JPS63230086A - 生理活性物質固定用担体 - Google Patents
生理活性物質固定用担体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業との利用分野〉
本発明は生理活性物質固定用担体に関し、詳しくは1分
子内にジスルフィド結合またはチオール基を有する生理
活性物質をジスルフィド結合交換反応によって固定化で
きる生理活性物質固定用担体に関するものである。
子内にジスルフィド結合またはチオール基を有する生理
活性物質をジスルフィド結合交換反応によって固定化で
きる生理活性物質固定用担体に関するものである。
〈従来の技術〉
酵素や抗体等の生理活性物質は、近年、その特異且つ選
択的な生物学的反応を利用して2種々の分野で利用され
ている。その代表例として、酵素を水不溶性の担体に固
定化させてなる固定化酵素や、免疫活性物質を固定化さ
せてなる免疫学的診斬試薬が知られている。
択的な生物学的反応を利用して2種々の分野で利用され
ている。その代表例として、酵素を水不溶性の担体に固
定化させてなる固定化酵素や、免疫活性物質を固定化さ
せてなる免疫学的診斬試薬が知られている。
このように、酵素や抗体等の生理活性物質を共有結合に
よって固定化するための担体粒子として、従来、その表
面にカルボキシル基、アミノ基、水酸基等の官能基金導
入した粒子が知られている。
よって固定化するための担体粒子として、従来、その表
面にカルボキシル基、アミノ基、水酸基等の官能基金導
入した粒子が知られている。
このような担体粒子に生理活性物質を固定化する方法と
して1例えば、担体粒子表面または生理活性物質中のカ
ルボキシル基をカルボジイミドにて活性化した後、これ
を対応する生理活性物質または担体粒子表面のアミン基
と反応させて、ペプチド結合を形成させる方法や、ある
いは担体粒子表面の水酸基を臭化シアンにてイミドカル
ボナール誘導体に変換した後、これを生理活性物質の有
するアミノ基と反応させる方法等が知られている。
して1例えば、担体粒子表面または生理活性物質中のカ
ルボキシル基をカルボジイミドにて活性化した後、これ
を対応する生理活性物質または担体粒子表面のアミン基
と反応させて、ペプチド結合を形成させる方法や、ある
いは担体粒子表面の水酸基を臭化シアンにてイミドカル
ボナール誘導体に変換した後、これを生理活性物質の有
するアミノ基と反応させる方法等が知られている。
しかし、かかる方法によれば、該活性物質の有するカル
ボキシル基やアミノ基は、何らの選択性なしに固定化の
反応に関与するので1例えば、酵素の基質に対する活性
部位や抗体の抗原結合部位の高次構造が破壊されること
があシ、その結果、固定化された生理活性物質の活性が
低下する。
ボキシル基やアミノ基は、何らの選択性なしに固定化の
反応に関与するので1例えば、酵素の基質に対する活性
部位や抗体の抗原結合部位の高次構造が破壊されること
があシ、その結果、固定化された生理活性物質の活性が
低下する。
また、酵素や抗体を固定化するための別の一つの方法と
して、従来、ジスルフィド結合交換反応を用いる方法が
知られている。この方法によるときは、生理活性物質は
、それが有するジスルフィド結合またはチオール基の反
応によってのみ担体に固定化されるので、上記したよう
な酵素や抗原における高次構造が破壊されることがない
。
して、従来、ジスルフィド結合交換反応を用いる方法が
知られている。この方法によるときは、生理活性物質は
、それが有するジスルフィド結合またはチオール基の反
応によってのみ担体に固定化されるので、上記したよう
な酵素や抗原における高次構造が破壊されることがない
。
従来、このようなジスルフィド結合またはこのジスルフ
ィド結合が還元された形態であるチオール基を粒子表面
に有する粒子担体として1例えば。
ィド結合が還元された形態であるチオール基を粒子表面
に有する粒子担体として1例えば。
7ガロ一ス誘導体に次の基
OOH
一0CONHCH(CH2) 2 C0NHCHCH2
SHC0NHCH2C0OH を結合した活性化チオールセファロース4B(7アーマ
シア・ファイン。ケミカルズ社製)や、アクリルアミド
デルに次の基 −CH2CHCONHCHCHz SHOOH を結合したエンザクリル(Enzacryl )・ポリ
チオール(コツホ−ライト・ラボラトリーズ社製)、ガ
ラスピーズにチオール基を含む置換基を結合したもの等
が知られている。しかしながら、h記したよりな担体粒
子は、主として、アフィニティ・クロマトグラフィー用
の充填剤として用いられるものであるので2元来1粒子
は水性媒体中で分散安定性をも友ない。
SHC0NHCH2C0OH を結合した活性化チオールセファロース4B(7アーマ
