JPS63500519A - γ−インタ−フェロンに対するモノクロ−ナル抗体、該抗体を産生するハイブリド−マ、および該抗体を使用するキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒ−インターフェロンに対するモノクローナル抗体、該抗体を産生ずるハイプリ ドーマ、および該抗体を使用するキット 本発明はγ−インターフェロンに対する新規なモノクローナル抗体、該抗体を産 生ずるバイブリド＃、−マ、および例えばγ−インターフェロンの検定のために 該抗体を使用するキットに関する。

均一抗体、すなわちモノクローナル抗体を産生じ得る細胞株を得ることが可能で あることは当分野でよく知られている。その基本的技術〔コーラ−（Ｋｏｈｌｅ ｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、　Ｎａｔｕｒｅ、２５６．１９ ７５　ｆ参照〕はマウスミｘ。

−マ細胞と牌細胞とを融合してハイブリド−マ＃ｌＢ胞全つくり、これらの細胞 から目的とする抗体を産生じ得るクローンを選択することから成っている。この 一般方法はま九米国特許第４３６４９３２号、同第４３６４９３’４号、同第４ ３６４９３５号、同第４３６４９３７号および同第４３６１５５０号の各明細書 にも開示されている。

一般方法はここ数年間というものすでに知られていたが、それぞれの適切なハイ プリド−マの形成および選択はそれ自体の特殊な困難を生じさせる。実際、適切 なハイプリド−マが見つかる確実性はなく、同様にそのハイプリドーママが意図 する性質の抗体を産生ずるという確実性もない。

モノクローナル抗体は多種多様な用途をもち、特にタンパク質（モノクローナル 抗体は該タンツク質に対して特異的である）を分離精製するために、ま九はそれ らを検定するために例えば診断用キットとして使用される。例えば、ＰＣＴ公開 出願ＷＯ３１１０２８９９お！びＷＯ３２１０１７７３を参照されタイ。

ヒトα−インターフェロン群は多くの別個の遺伝子によってコードされるために そのアミノ酸配列に差異が見られるが、ヒトｒ−インターフェロンはただ１つの 遺伝子によってコーＶされろ。しかしながら、ヒトγ−インターフェロンは非常 に不安定なタンパク質であって、とりわけそのカルボキシ未満が短縮されること により減収して多数のより小さいγ−インターフェロンを生じる。従って、ヒト γ−インターフェロン（ＧＩＦ）の完全なアミノ酸配列はそのｃＤＮＡ配列から 推定して次の過少でＭＥＴ　ＡＳＮ　ＭＡＬ　ＬＹＳ　ＰＩＥ　ＰｌｉＥ　ＡＳ Ｎ　ＳＥＲＡＳＮ　ＬＹＳ　ＬＹＳリーダー配列は小さな活字で示した加個のア ミノ酸配列と恐らくはその次の３個のアミノ酸配列から成る。ここで同定された 種々のγ−インターフェロンを次の表に示す。

インターフェロン型　アミノ酸 ｒ　−イアター７　ｚ　ｏ　ｙ　Ａ　（Ｇ工ＦＡ）　１〜１４６ｒ　−イアター ７ｚＣ１７Ｎ（Ｇ工Ｆ’Ａ’）　１〜１４２ｒ−インター７ｚａｙＢ（Ｇ工ＦＢ ”）　１〜１３１γ−インターフェロン（Ｇ４ＦＤ）　’４〜１４６＊　Ｇ工Ｆ Ｄは相対的に不活性である。

Ｇ工１’Ａはメチオニン残基（アミノ酸４８．８０．１２０および１３７）の位 置でＣＮＢｒによシ切断される。得られる５種類の切断生成物の混合物は本明細 書で”ＣＮＢｒ−Ｇ工ＦＡ＠と呼ばれるだろう。

さらに、１５個のカルボキシ末端アミノ酸１３２〜１４６から成るイプチド（本 明細書では１５ＡＡ−ｅプチドとして同定）はここに記載の試験方法において使 用した。

γ−インターフェロンはいろいろな疾患（＃！ｆにウィルス疾患およびある種の 癌）を防御するのに有用かつ最も有望な薬学的活性物質であることが各種の試験 によシ証明された。γ−インターフェロンは文献中に広く記載されておシ、例え ば公開された欧州特許出願第７７７６０号、同第８８５４０号および同第９５３ ５０号に記載されるように、リンパ球のマイトジェン誘発あるいは組換えＤＮＡ 技術によシ得ることができる。

ンターフエロンと結合せず、かつ実際に種々のＧ工に゛を識別し得る抗体を得る ことが非常に望ましいことは明白である。従って、本発明の目的はＧＩＦに強く 結合するモノクローナル抗体ン産生し得るモノクローナルハイブリドーマを単離 することであった。先に述べたように、この種の抗体はいろいろな目的、例えば ＧＩＦの検定またはＧＩＦの（アフィニティークロマトグラフィーによる）精製 のためにきわめて有用である。

本発明けＧ工Ｆ分子上の異なるエピトープ（抗原決定基）を認識し月つ次のａ） 〜ｄ）の要求に応じる多数のモノクローナル抗体を提供する： ａ）アフィニティークロマトグラフィーによるＧＩ上゛のｆ＊製に使用し得るモ ノクローナル抗体； ｂ）ＧＩＦの生物学的活性を中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）　Ｌ、ツレ故にＧＩ Ｆの試験に使用し得るモノクローナル抗体：Ｃ）全長Ｇ工ＦＡと短縮された（減 成された）ＧＩＦ特に活性の劣ったＧＩＦ（例えばＧ工Ｆ’Ｂ）とを識別し得る モノクローナル抗体： ａ）す７ドイツチＥＬ工ＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−１１ｎｋｅａ　ｉｍｍｕｎｏｓｏ −ｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；　酵素結合免疫吸着検定法）に一対として使用し得 る異なるモノクローナル抗体。

