JPS6335598A - T細胞活性化因子 - Google Patents
T細胞活性化因子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規なTI胞活性化因子に関する。
本発明のT細胞活性化因子は免疫担当細胞の機能を活性
化するので、癌その他の疾患に対する治療に用いること
ができる。
化するので、癌その他の疾患に対する治療に用いること
ができる。
従来技術
T細胞活性化因子は従来インターロイキン1(IL−1
)C1わzel、S、B、et at、、 ジャー
ナル・オブ・イムノロシイ(J、I++++y+uno
1.)、120 .1497〜1503、 1978]
、インターロイキン2 ([L−2)(Gillis
、 S、et al、、 J、Immunol、12
Q 、2027〜2032、1978)などが知られ
ている。
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Q 、2027〜2032、1978)などが知られ
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ヒトのIL−2の場合、呑口らによって、ヒトIL−2
産生細胞ジヤーカツト細胞由来の相補的DNAを用いて
、組換えDNA技術によりIL−2が産生され、レセプ
ター解析まで進んでいる(Taniguchi、 T、
et 、す1.、ネイチャー (Nature)
。
産生細胞ジヤーカツト細胞由来の相補的DNAを用いて
、組換えDNA技術によりIL−2が産生され、レセプ
ター解析まで進んでいる(Taniguchi、 T、
et 、す1.、ネイチャー (Nature)
。
302 、 305. 1983 ; Leo
nard、 11.J、 et al、、Na
ture。
nard、 11.J、 et al、、Na
ture。
311 、626−635 19843゜一方、IL−
1の場合も、最近相補的DNAが解析され(Auron
、 D、町射 1.、プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc
、Natl、 Acad、 Sci、)、 81.79
07〜?911. 1984; March、 C,J
、 Nature、315.641〜647、1985
) 、 I L−1α(等電点5.0)およびIL
−1β(等電点7.0)の全アミノ酸構造が明らかとな
っている。IL−1を生産する細胞としてはマクロファ
ージ、上皮系細胞、好中球、Bリンパ球などと広範であ
る(Brunt、 J、V、、バイオ/チクノロシイ(
Bio/TechnologY) 、 3 、595
〜597 。
1の場合も、最近相補的DNAが解析され(Auron
、 D、町射 1.、プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc
、Natl、 Acad、 Sci、)、 81.79
07〜?911. 1984; March、 C,J
、 Nature、315.641〜647、1985
) 、 I L−1α(等電点5.0)およびIL
−1β(等電点7.0)の全アミノ酸構造が明らかとな
っている。IL−1を生産する細胞としてはマクロファ
ージ、上皮系細胞、好中球、Bリンパ球などと広範であ
る(Brunt、 J、V、、バイオ/チクノロシイ(
Bio/TechnologY) 、 3 、595
〜597 。
1985)。
発明の解決課題および構成
本発明者は、IL−1産生細胞の培養上清より新規なT
細胞活性化因子を得るべく研究を重ねた。
細胞活性化因子を得るべく研究を重ねた。
その結果、従来報告されているものとは異なるT細胞活
性化因子を単離精製することに成功した。
性化因子を単離精製することに成功した。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、新規なT細胞活性化因子を提供する。
本発明のT細胞活性化因子は下記の理化学的性質を有す
る。
る。
a)分子潰:約16.100 (SO3−PAGIli
法)約20.000(ゲル濾過) b)等電点:9.3±0.3(クロマトフオーカシング
法) 約9.0(等電点電気泳動) C)アミノ酸組成比二6N塩酸で110℃、20時間減
圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザーにより分析し
たアミノ酸組成比(モル比)はアラニン(Ala)を1
.00として以下の通りである。
法)約20.000(ゲル濾過) b)等電点:9.3±0.3(クロマトフオーカシング
法) 約9.0(等電点電気泳動) C)アミノ酸組成比二6N塩酸で110℃、20時間減
圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザーにより分析し
たアミノ酸組成比(モル比)はアラニン(Ala)を1
.00として以下の通りである。
アラニン(Ala) 1.00アルギニン
(Arg) 0.74システイン(Cys)
測定せずグリシン(Gly)
1.11ヒスチジン(His) 0.22
イアoイシン(IIe) 0.350イシ7(
1,eu) 0.97リジン(Lys)
0.79メチオ=ン(Met)
0.14フェニルアラニン(Phe) 0.1
1プロリフ(Pro) 0.34セリフ
(Ser) 0.47トリプトファン(T
rp) 測定せずトレオニン(Thr)
0.33チロシン(Tyr) 0.
