JPS63291598A

JPS63291598A - 生体試料中のグルコ−スの測定方法

Info

Publication number: JPS63291598A
Application number: JP12395987A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Fujie; 藤江　眞一; Nobuo Oshima; 信夫大島; Akira Matsuyuki; 松行　昭
Original assignee: Meidensha Electric Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Meidensha Electric Manufacturing Co Ltd
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1987-05-22
Publication date: 1988-11-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ａ　産業上の利用分野この発明は、尿、血液、血清、血しょう、リンパ液等の
グルコースを高感度かつ高精度に定量可能な測定方法に
関する。Ｂ　発明の概要この発明に係る生体試料中のグルコースの測定方法は、
生体から分離した試料に共存する代謝生成物質を陰イオ
ン交換樹脂で処理して除去し、次いで共存物質である過
酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を還元剤により分解除去し、その
後試料中のグルコースを酵素グルコースオキシダーゼに
より酸化分解して生成する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のみ
を光学的方法、化学的方法により定量し、検量線に基い
てグルコースの量を求める方法である。そして試料中の
グルコースの酸化分解により生成した過酸化水素（Ｈ２
０□）のみを直接の測定対象にすることにより、共存す
る代謝生成物、過酸化水素（１１２０２）等を主原因と
する高い数値のブランク値を低下させ、微量のグルコー
スまでも高感度及び高精度に定量し、糖尿病等の診断及
び経過観察等に使用される検査室での生体試料中のグル
コースの定量を容易、正確かつ簡単にする。Ｃ従来技術 −ＩＱにグルコースは血液、尿、リンパ液等の一体液に
含まれる。そして、尿中のグルコースの場合、健康人であれは、ご
く微量存在するだけであるが、糖尿病になると著しく増
加する。そのために、糖尿病の診断や経過観察などに尿
中のグルコースの定量が行なわれ、迅速、簡易で、かつ
高感度及び高精度のへ　グルコースの定量法が重要な意
義を有することになる。しかし、従来の生体試料中のグ
ルコースの定量は、「ソモジー法」に代表されるように
グルコースの還元性を利用した低精度の方法しかない。Ｄ　発明が解決しようとする問題点上記のように、従来の「ソモジー法」を代表とするグル
コースの還元力を利用する各種の方法は、操作が煩雑で
、特異性が低く、しかも感度及び精度も低く、糖尿病の
診断、経過観察に十分役立ちえないという問題があった
。Ｅ　問題点を解決するための手段この発明に係る生体試料中のグルコースの測定方法は、
生体試料中のグルコースを定量するのに、生体試料を陰
イオン交換樹脂で処理し、次に上記試料を還元剤で処理
して上記試料中の過酸化水素を還元して分解した後、上
記試料を酵素グルコースオキシダーゼで処理し、上記試
料中のグルコースを酸化分解して、過酸化水素を生成さ
せ、その過酸化水素を、化学的方法及び物理的方法によ
り定量し、その定量値から検量線に基いてグルコースの
二を求めることを特徴とする。Ｆ　実施例この発明は、生体試料中のグルコースのみを酸化酵素グ
ルコースオキシダーゼにより選択的に酸化し、生成する
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を化学発光法等で定量し、検量
線に基いて、グルコースを定量することを意図し、以下
の実験を行なった。実験１尿を希釈して酵素グルコースオキシダーゼにより処理し
、生成した過酸化水素（１１２０２）にルミノール（発
光試薬）とフェリシアン化カリウム（触媒）を加えて生
ずる化学発光の発光量を測定した。第１図の線Ａはその
結果を示したものである。第１図において、線Ａは、尿中のグルコース濃度が１０
−’ｍｏＱ／（１以下では、水平となり、