従って、本発明はマウスミエローマ株由来の細胞とγ−インターフェロンで予め 免疫感作したマウス由来の牌細胞とを融合することにより形成されたハイプリド ーマによりて産生されたγ−インターフェロン（ＧＩＦ）に対するモノクローナ ル抗体（この抗体はインターフェロンα２と結合しない）、すなわち本明細書に おいて４７−１．３−６．３２．３５．２７．２２および９−１１と指定された 抗体を提供する。

本発明のモノクローナル抗体は好ましくはクラスエ９Ｇ１．にのものであるが、 他のクラス（例えば工９Ｇ２ａ、に）のものであってもよい。それらはＮＳＩミ エローマ細胞とγ−インターフェロンで予め免疫感作したＢＡＬＢ／ｃマウス由 来のｎ細空とを融合することによシ形成されたハイプリドーマから産生される。

本発明のハイプリドーマおよび抗体は下記の方法により得ることができる： １、マウスにＧ工ＦＡを数回注射して免疫感作を行う。使用するマウスの種類は 限定的でないが、良好な結果はＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用いたときに得られる。

抗原は適当な形体で、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で乳化した完全フロイ ントアジ−パン）（ＣＩ’Ａ）（１：１０割合）中に懸濁して適用される。注射 の回数および抗原の投与量は、抗原特異的牌細胞の数が十分になるようなもので あるべきである。一般に、免疫感作は１０μ９の抗原を約２週問おきに３同腹腔 内注射することから成る。この後さらにＰＢＳ中の抗原１０ａ９を静脈内に、そ してＣＦＡ／ＰＢＳ中の抗原１０μ９を腹腔内に注射することによシ追加免疫を 行う。

２、免疫感作したマウスの膵臓を摘出し、牌細胞の懸濁液を調製する。この方法 は公知技術に従う。

３、牌細胞とマウスミエローマ細胞を融合する。牌細胞とミエローマ細胞の融合 技術はよく知られている。最も有利には、２種類の細胞混合物を適当な融合促進 削（例えば平均分子量が約１０００〜約４０ｏＯｏｚリエチレングリコ−＃　； 　ＰＥＧ　１０００　）　と共に温めることによシ融合する。数種のマウスミエ ローマ細胞株が知られておシ、容易に入手できる。ＨＧＰＲＴ　欠損細胞株（Ｈ ＧＰＲＴ−ヒポキサンチン・グアノシル・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ ）が好適であり、この細胞株はＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンお よびチミジンを含む培地）において生存できないだろう。好ましくは、使用する ミエローマ細胞株はそれ自体が抗体を産生じないという点で非分泌型であるべき である。本発明の目的に適する細胞株はいわゆるＮＳＩ細胞株である。これらの 細胞はコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミル２ｌ　イア　（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ） 　によりてＰ　３　／Ｘ６３−Ａ８ミエローマ細胞から誘導された。

４、融合した牌細胞は標準方法に従って数個の別々の容器（例えば冴−ウェルプ レート）中で培養する。工程３で得られた細胞培養物は融合牌細胞（ハイプリド ーマ細胞）、未融合牌細胞および未融合ミエローマ細胞の混合物である。好まし くは。

未融合ミエローマ細胞株を排除する培地（例えばＨＡＴ培地）中で培養を行う。

悪性（増殖性）でないこれらの未融合牌細胞は通常短時間のうちに増殖を中止す るが、ＨＧＰＲＴ＋の融合細胞はＨＡＴ培地中で増殖することができる。

５、それぞれの容器中のハイプリドーマ細胞の上清は抗Ｇ工Ｆ抗体の存在につい て試験する。この試験は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＥＬ工ＳＡ）を使用するこ とにより都合よく行うことができる。この場合ＵＳ素アルカリ性ホスファターゼ に結合された抗体を選択したが、他の方法も使用できる。

６、目的とする抗体を産生ずるハイプリドーマを選択し、その後好ましくは限界 希釈法によシクローニングする。

７、選択したハイプリドーマを用いて目的とする抗体を産生させる。この産生は バイブリド９−マを適切な培地中で培養し、その後抗体を分離することによｔ） 　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で達成されるが、この方法は十分な量をもたらさない。大 量の抗体を産生させるためにはｉｎ　ｖｉｖｏ方法を使用することが好ましい。

ハイプリドーマをマウスの腹腔内に注射すると、そこで実質的賃の目的抗体を含 む腹水が生産されるであろう。その後目的抗体を標準方法によシ分離する。

多数のＧＩＩ’に対する抗体産生ハイプリド−マが本明細書中で開示されるが、 本発明は上記の特徴を示すモノクローナル抗体をすべて包含すると見なされる。

さらに、本明細書中で例示したハイシリドーマ技術を使用して上記のモノクロー ナル抗体を形成する方法も本発明の範囲内に含まれる。ハイプリドーマの多数の 例が本明細書中で開示されるが、当業者ならばここに記載の免疫感作、融合およ び選択方法に従うことにより、上記の反応性特徴を有する抗体を産生じ得る他の ハイプリド−マをつくることができるでおろう。既知のマウスミエローマ細胞株 と既知のマウス種由来の牌細胞からつくられた個々のバイブリド９−マは、その ハイプリドーマによって産生される抗体について同定することを除いてさらに同 定されることはないが、上記の反応性特徴を有する抗体を産生ずるすべてのハイ プリドーマは本発明内に含まれ、そのハイプリドーマを使用してこの抗体を産生 ずる方法も同様である。

さらに、本発明はここに記載の反応性特徴を示すモノクローナル抗体を使用する 治療または診断方法を包含する。

ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにＣＦ’Ａ／ＰＢＳ　エマルシヨン（１：　１）中の組換 え（非ダリコシル化）Ｇ工ＦＡＩＯμ９を１５日おきに３回注射することによシ 免疫感作した。各マウスには全容量０．２　ａｔを腹腔内に注射した。３回目の 注射の１５日後にＣＦＡ中の抗原１０μ９を腹腔内に、同時にＰＢＳ中の抗原１ ０μｓを静脈内に注射して追加免疫を行った。最後の注射の４日後にマウスを殺 して、融合用のｌ１ｌＩ！臓を摘出した。

