JPS63258850A - ｌ−シスチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素法にて！−シスチンを得る方法に関する
。

シスチンは還元をすることにより容易にシスティンへ変
換が可能であり、２−シスチン、２−システィンは医薬
あるいは医薬原料、食品添加物、化粧品添加物などとし
て利用されており、特に近年はコールドパーマ液の原料
などとしても需要が伸びているＳ元素含有のアミノ酸で
ある。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）従来
！−システィンの製法としては、（１）天然物から抽出
する方法、（２）有機合成法、（３）発酵法、（４）酵
素法などが知られているが、天然物から抽出する方法に
ついては、原料の供給が不安定であり、且つ不要な他の
アミノ酸が混入する。また有機合成法においてはり、　
　Ｌ一体の分割を要する。更に発酵法は蓄積量が低いな
どの欠点があり、工業的に有利な製法とは言い難い。

酵素を用いて２−システィンを合成する酵素方法として
は、（１）システィン・シンターゼや、システィン・デ
スルフヒドラーゼを用いて！−セリンと硫化水素から合
成する方法、（２）システィン・デスルフヒドラーゼを
用いてβ−置換アラニンと金属硫化物などから合成する
方法、（３）２−アミノ−チアゾリン−４−カルボン酸
（ＡＴＣ）から、ｆｆ１−ＡＴＣ−ヒドラーゼ、ＡＴＣ
−ラセマーゼ、Ｓ−カルバミル−ｌ−システィン・ヒド
ラーゼを用いて合成する方法などが知られている。また
本出願人は、先に２−セリンと金属水硫化物などのスル
フヒドリル基を有する化合物とをトリプトファン・シン
ターゼの存在下反応させて得る方法を出願した（特願昭
６０−８４５４５号）。

これらの発酵法を問わず、発酵法、合成法のいずれにお
いてもシスティン含有反応液よりシルティンの分離にお
いては、反応液の組成が複雑であることと、システィン
の水に対する溶解度が非常に大きいためシスティン含有
反応液より直接システィンとして単離・精製することは
極めて難しく、通常システィンを一旦強制的に酸化して
シスチンとして精製・単離を行い、必要により電解還元
などにより精システィンとして回収する方法が知られて
いる。

またシスティンからシスチンへの酸化方法も若干知られ
ており、例えば特公昭５７−７６３４公報ではシスティ
ン発酵水溶液中のシスティンをｐＨ５〜１０の範囲に維
持して、空気酸化やＨ！０．などの過酸化物を用いた酸
化方法が記載されている。

しかしながら該方法は、例えば！−セリンよりシスチン
を得る場合は、一旦酵素反応を終了してシスティンを製
造した後でないと適用できず、またｎｔｏｇや空気によ
る酸化方法は、システィン酸化反応条件制御に難があり
、酸化反応条件を厳しく制御しなければかなりの割合で
シスチン以外の分解物が生じるなど問題点があった。

また、ｌ−セリンの酵素反応においては、用いるスルフ
ヒドリル基化合物としては、硫化水素（Ｈｌｓ　）を直
接使用したほうが反応性が高いことが予想でき、また価
格も安いにもかかわらずＨ，Ｓガスは水に対する溶解度
がほとんどないため、通常はＨｚＳ源としては水硫化ソ
ーダなどの水可溶性塩が使用されていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、上記のような問題点を踏まえて、鋭意検
討の結果、本発明方法に達したものである。

−即ち本発明は、２−セリンを酵素反応により、硫化水
素、アルカリ金属水硫化物またはアルカリ金属硫化物と
反応させて得られるｌ−システィンを含む反応水溶液中
のｌ−システィンを酸化してｌ−シスチンを得るに際し
、ジメチルスルホキシドの存在下で酵素反応を行うこと
により、同時に反応系中においては酸化反応も行われる
ので、生成したシスティンを逐次シスチンに変換させな
がら反応を行うことを特徴とするｌ−セリンより！−シ
スチンの製造方法である。