【イ］の示す
発光強度がブランク値となる。そのため、１０−４ｍｏ
Ｑ／２以下の濃度のグルコースは定量不可能になること
が明らかとなった。又、尿中のグルコース濃度がＩ　Ｏ
−４ｍｏＱ／９以上の範囲でも、発光強度は、尿中のグ
ルコース濃度に対してゆるやかな直線を示すことか明ら
かとなった。その原因として、尿中には、過酸化水素（
１１゜０゜）及びその他の代謝生成物が存在するので、
それらの物質によりブランク値が高くなっており１、し
かも、グルコースの７シ１度と発光強度とが鋭敏な相関
を示さない可能がある。そのため、代謝生成物、及びあらかじめ生体体液中に共
存する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を除いてグルコースの定
量をする実験を次に行なった。実験２以下の番号順の操作により尿中のグルコースを測定した
。 ■尿２ｍすに強塩基性陰イオン交換樹脂（０「型）２ｍ
、Ｑを加えて攪拌後、上澄液１ｍｆｌを試験管に採取し
た。なお、強塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ−型）は、次の
第１表に示す諸元のものを使用した。第１表 ■採取した上澄み液１　ｍＱに０．１　ｍｏΩ／Ωリン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）　　１　ｍＱを加えて、上澄液
をｐｌ＋７．０に調整した。 ■そのｐｌ＋調整した溶液２ｍＱに還元剤である水素化
ホウ素ナトリウム（半井化学薬品■製ニー級）０．０１
ｇを添加して、発泡が終るまで放置し、尿中に共存する
過酸化水素（ｆ１２０２）を退元分解した。 ■その溶液から１　ｍＱを別の試験管に移し、そこへ０
５ｍ０Ｑ／Ｑリン酸緩衝？Ｗ　（ｐＨ６，０）　１　ｍ
Ｑを加えてｐｌ＋を７．０に調整した。 ■その調整した溶液から０．２　ｍｌを採取して別の試
験管に移し、そこへ純水０．８　ｍＮを加えて希釈した
。 ■希釈した溶液から０．１　ｍΩを採取して、別の試験
管に移し、そこへ１００μ／ｍΩ、の酵素グルコースオ
キシダーゼの溶液０．Ｏ１ｍΩを加えた。なお、次の第
２表は酵素グルコースオキシダーゼの諸元を示す。第２表 ■上記■で酵素グルコースオキシダーゼを加えられた溶
液は、次に２　Ｘ　１０−’ｍｏΩ／Ωのルミノール溶
液（発光試薬）と６　Ｘ　１０−３ｍｏΩ／９フェリシ
アン化カリウム水溶液（触媒）を加えた。そしてグルコ
ースの分解により生成した過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の化
学発光に生ずる発光量をルミノメータ（■明電舎製：商
品名Ｕ　Ｐ　’Ｄ　−８０００）により測定して過酸化
水素（８２０２）を定量し、グルコース標準液の検量線
に基いてグルコースの二を求め、その値を尿中のグルコ
ースの量にした。なお、検量線は、β−Ｄ−グルコース標準液を同様の操
作で、酵素グルコースオキシダーゼにより分解し、ルミ
ノール溶液とフェリシアン化カリウム水（８液で過酸化
水素＜　８２０２）を化学発光させて、発光量をルミノ
メータで測定することにより作成した。又次の第４表は、ルミノール溶液及びフェリシアン化カ
リウム水溶液の諸元を示す。第４表第１図の線Ｂは、検量線を示し、第１図の線Ｃは、測定
された尿中のグルコース濃度を示す。この結果から、尿
を直接酵素グルコースオキシダーゼにより処理した後、
過酸化水素（Ｈ２０□）を定量し、それらか尿中のグル
コースの量を求めた検量線Ａのブランク値【イ】よりも
、線Ｃのブランク値