２ｏ　細胞融合 勝機をＰＢＳ（Ｃａ　およびＭ９　を含まない）中に懸濁して細胞の数を数えた （１つの牌＠は約１０　個の細胞から成る）。

滅菌ガーゼを通して濾過した後、Ｃａ＋＋およびｙ、９＋　４−を含まない冷た いＰＢＳ（キプコ　カタログｌ’ｈ４２０）中で２回洗浄した。マウスミニロー ・マ細胞（ＮＳＩ）を同じＰＢＳで３回洗い、２種類の細胞を混合して一緒に遠 心した。この混合物は約１０８個の牌細胞と約１０７個のＮＳＩ細やから成って いた。

約０２−〇上清な細胞上に残しておいた。この管を穏やかに攪拌しながら沈殿物 を崩し、その後Ｃａ　およびＭｇ　を含まないＰＢｓ中５０ｕＤＰＥＧ１０００ （メ＃り　闇品１に９７２９）ｌｄを３７℃で絶えず攪拌しながら１分間滴下し た。３７℃で蜀秒攪拌後、この管にＣａ　およびＭｇ　を含まない温かいＰＢＳ を徐々に満たして遠心した。次いで、細胞な１（ＡＴ培培地−直接再懸濁し、冴 −ウェルプレー）（１１Ｌｌ／ウエル、ウェル当たり約２×１０６個の細胞を含 む）に分配した。この段階で、未処理牌細胞（各勝機の／、。）を支持細胞とし て加えた。

３、バイブリド３−マ細胞の培養 融合後あ時間して、各ウェルにＨＡＴ培地１−を加えた。新しい培地を全てのウ ェルに１週間に３回加えた。ハイプリドーマをＨＡＴ培地中で３週間培養し、続 いてＨＴ培地（同じ培地でおるがアミノプテリンを含まない）中でさらに３週間 培養することにより選択した。筒抜に、細胞を普通培地（１０％ウシ胎児血清（ Ｆｅ２）を含むＲＰ　Ｍ　工１６４０　）中に再懸濁した。

できるだけ速やかに、ハイプリド−マ細胞を標準技術を用いて凍結した。上清を 取っておいて抗ＧＩＦＡ抗体の存在について試験した・ バイブリド９−マ細胞培養物の上清中の抗ＧＩＦＡ抗体の存在は、酵素結合免疫 吸着検定法（ＥＬ工ＳＡ）　により試験した。基本的技術〔１酵素結合免疫吸着 検定法１：ボーラ−（Ａ、Ｖｏｌｌｅｒ）　。

ビット９クエｙｖ　（Ｄ、　Ｂｉｄｗｅｌｌ）およびパートレフト（Ａ、Ｂａｒ ｔ−１ｅｔｔ）；　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａ１．工ｍｍｕｎｏｌｏ ｇ７．　第４５章。

３５９頁を参照〕に従って酵素アルカリ性ホスファターゼに結合した抗体を使用 し、これをモノクローナル抗Ｇ工ＦＡ抗体の検出用に適合させた。使用した試験 は次の工程から成っていた：１）各ウェル当たり１５０　ｎ１ｉｉ　Ｇ工Ｆ’Ａ 　（被覆緩衝液１１当たり２５μ分　の希釈度：　０．２ｄ／ウエル）でプレー トを被覆し、４℃に一晩保持し、その後液体を振り出す。

２）各ウェル当たシ０．２ｄのＲＰＭ工　１６０および１０チＦ’Ｃ８を加え、 室温で１時間インキュベートシ、その後ＰＢＳ−ツイーンで４回洗う。

３）各ウェル当た９０２ｄのハイプリドーマ上清を加え、室温で２時間インキュ ベートし、その後ＰＢＳ−ツイーンで４回洗う。

４）ＲＰＭ工　１６４０オ！び１０　％　Ｆ　ＣＳ中１：５００に希釈し友アル カリ性ホスファターゼ結合ヒツジ抗マウスエｇ０２ｍｌを加え、室温で２時間イ ンキネベートし、その後ＰＢＳ−ツ（−ンで４回洗う。

５）ジェタノールアミン緩衝液中のＱ２ｄ　ＰＮＰＰ　を加え。

１５分、３０分、４５分および１時間後に読み取る。

プレート（９６−ウェルプレート；ＮＵＮＣ免疫プ免疫プレートロカタログｆｆ １２４５４）の底面へのＧ工Ｆ’Ａの吸着は、蒸留水１１当たｐＮａｚｃＯ３１ ５９９，ＮａＨＣＯａ　２．９３９およびＮａＮ３０．２　ｇを含む被覆緩衝液 （炭酸塩−重炭酸塩緩衝液）中で行った。４℃に一晩保持した後、ＲＰＶ工　１ ６４０および１０１　Ｆ’　ＯＳを含む培地（各ウェル当たり０２ｄ）と共に室 温で１時間インキュベートすることによシ、ウェルなタンパク質で飽和した。

そｏｉ、、ｉ留水１ｊ中にＮａＣｌ３　Ｓ）、　ＫＭ２ＰＯ４０２Ｓ）。

ＮＩＬ２ＨＰＯ４”１２Ｈ２０２，９Ｌ　ＫＣｇ　０．２９　ｋヨびツイーン２ ００．５−を含むＰＢＳ−クイーン（ｐＨ７，４）を用いてプレートを４回洗浄 した。

そのゾビートをバイブリド９−マ上清と共にインキ島ベートした後、アルカリ性 ホスファターゼに結合されたヒツジ抗マウス免疫グロブリン複合体（例えばＮＥ Ｎ社からのＮＥエニー００）を用いてマウス抗Ｇ工ＦＡ抗体の存在を調べた。

その複合体と２時間インキ瓢ベートし１次いで４回洗浄した後、基質溶液０．２ −を加えた。基質（）ぞラニトロフェニルホスフェー）；ＰＮＰＰシグマ１０４ ホスファターゼ基質標準＝１０４−１０５　）は蒸留水ｌｌ中ＫＭｇＣ１２？　 ５Ｈ２０１００＋１１Ｆ、　ＮａＮ３０２９およびジェタノールアミン９７ｄＹ 含む緩衝液（ＭＣ＃でｐＨ９Ｊｌｌに調整）に溶解した（緩衝液５ｄに対して５ ηの錠剤１個）。基質の添加後異なる間隔ンおいて４０５ｎｍ　での光学密度を 測定した（ダイナチク社からのオートリーダーＭ）ｊ５８（’））。