シア・ファイン。ケミカルズ社製)や、アクリルアミド
デルに次の基 −CH2CHCONHCHCHz SHOOH を結合したエンザクリル(Enzacryl )・ポリ
チオール(コツホ−ライト・ラボラトリーズ社製)、ガ
ラスピーズにチオール基を含む置換基を結合したもの等
が知られている。しかしながら、h記したよりな担体粒
子は、主として、アフィニティ・クロマトグラフィー用
の充填剤として用いられるものであるので2元来1粒子
は水性媒体中で分散安定性をも友ない。
従って、上記のような従来の担体粒子は1分散安定性が
要求される用途には用いることが困難である。かかる分
散安定性が要求される用途として。
要求される用途には用いることが困難である。かかる分
散安定性が要求される用途として。
例えば、粒子に抗体等を固定化した後、血清、尿等の検
体と混合して2抗原抗体反応を起こさせ。
体と混合して2抗原抗体反応を起こさせ。
その凝集の程度から診断を行なう診断用検査薬や。
粒子に酵素を固定化した後、水性媒体中に分散させて、
基質と反応させる酵素反応等を挙げることができる。
基質と反応させる酵素反応等を挙げることができる。
一方、2m以上の単量体成分を選択して乳化共重合を行
なう等の方法によって5分散安定性にすぐれる重合体粒
子を含むラテックスが得られることは既に知られている
。しかし、適当な単量体が見当たらないところから1表
面にジスルフィド結合やチオール基を有する重合体粒子
は、直接、乳化重合等の方法によって製造することは困
難である。また、乳化重合等によって得られた重合体粒
子に後反応を施すことによって1重合体粒子にジスルフ
ィド結合やチオール基を導入することができても、一般
には、このようにして得られる重合体粒子は、その分散
安定性が著しく損なわれて、長期保存安定性に劣ること
が多い。さらに、仮にジスルフィド結合またはチオール
基金導入し九後の重合体粒子がすぐれた分散安定性を有
していても、一般には、#素や抗体等を固定化した後は
。
なう等の方法によって5分散安定性にすぐれる重合体粒
子を含むラテックスが得られることは既に知られている
。しかし、適当な単量体が見当たらないところから1表
面にジスルフィド結合やチオール基を有する重合体粒子
は、直接、乳化重合等の方法によって製造することは困
難である。また、乳化重合等によって得られた重合体粒
子に後反応を施すことによって1重合体粒子にジスルフ
ィド結合やチオール基を導入することができても、一般
には、このようにして得られる重合体粒子は、その分散
安定性が著しく損なわれて、長期保存安定性に劣ること
が多い。さらに、仮にジスルフィド結合またはチオール
基金導入し九後の重合体粒子がすぐれた分散安定性を有
していても、一般には、#素や抗体等を固定化した後は
。
その分散安定性が損なわれる場合が多い。他方。
一般に、チオール基を表面にもつ重合体粒子は。
水性媒体中で保存される間にチオール基が酸化される結
果、保存期間が長期間にわたる場合は、チオール基数が
減少し、あるいは遂には消滅するので、チオール基導入
による所期の効果が得られなくなる。
果、保存期間が長期間にわたる場合は、チオール基数が
減少し、あるいは遂には消滅するので、チオール基導入
による所期の効果が得られなくなる。
〈発明が解決しようとする問題点〉
本発明は、従来のジスルフィド結合またはチオール基を
粒子表面に有する担体における上記問題点を解決するた
めになされたものであって1粒子表面にジスルフィド結
合を有し、且つ水性媒体中で長期間保存しても活性基の
減少や消滅がなく、分散安定性にも優れる生理活性物質
固定用担体を提供することを目的とする。
粒子表面に有する担体における上記問題点を解決するた
めになされたものであって1粒子表面にジスルフィド結
合を有し、且つ水性媒体中で長期間保存しても活性基の
減少や消滅がなく、分散安定性にも優れる生理活性物質
固定用担体を提供することを目的とする。
く問題点を解決するための手段〉
即ち1本発明の生理活性物質固定用担体は1表面にエポ
キシ基を有する平均粒径0.03〜3μmの重合体粒子
を含むラテックスに1分子末端に7ミノ基またはカルボ
キシル基を有する鎮状ジスルフィド化合物が、h記エポ
キシ基と結合されていることを特徴とするものである。
キシ基を有する平均粒径0.03〜3μmの重合体粒子
を含むラテックスに1分子末端に7ミノ基またはカルボ
キシル基を有する鎮状ジスルフィド化合物が、h記エポ
キシ基と結合されていることを特徴とするものである。
本発明において1表面にエポキシ基を有する重合体粒子
は後述する鎖状ジスルフィド化合物を。
は後述する鎖状ジスルフィド化合物を。
その表面に有するエポキシ基を利用して結合できるもの
であり、0.03〜3μm、好ましくは0.04〜1.