19”バリン(Val) 0.52本発明
物質は、ヒト細胞を培地に培養し、培養物中に本発明物
質を蓄積させ、該培養物から採取することによって得ら
れる。
(Arg) 0.74システイン(Cys)
測定せずグリシン(Gly)
1.11ヒスチジン(His) 0.22
イアoイシン(IIe) 0.350イシ7(
1,eu) 0.97リジン(Lys)
0.79メチオ=ン(Met)
0.14フェニルアラニン(Phe) 0.1
1プロリフ(Pro) 0.34セリフ
(Ser) 0.47トリプトファン(T
rp) 測定せずトレオニン(Thr)
0.33チロシン(Tyr) 0.
19”バリン(Val) 0.52本発明
物質は、ヒト細胞を培地に培養し、培養物中に本発明物
質を蓄積させ、該培養物から採取することによって得ら
れる。
本発明物質生産のために用いられるヒト細胞としては、
該物質を生産する細胞であればいかなる細胞株も用いる
ことができる。好適な例としては、ヒトBリンパ腫細胞
SSY株、バーキットリンパ腫ナマルバ株などがあげら
れる。
該物質を生産する細胞であればいかなる細胞株も用いる
ことができる。好適な例としては、ヒトBリンパ腫細胞
SSY株、バーキットリンパ腫ナマルバ株などがあげら
れる。
培地としては、ハムFIO培地、ハムF 12培地(以
上フローラボ社製)、ダルベツコウMEM培地、MEM
培地、RPMI−1640培地(以上日永製薬社製)な
どの無蛋白培地が用いられる。
上フローラボ社製)、ダルベツコウMEM培地、MEM
培地、RPMI−1640培地(以上日永製薬社製)な
どの無蛋白培地が用いられる。
培地には、必要により、仔牛脂児血清1〜lO%(W/
V)、グルタミン0.5〜5 m M /ml、抗生物
質〔ヘニンリン(25U/ml)、ストレプトマイシフ
(25■/m+ )など〕、重曹(0,01%)などを
適量加えてもよい。
V)、グルタミン0.5〜5 m M /ml、抗生物
質〔ヘニンリン(25U/ml)、ストレプトマイシフ
(25■/m+ )など〕、重曹(0,01%)などを
適量加えてもよい。
培養(こは、平型々の培養ビン、シャーレ、ローラボト
ル、スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを
用いることができる。培養は、通常種細胞密度5X10
’ 〜2X10’細胞/mlとし、30〜40℃、2〜
4日間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に培
養液中に生成する。たとえば、txto’細胞/m細胞
7細l密度、37℃、2日間の培養では、培養液中に4
4単位/mlの活性物質が生成する。
ル、スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを
用いることができる。培養は、通常種細胞密度5X10
’ 〜2X10’細胞/mlとし、30〜40℃、2〜
4日間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に培
養液中に生成する。たとえば、txto’細胞/m細胞
7細l密度、37℃、2日間の培養では、培養液中に4
4単位/mlの活性物質が生成する。
培養物からの本発明物質の採取は塩析、クロマトグラフ
ィー、電気泳動法、抽出法、遠心分離法、透析法などを
単独または適宜組み合わせることにより行う。具体的に
は次のとおり行う。得られた培養液上清を、冷却遠心分
離し、限外沖適用ホロファイバーで冷却下濃縮する。
ィー、電気泳動法、抽出法、遠心分離法、透析法などを
単独または適宜組み合わせることにより行う。具体的に
は次のとおり行う。得られた培養液上清を、冷却遠心分
離し、限外沖適用ホロファイバーで冷却下濃縮する。
濃縮液をリン酸緩衝液に対して透析する。
透析液をQAEタイプまたはDEAEタイプの陰イオン
交換樹脂たとえばDEAE−)ヨパール(東洋四速社製