強い陽性ハイプリドーマなりローニングのために選択した。

細胞株Ｕ９３７におけるＨＬＡり２スＩ抗原−発現の増強に対するＧＩＦＡの活 性を測定した。ハイプリドーマおよびクローン上清の中和活性（ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｚｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）はＧＩＦＡとのインキエベーシヲン後に試験し た。

ＨＬＡクラスＩ発現のバイオアッセイ／増強は次のように試験した： １）培養条件：　Ｕ　９３７細胞（前単球細胞株）をあるものはモノクローナル 抗体の存在下に、そしであるものは不在下に、ＧＩＦＡ（ｌｄ当たシ１単位およ び４単位）と共に３日間インキュベートした。

２）ＨＬＡ発現の定量化：これらの細胞はＨＬＡクラス■抗原に対して特異的な Ｗ６／３２モノクローナル抗体と共にインキ島イードした。その後、ＦＩＴＣ結 合抗マウスエ９抗体（Ｆ（ＡＢ’）２フラグメント）により細胞を標識した。

３）ＨＬＡクラスＩ抗原の発現強度をフローサイトメトリーによシ測定した。

ヒトガンマエＦＮのバイオアッセイとして、ＥＭＣＣ脳心筋炎）ウィルスの細胞 変性作用からのＡ３４９細胞の保護を使用した。反応はモス−ｖ　ン（Ｔ、　Ｍ ｏｓｓｍａｎ）らのＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ工ｍｍｕｎｏ−１ｏｇｉｅａＩＭｅｔ ｈｏｄｓ、　１９８３．６５．　ｐ、　５５〜６３に記載のＭＴＴ検定法を用い て実施する。生存＃！５ゆはテトラゾリウム塩ＭＴＴを暗青色のホルマザンに還 元する能力をもっている。ホルマザンの強度はその結晶をイソプＯｚｅノール中 に溶解した後分光光度計を用いて定量化しうる。検定は次のようにして行う＝１ ）ＲＰＭＩ−１０％ＦＣ８中のＧＩＦＡの溶液５０　ｐ　ｌを９６−ウェル平底 プレートの各ウェルに分配する。

２）各ウェルにハイプリドーマ上清（または精製モノクローナル抗体の希釈液） を１００μｌずつ加える。対照ウェルには抗体を加えない。

３）γ℃で１時間イン中ユベーシ、ン後、各ウェルにＲＰＭニー１０チ１’　Ｃ Ｓ　１００μｌ中の１０’個の新たにトリプシン処理したＡ３４９細胞を加える 。

４）３７℃で３時間インキエベーシ璽ン後、ＥＭＣウィルスを含む溶液間μｇを 加える。Ｅｔｃウィルスの添加量は細胞が３日で完全に溶解するように舖正する 。

５）　３日間インキエベーシ欝ン後、培地を新しい培地（ＲＰＭニー１０％ＦＯ ８）ｔｏｏμｌ　と取＃）換える。

６）各ウェルにＰＢＳ中５■／ｄのＭ’ｌ’Ｔ溶液Ｃ３−Ｃ４，５−シメチルチ アゾール−２−イル）　−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド〕１ ０μｌを加える。

７）３７℃で３時間インキエベーシヲン後、酸性化したインプロパツール（イン プロパツール１１当たシ１２５　Ｎ　ＨＣｇ　３．２　ｄ。

ドイツメルク社）１５０ｔｉ／　を加える。

８）ホルマザン結晶を十分に混合して溶解する。マイクロウェルの光学密度は試 験波長５７０ｎｍ　および基並波長６３０　ｎ　ｍを用いてダイナテク（Ｄｙｎ ａｔｅｃｈ）　ＭＲ５８０オートリーダーによシ測定する。各ウェルに存在する ホルマザンの量は、インターフェロンによ５ＢＭＣウィルスから保護された細胞 の数をあられす。

１２５工でヨウ素化したＧＩＦＡを上清と共にイン＝？、ベートした。ポリクロ ーナル抗マウスエ９を加えてそのモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿をガン マ線カウンターで測定し、その沈殿物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

免疫沈降検定は次のように実施した： ｌ）インターフェロンの標識化：ＧＩＦＡをポルトン−ハンター試薬（Ｂｏｌｔ ｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ　ｒｅａｇｅｎｔ；　英国アマ−ジャム社）によりヨウ素（ １２５工）化した。過剰の標識用試薬はセファデックスＧ２５Ｍクロマトグラフ ィーによショウ素化インターフェロンから分離した。

２）検定： ２　Ａ、　１２５ニーＧ工１’Ａ　とモノクローナル抗体とを加℃でＩ分間イン キュベートした： ２Ｂ、その複合体を抗マウス抗体により４℃で一晩沈殿させた； ２Ｃ，その沈殿物をＰＢＳで２回洗い、その後側の試験管に移し九： ２Ｄ、ｒ線カウンターで放射能を測定した：２Ｅ、可溶化した沈殿物を５ＤＳ− ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによシ分析した。

５、クローニング ハイプリドーマｍ胞は限界希釈法によりクローニングした。

ハイブリッド細胞を培養培地中に希釈し、プレート当たシω個の細１１！（０， ２ｍ／／クエル）となるように９６−ウェルプレート（平底リンプロ７６００３ −０５　）に分配した。ＢＡＬＢ／ａマウスの腹膜マクロ７アージを支持細胞と して使用し、これらはマウスの腹腔を１チ抗生物質（−！ニジランーストレプト マイシン）含有Ｉ（ＢＳＳ　（ギプコ　カタログ−４０６）を用いて４℃で洗浄 することによシ採取した。通常、マウス１匹から採取される腹膜マクロ７アージ は１枚の９６−ウェルプレート（約（２〜４　）　Ｘ　１０’細胞／ウエル）に とって十分な数であった。