【口】は低くなり、尿中のグルコー
ス濃度が１０−’ｍｏＱ／Ｑ以下の微量の範囲でも定量
可能となる。又線Ｃの発光強度は、線Ａに比較して、尿
中のグルコース濃度に対する勾配が急な相関を示し、線
Ａよりも測定感度が著しく向上していることか明かとな
った。実験３尿３ｍ交を実験２で使用したのと同じ強塩基性陰イオン
交換樹脂（ＯＨ−型）１ｍ９を充填したカラムに流下し
、溜出液のうち、最初の１　ｍＱを捨て、その後の溜出
液から１ｍΩを採取した。その溜出液１ｍ９を実験２の
■以下と同じ操作を行なって尿中のグルコースを定量し
た。その結果は、第１図の線Ｃと同じになった。実験４実験２の操作のうち、陰イオン交換樹脂を強塩基性のＣ
ｌ−型及びＣｌｌ３ＣＯＯ−型にそれぞれ変え、他の操
作は同様にして実験した。その結果、第１図の線Ｃと近
似した傾向を示すことが明かとなった。実験５実験２の操作のうち、陰イオン交換樹脂を弱塩基性の０
９−型に変え、他の操作は同様にして実験した。その結
果ブランク値は若干上昇するが、はぼ線Ｃと同様の傾向
を示すことが明かとなった。ところで上記実験では、還元剤として水素化ホウ素ナト
リウムを使用しているが、亜硫酸ナトリウムに変えて実
験しても、結果は同じであった。又、上記実験では、ルミノールとフェリシアン化カリウ
ムにより化学発光させて、その発光量から定量したが、
他の光学的方法として生物発光法、吸光度法、蛍光法及
びレーザ比濁法によっても同様に定量しつる。さらに物
理的方法としてポーラログラフイーによっても容易に定
量することがで診る。又生成した過酸化水素を直接化学的方法により定量して
もよい。その滴定法には、過マンガン酸塩滴定法、ヨウ
素酸還元滴定法等があるが、実験したところでは、いず
れも上記実験の光学的方法により測定した結果とほぼ完
全に一致した。さらに、上記実験１〜実験５では試料と
して尿を使用しているが、血液、血清、血しよう、リン
パ液、唾液及び胃液を試料にしても同様の結果が得られ
た。第２図は、このようにして実験により確立された測定法
の工程図である。Ｇ　発明の詳細な説明したように、この発明は上記のように■生体中の
代謝生成物をあらかじめ陰イオン交換樹脂で除去するの
で、生体体液中のグルコースの分解により生成する過酸
化水素（Ｈ２０□）の定量を妨害されることがない。 ■生体中の過酸化水素（１１２０２）をあらかじめ還元
剤で分解するので、生体中のグルコースの酸化分解によ
り生成する過酸化水素（ＬＯ２）のみを定量することか
できる。 ■検出系として過酸化水素（ｔｈｌｈ）を定量するので
、化学的方法及び物理的方法により高精度かつ高感度で
グルコースを定量することができる。 ■溶液中の過酸化水素（Ｌ０２）を測定するので、操作
が簡単で、かつ短時間に少量のサンプルて高い積度で測
定でき、しかも測定値からグルコースを定量するのでグ
ルコースの定量値も著しく高精度、高感度になる。 ■少量のサンプルから過酸化水素の測定か可能となるの
で、分析装Ｍも容易に自動化できる。 ■容易、かつ迅速で、しかも高精度、高感度に生体中の
グルコースの量を知ることかできるので、糖尿病の診断
等に役立つ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グルコースの発光強度を示す線図、第２図は
分析操作の工程図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）生体試料中のグルコースを定量するのに、生体か
ら分離した生体試料を陰イオン交換樹脂で処理し、次に
上記試料を還元剤で処理して、上記試料中の過酸化水素
を還元して分解した後、上記試料を酵素グルコースオキ
シダーゼで処理し、上記試料中のグルコースを酸化分解
して、過酸化水素を生成させ、その過酸化水素を化学的
方法及び物理的方法により定量し、その定量値から検量
線に基いてグルコースの量を求めることを特徴とする生
体試料中のグルコースの測定方法。
（２）上記試料が、尿、血液、血清、血しょう、リンパ
液、唾液、胃液であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の生体試料中のグルコースの測定方法。
（３）上記陰イオン交換樹脂が強塩基性陰イオン交換樹
脂でＯＨ＾−型のものであることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の生体試料中のグルコースの測定方法
。
（４）上記陰イオン交換樹脂が、Ｃｌ＾−型、ＨＣＯＯ
＾−型及びＣＨ＿３ＣＯＯ＾−型の強塩基性の陰イオン
交換樹脂であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の生体試料中のグルコースの測定方法。
（５）上記陰イオン交換樹脂が、Ｃｌ＾−型の弱塩基性
の陰イオン交換樹脂であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の生体試料中のグルコースの測定方法。
（６）上記陰イオン交換樹脂が１００〜２００メッシュ
の粒度であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の生体試料中のグルコースの測定方法。
（７）上記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸
ナトリウムであることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の生体試料中のグルコースの測定方法。
（８）上記化学的方法が、ルミノール及びフェリシアン
化カリウムを添加して、化学発光させ、その発光量から
過酸化水素を定量する方法であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の生体試料中のグルコースの測定
方法。
（９）上記化学的方法が、生物発光法により過酸化水素
を発光させ、その発光量から検量線に基いて過酸化水素
を定量する方法であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の生体試料中のグルコースの測定方法。
（１０）上記光学的方法が、レーザ比濁法であることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の生体試料中のグ
ルコースの測定方法。
（１１）上記化学的方法が、ポーラログラフィーにより
過酸化水素を定量方法であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の生体試料中のグルコースの測定方法
。
（１２）上記化学的方法が、過マンガン酸塩により滴定
して、過酸化水素を定量する方法であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の生体試料中のグルコース
の測定方法。
（１３）上記化学的方法が、ヨウ素により還元滴定する
ことにより過酸化水素を定量する方法であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の生体中のグルコース
の測定方法。