は空気の通過を許す。イオン選択電極は開口11の内部に置かれ、円筒状ま
たは棒状の形の多孔質管質17によって連結され、試料が電極へ適用さn7t−
ときKvL極間のイオン的流れの手段を提供する。この円筒状またFi枠棒状多
孔質物質17は開口11間の空間の中に改かれる。
上部部分】2と下部部分】4とは、多孔質物質17上へ、あるいけ枠ま7tは胴
体10のその二つの部分の間またはそれらの中することによって、シールされる
。
図3に示すように、センサー30はイオン選択電極を置くことができる4個の位
置をもっている。一般的には、これらの位置の各々において1個のイオン選択電
極が存在するけれども、こnらは望まれる分析的情−に依存して各種の組合せに
おいて使用できる。従って、上部部分12中の溝6および下部部分14中の溝の
位置は実施しようとする分析にとって必要なとおりに変る。例えば、上部部分1
2中の*6は図3に示すとおりに位置することができ;下部部分14中の溝は、
上部部分12と下部部分14とが接合されるときに、上述のとおり、3個の電極
の間で空間が規定されるように位置される。あるいはまた、2”個の溝6を上部
部分中で相互に平行に置き、下部部分14甲の溝がそれに対応して位置させるこ
とができる。2個、3個、または4個全部の電極を使用できる。多孔質榛17は
親水性で電導性であるか、疎水性で非電導性である。一対の電極の間での電導性
物質まfcは非電導性物質の使用は実施されるべき分析によって決定される。濃
の各種組合せは例によって最もよぐ記述される。
第一の例においては1図4aに示すとおり、三つの膜が活性であり、この三つす
べてが同じ膜を含んでいる。位taとbは測定されるべ會イオンの既知良度?も
ち1位置Cは対象とするイオンの未知濃度を含む試料をもっている。aとbにあ
る溶液の間で発生さnるsmfはセンサーを検量するのに使用でき、傾斜のWを
次に使ってbとCにおける溶液の間で発生するauntからその試料の#夏が決
定される。さらに、aとbO中のイオン濃度は既知であるので、予め測定した傾
斜値を使用して、aとbの間室位差がどうあるべきかを計算してこの値を測定し
九電位差と比較するか、あるい#″taKついて一度を計算しこれが既知の値か
らどう変るかを決定することが可能である。臨床化学的な意味においては、a中
の溶1eLを次に対照標準として使用される。
このa、b、a配置はまた繰返しの試料を分析できるような方式で使用すること
ができる。これは図4bにおいて示される。この場合には、同じ試料を位置aと
cKtき、参照溶液をbに置く。予め測定し友傾斜値を使い、同じ試料について
二つの値を同時に決定することができる。
二つの分析成分を同時に測定することも可能である。これは図40において示さ
れている。例えば、aとdけ一つの分析成分について選択的な膜であり、bとc
#:を別の分析成分について選択的な膜であることができる。有用な組合せはナ
トリウム/カリウム、pH/カルシウム、グルコース/尿素、および尿素/クレ
アチニンであることができる。これらの場合Kd予めきめた検量データーが必要
とされる。
酵素/基質センサーは図4已において示すとおりに構成することができる。この
場合には、a、b、cおよびdはすべて同じ膜であることができ1例えば、それ
らはすべてpH測定用であることができる。しかし、aとdはpH膜のほかに、
固定化酵素を含む。未知分析成分試料濃度がCとdの両方へ添加さfl、、同じ
分析成分の既知濃度がaとbへ添加される。亀とdの中の酵素が基質に働き、試
料中の分析成分の濃度に比例するpH変化を生ずる。すべての膜が同等であると
仮定すると、亀とb(参照溶液)の間で発生する6璽fは電極を検量するのに用
いることができる。aとbについて得られる検量データーは次にCとdの中の試
料濃度を計算するのに使用できる。
酵素/基質センサーは図4Kにおいて示すとおりに構成することができる。この
場合には、a、bおよびcFiすべて同じ膜であり、例えば、それらはすべてp
H測定用である。しかtz−sc、bおよびCけpH膜のほかに、固定化基質を
含む。1とbの中の基質濃度は異っており、C中の基質濃度Fiaおよびb中と
同じであることができ、あるいは異なっていることができる。
未知濃度の分析成分酵素をCへ添加し、測定されるべき酵素の既知濃度faとb
へ添加する。亀、b、および。の中の酵素はa、bおよびCの中で基質に作用し
、試料中の酵素濃度に比例するpH変化を生ずる。すべての膜がすべて同じであ
ると仮定すると、aとb(参照溶液)の間で発生するsmt を電極を検量する
のに使用できる。aとbについて得られる検量データーはCの中の酵素試料濃度
を計算するのに次に使用してよい。
図4kにおいて代表されるような酵素/基質センサーの中で固定化することがで
きる基質の例は、L−アラニンおよびL−アスパルテートのようなアミノ酸、ク
レアチンおよび澱粉である。これらはそれぞfl、アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ。
アスパルテートアミノ−トランスフェラーゼ、クレアチンキナーゼ、およびアミ
ラーゼ、の試料の中での測定に用いることができる。実施例8において述べると
おり1図4kにおいて表わされるような酵素/基質もまた試料のクレアチンll
!1度を測定するのに用いることができる。
もしカイネテイツク・レート法(kinatio rate method)を
用いるとすれば、この方法論は事実上、酵素的反応速度に及ぼすいかなる温度効
果をも「補正J (”calibrats ouz” )することを可能にする
。終点または平衡測定の場合には、ネルンスト式中の温度効果が正規化(nor
malized ) される。
電極間の多孔質棒17は電導性であることができ、あるいけ非電導性であること
ができ、一対の電極間の電導性まfcは非電導性物質の使用Fi実施さnるべき
分析によって決定される。
多孔質物質はナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ−ビニリデンフル
オライド、エチレンビニルアセテート、スチレン−アクリロニトリル、あるいは
ポリ四弗化エチレンのような微孔質プラスチックのものであることができる。こ
の多孔性物質はまたロールに巻いたフィルターペーパーあるいは縦長のファイバ
ー束のような性質のセルロース質のものであることができる。一つの具体化にお
いては、この多孔性物質は超高分子量微孔質ポリエチレン(ボレツクスのテクノ
ロジー社、フェアバーン、GA)の円筒形状庁から成る。この物質はその性質は
水でi’qfiないよう疎水性である。
この多孔性物質はそnを界面活性剤の溶液(容積で約0.1俤から0.6チ)の
中に浸すことによって親水性とすることができる。有用であることが発見さt′
Lfc界面活性剤は非イオン性界面活性剤5例えば、トライトンx−100(ロ
ーム・アンド−ハース社)を含む界面活性剤のオクチルフェノキシポリエトキシ
エタノール族、プリイ゛(Br1j ) 35のようなポリオキシエチレンエー
テル、ツイーン20のようなポリオキシエチレンンルビタン誘導体、3Mのフル
オラドFC−171のようなフルオル脂肪族ポリマー状エステル、およびシェレ
ックス・ケミカル社のアロサーフ66PK−12のような界面活性剤、である。
アニオン性およびカチオン性界面活性剤も使用できる。湿潤剤または界面活性剤
なしの多孔性物質は非電導性でおる。二つの室径間に界面活性剤が存在しないと
、もちろん、非電導性全もたらす。
イオン選択電極はイオン選択膜18と銀/塩化銀の物質である参照電極22とで
構成さ九る。イオン選択11118はイオン選択化合物(イオン透過担体)、熱
可塑性樹脂および可盟剤でつくられ、これらはすべて有機溶剤中で可溶である。
その腹は保持器リング24のような保持手段によってイオン選択電極の中で所定
位置に保持される。このようIc、この保持器手段とセンサー胴体の下部部分と
の間に、膜からの洩九がないような機械的シールが存在する。センサーの重要特
性は、その中に組込まれるイオン選択膜が、そのセンサが使用できる前の事前調
整(例えば、測定されるべきイオンの溶液の中に浸漬)fir必要としない。
水素イオン選択膜の場合には、膜中に組込−!ねるイオン選択性化合物は一般式
をもつ。この化合物において、R8,R,およびR1は同種また#i異種である