)カラムクロマトグラフィーにかけ、0〜1.0MのN
aCβ勾配で溶出する。活性画分を集め限外p過膜によ
り濃縮し、高速液体クロマトグラフィータイプの陰イオ
ン交換樹脂たとえばファルマシアFPLCモノQ(ファ
ルマシア・ファイン・ケミカルズ社製)カラムクロマト
グラフィーにかける。0〜1.OMのNaC1勾配で溶
出し、活性画分を回収する。活性画分を限外−過で濃縮
後、逆相高速液体クロマトグラフィーにかける。0.1
%トリフルオロ酢酸から70%アセトニトリルを含む0
.1%トリフルオロ酢酸までの勾配溶出を行う。アセト
ニトリル約45%で溶出される両分に活性画分が溶出さ
れる。
交換樹脂たとえばDEAE−)ヨパール(東洋四速社製
)カラムクロマトグラフィーにかけ、0〜1.0MのN
aCβ勾配で溶出する。活性画分を集め限外p過膜によ
り濃縮し、高速液体クロマトグラフィータイプの陰イオ
ン交換樹脂たとえばファルマシアFPLCモノQ(ファ
ルマシア・ファイン・ケミカルズ社製)カラムクロマト
グラフィーにかける。0〜1.OMのNaC1勾配で溶
出し、活性画分を回収する。活性画分を限外−過で濃縮
後、逆相高速液体クロマトグラフィーにかける。0.1
%トリフルオロ酢酸から70%アセトニトリルを含む0
.1%トリフルオロ酢酸までの勾配溶出を行う。アセト
ニトリル約45%で溶出される両分に活性画分が溶出さ
れる。
活性画分を5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分析することにより活性画分が単一蛋白質であることを
確認する。
分析することにより活性画分が単一蛋白質であることを
確認する。
本発明物質の分析は以下の方法で行われる。
(1) 分子量
A、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法(以下5OS−PAGBという)による分子
量測定 レムリ(Laemml i)らの方法(Laemmli
、 U、に、。
電気泳動法(以下5OS−PAGBという)による分子
量測定 レムリ(Laemml i)らの方法(Laemmli
、 U、に、。
卦 且1.ネイチ+ −(Nature)、 227
、680゜19703に従い濃度15%のポリアクリル
アミドゲルを使用する5DS−PAGEにより測定する
。
、680゜19703に従い濃度15%のポリアクリル
アミドゲルを使用する5DS−PAGEにより測定する
。
B、セファデックスG=100を用いたゲルp適法によ
る分子量測定 セファデックスG’−100(ファルマシア社製)をカ
ラム(18x240mm、ガラスカラム)に充填し、1
0mMリン酸緩衝液−NaCIt(PBS)10.3M
NaCj2 (p H7,2)の緩衝液を用い、本発
明物質を添加し、ゲルp過を行う。
る分子量測定 セファデックスG’−100(ファルマシア社製)をカ
ラム(18x240mm、ガラスカラム)に充填し、1
0mMリン酸緩衝液−NaCIt(PBS)10.3M
NaCj2 (p H7,2)の緩衝液を用い、本発
明物質を添加し、ゲルp過を行う。
分子量は溶出位置より標準分子量キット(ファルマシア
社製)から求めた標準曲線を用いて算出する。
社製)から求めた標準曲線を用いて算出する。
(2)等電点
A、クロマトフオーカシング法
0、025 M )リエチルアミンー塩酸緩衝液(pH
11,0)で平衡化したFPLC用モノPカラム(0,
5X20c+n、ファルマシア社製)を用い、溶出は0
.0075mmol/pH単位/mlファルマライト(
pH8〜10.5 )−塩酸(pH8,0)を用いクロ
マトフオーカシング法(Siegel、 L、M、、バ
イオキミカ エト バイオフィジカ アクタ(Bioc
himica et BiophysicaActa)
、 112 、346.1966)により等電点測定を
行う。等電点は、溶出位置におけるp Hの実測値より