5μmの平均粒径を有するものである。粒径が小さすぎ
ると、該重合体粒子に生理活性物質を固定して水性媒体
中で反応を行なわせた場合1反応後の回収が困媚となる
。一方1粒径が大きすぎると。
であり、0.03〜3μm、好ましくは0.04〜1.
5μmの平均粒径を有するものである。粒径が小さすぎ
ると、該重合体粒子に生理活性物質を固定して水性媒体
中で反応を行なわせた場合1反応後の回収が困媚となる
。一方1粒径が大きすぎると。
該重合体粒子の単位体積当りの粒子表面積が小さくなる
ので生理活性物質の固定化量が少なくなると共に、水性
媒体中への分散が困蛾となるので好ましくない。
ので生理活性物質の固定化量が少なくなると共に、水性
媒体中への分散が困蛾となるので好ましくない。
上記重合体粒子はラテックス状態にて得られるものであ
り2通常乳化重合法を利用して調製される。つまり1本
発明において用いる重合体粒子は七の表面にエポキシ基
を有し、に記条件を満たすものであれば特に限定される
ものではないが、エポキシ基を有する単量体を乳化共重
合して得られる重合体粒子は、平均粒径の調整や、エポ
キシ基導入操作の簡便性の点で好ましいからである。
り2通常乳化重合法を利用して調製される。つまり1本
発明において用いる重合体粒子は七の表面にエポキシ基
を有し、に記条件を満たすものであれば特に限定される
ものではないが、エポキシ基を有する単量体を乳化共重
合して得られる重合体粒子は、平均粒径の調整や、エポ
キシ基導入操作の簡便性の点で好ましいからである。
かかる重合体粒子は、エポキシ基導入のためにグリシジ
ル(メタ)アクリレートを単量体として乳化共重合する
ことが好ましい。
ル(メタ)アクリレートを単量体として乳化共重合する
ことが好ましい。
しかし、このグリシジル(メタ)7クリレートは一般に
重合安定性が悪いので多量に乳化共重合させた場合、重
合反応中に容易に凝集してしまい。
重合安定性が悪いので多量に乳化共重合させた場合、重
合反応中に容易に凝集してしまい。
生理活性物質を固定するために1本発明のように比較的
多量のグリシジル(メタ)アクリレートを乳化共重合し
て担体を得ることは困難であるとされていた。そこで本
発明では上記単量体を用いる場合多官能性内部架橋用単
量体および(メタ)アクリロニトリルと乳化共重合する
ことが好ましい。
多量のグリシジル(メタ)アクリレートを乳化共重合し
て担体を得ることは困難であるとされていた。そこで本
発明では上記単量体を用いる場合多官能性内部架橋用単
量体および(メタ)アクリロニトリルと乳化共重合する
ことが好ましい。
即ち、このような組成とすることで重合安定性および水
性媒体中での分散安定性を維持しながら、高密度にエポ
キシ基t−重合体粒子表面に導入でき。
性媒体中での分散安定性を維持しながら、高密度にエポ
キシ基t−重合体粒子表面に導入でき。
好ましい単量体組成となるのである。これは多官能性内
部架橋用単量体と(メタ)アクリロニトリルとがグリシ
ジル(メタ)アクリレートと有効に共重合し、内部凝集
力を高めながら水不溶性の重合体粒子を作るためである
と推定される。
部架橋用単量体と(メタ)アクリロニトリルとがグリシ
ジル(メタ)アクリレートと有効に共重合し、内部凝集
力を高めながら水不溶性の重合体粒子を作るためである
と推定される。
上記共重合組成において、グリシジル(メタ)アクリレ
ートは単量体混合物中10〜60ili景%の範囲とす
ることが好ましく、 10重量%に満之ないと、得ら
れる重合体粒子の表面に導入されるエポキシ基の量が少
なくなり、後述するジスルフィド化合物の結合量および
生理活性物質の固定化量が少なくなるので好ましくない
、また、60重量%を超える量を乳化共重合すると1重
合安定性が悪くなり1重合反応中に多量の凝集物の生成
を伴なうようになる。
ートは単量体混合物中10〜60ili景%の範囲とす
ることが好ましく、 10重量%に満之ないと、得ら
れる重合体粒子の表面に導入されるエポキシ基の量が少
なくなり、後述するジスルフィド化合物の結合量および
生理活性物質の固定化量が少なくなるので好ましくない
、また、60重量%を超える量を乳化共重合すると1重
合安定性が悪くなり1重合反応中に多量の凝集物の生成