このように本発明では、システィンの酸化剤として使用
するジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略す）を、
ｌ−システィン製造時の酵素反応系において使用するこ
とにより、反応工程において生成システィンを完全にシ
スチンに変換でき、またたとえシスティン反応に硫化水
素ガスを用いた場合でも、ＤＭＳＯが反応系中で硫化水
素の溶解補助剤としての作用をするので、酵素反応水性
媒体中で充分な濃度を維持して実施できる。

また系中で添加したＤＭＳＯは全く酵素反応を阻害する
ことな（、酵素反応のより生成してくる！−システィン
を逐次安定な！−シスチンに酸化して酵素反応系から析
出させるため、ｌ−システィン製造時の酵素反応速度を
著しく速めることができることもわかった。

したがって本発明は、生成した！−システィンの副生物
への分解をも防ぐことが可能となり、！−セリンから高
収率でｌ−シスチンを得ることができる。

本発明において使用する酵素は、２−セリンと硫化水素
、アルカリ金属水硫化物及びアルカリ金属硫化物との酵
素反応に用いられる酵素であれば何ら制限されず、例え
ば公知のシスティン・シンターゼやシスティンデスルフ
ヒドラーゼなどの酵素を用いてもよく、また前記した出
願人の提案のトリプトファン・シンターゼを用いて反応
させることもできる。

特に本発明においては、トリプトファン・シンターゼを
用いて実施するのが効果も太き（好ましい方法であり、
トリプトファン・シンターゼの酵素生産菌としては前記
特願昭６０−８４５４５号公報に開示されているように
エシェリヒア・コリ　ＭＴ−１０２３２（Ｆ　Ｅ　ＲＭ
　　Ｂ　Ｐ　−１９）、エシェリヒア・コリ　ＭＴ−１
０２４２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０）などの微生物や、
ノイロスポラ・クラッテ（ＡＴＣＣ１４６９２）などの
微生物が使用できるが、特にエシェリヒア・コリから得
られたトリプトファン・シンターゼを用いるのが有利で
ある。

酵素は必ずしも抽出された純粋なものを使う必要はなく
、上記生産菌株の培養物、培養物から遠心分離などの方
法によって採取した生菌体、あるいはその凍結菌体、凍
結乾燥菌体、あるいは超音波処理などによって得られる
菌体処理物などが利用される。

本発明方法においては、２−セリンの基質濃度は特に制
限はないが、通常液中濃度１〜２５重世％の範囲で使用
するのがよい、また反応液中における酵素の使用量は、
酵素の使用形態により異なり特に制限はなく、基質濃度
、酵素活性などの諸条件により変更される。またトリプ
トファン・シンターゼ使用の場合は、基質の他に補酵素
であるピリドキサールＩ）ン酸を微量、例えば液中濃度
として０．１〜５０ｐｐｍの範囲で添加することが望ま
しい。

本発明においては、酵素反応時に供給するスルフヒドリ
ル基化合物としては、ＮａＨＳ、にＩｔｓなどのアルカ
リ金属水硫化物であり、また直接硫化水素ガスを反応系
中に導入してもよい、硫化水素の場合は、その使用量は
ｉ−セリンに対して１倍モル以上がよい。

また本発明の特徴であるＤＭＳＯの使用量は、ｌ−セリ
ンに対して０．２〜５倍モル程度であり、さらに好まし
くは０．５〜２．０倍モルが反応系中に添加される。使
用量が０．２倍モル以下であると生成！−システィンを
全量！−シスチンに変換することが難しく、また硫化水
素を使用した場合は、その溶解度も低下する。また５倍
モル以上であると著しく酵素反応を阻害する傾向になる
。

反応温度は通常２０〜６０°Ｃの範囲であり、反応ｐＨ
は５〜１０である。また反応時間は、通常２〜５０時間
であり、硫化水素の場合は２〜１０時間がよい。

反応液は、時間が経過するに従って白色を呈し、これは
反応液中にｌ−シスチン結晶が逐次析出してきているこ
とを示す。

反応終了後の反応液中には、未反応氾−七リン及びｌ−
シスチンが析出した状態で存在するが、本反応液よりシ
スチンを単離するには、例えば反応液を塩酸強酸性下で
活性炭を加え加熱処理、熱濾過に付することにより酵素
菌体を除去して、反応液のｐｕを再び５付近まで戻すこ
とにより、！−シスチンを晶析させ通常の固液分離によ
り純度の高いｌ−シスチンか取得可能となる。また、こ
のようにして得られた２−シスチンを電解還元すれば、
２−システィンを得ることが出来る。