ことができる化合物の成分を表わす。R19R2’−およびn、Fil)ハロゲ
ン、 2)炭素原子数4−18個のアルキル基、3)ハロゲン置換アルキル基、
4)アルコキシ基、5〕ハロゲンf!lt換アルコキシ基、 6) −CO,R
,によって表わさ?LR,か1−18個の炭素原子をもつアルキルである酸基、
あるいは、 7)−COR,によって表わされR,:AZR,について定義さn
る基から選択されるケト基、あるいに、水素原子、であることができる。
水素イオン感知膜の成分として特に好ましいこの一般式の誘導体は次のものを含
む:
ζ 2−トリフルオロメチル−4−オクタデシルオキシフェニルヒドラゾン−メ
ソオキサロニトリル
b、2−オクタデシルオキシ−5−トリフルオロメチルフェニルヒドラゾン−メ
ンオキサロニトリル
C,2−オクタデシルオキシ−5−カルブエトキシフェニルヒドラゾンーメソオ
キサロニトリル
cl、2−オクタデシルオキシ−4−フルオロフェニルヒドラゾンーメソオキサ
ロニトリル
イオン選択性化合物がカルプエトキシフェニルヒドラゾンメソオキサロニトリル
である良は、それらが1分またFi1分以下の応答時間全示し1、安定な電位を
生じ、水素イオンの1桁変化あたり57−59mVの程度の傾斜を示し、かつ華
前調整を何ら必要としない、という点において特に有用である。その種の膜がな
せすぐれた性能特性を示すかは明らかではない。しかし、それはアニリノ基に対
してメタの位置の電子引抜性エステル基とそのプロトンが存在することに帰せら
れるかもしnない。
そのプロトンは明らかにより酸性であり、それゆえ、より容易に交換される。
上述のイオン選択性化合物のほかに1本発明のイオン選択膜18はまたグラスチ
ックまたは熱可塑性樹脂と、任意成分として、可塑剤、とから成る。使用さnる
プラスチックは溶剤流延法によってフィルムを形成するのに使用できるプラスチ
ックFXトれでもよい。例えば、そのプラスチックはポリビニルクロライド、ポ
リビニルアセテート、シリコーンゴムまたはセルロースアセテートであることが
できる。この膜成分は支持体を提供し膜へ成形する目的に役立ち、かつイオン選
択性化合物が組込まれるマトリックスとして作用する。更に、疎水性物質である
ため水に対するバリヤーとして働く。一つの具体化においては、膜中で用いられ
る熱可塑性樹脂はポリビニルクロライドである。使用できるその他のものは、セ
ルロースアセテート、ポリビニルアセテート、およびシリコーンゴムを含tr。
可塑剤は、こ1mは膜の任意的成分であるが、膜処方の配合ま7’Cは製造を容
易にしかつ膜の可撓性を加善する一般的目的に適する非揮発性物質はどれでもよ
い。可塑剤はまたイオノホアの溶解に寄与する。それは例えば、単独か組合せで
使用する次のものの一つまたは一つ以上であることができる:フタレート、アジ
ペート、セバケート、脂肪族および芳香族エーテル、脂肪族および芳香族ホスフ
ェート、脂肪族および芳香族エステル、およびニトロ化さfL7を脂肪族および
ニトロ化され友芳香族工=チル。本発明の一つの具体化においては、可塑剤は2
−二トロフェニルオクチルエーテルである。
イオン選択膜18の成分は各種の量で存在することができる。使用プラスチック
に膜の重量で約10−30チから成り、一つの具体化においては約28重量%で
ある。イオン選択性化合物は膜の重量で約1%から約10チであることができ、
一般的には重量で約3チから約6%である。可塑剤は膜の重量で約50%から約
80%であふことができ、一般的には重量で約70チから成る。
本発明のイオン選択電極の中へ組込まれるイオン特異性膜18は一般的にはlミ
ルより大きい厚みのものものであり、好ましくは厚さが約3ミルから約15ミル
である。
本発明のイオン特異性膜は少くとも二つの異なる方法:溶剤流延および浸漬塗布
、Kよってつ(ることかできる。溶剤流延法は実施例2において解説され、一般
的には次の各工程を含む:
1、a) エーテルを生成させるための硝酸塩化フェノール系物質のアルキル化
、 b)ニトロ基のアミノ基への還元、 C)このアミンの塩酸塩の沈澱、およ
び、 d)塩酸塩のメンオキサロニトリル誘導体への転化、による水素イオン特
異性化合物の製造;
2、揮発性(有機質)溶剤中でのイオン特異性化合物、可塑剤およびプラスチッ
ク物質の溶解:
3、揮発性有機溶剤の除去(例えば蒸発による)。
膜が形成され几のち、そtl−を適切な形態に形状を与え(例えば、切断による
。パンチ型道具を使用。)1本発明の電極胴体あるいけオリオン電極胴体(オリ
オン・リサーチ社、ケンブリッジ、MA、カタログ4950015)、のような
電極胴体中へ組入れる。図5は0−リング63によって電極中に保持された本発
明のイオン選択膜62をもつオリオン電極胴体61を示している。第二〇〇−リ
ング(図示せず)が膜の周りの試料洩れを防ぐ。
イオン選択膜はまた浸漬塗布法または連続的塗布法によって形成させることがで
きる。この方法においては、ナイロンメッシュあるいはポリエステルメツシュ(
例えは、ペキャップ355.?クト社、エルムスフオード、NY)のようなベー
ス物質を溶剤浴(例えば、4−メチル−2−べ/タノンのようなケトン)の甲に
入れ、メツシュ内で捕捉されている空気を除く。
これは例えはブランソンの超音波クリーナーを使って超音波的に行なうことがで
き、処理所要時間は約10−15秒である。
溶剤でまだ濡れている間に、そのメツシュを膜調合智の中に入j1.それを取出
したのち、過剰の調合物を掻き取る。調合物を含むメツシュを次に乾燥し、これ
は例えば室温においてかま九は温空気(例えば35−50℃)中で行なうことが
できる。
内部参照物質は測定されるべきイオンの塩の溶液から成る。
も1.
【熱電極が銀/塩化銀である場合には対イオンは塩化管から成る。寒天ま
たはグルコースのようなゲル化剤を参照物質を所定位置で固定するのに使用でき
る。pHセンサーの場合には、参照物質は緩衝溶液である。一つの具体化におい
ては、pH参照物質け50tnlのグリセリン、pH7,4の燐酸塩緩衝化鍼水
(シグマ・ケミカル社、セントルイス、MO)から成る水溶液の50d、および
2.0tの寒天、から成る。この混合物を加熱して寒天を溶かし、次に膜後方に
ある凹みの中に入れる。しばらくして、通常は5−10分後圧、混合物がゲル化
する。カリウムセンサーについては、その水性溶液は50t/の0.2 M K
CJであり、す) IJウムおよび塩化物センサーについては、その水性浴tは
0.2 M NaQjである。
他のイオンの測定に図1−3のセンサーを変性するに#−j。
少くとも一つの膜成分を変え、内部参照物質を測定されるべぎイオンを含むよう
に変性することが必要である。例えば、カリウムの測定には、膜はパリノマイシ
ン、ベンゾ−15−クラウン−5のクラウンエーテル誘導体あるいけいくつかの
他の中性担体のような、カリウムに特異性のイオン透過担体を含む。内部参照物
質は塩化カリウム溶液から成り、ゲル化剤を併用しあるいは併用しない。
ナトリウムの測定に図1−3センサーを変性するには、膜はモネンシン、ベンゾ
−12−クラウン−5のクラウンエーテル誘導体あるいはいくつかの他のナトリ
ウム中性担体〔例えば、シモンらのAnalytical Cham、、 51
:351−353(3979)ン。
のようなナトリウムについてのイオン透過担体を含む。内部参照物質は塩化ナト
リウムを含む。
塩化物の測定に図1−3のセンサーを変性するには、膜は四級アンモニウム塩ア
リクワット336のような塩化物についてのイオン透過担体を含む。内部参照物
質は塩化物イオンを含む。
前述のとおり、センサー30は磁気ストライプ8をもつ把手5′ftもっている
。このストライプはクレジット・カード上で共通的に見出されるストライブにき
わめて似ており、製造時においてストライプ上へ記録されるデーターを保持して
いる。そのデーターは、例えは、次の情報を含む:1、試験タイプ:独特の2つ
のアラビア数字は各々特定のタイプの試験カード(すなわち、各々特定のアナラ
イト)全認定する。これは、操作者が試験タイプの情報を登録する必要性をなく
し、その結果、エラーの可能性をな(する。
2、校正定数:測定信号に基づいてアナライト濃度を計算する几めの計器メそリ
ー内に貯蔵されている式に用いる3つのアラビア定数。この定数は、試験カード
の起り得る失敗を検知するための同時校正と連動して使用してもよい。
3、満期二計器に試験カードの満期をめさせそして期間外のカードが使用されな