を伴なうようになる。
多官能性内部架橋用単量体としては、共重合性が良く、
さらに1重合安定性が良好であるものとして多価アルコ
ールのポリ(メタ)アクリレート(以下、ポリ(メタ)
アクリレートという)を用いることが好ましく、具体的
には、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリ
レート、l、3−ブチレングリコールジメタクリレート
、トリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロ
ールプロパントリメタクリレート。
さらに1重合安定性が良好であるものとして多価アルコ
ールのポリ(メタ)アクリレート(以下、ポリ(メタ)
アクリレートという)を用いることが好ましく、具体的
には、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコー
ルジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリ
レート、l、3−ブチレングリコールジメタクリレート
、トリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロ
ールプロパントリメタクリレート。
トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラメチ
ロールメタンテトラアクリレート等が好ましく用いられ
る。また、ジビニルベンゼン−?N。
ロールメタンテトラアクリレート等が好ましく用いられ
る。また、ジビニルベンゼン−?N。
N′−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部架
橋用単量体として用いることができる。該内部架橋用単
量体は、単量体混合物中、1〜304i量%、好ましく
42〜2011量%の範囲で用いられる。該内部架橋用
単量体の量が少なすぎると、乳化共重合しても添加効果
が発現せず、また過多に使用すると、111合安定性を
損ない凝集物量が増加したり、得られる重合体粒子の水
性媒体中での分散安定性が損なわれるので好ましくない
。
橋用単量体として用いることができる。該内部架橋用単
量体は、単量体混合物中、1〜304i量%、好ましく
42〜2011量%の範囲で用いられる。該内部架橋用
単量体の量が少なすぎると、乳化共重合しても添加効果
が発現せず、また過多に使用すると、111合安定性を
損ない凝集物量が増加したり、得られる重合体粒子の水
性媒体中での分散安定性が損なわれるので好ましくない
。
上記多官能性内部架橋用単量体と共に乳化共重合する(
メタ)7クリロニトリルは、単量体混合物中、1〜60
重量%の範囲で用いることが好ましく、#範囲外では重
合安定性や分散安定性が損なわれる場合がある。
メタ)7クリロニトリルは、単量体混合物中、1〜60
重量%の範囲で用いることが好ましく、#範囲外では重
合安定性や分散安定性が損なわれる場合がある。
本発明に用いる重合体粒子を形成するにおいて。
上記各単量体を乳化共重合すると七によって分散安定性
等にすぐれた重合体粒子を得ることができるが、得られ
る重合体粒子のガラス転移点をその用途に応じた所望の
ものとするために、上記各単量体を除くラジカル重合性
単量体を単量体混合物中、10〜8811量%、好まし
くti20〜78?を量%の範囲で共重合させてもよい
。このような単量体として社、酢酸ビニル、(メタ)ア
クリル酸アルキルエステル、スチレン、メチルスチレン
。
等にすぐれた重合体粒子を得ることができるが、得られ
る重合体粒子のガラス転移点をその用途に応じた所望の
ものとするために、上記各単量体を除くラジカル重合性
単量体を単量体混合物中、10〜8811量%、好まし
くti20〜78?を量%の範囲で共重合させてもよい
。このような単量体として社、酢酸ビニル、(メタ)ア
クリル酸アルキルエステル、スチレン、メチルスチレン
。
ビニルトルエン、(メタ)アクリルアミドなどの比較的
ガラス転移温度が高い単量体、特に室温以上のガラス転
移温度を有する単量体を一種以上用いることが重合体粒
子間の融着を防止する丸めに好ましい。これらのうち、
特に好適には、メタク!J ルtao炭素数1〜3のア