約３週間後、クローンは肉眼で見えるようになるだろう６次にそれらをＵ−ウェ ルプレートに移した。この段階でクローンを出来るだけ速やかに凍結した。その 後上清を取っておいて抗Ｇ工ＦＡ活性について試験した。

多数の適当なりローンが同定された。それらの名称、それらの寄託番号（低回／ セリ、パスツール研究所）、および産生されたモノクローナル抗体の名称を以下 に示す：３ＯＮ４７−１　ニー４６３　４７−１４７Ｎ３−６　ニー４６６　３ −６ ４７Ｎ３０Ａ３２　ｌ−４６４３２ ４７Ｎ３０Ａ３５　ｌ−４６５３５ ４７Ｎ３８Ｂ２７　ニー４６８　２７ ４７Ｎ４８Ｂ２２　ニー４６９　２２ ４７Ｎ９−１１　ｌ−４６７９−１１ 大量のモノクローナル抗体を得るために、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスにハイ プリドーマ細胞を注射することによシ腹水を生じさせた。

細胞注射の１０日前に、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル−ペン タデカン、アルドリッチ　Ｔ２２８０２　）　０５　ｄをマウスに腹腔内注射し た。ハイシリド−マ細胞をＰＢＳダルベツコ（ギプコ　０４１．４０４０　）　 で３回洗浄した後、細胞懸濁液を２５×１０７細胞／ｄに調製し、０２−を各マ ウスに注射した（マウス当た。９５　Ｘ　１０’細＠）。１０〜２０日間後に腹 水を採取した。数日間休んだ後で再び各マウスから腹水を集めることができた。

少なくとも２−または３の腹水試料を各マウスから収穫した。

た。等容量の飽和（ＮＨ，）２Ｓｏ４溶液（４℃）を攪拌しながら数分間にわた りてゆっくシ添加した：最終（ＮＨ，）　２Ｓｏ４濃度は閏チ飽和であった。こ の溶液を氷上に父分間放置し、次に５０００×９で１０〜１５分遠心した。沈殿 物を回収し、４０ｍＭ　ＮａＣＪおよび２ＤｍＭトリスー　ＨＣＩ　（ｐＨ７， ８）を含む緩衝液（緩衝液Ａ　）　１５ｄ中に溶解した。再懸濁した沈殿物は２ ０ｍＭ　ＮａＣＪおよび２０　ｍ　Ｍトリス−ＨＣＩＩ　（ｐＨ７，８）を含む 緩衝液（緩衝液Ｂ）１００倍容量に対して透析した。イオン交換クロマトグラフ ィーに先立って、変性されたタンパク質を１５０００　Ｘ　ｇ　で１０分遠心す ることによシ除いた。

ＤＥＡＩセルロースクロマトグラフィー：緩蓋液Ｂで平衡化したＤ］１Ｅ５２（ ワットマン）をカラム（２，５ｃｍ　Ｘ２７ｃｍ　）に充填して、充填床容量１ ３２ｄを得た。４５ｄ／時間のポンピング流速で充填した。

クロマトグラフィーは室温で行った。カラムへの添加直前に、透析試料を緩衝液 Ｂのイオン状態に調整した。その試料を５０ｄ７時間の流速でカラムに添加した 。緩衝液Ｂ（床容量の／１ｏ）で洗浄後、カラムを線状勾配（４０ｍＭ−２００ ｍ　Ｍ　）のＮａ（Ｊで溶離した。全勾配容量は１１であり、溶離速度は５０ｄ ／時間であシ、溶出液の１０ｄ画分を集めた・ ８、凍結乾燥 溶出画分を１　（ｗ／ｖ　）　４　ＮＨ４ＨＣＯ３に対して招待間透析した。

透析後の最終容量は１６８−であった。このプールを０２２ミクロン膜フィルタ −（ファｉコン）に通してｐ過滅菌した。Ｆ液の１０ｄアリコートを滅菌容器中 に移して凍結乾燥した。凍結乾燥後、自動歪締装置を使用することにより無菌状 態を保った。

モノクローナル抗体の同定は次の情報を提供し、そしてモノクローナル抗体は選 択基準を提供するために使用されたこの情報から選択される： （１）特異性、すなわち抗体がどの型のγ−インターフェロンと結合するかにつ いての決定： （１）工９サブクラスの決定； （…）抗体が分子（この場合はγ−インターフェロン）の生物学的機能に対して 示す作用の決定。

１、モノクローナル抗体の特異性 特異性は上記実施例中の第４Ａ項に記載のｇＬ工ＳＡ試験、第４Ｂおよび４０項 に記載の生物学的活性の阻害、および第４Ｄ項に記載の免疫沈降検定を使用して 決定された。

２、１９サブクラスの決定 培養上清から精製されたモノクローナル抗体のアイソタイプは間接的ＥＬ工ＳＡ 試験によシ試験した。上記のようにプレートを各ウェル当たシ３０　ｎ　ＭのＧ ＩＦＡで被覆し、ＲＰＭ工１６４０および１０４ＦＣ８で処理した。ＲＰＭ工１ ６４０および１０チＦＣ３で希釈したモノクローナル抗体を、ウェルの底に被覆 された抗原に２時間のインキエベーシ曹ンによって固定させた。その後、種々の マウスエ９サブクラスに対して特異的な抗体の溶液（希釈度１　：　１０００　 ）をウェルに加えた。ここで使用したすべての抗アイソタイプ抗体（工ｇＭ；　 ＩｇＧ１；　工５）Ｇ２＆；　工９Ｇ２ｂ；工ｇＧ３およびＩｇＡ；λおよびに ）はウサギにおいて生産した。

抗アイソタイプ抗体の存在はアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）に結合させた抗 （ウサギエ９）によって検出した。イン中為ページ璽ン条件および結果の読み取 シは、上記のＥＬ工ＳＡ試験について記載した通りでありた・ ＧＩＦ’Ａ−注射マウスのｆＰＡ細胞の融合によシ得られたハイプリッｒおよび クローンは次の４つの検定法でスクリーニングした： ａ）直接的ＥＩ、ＩＳＡ：第４Ａ項のように実施したが、異なるＧＩＦ類〔ＧＩ ＦＡ、Ｇ工ＦＡ’、Ｇ工１’Ｂ、ＧＩＦＤ、天然ＧＩＦ。