以下実施例によって本発明の詳細な説明するが、実施例
中のシスチンの分析方法は公知のガイトンデ（Ｇａ　ｉ
　ｔｏｎｄｅ　）の方法によりシスティン換算で算出し
た。

すなわち、１　、０００〜２，０００倍に希釈した被検
液に５ＮＭの１．４−ジチオトレイトール（還元側）約
同屡加えてさらに２ＮのＮａＯＨによりｐＨ８，０〜８
．５とし、室温にて１時間放置して含有するシスチンを
すべてシスティンに還元し、酸性ニンヒドリン試薬を用
いて発色させ、吸光度計にて５６０ｎ＊の吸光度を測定
する。

一方、既知の濃度の標準サンプルを作成し、５６０ｎｍ
の吸光度の検量線を作成しておき、本検量線をもとに被
検液中のシスティン濃度を算出した。

実施例１ 撹拌機及び吹き込み管、排気管つきの２００　ｄ容セパ
ラブルフラスコに２−セリンｌＯｇを、ＤＭＳＯ５，６
ｇ、ピリドキサールリン酸２５ｉｄを加え、イオン交換
水にて全容を１００　ａｄとする。　１０％ＮａＯＨ液
にて反応液のｐＨを８．５として反応液を３５℃に一定
に保ちトリプロファン・シンターゼ含有菌体（エシェリ
ヒア・コリ　ＭＴ−１０２４２，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２
０）を乾燥菌体換算で２．０ｇ装入する。

硫化水素ガスをボンベより約１４ｄ／分の速度で吹き込
み始め、約４時間で吹き込みを終了する。

（硫化水素の使用量は、対β−セリン約１．５倍モルで
ある。）その間、吹き込みを開始したら反応系内は徐々
に白色となり！−シスチンが析出した。

反応終了後の反応液をなるべく均一にサンプリングし、
２Ｎ塩酸に熔解後遠心分離により除菌しで！−シスチン
をｌ−システィン換算で分析すると、９．３％、すなわ
ち！−セリンのｌ−シスチン転換率は約８１％であった
。

次に反応液に３５％塩酸約２５ｄを加えて、反応液のｐ
Ｈを０．５とし、活性炭１．０ｇを装入して、９５°Ｃ
で約１時間加熱処理を付した。加熱処理後、直ちに熱濾
過を行い除菌をした。

除菌後の黄透色の液を４０％ＮａＯＨ約５ｄを加えてｐ
Ｈ５とし、冷却によりｌ−シスチンの結晶を析出させた
。

析出したｌ−シスチンの結晶をヌッチェで濾過し、イオ
ン交換水２０Ｉｄで洗浄後、乾燥して白色のｌ−シスチ
ン結晶８．２ｇを得た。

（仕込ｌ−セリンに対して７２モル％の収率）本結晶の
〔α）　”＝−２１８，７″′、純度９９．１％、アッ
シュ分０．２％と良好であった。

実施例２ 撹拌機つきの２００　ｍｌ容セパラブルフラスコに２−
七リン１０ｇ、、ＤＭＳＯ５，６ｇ、ピリドキサールリ
ン酸２５■、水硫化ソーダ９．５ｇ（試薬７０％純分）
を加え、イオン交換水にて全容を２００ｇとする。１０
％ＮａＯＨにて反応液のρ）を８．０として、反応液を
３５°Ｃに一定に保ち、実施例１に用いたトリプトファ
ンシンターゼ含有菌体を乾燥菌体換算で２．０ｇ装入し
、反応中のｐＨを４モル／ｌリン酸により８．０に維持
する。