ルキルエステルヤステレンが用いられる。
ガラス転移温度が高い単量体、特に室温以上のガラス転
移温度を有する単量体を一種以上用いることが重合体粒
子間の融着を防止する丸めに好ましい。これらのうち、
特に好適には、メタク!J ルtao炭素数1〜3のア
ルキルエステルヤステレンが用いられる。
1述したように乳化共重合によって表面にエポキシ基を
有する平均粒径Q、03〜3μ鶏の重合体粒子を得る場
合、該乳化共重合反応は、PHを7付近に保って行なり
ことが望ましい。何故なら1反応時のPHが酸性または
アルカリ性に偏っていると、エポキシ基(グリシジル基
)がrA4iIlすると共に、水溶性重合体が生じる傾
向があり、また、ニーキシ基の開裂によって得られる重
合体粒子の表面に多くのエポキシ基を有さないようにな
り、ジスルフィド化合物の結合量が充分でなくなるから
である。
有する平均粒径Q、03〜3μ鶏の重合体粒子を得る場
合、該乳化共重合反応は、PHを7付近に保って行なり
ことが望ましい。何故なら1反応時のPHが酸性または
アルカリ性に偏っていると、エポキシ基(グリシジル基
)がrA4iIlすると共に、水溶性重合体が生じる傾
向があり、また、ニーキシ基の開裂によって得られる重
合体粒子の表面に多くのエポキシ基を有さないようにな
り、ジスルフィド化合物の結合量が充分でなくなるから
である。
上記のような単量体組成は、水性媒体中にて従来よI)
知られている通常の方法にて乳化共重合させることがで
きるが1本発明の生理活性物iX固定用担体は、乳化剤
が吸着などによって混在すると。
知られている通常の方法にて乳化共重合させることがで
きるが1本発明の生理活性物iX固定用担体は、乳化剤
が吸着などによって混在すると。
例えば抗原抗体反応1に凝集化現象によって判断する特
異的な反応に用いた場合に、検体中に目的とするに原ま
走は抗体がなくとも凝集してしまう。
異的な反応に用いた場合に、検体中に目的とするに原ま
走は抗体がなくとも凝集してしまう。
所IF4非特異的凝集を生じることがめる。従って。
乳化共重合に際しては乳化剤を用いないことが好ましく
、特vcJ:、記単量体組成とすると乳化剤不存在下で
も1重合安定性は良好で6る。しかし、固定される生理
活性物質の種類によってはその用途において乳化剤が照
影IIIを及ぼさない場合もあり。
、特vcJ:、記単量体組成とすると乳化剤不存在下で
も1重合安定性は良好で6る。しかし、固定される生理
活性物質の種類によってはその用途において乳化剤が照
影IIIを及ぼさない場合もあり。
その場合は添加してもよいことはいうまでもない。
上記のような乳化共重合において、単量体成分混合物の
水性媒体中での濃度は、得られる分散液における(合体
粒子の平均粒さとも関連するが。
水性媒体中での濃度は、得られる分散液における(合体
粒子の平均粒さとも関連するが。
通常、1〜40g1量%の範囲である。
重合開始剤としては、水浴性ラジカル重合開始剤が用い
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や。
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や。
これら過硫酸塩とチオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウ
ム、チオ硫酸水素ナトリウム等のようなチオ硫酸塩、又
は亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナト
リウム等のような亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤
が好ましく用いられるが、これらに限定されるものでは
ない、これら重合開始剤の使用量は、単量体混合物に対
して0.01〜1重量%の範囲が好適である。重合の雰
囲気も。
ム、チオ硫酸水素ナトリウム等のようなチオ硫酸塩、又
は亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナト
リウム等のような亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤
が好ましく用いられるが、これらに限定されるものでは
ない、これら重合開始剤の使用量は、単量体混合物に対
して0.01〜1重量%の範囲が好適である。重合の雰
囲気も。
特に制限されないが、好ましくは酸素を除い九不活性ガ
ス雰囲気が用いられる。また、ii合温度は。
ス雰囲気が用いられる。また、ii合温度は。
特に制限されないが1通常、20〜100℃、好ましく
は40〜90℃の範囲である。
は40〜90℃の範囲である。
上2ピのようにして得られる重合体粒子は、前述したよ
うに平均粒径が0.03〜3μ常を有するもので7bり
、水性媒体中での分散安定性にすぐれたものであるが、
線型合体粒子の比重40.9〜1.5の範囲に調整する
ことが水性媒体中での分散安定性の維持や、ジスルフィ
ド化合物との結合反応、生理活性物質の固定化反応を行
ないやすく好ましいものである。
うに平均粒径が0.03〜3μ常を有するもので7bり
、水性媒体中での分散安定性にすぐれたものであるが、
線型合体粒子の比重40.9〜1.5の範囲に調整する
ことが水性媒体中での分散安定性の維持や、ジスルフィ
ド化合物との結合反応、生理活性物質の固定化反応を行
ないやすく好ましいものである。
本発明の生理活性物質固定用担体は上記重合体粒子の表
面に存在するエポキシ基に1分子末端にrH)基または
カルボキシル基を有する鎮状ジスルフィド化合物を結合
することによって得られる。
面に存在するエポキシ基に1分子末端にrH)基または
カルボキシル基を有する鎮状ジスルフィド化合物を結合
することによって得られる。
このような鎖状ジスルフィド化合物としては。
例えば1式
%式%(
で表わされるシスタミン、式
で表わされるシスチン、式
で表わされるホモシスチン、式
で表わされるペニシラミンジスルフィド、式で表ワサれ
るペニシラミンシスナインジスルフィド、式 %式% で表わされるジチオジグリコール酸1式HOOC−CH
2−CHz −8−8−CH2−CHx −COOHで
表わされるジチオジプロピオン酸1式%式% で表わされるジチオサリチル酸 などを挙げることができる。
るペニシラミンシスナインジスルフィド、式 %式% で表わされるジチオジグリコール酸1式HOOC−CH
2−CHz −8−8−CH2−CHx −COOHで
表わされるジチオジプロピオン酸1式%式% で表わされるジチオサリチル酸 などを挙げることができる。
上記鎖状ジスルフィド化合物をエポキシ基と反応させる
には、エバキシ基を表面に有する重合体粒子を含むラテ
ックス中に、該ジスルフィド化合物を添加、混合し、単
に撹拌を行なうだけでよく。
には、エバキシ基を表面に有する重合体粒子を含むラテ
ックス中に、該ジスルフィド化合物を添加、混合し、単
に撹拌を行なうだけでよく。
この際の反応温度は通常20〜90℃、好ましくは30
〜70℃にて行なわれ、数時間〜数日間で反応が完了す
る。
〜70℃にて行なわれ、数時間〜数日間で反応が完了す
る。
本発明の生理活性物質固定用担体はと記のように1表面
にエポキシ基を有する重合体粒子のエポキシ基と、特定
の官能基を有する鎖状ジスルフィド化合物とを反応させ
て2粒子表面にジスルフィド結合を導入したものである
。この表面に導入するジスルフィド結合の址社固定すべ
き生理活性物質の量によって任意に選択することができ
るが。
にエポキシ基を有する重合体粒子のエポキシ基と、特定
の官能基を有する鎖状ジスルフィド化合物とを反応させ
て2粒子表面にジスルフィド結合を導入したものである
。この表面に導入するジスルフィド結合の址社固定すべ
き生理活性物質の量によって任意に選択することができ
るが。
固定化量のamのしやすさや、水性媒体中での分散安定
性を考慮すると、担体の表面にジスルフィド結合がl
X 10−7〜I X 1.0−’moJ/m’、好ま
しくはlXl0 〜lXl0 moJ/イの範囲とな
るように調製する。
性を考慮すると、担体の表面にジスルフィド結合がl
X 10−7〜I X 1.0−’moJ/m’、好ま
しくはlXl0 〜lXl0 moJ/イの範囲とな
るように調製する。
このようにして得られる本発明の生理活性物質固定用担
体は、’i合体粒子表面に鎖状ジスルフィド結合を有す
るものであり1分子内にジスルフィド結合またはチオー