ＣＮＢｒで切断したＧＩＦＡ（＝ＣＮＢｒ−Ｇ工に’Ａ）。

１５０００１１１末端アミノ酸を表すはゾチト’（＝１５ＡＡ−！ブチＦ）。

およびＢＳＡに結合させたこのイプチド（＝ＢＳＡ−イプチＦ）〕を３０ｎＭ／ ウェルでＫＬ工ＳＡプレート上に被覆した。

ｂ）中和検定：この試験は実ｔＩＡ例の第４Ｂおよび４Ｄ項のように実施したが 、ＧＩＦＡのほかにＧ工Ｆに、Ｇ工ＦＢ。

ＧＩＦＤおよびγ−インターフェロンの純粋な市販品（米国二為−シャーＶ−州 、二纂−フルンスウィック、インターフェロンサイエンス社）を使用した。

Ｃ）免疫沈降検定二種々のＧＩＦ類（ＧＩＦ’Ａ、Ｇ工ＦＡ’。

Ｇ工ＦＢ、ＧＩＦＤおよび１５ＡＡペプチド）は実施例の第４Ｄ項でＧＩＦ’Ａ について記載し友ようにヨウ素化し、インキュベートしそして検定した（下記の 表１参照）。

ｄ）エピトープ試験−ＧＩＦＡに結合するためのモノクローナル抗体同士の競合 １）ＥＬ工ＳＡの使用ニ ブレートをウサギ抗体で被覆した。２ｎ９／ｎｕ　のＧ工ｒＡ’４−加、ｔ＆。

２２１１合体を別のモノクローナル抗体の存在下に加えた。

ＭＡｂ（モノクローナル抗体）２２が認識するものと異なるエピトープを認識す るＭＡｔ＋は２２複合体の結合を阻害しないであろう。ｎに等しいＭＡｂはその 複合体の結合を阻害するであろう。

ＭＡｂ（モノクローナル抗体）２１および非結合ＭＡｂ２２はその複合体と競合 しない。これらは２つのＭＡｂによるサンドイッチ検定法に使用することができ る。

この試験は次のように実施した： イ）ウサギ抗Ｇ工Ｆ’Ａポリクａ−ナル抗仕をマイクロタイタ−ウェル上に塗布 した： ０）ＧＩＦＡと共に１時間イ／キエベートした：ハ）検定しようとするＭＡｂと ＡＰに結合されたＭＡｂ２２との混合物と共に１時間インキュベートした：二） ＡＰと共に１時間インキュベートした：ホ）光学密度を読み取った。

２）免疫沈降検定の使用−ＭＡｂに結合するためのＧＩＦＡとＣＮＢｒ−ＧＩＦ Ａとノ競合： Ｇ工ＦＡ分子上の中和抗体のエピトープを局在化する１つの方法は５分子の既知 フラグメントが完全な分子の沈殿を阻害するかどうかを調べることである。モデ ル実験として、まず初めにＧＩＦＡを沈殿させるがＧＩＦＢを沈殿させないＭＡ ｂ３−６を用いて試験した。Ｇ　Ｉ　Ｆ　Ａ、の沈殿は１５ＡＡペプチドによシ そしてまたＣＮＢｒ　−ＧＩｌ’Ａ　により阻害された。その後、ＣＮＢｒ−Ｇ 工ＦＡフラグメントがＧＩＦＡの沈殿を阻害するかどうか調べるために、ＭＡｂ ２２およびＭＡｂ３５に対して試験された。ＭＡｂＺ２の活性は阻害されなかっ たが、ＭＡｂ３５の活性は阻害された。

この試験は次のように実施した： イ）ＣＮＢｒ−Ｇ工Ｆ’Ａを１２５ニーＧ工ＦＡ　と混合し、検定すべきＭＡｂ と共にインキ、ベートした： 口）その抗体をウサギ抗（マウスエ９）　抗体により沈殿させた。

ハ）沈殿物の放射能をγ線カウンターで測定した。

抗体の説明 ＭＡｂ４７−１、クラスＩｇＧ２１に：直接的ＥＬ工ＳＡにおいて、それはＧ工 Ｉｉ’Ａ、Ｇ工ＦＡ’。

ＧＩＦＢ、ＧＩＦＢおよびＣＮＢｒ−Ｇ工１’Ａ　に結合するが、ＢＳＡ−ペプ チドに結合しない。それは異なるＧＩＦまたはそれらの７ラグメントを沈殿させ ない。それは試験したＧＩＦのすべての生物学的活性を中和しない。それＦ！、 ＧＩＦがプラスチックまたはニトロセルロースシート上に塗布されたときだけＧ ＩＦを認識する。

ＭＡｂ９−１１、クラ、スエＣｊＧＩ、に：直接的ＥＬＩＳＡにおいて、それは Ｇ工に″Ａ、Ｇ工Ｆ入。

ＧＩＦＢお工びＧ工Ｆ’ｌ）に結合するが、ＢＳＡ−はブチＦおよびＣＮＢｒ− ＧＩＦ’Ａに結合しない。それはＧ工ｊ”Ａ、Ｇ工ＦＡ’。

ＧＩＦＢ、ＧＩＦＤ　または１５ＡＡ−！’ゾチドを沈殿させない。試験したＧ ＩＦのすべての生物学的活性を中和しない。それはＭ　Ａ　ｂ　４７’−１と同 じエピトープを認識するが、比較的低い親和性を有する。

ＭＡｂ３−６、クラスエｇＧｔ、に： 面接的ＥＬＩＳＡＩＣおいて、それはＧＩＦＡ、ＧＩＦＢ。

ＢＳＡ−−？ブチＦ３およびＣＮＢｒ−Ｇ工１’Ａに結合するが、ＧＩＦにおよ びＧＩＦＢに結合しない。それはＧ工ｌ’ＡおよびＧＩＦＢお工び１５ＡＡペプ チドを沈殿させるが、Ｇ工ＦＡ’およびＧ工１’Ｂを沈殿させない。それは試験 しｆｃＧ工Ｆの生物学的活性を中和しない。