求める。
11,0)で平衡化したFPLC用モノPカラム(0,
5X20c+n、ファルマシア社製)を用い、溶出は0
.0075mmol/pH単位/mlファルマライト(
pH8〜10.5 )−塩酸(pH8,0)を用いクロ
マトフオーカシング法(Siegel、 L、M、、バ
イオキミカ エト バイオフィジカ アクタ(Bioc
himica et BiophysicaActa)
、 112 、346.1966)により等電点測定を
行う。等電点は、溶出位置におけるp Hの実測値より
求める。
B1等電点電気泳動
等電点装置(ファルマシア社製、スウェーデン)とアン
ホライン(Ampholine)ポリアクリルアミドプ
レー)(pH3,5〜11.0 )<LKB社マニュア
ルに従い作成)を使用し、標準等電点測定マーカーキッ
ト(ファルマシア社製、スウェーデン)を使用して等電
点を測定する。等電点は銀染色法(第1化学薬品)によ
り染色後、等電点マーカーを基準に算出する。
ホライン(Ampholine)ポリアクリルアミドプ
レー)(pH3,5〜11.0 )<LKB社マニュア
ルに従い作成)を使用し、標準等電点測定マーカーキッ
ト(ファルマシア社製、スウェーデン)を使用して等電
点を測定する。等電点は銀染色法(第1化学薬品)によ
り染色後、等電点マーカーを基準に算出する。
(3) アミノ酸組成比
6N塩酸で110℃、20時間加水分解(減圧下)後、
アミノ酸アナライザー〔ピコタグ(P IC0−TAG
)、ウォーターズ社製、アメリカ〕によりアミノ酸組成
を分析する。
アミノ酸アナライザー〔ピコタグ(P IC0−TAG
)、ウォーターズ社製、アメリカ〕によりアミノ酸組成
を分析する。
〔4)活性測定法
笠原らの方法(臨床検査28 、(3)、 3281
984)に準じて、活性の評価をする。すなわち、4〜
6週令のC3H/Heマウスの胸腺細胞を10%仔牛脂
児血a(Fe2)(ギブコ社製)およびコンカナバリア
A (ConA)0.5〜1.Og/mlを加えたRP
MI−1640培地(日水製薬社!lりに1〜2XIO
’細胞/mlの濃度で懸濁させる。この胸腺細胞懸濁液
Q、1mlおよび適当濃度に希釈した本発明試料各Q、
1mlを96穴マイクロプレートの各ウェルに入れ、こ
れを5%炭酸ガス含有空気中、37℃で48時間培1す
る。0.25μC1の3H−チミジンを各ウェルにパル
スラベルして、3日目に細胞を回収する。3H−チミジ
ンの導入は続く液体シンチレーション計数により測定す
る。活性は最大胸腺細胞3H−チミジン導入の50%を
発生させる能力を1単位とし、これに試料の希釈倍率を
乗する方法で表す。なお、比活性は、ブラッドフォード
の方法(Bradford、 N、M、et 旦、、
アナライザー バイオケミストリ(Anal、 Bio
chem、)。
984)に準じて、活性の評価をする。すなわち、4〜
6週令のC3H/Heマウスの胸腺細胞を10%仔牛脂
児血a(Fe2)(ギブコ社製)およびコンカナバリア
A (ConA)0.5〜1.Og/mlを加えたRP
MI−1640培地(日水製薬社!lりに1〜2XIO
’細胞/mlの濃度で懸濁させる。この胸腺細胞懸濁液
Q、1mlおよび適当濃度に希釈した本発明試料各Q、
1mlを96穴マイクロプレートの各ウェルに入れ、こ
れを5%炭酸ガス含有空気中、37℃で48時間培1す
る。0.25μC1の3H−チミジンを各ウェルにパル
スラベルして、3日目に細胞を回収する。3H−チミジ
ンの導入は続く液体シンチレーション計数により測定す
る。活性は最大胸腺細胞3H−チミジン導入の50%を
発生させる能力を1単位とし、これに試料の希釈倍率を
乗する方法で表す。なお、比活性は、ブラッドフォード
の方法(Bradford、 N、M、et 旦、、
アナライザー バイオケミストリ(Anal、 Bio
chem、)。
72 、248.1976)または、5DS−ポリアク