反応は、ｐＨ８，０／３５°Ｃにて約１６時間行ったが
、反応開始後２時間目付近より反応系内にシスチンが析
出して白濁し始めた。

反応終了後の反応液をなるべく均一にサンプリングし、
２Ｎ塩酸に溶解後遠心分離により除菌して２−シスチン
を！−システィン換算で分析すると、９．１％すなわち
！−セリンの！−シスチンへの転換率は約７９％であっ
た。

以下実施例１と同様にして処理をして、ｔ−シスチンの
結晶７．６ｇを得た。（仕込のｌ−セリンに対して６６
．７モル％の収率） 本結晶の〔α）　”＝−２２０°、純度９９．３％、ア
ク ッシュ分０．１％と良好であった。

実施例３ 撹拌機つきんの２００　ｄ容セパラブルフラスコに！−
セリン１０ｇ、ＤＭＳＯ５，６ｇ、ピリドキサールリン
酸２５ｄ、硫化ソーダ９．３ｇ（試薬純度９６％以上）
を加え、イオン交換水にて全容を２００ｇとする。

１０％ＨＣｌにて反応のｐｏを８．０として反応液を３
５℃に一定に保ち、実施例１の用いたトリプトファン・
シンターゼ含有菌体を乾燥菌体換算で２．０ｇ装入し、
反応中のｐＨを１０％ＨＣｆｆｉにより８．０に維持す
る。

反応はｐｔ１８．０／３５℃にて約１６時間行ったが、
反応開始後２時間目付近より反応系内にシスチンが析出
して白濁し始めた。

反応終了後の反応液をなるべく均一にサンプリングし、
２Ｎ塩酸に溶解後遠心分離により除菌してｌ−シスチン
を！−システィン換算で分析すると８．７％すなわちｌ
−セリンのｌ−シスチンへの転換率は約７４％であった
。

以下、実施例１と同様にして処理して、！−シスチンの
結晶７．４ｇをえた。（仕込のｌ−セリンに対して６４
．９モル％の収率） 本結晶の〔α〕？−−２２１°、純度９８．９％、アッ
シュ分０．３％と良好であった。

実施例４ 撹拌機つきの２００　ｄ容セパラブルフッラスコに２−
セリンｌＯｇ、ＤＭＳＯ５，６ｇ、及びイオン交換水に
て全容を５０ｇとする。

システィンデスルヒドラーゼ含有酵素液（バチルス・ズ
ブチリス　Ａ　Ｔ　ＣＣ６０５１を培養後集菌し、バッ
ファー中で超音波により菌体破砕したもの）を加え、Ｎ
ａＯＨ液にてｐｔｔｓ、ｓとし、反応液全容を１００ｇ
とする。

硫化水素ガスをボンベより約１４ｒＩ１１ノ分の速度で
吹き込み始め、約４時間で吹き込みを終了した。

（硫化水素の使用量は、対！−セリン約１．５倍モル）
その間、吹き込みを開始したら反応系内は徐々に白色と
なりｌ−シスチンが析出した。

反応終了後の反応液をなるべく均一にサンプリングし、
２Ｎ塩酸に溶解後遠心分離のにより除菌して！−シスチ
ンを２−システィン換算で分析すると、５．８％、すな
わちｌ−セリンのｌ−シスチンへの転換率は約５３％で
あった。また反応系内のシスティンのみの濃度を測定す
ると０．１％以下であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）、ｌ−セリンを酵素反応により、硫化水素、アルカ
   リ金属硫化物、またはアルカリ金属水硫化物と反応させ
   て得られるｌ−システィンを含む反応水溶液中のｌ−シ
   スティンを、酸化してｌ−シスチンを得るに際し、ジメ
   チルスルホキシドの存在下で酵素反応を行い、生成した
   システィンを、逐次シスチンに変換させながら反応を行
   うことを特徴とするｌ−セリンよりｌ−シスチンの製造
   方法。 ２）、ｌ−セリンの酵素反応をトリプトファンシンター
   ゼの存在下で行う特許請求の範囲第１項記載の方法。