Ｍ　Ａ　ｂ　３２、クラスエｇＧ１、に：直接的ＢＬ工ＳＡにおいて、それはＧ ＩＦＡ、ＧＸＦＤおよびＢＳＡ−ペプチドに結合するが、Ｇ工Ｆ’Ａ’、ＧＩＦ ＢおよびＣＮＢｒ−ＧＩＦＡに結合しない。それはＧＩＦＡ、ＧＩＦＢおよび１ ５ＡＡペプチドを沈殿させるが、Ｇ工ＦＡ′およびＧＩＦＢを沈殿させない。そ れは試験したＧＩＦの生物学的活性を中和しない。それはＧ工ＦＡ分子の最後の １５アミノ酸（１３２〜１４６）内のエピトープを認識し、ＭＡｂ３−６と異な る。

ＭＡｂ３５、クラスＩｇＧ１、に： 直接的ＥＬ工ＳＡにおいて、それはＧＩ′ｆ！’Ａ、ＧＩＦＡ〆。

Ｇ工１’Ｂ、Ｇ工Ｆｌｙ、およびＢＳＡ−ペプチドに結合するが。

ＣＮＢｒ−ＧＩＦＡに結合しない。それはＧＩＦＡ、ＧＩＦＡ’。

ＧＩＦＢ、ＧＩＦＤおよび１５ＡＡペプチドを沈殿させる。それは試験したすべ てのＧＩＦの生物学的活性を中和するが。

ＧＩＦＢのそれを優先的に中和する。それはＱＮＢｒ−Ｇ工１’ＡがＭＡｂ３５ によるＧＩＦＡの沈殿を阻害できるが、ＭＡ１２２によるＧＩＦＡの沈殿を阻害 できないという点でＭＡｂ２２と異なる（表２参照）。

ＭＡＩＺ７、クラスエｇＧｌ、に： 直接的ＥＬ工ＳＡにおいて、それはＧ工１’Ａ、Ｇ工ＦＡ′。

ＧＩＦＢおよびＧＩＦＢに結合するが、ＢＳＡ−はブチＦおよびＣＮＢｒ−Ｇ工 Ｆ’Ａ　に結合しない。それはＧＩＦＡ、Ｇ工Ｆ’Ａ’。

ＧＩＦＢおよびＧＩＦＢを沈殿させるが、１５ＡＡベプチＶを沈殿させない。そ れは試験したすべてのＧＩＦの生物学的活性を中和する。

ＭＡｂＺ２、クラスＩ、Ｇｌ、に： 直接的ＥＬ工ＳＡにおいて、それはＧＩＦＡ、Ｇ工Ｆ’Ａ〆。

ＧＩＦＢおよびＧＩＦＢに結合するが、ＢＳＡ−−？ブチＦおよびＣＮＢｒ−Ｇ ＩＦＡに結合しない。それはＧ工１’Ａ、ＧＩｋ’Ａ。

Ｇ工Ｆ’ＢおよびＧ工Ｆ’Ｄを沈殿させるが、１５ＡＡイプチｒを沈殿させない 。それは試験したすべてのＧＩＦの生物学的活性を中和する。不溶性のマトリッ クスに結合させたとき、それは天然Ｇ工Ｆおよび組換えＧＩＦを保持することが でき、その後これらのＧＩＦは例えばｐＨ２，５で酢酸により溶離される。

検定においてこの抗体とＭＡ’ｂ２７との間にはほんのわずかな競合しか存在し ないので（表３参照）、これらのＭＡｂは異なるエピトープを認識するかもしれ ない。

表２−Ｇ工ＦＡおよびＣＮＢｒ−ＧＩＦＡのＭＡｂにＭＡｂの組合せ　カウント 数／分 ２２　＋　ＣＮＢｒ−ＧＩＦＡ　３１０６３５　＋　ＣＮＢｒ−ＧＩＦＡ　４１ ２ＭＡｂの組合せ　光学密度 ２２ＡＰ　十培地　０９３９ ２２ＡＰ　＋　２２　０．４２３ ２２ＡＰ　＋　２７　０．７４４ 本発明はさらにここに記載のモノクローナル抗体の少なくとも１種、特に２種か ら成るキットを提供する。これらのキットはＧＩＦの定量化を可能にする。好適 なキットは２棟類の異なるモノクローナル抗体（Ｇ工ＦＡ分子上の異なるエピト ープを認識する）、標準Ｇ工ｌ！’Ａ組成物および好ましくは試験用の反応容器 を含み、この容器は例えば溶血’１１　（１２Ｘ　７５　ｍ　）または適当がウ ェルプレート（例えば９６−ウェルプレート）であシ得る。

第１の抗体は所望により反応容器の内面にすでに被覆されていてもよいが、好ま しくは別々の試薬として提供される。標準Ｇ工ＦＡ溶液（試験を行うためにいろ いろな濃度に希釈できる）は必要なものであり、それは通常標準Ｇ工１’Ａ溶液 を調製し得る凍結乾燥された組成物の形、特に密閉バイアル中に安定剤を含む組 成物として提供され、好ましくは窒素または他の不活性ガスの存在下で貯蔵され るだろう。第２のモノクローナル抗体はそれに結合されたまたはその一部として の検出可能な応答を発することができる成分（例えばある種の試験反応、特に着 色反応を行うことができる酸素）を含むでおろう。この成分はノラニトロフェニ ルホスフェート（ＰＮＰＰ）をパラニトロフェノール（その黄色により検出可能 ）に分解しうるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）であシ得る。読み取シは自動 的に行われ、例えば９６−ウェルプレートでの試験はコンピュータに接続するこ とによって直ちに読み取シをプリントアウトすることができるグイナテクオート リーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ）で解読される。また、試 験を溶血管で行う場合は、吸光度を分光光度計で読み取ることができる。

一層感度のよい試験は、第２ＭＡｂにビオチンを結合させて、第３工程でアルカ リ性ホスファターゼに結合したアビジンを加えることによシ実施される。アビジ ンはビオチンに結合され、その後ＰＮＰＰが加えられると、遊離したパラニトロ フェノールが前のように読み取られる。