リルアミドゲルの銀染色からの蛋白質定量値を基に、前
述の方法で算出した単位数をこの定量値で割った値で表
す。
リルアミドゲルの銀染色からの蛋白質定量値を基に、前
述の方法で算出した単位数をこの定量値で割った値で表
す。
本発明のT細胞活性化因子を先の活性測定法に従って活
性測定を行った結果、第1図に示されるように本発明因
子がT細胞活性化作用をもっていることが明らかである
。第1図の実験においては、C3H/Heマウス胸腺細
胞107細抱/m+を、0.5x/mlのコンカナバリ
ンA(ConA)存在下、48時間培養後、続く24時
間の〔3H〕−チミジンの取り込みにより活性測定を行
った。
性測定を行った結果、第1図に示されるように本発明因
子がT細胞活性化作用をもっていることが明らかである
。第1図の実験においては、C3H/Heマウス胸腺細
胞107細抱/m+を、0.5x/mlのコンカナバリ
ンA(ConA)存在下、48時間培養後、続く24時
間の〔3H〕−チミジンの取り込みにより活性測定を行
った。
ヒト白血病細胞株H3B、2細胞CKasahara。
T、et (11,、ジャーナル・オブ・イムノロジー
(J、 Immunol、)、 134 、1682(
1986) ) 10’細胞/rr11を50眉/ml
のフィトヘマグルチニン(PHA)存在下、本発明因子
10ng/mlとともに24時間培養し、培養上清中の
IL−2活性を測定した。IL−2活性はIL−2依存
性キラ−T細胞株を用いて、〔3H〕−チミジンの取り
込み看として測定した。結果を第1表に示す。
(J、 Immunol、)、 134 、1682(
1986) ) 10’細胞/rr11を50眉/ml
のフィトヘマグルチニン(PHA)存在下、本発明因子
10ng/mlとともに24時間培養し、培養上清中の
IL−2活性を測定した。IL−2活性はIL−2依存
性キラ−T細胞株を用いて、〔3H〕−チミジンの取り
込み看として測定した。結果を第1表に示す。
第 1 表
−2,898±800
+ 12.100±1,000
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1
(1)細胞培養
ヒトリンパ腫細胞系5SY−1株(英国Nationa
l Co11ection of^nimal Ce1
l Cu1tureに1985年8月13日イ寸でNC
ACC85061901として寄託しである。)5X1
0’細胞/mlを5%仔牛脂児血清を加えたRPMI培
地(田水製薬社製) 80 Qmlを含むスピナーフラ
スコ(柴田製作所社製)に接種し、培養を37℃で48
時間行った。細胞濃度が2X10’細胞/mlに到達し
たとき、培地を1%仔牛脂児血清を加えたRPMI−1
640培地800m1に交換し、サラにシリカ(マリン
クロット ケミカルワークス社製)を培地に対して、1
00g/ml加えて、37℃で48時間培養した。かく
してT細胞活性化因子が44.4単位/ml培地に蓄積
した。同操作をくり返し、該因子を有する培養上清27
1を得た。
l Co11ection of^nimal Ce1
l Cu1tureに1985年8月13日イ寸でNC
ACC85061901として寄託しである。)5X1
0’細胞/mlを5%仔牛脂児血清を加えたRPMI培
地(田水製薬社製) 80 Qmlを含むスピナーフラ
スコ(柴田製作所社製)に接種し、培養を37℃で48
時間行った。細胞濃度が2X10’細胞/mlに到達し
たとき、培地を1%仔牛脂児血清を加えたRPMI−1
640培地800m1に交換し、サラにシリカ(マリン
クロット ケミカルワークス社製)を培地に対して、1
00g/ml加えて、37℃で48時間培養した。かく
してT細胞活性化因子が44.4単位/ml培地に蓄積
した。同操作をくり返し、該因子を有する培養上清27
1を得た。
(2)T細胞活性化因子の分離精製
1)精製工程1
上記培養上清271を冷却遠心分離機(4℃)で8.