いようにする4つのアラビア数コードロこの定数のフォーマット1jYYWWで
あり、ここでYYti年の巖後の2つのアラビア数字(例えば1985年では8
5)であり、WWはその年の週(例えば5月5日から5月11日までの週は週1
9である)である。
4、予備:4つのアラビア数字は将来の使用のために残されている。
上記データに加えて、以下の1管理慣用データをカードに記入できる:
1、リーダー:磁気ストライプ読取回路に対して最小限15個のl1101゜
2、スタートセンチネル:データの開始を表わすのに用いる特殊の文字。
3、LRCt:磁気ストライプからデータを読み取る際にエラーを検知するため
の各データの文字に付されるパリティ−ビットと連結して使用される水平冗長検
査。
磁気ストライプの独立的機能は一回だけ使用するよう設計されている使い捨てテ
ストカードの再使用を防ぐことである。
こfl、はテストカードが計器から取出されるときにコード化情報を破壊するこ
とによって達成される。上述のエラーチェック機能はカードを再使用しようとす
る場合にそのカードを拒絶する。
図6fl示差的測定技法により試料成分の活量またはa度を測定するのに用いる
ことができる本発明のセンサーを示している。測定できる生物学的液体(例えは
、血液、血清、血漿、尿素、唾液、脳背髄液)の成分は、例えば、グルコース、
尿素、トリグリセリド、クレアチニン、リパーゼ、尿酸、および、他の酵素(例
えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ(8GPτまたけAL丁);アルカリ
性ホスファターゼ(ムLP):クレアチニンキナーゼアスパルテートアミノトラ
ンスフエラーゼ(8GO?またはA、ST)を含む。
センサ−70F!イオン選択電極から成り、それは上部部分42と下s部分44
とをもつ枠または胴体40の中で保持される。枠40の上部部分42は4個の開
口34と開口間に位置する3個の溝36をもっている。枠40の下部部分44は
4個の開口35と開口間に位置する3個のl1llftもっている。上部部分4
2と下部部分44は開口34と開口35とが一線に並び、上部部分42の溝36
と下部部分44の溝とが一線に並ぶ関係にある。その結果、開口34と開口35
とは開口39を形成し、上部部分42の溝36と下部部分44中の溝とは開口3
903個の間の空間を規定する。上部部分42#:を開口34の間に位置する小
穴43を有している穴43は空気が空間41に入ることを許す。
イオン選択電極は開口39内に置かれ5円筒状または棒状である多孔性物質によ
って連結される。多孔性−質46ij電極において試料を適用したときの電極間
のイオン的流れの手段を与える。この円筒状ま九は棒状の多孔性物質46は開口
390間の空間41の中に置かれる。
図1−3のセンサーについて述べ次とおり1図6に描かれている4個より少なく
おるいFi4個より多いイオン選択電極全使用することができる。また前述した
とおタ、電極間の多孔性物質は親水性または疎水性であることができ1分析の種
類がこの特性を決定する。例えは、酵素基質を図6に示すセンサーを使って測定
しかつ参照試料を使用すべき場合には、その配ffi&:は図46に示されると
おりのものであることができる。
これらのイオン選択電極は酵素または基質を固定化させt層48:イオン選択膜
50:この両者の間に置いた膜52:内部参照物*S4;および、参照電極56
.から成る。層48近傍に追加の膜58が存在することができる。
イオン選択膜は尿素電極の場合として、H+またはアンモニウムイオン(NH:
)について選択性であることができる。アンモニウム選択膜の場合においては、
イオン透過担体はノナクチン(nonactina )のようなアンモニウム選
択性の物質である。イオン選択膜はイオン選択電極中で保持器リング60のよう
な保持器手段によって所定位置で保持される。
R148は少(とも一つの酵素または基質をその上において固定化させている。
層48は例えば、約180ミクロンの厚さをもつニトロセルローズ膜(例えば、
タイプAK100、シュライヘル・アンド・シュニル社、キーン、NJ)である
ことができる。この層はまたナイロン、セルロース、セルロースアセテート、ガ
ラスファイバー、あるいけ、酵素または基質の固定化用固体支持体として役立つ
ことができる多孔性物質のどれでつくってもよい。酵素まfI:、げ基質は物理
的保持(例えば固相上への吸着)あるいは化学的保持(例えば、共有結合まyc
i’を架橋)によって固定化させることができる。
層48は膜52によってイオン選択膜50から分離されており、その膜は一般的
には簿り(例えば20ミクロン以下の厚さ)かつ例えば透析膜(例えば、スペク
トラ・ボール2、スペクトラム・メディカル学インダストリーズ社、ロサンセル
ス)であることカニできる。膜52は、例えば、イオン選択膜50の成分が層中
へ移行するのを妨げることによって層48の固定化酵素の活性を保存するという
目的に役立ち、移行は酵素の変性まfcは不活性化の原因となる。
膜58Fi任意的であり、その存在は試料のどの成分が測定されようとしている
か、そして/または、その成分がどのようにして測定されようとL7ているか、
によってS1定される。陵58の機能は層48の酵素または基質の物理的保持(
固定化)を助け、モして/ま友は、基質に対する拡散障壁として役立つことであ
る。例えば、層48中で固定化された酵素の基質一度を測定するために、終点測
定ではなく動的辿1定を行なうことが望ましいかもしれない。動的測定について
のM練性の範囲をひろげるためには、酵素反応に拡散制限(diffusion
11m1ted )であることが必要である。この場合には、膜58は両目的
に役立つ。しかし、終点測定が望ましい埼合には、拡散障壁は必%とさn、ずか
つ膜58Fi必要ではない。膜58tj基質に対する拡散障壁として役立グこと
ができる、再生セルロース(透析膜)またはその他の超濾過膜または逆滲透膜物
質でつくることができる。
内部参照物質541−j緩衝溶液から成る。一つの具体化においては、そrtは
pH7,4のgQI!i!塩緩衝鍼水の充填用溶液(fillingsolut
ion ) から成る。好ましい具体化においては、それげ約50M1のpH7
,4の燐酸塩緩衝化鍼水、約501のグリセリンおよび約2.O?のアガロース
から成るゲルである。
参照電極56は固定され九電位をもつ!極であり、試料溶液が変えられあるいは
検量用溶液によって置換えられるときにも液体ジャンクション電位に変動を示さ
ない。満足できる参照電極性能についての主要な要請事項け、可逆性(電気化学
的意味における)、再現性および安定性である。三つの凰の参照電極系が現在使
用されている。飽和カロメル電極(sgc)のような金属アマ、ヤガム:キンヒ
ドロ/またはフェリーフェロシアナイド電極のようなレドックスカップル;銀−
塩化銀参ff、!極のような金属/ハロゲン化金属電極;である。本発明におい
ては、参照電極は一般的には銀/塩化銀ボタン(button )である。
本発明の主題は以下の実施例によって例証されるが、それらはl!lll@を意
味するものと考えるべきではない。
水素イオン特定性化合一2−オクタデシルオキシ−5−カルボエトキシフェニル
ヒドラゾンメンキサロニトリルを次の方法で調製する。先ず、オルガニツクシン
セシス(Organie8ynthegis )、Goil、 vol、3 、
pp140−!4] に記載の一般法に従ってエチル−4−オクタデシルオキ
シ−3−二トロベンゾエートを調製する。
次の混合物を、機械的攪拌器を備えた1 1Jツトル3頚フラスコ中で72時間
還流する:
25ン(0,12moi)のエチル−4−ヒドロキシ−3−ニトロベンゾエート
ランカスター〇シンセシス(L+ancaater 5ynthesis )。
ウィンドハム(winaham )、N)1カタログ+645141?(0,1
2mol)の96チ1−ブロモオクタデカンアルドリッチ(Aldrich )
ケミカル社、ミルウォキー。
WX、カタログ≠19,949−4
16.4Fの無水炭酸カリウム
500dの無水アセトン
還流時間を終えて、反応混合物を室温(即ち、約20−27℃)K冷却し濾過し
て塩類を除く。p液をブチ−ブリンクマン(Buchi−Brinkman )
回転蒸発器を用いて蒸発させる。
残留物を500mのトルエンに溶かし、順次、400mの5チ炭酸水素す)+J