好適な実施態様では２つのキットが提供され、それぞれのキットは２種類の異な るモノクローナル抗体（すなわち、一方のキャッチャ−およびビオチン複合体と しての他方のトレーサー）および標単Ｇ工Ｆ’Ａ製削（好ましくは凍結乾燥した もの）を含む。第１の中クトは全長Ｇ工ＦＡ分子のみを検出し、キャッチャ−と してＭＡｂ３−６を使用する。第２のキットは全部のＧＩＦを検出し、キャッチ ャ−としてＭＡｂ３５を使用する。各キットにおいて、トレーサーはビオチンを 結合させたＭＡｂ２７である。

表１はＭＡ’ｂ３−６がＣ−末端の１５アミノ酸を欠くＧ工Ｆ分子に結合しない ことを示している。それ故に、ＭＡｂ３−６は全長Ｇ工Ｆを検出および定量化す るのに適したＭＡｂでおる。

第２のキットは１２５ｎ９　Ｇ工Ｆ／ｄの感度を有する。

第１のキットは例えば全長Ｇ工Ｆの濃度を測定するために使用され、そして第２ のキットは全部のＧＩＦを測定するために使用される。その差異はＣ−末端のア ミノ酸を欠失したＧＩＦをあられす。

キットはまたＧＩＦ（組換え体または天然Ｇ工Ｆ）、特に生物学的液体（例えば ヒト血清）中の天然Ｇ工Ｆを測定するために使用される。キットは種々の病理学 的状態を監視するために。

または臨床試験乞追跡調食するために使用される・国　際　！１１　ｆ　報　告 Ａ！０ＪＤＣＴｏ　ｈＨＥ　ＸＮ′ｒＥ助込τ１’０ＮＡＬ　５ＥＡＸＣＨＲＥ ＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．マウスミエローマ細胞株由来の細胞と、予めγ−インターフェロンで免疫化 したマウス由来の脾細胞と、の融合により形成されたハイプリドーマにより産生 されるγ−インターフェロンに対するモノクローナル抗体であって、該抗体はイ ンターフェロンα２と結合せず、本明細書中で４７−１，３−６，３２，３５， ２７，２２および９−１１と指定された抗体から選択されるモノクローナル抗体 。
2. ２．サブクラスＩｇＧ１，に属し、ＮＳ１ミエローマ細胞と予めγ−インターフ ェロンで免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞との融合により形成された ハイブリドーマから産生される、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
3. ３．ａ）マウスをγ−インターフェロンで免疫化し；ｂ）該マウスから脾臓を摘 出して、脾細胞の懸濁液をつくり； ｃ）該脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合促進剤の存在下に融合させ； ｄ）別々のウェルにおいて、未融合ミエローマ細胞が生残できない培地中で融合 細胞を培養し； ｅ）ハイブリドーマを含む各ウェル中の上清を、γ−インターフェロンに対する 抗体の存在について評価し；ｆ）インターフェロンα２に結合しない抗体を産生 するハイブリドーマを選択してクローニングし；そしてｇ）該クローンの上清か ら抗体を回収する；ことから成る方法により製造される、請求の範囲第１項記載 のモノクローナル抗体。
4. ４．ｒ−インターフェロンに対するモノクローナル抗体を産生し得るモノクロー ナルハイブリドーマであって、該ハイブリドーマはマウスミエローマ細胞株由来 の細胞と予めγ−インターフェロンで免疫化したマウス由来の脾細胞との融合に より形成され、本明細書中で３０Ｎ４７−１，４７Ｎ３−６，４７Ｎ３０Ａ３２ ，４７Ｎ３０Ａ３５，４７Ｎ３８Ｂ２７，４７Ｎ４８Ｂ２２および４７Ｎ９−１ １と指定されたハイブリドーマから選択されるモノクローナルハイブリドーマ。
5. ５．適当な培地中で請求の範囲第４項記載のハイブリドーマを培養し、該ハイブ リドーマの上清から抗体を回収することから成る、γ−インターフェロンに対す るモノクローナル抗体の産生方法。
6. ６．マウスの腹腔内に請求の範囲第４項記載のハイブリドーマを注入し、目的と する抗体を含む腹水を該マウスから採取することから成る、γ−インターフェロ ンに対するモノクローナル抗体の産生方法。
7. ７．γ−インターフェロンの試料を、キャッチャーとして作用する第１のモノク ローナル抗体に加え；第１のモノクローナル抗体およびγ−インターフェロンを インキュベートし；第２抗体および検出可能な応答を発することができる成分か ら成るトレーサーを加え；インキュベートし；そして該応答を測定して目的のγ −インターフェロン分子の濃度を求める；各工程から成るγ−インターフェロン 分子の測定方法。
8. ８．モノクローナル抗体３−６または３２を、モノクローナル抗体３５，２７お よび２２から選択された抗体に結合されたビオチンと共に使用することから成る 、末端がＡＬＡＳＥＲＧＬＮで終止する全長γ−インターフェロン分子を測定す るための、請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．γ−インターフェロン、特に末端がＡＬＡＳＥＲＧＬＮで終止する全長γ− インターフェロンを検出するためのキットであって、γ−インターフエロン分子 上の異なるエピトープを認識する少なくとも２種類の請求の範囲第１項記載のモ ノクローナル抗体；標準γ−インターフエロン製剤；および１つのモノクローナ ル抗体に結合された検出可能な応答を発することができる成分；を含有すること を特徴とするγ−インターフェロン、特に全長γ−インターフェロンの検出用キ ット。
10. １０．抗体３−６および抗体２７を含み、検出可能な応答を発することができる 成分は抗体２７に結合されている、請求の範囲第９項記載の末端がＡＬＡＳＥＲ ＧＬＮで終止する全長γ−インターフェロンの検出用キット。
11. １１．抗体３５および抗体２７を含み、検出可能な応答を発することができる成 分は抗体２７に結合されている、請求の範囲第９項記載のγ−インターフェロン 検出用キット。