OOO回転/分、20〜30分間遠心分離した。上澄液
を4℃で限外p適用ホロファイバー(分画分子13,0
00、アミコン社製)を用いて約15倍濃縮した。濃縮
サンプルをさらに同ホロファイバーを用いて、ポリエチ
レングリコール6、000を0.01%含むlQmMリ
ン酸緩衝波緩衝液7.5)に対し、NaCla度15m
M程度まで透析を行った。
OOO回転/分、20〜30分間遠心分離した。上澄液
を4℃で限外p適用ホロファイバー(分画分子13,0
00、アミコン社製)を用いて約15倍濃縮した。濃縮
サンプルをさらに同ホロファイバーを用いて、ポリエチ
レングリコール6、000を0.01%含むlQmMリ
ン酸緩衝波緩衝液7.5)に対し、NaCla度15m
M程度まで透析を行った。
2)精製工程2
工程1で得られた濃縮成約2βを0.01%ポリエチレ
ングリコール6.000を含む10mMIJン酸緩衝液
(pH7,5)で平衡化したDEAE−) Elパール
650M (2,8cmX40am)(東洋曹達社製)
カラムを用いるDEAE−トヨバールクロマトグラフィ
ーで処理した。
ングリコール6.000を含む10mMIJン酸緩衝液
(pH7,5)で平衡化したDEAE−) Elパール
650M (2,8cmX40am)(東洋曹達社製)
カラムを用いるDEAE−トヨバールクロマトグラフィ
ーで処理した。
サンプル充填後、カラム平衡緩衝液で洗浄し、次にO〜
1.0Mの塩化す) IJウム勾配で溶出した。前記活
性測定法より活性画分を同定した。主な活性は約0.6
〜0.8MのN a C1で溶出しく約180m1)。
1.0Mの塩化す) IJウム勾配で溶出した。前記活
性測定法より活性画分を同定した。主な活性は約0.6
〜0.8MのN a C1で溶出しく約180m1)。
この方法により生理活性面の回収率は約23%であり、
精製度は約2.500倍であった。
精製度は約2.500倍であった。
3)精製工程3
工程2で得られた活性画分18 Qmlを集めて、限外
濾過膜YM5(アミコン社製)により、約100倍濃縮
した(約2m1)。この濃縮液を10mM)リス塩酸緩
衝液(p H7,5)により、Na(1!濃度を約30
mMまで希釈の後、ファルマシアFPLCモノQカラム
(5mmx 5 Qmm)(ファルマシア・ファイン・
ケミカルズ社製)に吸着させた。カラムを10 m M
l−+7ス塩酸緩(析液(p H7,5)で洗浄し、
次に0〜1゛Mの塩化す) IJウム勾配で溶出した。
濾過膜YM5(アミコン社製)により、約100倍濃縮
した(約2m1)。この濃縮液を10mM)リス塩酸緩
衝液(p H7,5)により、Na(1!濃度を約30
mMまで希釈の後、ファルマシアFPLCモノQカラム
(5mmx 5 Qmm)(ファルマシア・ファイン・
ケミカルズ社製)に吸着させた。カラムを10 m M
l−+7ス塩酸緩(析液(p H7,5)で洗浄し、
次に0〜1゛Mの塩化す) IJウム勾配で溶出した。
活性画分は、約0.3〜0.5M NaC(lで溶出
した(約15m1>。
した(約15m1>。
この工程の活性回収率は約60%であり、M製、文は約
1.3倍上昇する。
1.3倍上昇する。
4)精製工程4
工程3で得られた活性画分15m1を集めて、限外p過
膜YM5(アミコン社製)により、約10倍濃縮した。
膜YM5(アミコン社製)により、約10倍濃縮した。
濃縮液を逆相高速液体クロマトグラフィーカラムMMC
−バック AM−3120DS (15cmx(is、
栗田工業社製)にかけた。TRIROTARSR高速液
体クロマトグラフィー(日本分光社製)を使用し、21
0nmの吸光度で溶出液をモニターした。溶出は30℃
で0.1%トリフルオロ酢酸から70%アセトニトリル
を含む0.1%トリフルオロ酢酸までの勾配により1.