ウム水溶液で4回、さら[400dの飽和塩化ナトリウム水溶液で1回洗滌する
。トルエン層を無水硫散ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させる。これにより得几
油は放置すると結晶化する。固形物をヘキサンで再結晶させ、カーボンで脱色さ
せる。収量はエチJ%/−4−オクタデシルオキシ−3−ニトロベンゾエート(
m、p、48 56°)36?(収率66s)である。
接触水素化によって該二)o化合物をアミノ化合物に還元する。上記の;トロ化
合物10Pftカーボンに担持させた10チパラジウムO15g−と共に200
it/のヘキサノに加える。混合物全パル(parr )水素化器に入れ、6
pslgの水素圧の下で40℃に加熱し、同器内で18時間振盪させる。反応混
合物を熱い間(たとえば、約50℃)にセライ) (Cs1ite ) 濾過器
補助媒体〔通常ケイソウ±(マンビル(ManvilX! ) ) f通して濾
過し、溶液を塩化水素ガスで処理してアミンの塩酸塩をほぼ定量的な収率(m、
p、141−145°)で沈澱させる。
エチル−4−オクタデシルオキシ−3−アミノベンゾエートの塩酸塩をブラウン
等(Brown et ILl ) の方法の改良法によってメンキサロニトリ
ルに変化させる(米国特許第3.743,588号〕。上記塩酸塩8.5 P
C0,018mol)を温めなから12のジメチルホルムアミド(DMF)&C
溶解させ。
約00の温度にする。この***液に31LJ?の#塩酸を加え1次いで500i
dのDMFに溶かし7′c1゜3Pの亜硝酸ナトリウムを加える。反応混合物を
1時間磁気攪拌を行う。次に1.15mの予め温めたマロノニトリルを加え、そ
の混合物を約lO分間磁気攪拌を行う。強塩基性溶液(たとえば、pHが9より
も大ンとなるだけの量のトリエチルアミンを加える。混合物を室温に温めて18
時間攪拌する。反応混合物ft良塩酸で酸性(pHを約2.3)にすると沈澱物
が生じる。沈澱物を濾過し、水で洗い、メタノールで再結晶させる。得られたも
のは約7.1’(76チ)の2−オクタデシルオキシ−5−カルボエトキシフェ
ニルヒドラゾンメンキサロニトリル(+m、p、 76−77°)である。第1
表に示す他の誘導体は同様の方法で調製し、た。
実施例2−PVC膜の溶液流延及びイオン選択性電極への組込1.51の2−ニ
トロフェニルオクチルエーテル〔ブルカ(Fluka )ケミカル社、ハウプパ
ウゲ(Hauppauge)、NY。
カタログ÷737323及び0.10S#の水素イオノホア(実施例1vc記載
した方法によって調製されるようなもの)を10dのテトラヒドロフランに溶解
させる。この溶液に0.6?の極めて高分子量で1.385 fP/ccの密度
を有する粉末状ポリ塩化ビニル〔プルドリツチ(AzariOh )ケミカル社
、ミルウオーキー、11.力20グ+18,261−:a)?添加−t−ル。P
v025に溶解するまで混合物を振盪させる(たとえば、うずまき状に)。
pvc浴液を厚さ橘4の応力除去を行ったボリア0ピレン板上に流し、テトラヒ
ドロフランの蒸発を生ずる状態に保たせる。
たとえば、テトラヒドロフランが蒸発するに従って除去されるように、ヒユーム
フードの下で室温で蒸発をおこさせることができる。得られた生成物はイオン各
定性化合物を含むプラスチックの膜である。+7コルクボーラー(内径0.51
n)を用い膜から円板を切り取り、オリオン(orion ) を極体〔オリオ
ンリサーチ社(0rion Re5earch Inc、 )、ケンブリッジ。
MA、カタログ+9500153に取付ける。内部参照電極は銀/塩化銀参照電
極であり、内部充填溶液FipH7,4のリン酸塩緩衝塩液〔シグマ(8XGM
A)ケミカル社、セントルイス。
MO、カタログナ1000−3)である。
該電極のpH−感知性能の評価が行われた。すべてのa+定は2501のビーカ
ー中で磁気攪拌を行いながら二重接点のAg/Ag0−1 参照電極〔コーニン
グ(Corning )、カタログ+476067〕を対照して行った。比較の
ために、組合せpH/参照電極を試験液に浸して、膜中の■Vの変化を、ガラス
電極で測定されるpHの変動に関連させつるようKpH変化を記録した。
本発明の膜は、伸ばした時に裂けも破n、もしなかったという事実によって明か
なように、良好な機械的強度を示した。さらに良好な分析性能をも示し、6乃至
8のpH範囲にわたり10単位轟り55−85mvの傾き値ft得た。但しこの
範囲の両端では若干性能が低下した。1価イオンの場合、理論的な傾きは25℃
で±59.1mマである。さらに、応答時間すなわち平衡に達するまでの時間は
1分よりも短かく又電極はなんら試験準備を必要としなかつ友。
上記の膜の性質を、水素イオン選択性成分が前に述べられた3−クロロ−2−オ
クタデシルオキシフェニルヒドラゾンメソキサロニトリルである以外は同様の方
法で+Xl+した襖の性質と比較し、た。前記の膜に比べて、塩素化メンキサロ
ニトリルから調製した膜は劣る性能を示し、た。すなわち、傾き値は同−pH範
囲にわたって40mv以下であり感度は減少を示した。
種々の水準イオノホアの性能を第1表にまとめる。イオノホアの位置に対してオ
ルH(親油性の18個の炭素@を有する3つの誘導体は親油性鎖がバラにある誘
導体よりも性能がすぐれていることがこの結果から判る。これから推測できるこ
とは。
水素イオン交換位置に隣接する親油性鎖は恐らく水素イオンに対する応答を促進
するのであろうということである。親油性鎖は活性位置の回りに製油性9域を形
成し7、それによって水素イオンに対する選択性を高めるのかもしれない。
実施例−3−尿素画定用酵素電極の調製第6図に示すようなセンサーを尿素測定
のために使用する。
尿素−選択性センサーは、酵素ウレアーゼを含有する別のFMをセンサーのイオ
ン選択性電極の中に組込むことによってつくられる。従ってpH膜か又はアンモ
ニウムイオン(NH:)膜であることができる。つ1/アーゼ含有膜に第4fl
dに示す電極a。
b、及びcIC存在する。この2つの膜は第3の膜(たとえば第6図の膜52)
によって隔離されている。
供試試料(たとえば、白液、血漿)、わ照及び校正試料を第4e図に示すような
′¥r、極に加える。
A及びBは多孔性物質でつくられた芯であり、湿潤剤の付加によって導電柱にさ
れている。a、b、及びcFiアンモニウムイオン選択性電極である。2種類の
既知のレベルの尿素、参患者の賦形けCに加える。Cもウレアーゼを有している
。
ウレアーゼによって触媒作用が示される反応けb及びCにおいて起る。こnによ
って患者の試料と、2つの校正試料との比較ができ、従ってテストカードの校正
が考旙される。
ウレアーゼが存在する場合には次の反応が起る:NH,C0NH+HOe2NH
5+00゜NH,−)−H,O□ N!(4−)−OH−co、−4−a、oマ
=公HCO,−+H“この結果、アンモニウム選択性嘆がアンモニウムイオン(
NH4−)濃度の変化を検知するために用いられることができるが又FipH選
択性膜がOH−の生成によって起るpHの増大を検知するために用いられること
ができる。
ウレアーゼ含有膜は次のように調製される:5ay/dのウレアーゼ(300ユ
ニツト/9ニユーイングランドエンチームセンター(New England
Enxyme Center )、ボストン。
MA)溶液をpH7,4のリン酸塩緩衝塩液〔ジグ−r (S igma )ケ
ミカル社、カタログ≠1000−3)中で調製する:有効と判明した他の緩衝液
けOlI MNaCj中の10組mol / Lナトリウムヘーベス(Sodi
um Hepes ) (pH7,4)及び0.11JNaQt中の10 mm
ol/L NaH,PO4,10mmol/L )リスペース(tris ba
se ) (pH7,4)である。12ミクロンのポアサイズのニトロセルロー
ス膜〔シュライヘル&シュエル(5chlai−cher & 5chuell
)社、キーン、NH,03421グレードAxloo:lの47jIJ径の円
板を700 ulの酵素溶液中に室温で5分間浸漬する。膜を溶液から取出し、
過剰の液を撹拌棒で掻き落す。膜を疎水性の面(たとえば、ポリプロピレンのシ
ート)上に置き室温で30分間風乾する。膜は密封容器内に4℃で貯蔵する。円
板を膜から切り取って電極a、b、及び。の中に置く(第4r図参照)。試料溶
液(25マイクロリツトル)をCに入れ校正溶液をa及びbK入れることができ
る。a、b及びC中のウレアーゼは校正溶液及び試料中の尿素に作用し、アンモ
ニア及び二酸化炭素(GO□)′fr遊離する。pH又はアンモニアの増加量を
測定する。
たとえば、40 mmol / L NaH,POい40 mmol / L
)リスペース、及び100 maol / L Na(J を含有するpH7,
5の緩衝溶液を調製した。5mmol/L尿素OlI 0 mmol/ L尿素
を含む緩衝溶液を調製し次。5mmol/L 尿素溶液をa及びCの中に入れ、
尿素を含まない緩衝溶液をbの中に入れた時約1分後に2511Vの差異が認め
らn7H010mmol/L尿素溶液の場合には50mvの差が観察された。尿
素の無い場合には起電力の差は認められなかった。
同様の挙動apH膜をアンモニウム選択性ノナクチン膜で置換えた場合にも認め
られた。
第4e図に関し、セルa、b、及びCは夫々固定化されたグルコースオキシダー
ゼ及びカタラーゼを有する膜を含有している。
グルコースオキシダーゼ(COD)及びカタラーゼが存在する場合には次の反応
が起るニ
ゲルコース十H,O+O,−〉グルコン酸(H”)+H,O。
カタラーゼの目的はグルコースの酸化で消費さfl、た酸素を再循環させ、そf
’LKよってグルコースが測定されつる線状9域を拡げることである。グルコー
スオキシダーゼ/カタラーゼ膜は次のようにh製し几:先きに述べ次ニトロセル
ロース膜を、pH7,4のリン酸塩緩衝塩液中に5w/atグルコースオキシダ
ーゼ〔300ユニツト/■、ベーリンガーマンハイ7 (Boehringar
Mannbsin )) 及び1g47m1カタラーゼ[40,000ユニツト
/タシグマ(Sigma )、 カタログ−+C−100:lより成る溶液70
0マイクロリツトル中に浸漬し友。膜は実施例3のように乾燥した。酵素円板を
a、b、及びCの中に入れた。試料中のグルコースの濃度はbと0との間に生じ
た電位差に比例することが見出された。
他のグルコース測定方法は酵素系としてヘキソキナーゼ/ATPを使用する。第
46図に関し、セルa、b、及びCけ夫々固定化されたヘキソキナーゼ、ATP
、及び塩化物、酢酸塩、又は硫酸塩のようなマグネシウム塩を有する膜を含有す
る。
ヘキソキナーゼ、ATP、及びマグネシウムイオンが存在する場合には次の反応
が起るニ
ゲルコース+A’l’Pコリヱ;グルコース−6−ホスフェート+ADP+Iτ
“ペキンキナーゼ/^TP膜は次のように調製1−た:前に記したニトロセルロ
ースDIをlo%グリセロール、0.25%トライトン(Triton ) X
−100及び0.005M)リエタノールアミンより成る緩衝液(pH7,8)
中に10 i/L酢酸マグネシウム%50519/dATP、及び101119
/dヘキソキネーゼより成る溶液1.Od中に浸漬した。試料中のグルコースの
a度はbとCとの間に生じた電位差に比例することが見出され友。
第4j図に関し、酵素(この場合にはリパーゼ)を含有する膜をセルa、b、及
び0の中に置く。リパーゼが存在すると次の反応が起る:
リパーゼ
トリグリセリド+H80−タグリセロール+脂肪酸(H+)さぎの実施例の場合
と同様に、ニトロセルロース膜を5η/dリパーゼ緩衝液〔シグマ(Sigma
)ケミカル社、カタログ≠L4384)中に浸漬して膜全調シした。トリグリ
セリドを含有する試料を添加すると生じるpHの低下がpH4l’極で検知され
た。
実施例6 尿酸測定用酵素電極の調製
さきの実施例の場合と同様に、そし′″′C第4e図に関し、ウリカーゼ〔50
ユニット/威、シグマ(j3igmlL )ケミカル社カタログ、、1(U18
78)及びカタラーゼ(1#/m40.Oo 。
ユニット/〜シグマケミカル社、カタログ4cm100’:lの溶液中にニトロ
セルロース膜を浸漬して尿酸用の時定な電極を調製する。酵素膜をセルa、b、
及び0の中に置く。
ウリカーゼ及びカタラーゼが存在する場合には次の反応が反応で生じたco□は
p)iの低下をもたちしpHt極で検知さt’l−る。
実施例7 テオフィリン測定用免疫センザーの調製この場合K14.テオフィリ
ンの測定はテオフィリンとカフェインの免疫化学的反応性の差にもとすくもので
ある。カフェインはメチル基1個だけテオフィリンと異っている。テオフィリン
及びカフェインはクラウンエーテル部分にカップリングされており、各結合体は
PvC膜の中に組み込まれている。テオフィリン膜が牛セルを形成し、一方カフ
ェイン膜が他の半セルを形成している。カフェイン膜は参照電極どして役立ち、
6膜は単独でカリウムイオンへの応答を示す。しかし、6膜が6炎電池に組込ま
れ、カリウムイオンを含有する同じ溶液を各半セルに入れる時に、2つの牛セル
の間に生じる起電力dゼロミリボルトに極めて近い。テオフィリン及びカフェイ
ン結合体ha気化学的意味では同一の挙動を示すけj、ども、テオフィリン抗体
に対する免疫化学的反応性の点では大きな相違がある。この免疫化学的反応性の
相違及び同一のイオン泳動性電気化学的反応性がテオフィリンに対する競合的結
合の示差電位差測定法の根拠となっている。この方法は一定のイオン強度も、ま
た一定のカリウムイオン活量も要しない〔レヒニッッ(Rechnitz)の研
究にあるように〕。本方法の主要な利点は、稀釈もせず透析もし、ない血清試料
を用いることができるという事実にある。
センサーの配[H第42図に示すようにすることができる。
センサーは、セルa及びd内のテオフィリン・クラウンエーテル結合体及びセル
b及びC内のカフェイン−クラウンエーテル結合体より成り、多孔性の接続部人
及びCによって隔離されている。テオフィリンを含む試料を0及びaK加え、一
方校正浴液をa及びbVc加える。競合的結合の局面にはカフェインに対する相
互反応性が低いテオフィリン抗体の存在が必要である。抗体?j、センサーでの
分析前に試料及び校正溶液に加えてもよいL2、或いはセンサー内で競合的結合
が起るようにセンサー七A中に包含させてもよい。抗体部位に対する競合は膜中
に固定さ′rL7tテオフィリンと試料中のテオフイリ/との間で始められるd
A b −1−A g (試料) + A g−4;tムbAg(試料)+Ab
Ag−((膜) (膜)
テオフィリン抗体が、膜(a及びC)内に[151?されているテオフィリンと
結合すると電位の変化が生じ、その大きさは試料中のテオフィリンの濃度に反比
例する。従って、試料中のテオフィリンt1度が増加すると、膜に結合すること
のできる抗体は減少し、従って生じる起電力は小さくなる。典型的な測定では。
抗体の結合如よる電位差の変化は通常数ミリボルトの程度にある。カフェイン「
参照」膜に対し、てすなわちそれと組合わせてテオフィリン膜による示差研究法
を用いる場合の他の利点はコそンモードすなわち初めの開始電位がゼロミリボル
トに近く、測定すべき信号が数ミリボルトの程度にあるということである。
コモン毛−ドの電位が低いと信号電圧を測定する場合の感度が高くなり、従って
バックグラウンドやコモンモードの電圧が信号電圧より本低い地合には、よ杓正
確な精度のよい測定が可能になる。前に述べたように、テオフィリン半セルとカ
フェイン半セルとの間の電位差に、同じカリウムイオン含有試料で処遇するとき
はほとんどゼロである。し7かし、生セルがSOB又c1銀−塩化銀参照1!′
極で置換される場合には、同じカリウムイオン活量液での1i佼差は50鳳V以
上はどに増加する。
結合体の合成法及び膜の調製法を次に述べる。
テオフィリンベンゾ−15−クラウン結合体反応調製機構l−メチル−7−((
ピバロイルオキシ)メチル〕キサンチン
4′−アミノ−ベンゾ−15−クラウン−(11−ブロモウンデカノアミド)
テオフィリン−ベンゾ−クラウン−5結合体合成の第1段階1″11−メチルキ
サンチンの7位をブロックすることを含む。ツー(Hu)、シンク(8ingh
) 及びクルマン(Ullman )の方法[J、Am、Chew。Soc、
、45:17iX−1713(1980)) に従った。11のコニカルフラス
コ中の700dの無水DMFに3.2 t (18,9m+aol )の98チ
l−メチルキサンチン〔アルドリッチ(Aldrich )ケミカル社。
カタログ428,098−4 〕を加え、混合物f磁気攪拌して溶解が起るまで
加温し、次いで室温に冷却した。この溶液を攪拌しながらその中に2.0 ?