0ml/分の流速で行った。
−バック AM−3120DS (15cmx(is、
栗田工業社製)にかけた。TRIROTARSR高速液
体クロマトグラフィー(日本分光社製)を使用し、21
0nmの吸光度で溶出液をモニターした。溶出は30℃
で0.1%トリフルオロ酢酸から70%アセトニトリル
を含む0.1%トリフルオロ酢酸までの勾配により1.
0ml/分の流速で行った。
該因子はアセトニトリル濃度約45%で溶出された。活
性画分を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析することにより、該両分は分子量的16.10
0の単一蛋白質を含むことを確認した。この工程の活性
回収率は約61%であり、精製度は約25倍であった。
性画分を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析することにより、該両分は分子量的16.10
0の単一蛋白質を含むことを確認した。この工程の活性
回収率は約61%であり、精製度は約25倍であった。
なお全工程を通じての活性回収率は約8%であり、精製
度は約8.5X10’倍であった。また該因子の生物活
性は、約I X 10’単位/mg蛋白であった。
度は約8.5X10’倍であった。また該因子の生物活
性は、約I X 10’単位/mg蛋白であった。
なお精製結果のまとめを第2表に示した。
発明の効果
本発明によれば、免疫担当細胞の機能を活性化し、癌そ
の他の疾患に対する治療に用いることができる新規なT
細胞活性化因子が提供される。
の他の疾患に対する治療に用いることができる新規なT
細胞活性化因子が提供される。
第1図は、本発明因子のT細胞活性化作用によるC3H
/Heマウス胸腺細胞への〔3日〕−チミジンの取り込
み活性を示す。
/Heマウス胸腺細胞への〔3日〕−チミジンの取り込
み活性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)下記の理化学的性質を有する新規T細胞活性化因子
。 a)分子量:約16,100(SDS−PAGE法) b)等電点:9.3±0.3(クロマトフォーカシング
法) c)アミノ酸組成比:6N塩酸で110℃、 20時間減圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザーに
より分析したアミノ酸組成比(モル比)はアラニン(A
la)を1.00として以下の通りである。 アラニン(Ala) 1.00 アルギニン(Arg) 0.74 アスパラギン酸/アスパラギン 0.32 (Asp/Asn) システイン(Cys) 測定せず グルタミン酸/グルタミン 0.71 (Glu/Gln) グリシン(Gly) 1.11 ヒスチジン(His) 0.22 イソロイシン(Ile) 0.35 ロイシン(Leu) 0.97 リジン(Lys) 0.79 メチオニン(Met) 0.14 フェニルアラニン(Phe) 0.11 プロリン(Pro) 0.34 セリン(Ser) 0.47 トリプトファン(Trp) 測定せず トレオニン(Thr) 0.33 チロシン(Tyr) 0.19 バリン(Val) 0.52
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61181013A JPS6335598A (ja) | 1986-07-31 | 1986-07-31 | T細胞活性化因子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61181013A JPS6335598A (ja) | 1986-07-31 | 1986-07-31 | T細胞活性化因子 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6335598A true JPS6335598A (ja) | 1988-02-16 |
Family
ID=16093222
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61181013A Pending JPS6335598A (ja) | 1986-07-31 | 1986-07-31 | T細胞活性化因子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6335598A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61187758A (ja) * | 1985-02-15 | 1986-08-21 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 飼料用ミネラルペレツト |
US20120082695A1 (en) * | 2009-11-27 | 2012-04-05 | Axel Ruth | Cosmetic active preparation |
-
1986
- 1986-07-31 JP JP61181013A patent/JPS6335598A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61187758A (ja) * | 1985-02-15 | 1986-08-21 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 飼料用ミネラルペレツト |
JPH0552172B2 (ja) * | 1985-02-15 | 1993-08-04 | Mitsui Toatsu Chemicals | |
US20120082695A1 (en) * | 2009-11-27 | 2012-04-05 | Axel Ruth | Cosmetic active preparation |
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