(N 8.9 rnIaol、 )の無水炭酸ナトリウムを加え、続いて50d
のDMFに溶解しfc3.0 P C19,31!1I1101)の97チクロ
ロメチルビパレート〔アルドリッチ(A16rich )ケミカル社、カタログ
fr14.118−6 )f1時間かけて滴加[また。反応混合物を室温で1夜
間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、残留物を5011!lの塩化メチレン
で処理した。不溶物質を戸別して1sxxclで洗って、1.24S’の1−メ
チルキサンチンを得た。塩化メチレン溶液を蒸発乾固して、−保護及び二保護キ
カンチンの混合物を得几。−保護1−メチル−7−〔(ピバロイルオキシ)メチ
ルフキサンチンを酢酸エチルから結晶化させて二保護キサンチンから分離した。
この方法によって1.5?の一保護キサンチン(In、9.204−206°)
が得られた。−保護キサンチンを分離した酢酸エチルp液には。
二保護キサンチンが含まれ、蒸発乾固後、20dの2N水酸化す) IJウムと
共に18時間還流させた。反応混合物を冷却し。
濃塩酸で酸性にし、クロロホルムで抽出した。水層を蒸発させて0.5g−の1
−メチルキサンチンを得た。
合成の第2段階は4しアミノ−ベンゾ−15−クラウン−5塩酸塩の調製である
。1:1水酢酸/クロロホルム8001/中%3(1(6,11創mol )の
ベンゾ−15−クラウン−5〔バリシュ(PILrish )ケミカル社、オー
レム(Oram ) 、UT、カタログ≠工oos)の溶液を攪拌しつつ、その
中に50idの氷酢酸中に溶解した15*/の濃硝酸溶液を、1時間を要して滴
加した。反応混合物を1時間攪拌し、次いで回転蒸発器で蒸発乾固させた。残留
物i500x/の5%炭炭水水素ナトリウム水溶液処理し、その混合物を500
ic/のクロロホルムで分配させた。クロロホルム層を飽和環化ナトリウム水溶
液で洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。クロロホルムを蒸発させて30?(
E16チ)の4しニトロベンゾ−15−クラウン−5?得た。
生成物をエタノールで再結晶させ、その15fi’(48mmol )?250
r、、/のジオキサンに溶解し、50℃のバー/I/ CPa1r )水素化量
中、ラネー(Raney) ニッケル上で接触還元した。
反応混合物を濾過し、PRを蒸発乾固し、残留物を200dの酢酸エチルi9溶
解した。次いで溶液を塩化水素ガスで処理して41−アミノ−ベンゾ−15−ク
ラウン−5の塩酸塩を沈澱きせた。収量9.05’(58チ)。
合成の第3段階は4ヒベンゾ−15−クラウン−5−(11−プロモウンデカノ
アミド)の調製である。250dのコニカルフラスコ内の100i&のaH,c
l、に溶かしfcl 0 ? (37,7■1101 )の11−ブロモウンデ
カン酸〔アルドリッチ(Al−zich )ケミカル社、カタログ+83,28
0.4 :lに5.5 altD )リエチルアきンを加えた。混合物を0℃に
冷却し、9.6751’のN、N−ビス〔2−オキソ−3−オキサゾリジニル〕
ホスホルジアミジツククロリド〔ボブクル(BOPCL)ケミカルダイナミック
社、カタログ4iz−1370−00)を加えた。混合物を0.5時間攪拌し1
次いで12.06PC37,7mmol )の4μアミノ−ベンゾ−15−クラ
ウン塩酸塩′fr5.5 mのトリエチルアミンと共に添加した。この反応混合
物に更に50m1のcti、cl!に溶かした5、5dのトリエチルアミンを1
時間かけて滴加した。
反応混合物は18時間呈室温暖めて置いた。つぎに水(50sd)を加え、混合
物を濃塩酸で酸性にした。CH,01,層を順次。
200m/の飽和塩化ナトリウム溶液で3回、及び200TLlの5チ炭酸水素
ナトリウム溶液で3回流つ几。OH,Cj1層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後蒸
発乾固させた。残留物音へキサン/酢酸エチルで結晶化させ、8.814t%)
の4μベンゾ−】5−クラウン−5−(11−ブロモウンデカノアミド) (g
+、p。
101−103°)を得た。分析結果: 、 C,、H4゜BrN0.の計算値
:C:56.60;Flニア、60;Br:15.06;N:2.62゜実測値
:c:56.44 ;Hニア、46;Br:14.89:N:2.60゜第4段
階では、゛クラウンエーテルを保@l−メチルキサンチンにカップリングさせた
。125dのコニカルフラスコ中の50dのDMFに1.0 PC3,57t*
aol ) ノ1−メfk−7−〔(ピバロイルオキシ)メチルフキサンチンを
加えた。混合物を溶解するまで温めた(たとえば、攪拌しながら約80℃K)。
溶液を室温に冷却し0.76 P C7,1ml1lal )の無水炭酸ナトリ
ウムを加え、続いて1.90 t (3,57mmol )のクラウンエーテル
アミドを加えた。反応混合物を窒素中で3日間攪拌した。
回転蒸発器でDMF′t−除き、100d(7)水’に加1 混合物t50dの
クロロホルムで3回抽出した。クロロホルム抽出物を合わせて、100dの飽和
塩化ナトIJウム水溶液で1回洗い無水硫酸す) +7ウムで乾燥した。クロロ
ホルムを蒸発させて淡褐色の油を得た。
第5段階は保護基を水性ベースで除去することである。
250m1の丸底フラスコに入れた上記の油に75dの0.2MNaOHと25
1のメチルアルコールを加えた。混合物を1時間還流させ、室温に冷却した。溶
液を氷/アセトン浴中で冷却しつつ濃塩酸で酸性にし、た。沈澱物をエチルアル
コール−水から再結晶させて、1.2PC5Fl)の黄色ががった白色の結晶性
固体(m、p、 166−170°)を得た。不物質に高速液相クロマトグラフ
ィー分析により均質であることを認めた。分析m果: −a、、u4.N、o、
ノ計算値: C:60.47;Hニア、37;N:11.37.実測値:C:
60.25;Hニア、23;N:1109゜ベンゾ−12−クラウン−4誘導体
を同様の方法で調製した。
保護1−メチルキサンチン′fr1.7−シメチルキサンチンで置換えた以外は
、反応機構の第4段階に従ってカフェイン結合体を調製した。
125111のコニカルフラスコ中のDMF50ml中に1.o?(5,56m
mol )の1.7−シメチルキサンチンを加えた。混合物を溶解するまで攪拌
しながら暖めた。溶液を室温に冷却し、0.595’の無水炭酸ナトリウムを加
え、続いて前述のクラウンエーテルアミドをλ95)(5,56mmo1.)加
え、反応混合物を3日間攪拌した。回転蒸発器をDMFを除き、X0OJI!7
の水を加え、混合物を50i*lのクロロホルムで3回抽出した。抽出物を合わ
せて100凝/の飽和塩化ナトリウム水溶液で1回洗い。
無水硫酸す) IJウムで乾燥した。クロロホルムを蒸発させて褐色の油を得、
ヘキサン−酢酸エチルで結晶化させて1..0P(29%)の生成物を得7t、
生成物を酢酸エチ/I//ヘキサンから再結晶すせカーボンで脱色して、高速液
体クロマトグラフィーにょ結果” ”3!H47Nloaの計算値: C:61
.03;Hニア、52;N:11.12゜実測値 C:60.78;Hニア、5
3;N:10.97゜ベンゾ−12−クラウン−4誘導体を同様な方法で調製し
た。
テオフィリン膜の成分ho、oostのテオフィリン−クラウンエーテル結合体
、0.02iのテトラ(p−クロロフェニル)ホウ酸カリウム、0.5dのビス
(2−エチルヘキシル)セバケート、0.31の高分子量pvc及び5ゴのTH
Fより成った。
膜は前に述べたように溶液流延法又は浸漬堕布法で形成させることができる。
カフェイン膜
カフェイン膜の成分は、o、o o s yO力7エインークラウ/ ニーfル
M合体、o、02fのテトラ(p−クロロフェニル)ホウ酸カリウム、0.5t
/のビス(2−エチルヘキシル)セバケート、0.3?の高分子量pvc及び5
mlのTHFより成った。
膜は前述のように溶液流延法又は浸漬塗布法を形成させることそれぞれテオフィ
リン及びカフェインの膜を1つずつオリオン(0rion ) 95電極体に収
めfc6内部の充てん溶液は、pH7,4のリン酸塩緩衝塩液より成って、診照
電極Fi@/塩化銀線であった。2つの電極をゴム栓に取付け5.0 atのp
H7,4のリン酸塩緩衝塩液に浸漬し友。溶液は磁気攪拌された。2つの電極間
で測定した起電力は0.23mマであつ友。カリウムイオンに対する応答を試験
する九めに、100 uJの0.2molKCj を上ヘッドで、攪拌中の緩衝
液に入れた。ストリップチャートレコーダーの出力に間層なビーク(0,3mマ
)とをして示された過度応答が認められた。電位差は30乃至60秒以内にベー
スラインの値に戻った。カリウムに対する過渡応答は、恐らく膜表面近傍のカリ
ウムイオンの局部的濃縮によるものであり、溶液が混合されるにつれて消失する
ためであろう。
プロティンに対する応答を調べるために、3.5)/61のアルブミンと3.o
y/atのグロブリンより成る]0Oujの標準プロティン溶液〔シグマ(51
g1aa )ケミカル社、セントルイス、MO,カタログ≠540−10)を溶
液に加えた。標準プロティン溶液は電極になんの影響も与えなかっ几。
しかし、100uJのテオフィリン抗体〔イミュノテク(Immaur+ots
ah )社、アルストン(A11ston )、MA、カタログ$651又はリ
サーチ・プラス(Re5earch Plug ) 。
ベイヨy (Bayonne )、NJ、カタログ+0l−9603−09)を
添加した時、2つの電極間の電位差は約20乃至30分間にわたって0.85m
vだげ移動し友。
この形式のセンサーは競合的結合測定に用いることができる。試料中に結合さ九
ないで残っている抗体を測定し、試料中に存在する抗原の間接的目安とする。試
料中の抗原によって結合される抗体が多いほど、得らnる電気信号は小さくなる
。なせならば、センサー膜中に固定され又いる抗原への結合に利用しうる抗体が
少なくなるからである。すなわち、抗原の6r!tはクレアチニンは腎機能の重
畳な指示薬であり、血清中のその測定は日常性われる血液検査である。現在、臨
床実験室にはクレアチニンを測定する2つの方法がある。より広く用いられてい
る方法は、アルカリ溶液中でOクレアチニンとビクラートの赤色複合体の生成に
基ずくヤツフエ(Jaffe ) 反応である。
この方法は成る種の代謝産物や薬物が存在すると誤まった結果を与える。第2の
方法に酵素を利用するものである。酵素法は非常に特効性があるけれども、検査
を行うのに必要な費用と時間が臨床実験室での日常使用全制限する。
極(最近に、クレアチニウムイオン選択性電極が述べられた〔イー−ピー・ディ
アモンデイス(K、P、Diamondiss )及びティm−ビー・ハジイア
ナウ(’r、P、Hadjiannou )、ムn11゜Lett6.13.1
317−1332(1980))、クレアチニン及びテトラフェニルホウ素ナト
リウムの等モル水溶液を混合し、次いで塩藪溶液を加えるとクレアチニニウム・
テトラフェニルホウ素鎖酸塩を生ずることによってクレアチニウムイオン交換体
が調製される。該塩を2−二トロトルエンで抽出し、この錯塩溶液を、テフロン
膜を備えたオリオン(Orion)92[オリオンリサーチ(0rion Re
5earch ) 、ケンブリッジ、MA)IIt極内に液体イオン交換体とし
て用いた。この種のイオン込択性を極内ではイオン交換物質は受器に収められた
液状であって。
膜を通して試料溶液に絶えず浸出するので、周期的に補充し、なければならない
。電極は使用前24時間0.01mol/Lクレアチニニウムクロリド中に浸漬
してコンディショニングされた。
pH3におけるクレアチニウム電極の応答は、10−3乃至】0−1+aol/
Lの範囲では20℃で57論マの傾きをもつ直線状であった。10°4乃至10
−” sol/Lの範囲でに傾きH37mvに下がった。
本発明は該イオン交換物質を固定化1−たプラスチック膜を利用するものである
。2−ニトロトルエンを可塑剤として用いるpvc膜にクレアチニニウムテトラ
フェニルホウ素を組み込むとき%10”” mol/L乃至10−’ !+10
1/IIクレアチニニウムクロリドの間で44論マの傾きが認められ、10−’
乃至10−”mol/ムの範囲で#′i14mvに低下した。クレアチニンの臨
床的に重要な範囲は10−4乃至10−” anal/Lである。2−ニトロ−
p−シメン及び2−ニトロフェニルオクチルエーテルのヨウな他のニトロ化した
可塑剤を用いると10−4乃至10−” mol/Lの範囲で11感度がよくな
らなかつ次。
10−4乃至10−”mol/Lの範囲での著しく改善さ九た応答は一般式:
(式中、7=Qj、 Br、 F、 CF、 ) f夢するi換テトラ7z、=
ルホウ素塩を用いた時に得らまた。1つの態様では、0.025’のクレアチニ
ニウムテトラ(p−クロロフェニル)ホウ素、1.5耐の2−ニトロフェニルオ
クチルエーテル、0.35’の非常に高分子量のpvc、及び5ゴのTHFより
成る膜が調製された。脱は前シで述べたように、溶液流延法又は浸漬塗布法によ
ってFMMさtl、た。?$gu 10−31ool /L乃至10−” m0
1/Lクレアチニニウムクロリドの間で55論マの傾きを、又10−4乃至10
”” r+ol/Lの1囲で40zvの傾きを生じ、なんら試験率備を要しなか
った。置換テトラフェニルホウ素塩は未置換テトラフェニルホウ素塩よりも臨床
的な一度範囲ではるかに高い感度を示【−九。種々のt換テトラフェニルホウ素
塩の性能を第2表にまとめる。
未置換テトラフェニルホウ素に比して置換テトラフェニルホウ素塩の予期しなか
った感度の増加は脂肪親和性の増大及び置換テトラフェニルホウ素塩で形成され
7′iC@体のイオン交換性の本質の差に帰することができる。実際には、クレ
アチニンを含む溶液のpHは、酸の添加によって3以下のpl(に下げなげれは
なちない。こ九は試料を酸溶液で稀釈することによって行うことができる。しか
し、血清試料の場合には、著しい稀釈はクレアチニンの濃度の減少によって測定
感度に悪影響全入ばずことがある。
本発明の場合には、別のアプローチをとった。クレアチニンを含有する試料のp
Hけ無水グリシン塩酸塩を含む保持体で試料を処理することによって低下させた
。これはニトロセルロース〔シュライヘル・アンド・シュル(5chleich
er and8chull ) 12ミクロン等級Hx−Zoo)のような膜保
持体をグリシン塩酸塩水溶液(0,1乃至1.0mol/L)に浸漬することに
よって行った。ニトロセルロース膜がクレアチニニウムテトラ(p−りpロフェ
ニル)ホウ素PvG膜の表面を覆うようにサンドイッチを形成させた。第4に図
に関し、各セルa。
b、及び0けクレアチニニウムPVC膜及びグリシン塩酸塩を含むニトロセルロ
ース膜を含有している。血清試料をGに、参照溶液及び校正溶液をa及びbKそ
れぞれ加える。グリシン塩酸塩はクレアチニンをクレアチニウム塩酸塩に変え、
それは膜によって検知される。
a及びbの間に生じ次起電力はセンサーを校正するのに用いることができる。a
及びbからの傾き及びb及びCの間に生じた起電力はさらに試料中のクレアチニ
ンa度をめるのに用いることができる。
クレアチニニウム塩酸塩〔シグマ(81g+ia )ケミカル社、セントルイス
、MO、カタログ+C−6257)及び置換テトラフェニルホウ素の対応する1
ナトリウム塩の当モル水溶液を混合してクレアチニエウムテトラフェニルホウ素
塩を調製した。
沈澱した塩を許別し、水で洗って乾燥しfc、置換テトラフェニルホウ素誘導体
ナトリウム塩はカッルット(0assoratto) 。
マフラファーティ(Mclaffarty )及びモア(Moors )の方法
(Anal、 Chew、Acta 32 :376−380(1968))に
ょシ調製し、次のステップを含んでいる:第2表 クレアチニニウムテトラフェ
ニルホウ素塩のクレアチニニウム塩酸塩に対する応答
傾き (mv) 傾き(mv)
H5010
F 45 26
(iJ 55 36
CiF、 57 40
第2表に見られる論マの読みはすべて二重接点銀−塩化銀参照を極に対するもの
である。使用したクレアチニニウム溶液は150mM塩化ナトリウム及び6−M
塩化カリウムを含む0.05Mグリシン−グリシン塩酸塩緩衝液(pH3,0)
を用いて調製した。
ナトリウムイオンに対して選択性のある膜を、以下の比率の成分を用いて調製し
7j:0.2Pのメチル化モネンシン、0.041のテトラ(p−クロロフェニ
ルンホウ酸ナトリウム、2.0111の2−二トロフェニルオクチルエーテル、
1.25’の高分子tP VC,12tl(Df )ラヒYロア9:/CT H
F )及ヒ511tlノ4−メチルー2−ペンタノン。
膜は前述のように溶液流延法か又は浸漬塗布法で形成させることができる。
膜を既述の電極ハウジング内に収めナトリウムイオン含有水溶液を用して試験を
行った。センサーは25℃で10単位当り57乃至60mvの傾きを生じた。
メチル化モネンシンのy4製
500dの丸底フラスコ内の250dの1,4−ジオキサン[20idのヨード
メタンととも5.01のソジウムモネンシン[シグマ(131gma )ケミカ
ル社、セントルイス、MO,カタログ+M2513]を加えた。混合物を18時
間ゆるやかに還流させ、次いで回転蒸発器で蒸発乾固させた。残留物を200d
のメチレンクロリドに溶解し、順次、500dの飽和塩化ナトリウム水溶液で2
回、200dの5チ炭酸水素ナトリウム水溶液で2回、及び200dの飽和塩化
ナトリウム水溶液で11洗つ友。該メチレンクロリド溶液に無水硫酸す) IJ
ウムで乾燥し、蒸発乾固させた。残留物ft50℃の水浴中で温めながら50w
t/のヘキサンで処理した。ヘキサン溶液itl乃至2時間フリーザー内で冷却
し、次いで濾過して沈澱塩類を除いた。ヘキサン溶液1r蒸発乾固させて、2.
5乃至4.01の淡褐色の油r得几。該油はナトリウム選択性膜を調製する(D
IC使用【7た。
力IJウムイオンに対して選択性のある膜を、以下の比率の取分を用いて調製し
た:0.2pのパリノマイシン、0..04 Pのテトラフェニルホウ酸カリウ
ム、2.0mの2−ニトロフェニルオクチルエーテル、1.21の高分子量PV
C,10at7(D’rHF及び5M!の4−メチル−2−ペンタノン。
膜は既述のように溶液流延法又は浸漬塗布法で形成させること環化物イオンに対
し選択性のある膜を、以下の比率の成分を用いてルー製し7’c:1−Omjの
アリフォー) (A11quat )336〔アルドリッチ(ム1drich
)ケミカル社、ミルウオーキー、WX、カタログ≠20,561−3)、2.O
dのトリス(2−ブトキシエチル)ホスフェート〔アルドリッチ(Aldric
h ) ケミカル社、ミルウオーキー、WI、カタログ+13,059−1 )
、1.21の極めて高分子量のpvc(アルドリッチ(*xartch)ケミカ
ル社、ミルウオキー、WI、カタログ4xs、26x−33,1述のように溶液
流延法又は浸漬塗布法で形成させることができる。
本発明は試料、等に血液、崩消、血漿、尿、唾液及び脳背甑液のような生物学的
液体のイオン含有量又は他の成分の濃度の測定に産業的効用がある。本発明は、
生物的試料のイオン活量のみならすグルコース、尿素、トリグリセリド、クレア
チニン、尿酸、リパーゼ、他の酵素及び薬物のようなその他の試料成分の濃度の
迅速測定に特に有用である。イオン選択性膜の試%!備の必要がなく、迅速に結
果が得られるので臨床的又は研究的状況下で用いるのに好適である。さらに、本
発明は飲料、肉類1缶結及び処理食品、果実抽出物等の他の試料中の同様の渦、
定に用いることができる。
等価物
当業者は、足算的実験にすぎないものを用いて、ここに明確に記載した特定成分
及び物質の多くの等価物を認知し又は確認することができるであろう。そのよう
な等価物は次の請求範囲内に包含されるように意図されろ。
浄書(内容に変更なし)
9@、Odべ科
浄i!F(内容に変更なし)
浄書(内容に変更なし)
浄g!(内容に変更なし)
(1,b+(A々)オクレアナニウム■臭十り゛リミン賎1ζ膵R’mat。
手続痛正書は
1.事件の表示
PCT/US86101370
2、発明の名称
イオン選択電極をもつセンサー
3、補正をする者
事件との関係 出 願人
6、補正の対象
(1)出願人の代表貴名を記載した所定の書面(2)委任状及訳文
(3)タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文(4)図面の翻
訳文(φA−−句
7、補正の内容
別j紙の通り(尚、(3)、(4)書面の内容には変更ない国際調査報先
ANNEX To ’hεE ZNTER+NATiCNAL SE、!IRc
HFtZ:’ORT ON++Φ・リー++++++―−噂−―−・++彎−−
豐−+++噂−−++++−一一苧呻・−ENTE訳ATZONAf、 APP
tJCATrON No、 PCT/US 86101370 (SA 137
52)響−++嗜−・−一一+−−噂−―−−+彎個++需・+−・中 −+拳
・−一一+−嘩轡−・雫−++骨−+++−・++−Th@European
Patent 0ffica is in no way Liabla fo
r thesepartieulars which ar@ merely
given for tha pulpo!l! ofintoごnati口n
。
Pat@ntdoeuITlentPujコLicationPatentfa
milyE’ubiicatio二。
cited in 5earch ciat@membar(s) darer
ep口rt
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)試料中のイオン活量の電位差測定用センサーにおいて、a.フレーム; b.各電極は該フレーム内に配設され、1.活量を測定すべきイオンに対して選 択性があるイオノホアを含有する選択的透過柱のある膜、及び2.参照電極 より成る、少くとも2個のイオン選択性電極;c.導電性である時に、電極にイ オン流を与える電極間の多孔性物質;及び d.既知の濃度の、活量を測定すべきイオンを有する内部参照物質 よりなるセンサー。 (2)試料中のイオン活量又は他の成分濃度の電位差測定用センサーにおいて、 a.各セクシヨンはそれを貫通する開口部、及び開口部間の対応する面内の凹み を有し、上部セクション及び下部セクションは、開口部間に内部チヤネルを形成 するように、2つのセクション内の孔を一直線状に並べ、対応する面内の凹みを 合致させるような関係に対応している、上部セクシヨン及び下部セクシヨンを有 するフレーム;b.各電極は、 1.測定すべきイオンに対して選択性があるイオノホア;熱可塑性樹脂又はプラ スチック;及び可塑剤;よりなるイオン選択性膜、及び 2.参照電極 よりなる、開口部内のイオン選択性電極;c.開口部内にイオン選択性膜を定着 させるための保持手段;d.電電性であるときに開口部内のイオン選択性電極間 にイオン流を与える.センサーフレーム内の開口部間の空間中の多孔性物質;及 び e.既知の濃度の、活量を測定すべきイオンを有する内部参照物質 よりなるセンサー。 (3)各イオン選択性電極が、センサーを使用する前に試験準備を要しないイオ ン選択性膜を有する請求の範囲第2項に記載のセンサー。 (4)イオン選択性膜が約1ミル乃至約15ミルの厚さを有し、約1乃至約10 重量%のイオノホア;約10乃至約30重量%の熱可塑性樹脂又はプラスチック ;及び約50乃至約80重量%の可塑剤よりなる請求の範囲第3項に記載のセン サー。 (5)イオン選択性膜が、さらに、メツシユ状物質を含む請求の範囲第2項に記 載のセンサー。 (6)メツシユ状物資がナイロンのメツシユ状物質又はポリエステルのメツシユ 状物質である請求の範囲第5項に記載のセンサ(7)イオン選択性膜が、さらに 、試料のpHの淡化を生じせしめる反応の触媒としてはたらく酵素、又は試料の pHの変化を生じせしめる反応の基質である物質を包含し、該酵素又は該物資が 膜に固定されている請求の範囲第2項に記載のセンサー。 (8)試料のPHの変化に帰着する反応の触媒としてはたらく酵素の試料中の活 量、又は試料のpHの変化に帰着する反応の基質である成分の試料中の濃度の電 位差測定用センサーにおいて、a.各セクシヨンは、それを貫通する開口部、及 び該開口部間の対応する面内の凹みを有し、上部セクシヨン及び下部セクシヨン は、開口部内に内部チャネルを形成するように、2つのセクション内の孔を一直 線状に並べ、対応する面内の凹みを合致させるような関係に対応している、上部 セクション及び下部セクシヨンを有するフレーム;b.各電極は、 1.pHの変化に帰着する反応の触媒としてけたらく少くとも1つの酵素、又は pHの変化に帰着する反応の少くとも1つの基質をその上に固定させている層; 2.水素イオン又はアンモニウムイオンに対して選択性があるイオノホア;熱可 塑性樹脂又けプラスチック;及び可塑剤;を含有するイオン選択性膜;及び3. 参照電極 よりなる、開口部内のイオン選択性電極;c.開口部内にイオン選択性膜を定着 させるための保持手段;d.導電性であるときに開口部内のイオン選択性電極間 にイオン流を与える、センサーフレーム内の開口部間の空間中の多孔性物質;及 び e.既知の水素イオン濃度又は既知のアンモニウムイオン濃度を有する内部参照 物質 よりなるセンサー。 (9)各イオン選択性電極は、センサーを使用する前に試験準備を要しないイオ ン選択性膜を有する請求の範囲第8項に記載のセンサー。 (10)層に固定された酵素が、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラ ーゼ、ウリカーゼ、リパーゼからなる群より選ばれ;層に固定された基質が、L −アラニン、L−アスパラテート、澱粉、クレアチニン、及びクレアチンからな る群より選はれ;そしてイオン選択性膜が約1ミル乃至約15ミルの厚さを有し 、約1乃至約10重量%のイオノホア、約10乃至約20重量%の熱可塑性樹脂 又はブラステック、及び約50乃至約80重量%の可塑剤よりなる請求の範囲第 8項に記載のセンサー。 (11)イオン選択性膜が、さらに、メツシユ状物質を含む請求の範囲第8項に 記載のセンサー。 (12)前記メツシユ状物質がナイロンのメツシユ状物質又はポリエステルのメ ツシユ状物質である請求の範囲第11項に記載のセンサー。
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1987
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JP2022098478A (ja) * | 2020-12-21 | 2022-07-01 | エフ ホフマン-ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト | センサアセンブリ |
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