ル基を有する生理活性物質とジスルフィド結合交換反応
によって固定化できるものである。また1本発明の担体
はそのままで生理活性物質と反応させて固定化できるが
、該担体の表面に有するジスルフィド結合を、適宜の還
元剤にて還元してチオール基とし、チオール基を有する
担体として生理活性物質の固定に供することもできる。
体は、’i合体粒子表面に鎖状ジスルフィド結合を有す
るものであり1分子内にジスルフィド結合またはチオー
ル基を有する生理活性物質とジスルフィド結合交換反応
によって固定化できるものである。また1本発明の担体
はそのままで生理活性物質と反応させて固定化できるが
、該担体の表面に有するジスルフィド結合を、適宜の還
元剤にて還元してチオール基とし、チオール基を有する
担体として生理活性物質の固定に供することもできる。
ジスルフィド結合を還元するには、特に限定されるもの
ではないが1例えば1本発明の担体ヲ含むラテックス中
に2−メルカプトエチルアミン、2−メルカプトエタノ
ール、ジチオスライドール、水素化ホウ素ナトリウム等
のような還元剤を加え、混合して、放置し九後、遠心分
離し。
ではないが1例えば1本発明の担体ヲ含むラテックス中
に2−メルカプトエチルアミン、2−メルカプトエタノ
ール、ジチオスライドール、水素化ホウ素ナトリウム等
のような還元剤を加え、混合して、放置し九後、遠心分
離し。
上澄み液を捨て、生成した沈澱に水性媒体を加えて、こ
れを再分散させ、この後、遠心分離と再分散とを繰り返
せばよい。
れを再分散させ、この後、遠心分離と再分散とを繰り返
せばよい。
〈発明の効果〉
以上のように1本発明の生理活性物質固定用担体によれ
ば、ジスルフィド結合またはチオール基を有する酵素や
各種タンパクなどの生理活性物質をジスルフィド結合交
換反応によって比較的容易に共有結合にて固定化するこ
とができると共に、得られる固定化担体も・水性媒体中
で分散安定性にすぐれるものである。
ば、ジスルフィド結合またはチオール基を有する酵素や
各種タンパクなどの生理活性物質をジスルフィド結合交
換反応によって比較的容易に共有結合にて固定化するこ
とができると共に、得られる固定化担体も・水性媒体中
で分散安定性にすぐれるものである。
また、鎖状ジスルフィド化合物との結合用のエポキシ基
を、特定単食体を乳化共重合して導入した場合には、生
理活性物質固定用担体の粒子表面にエポキシ基を高密度
、且つ均一に導入できるので、生理活性物質の固定化量
を多くすることも可能である。
を、特定単食体を乳化共重合して導入した場合には、生
理活性物質固定用担体の粒子表面にエポキシ基を高密度
、且つ均一に導入できるので、生理活性物質の固定化量
を多くすることも可能である。
〈実施例〉
以下に本発明の実施例を挙げて具体的に説明するが、何
らこれらに限定されるものではなく1本発明の技術的思
想を逸脱しない範囲で種々の応用が可能である。
らこれらに限定されるものではなく1本発明の技術的思
想を逸脱しない範囲で種々の応用が可能である。
実施例1
グリシジルメタクリレート18.li+、メチルメタク
リレート26g、トリエチレングリコールジメタクリレ
ート4gおよびアクリロニトリル12gを蒸留水340
Iに加え、過硫酸カリウム0.3gを水10pに溶解し
た重合開始剤水溶液を窒素気流下にて加えて70℃の温
度で乳化重合を開始した。
リレート26g、トリエチレングリコールジメタクリレ
ート4gおよびアクリロニトリル12gを蒸留水340
Iに加え、過硫酸カリウム0.3gを水10pに溶解し
た重合開始剤水溶液を窒素気流下にて加えて70℃の温
度で乳化重合を開始した。
系のpH1を7.0に維持しながら6時間撹拌して重合
を行ない、固形分濃度約15重量%、平均粒径0.45
μmの表面にエポキシ基を有する重合体粒子を含むラテ
ックスを得た。重合反応は非常に安定して行なわれ、凝
集物量は約0605重量%であった。
を行ない、固形分濃度約15重量%、平均粒径0.45
μmの表面にエポキシ基を有する重合体粒子を含むラテ
ックスを得た。重合反応は非常に安定して行なわれ、凝
集物量は約0605重量%であった。
得られたラテックスを遠心分離し、沈降した重合体粒子
を蒸留水にて洗浄するという操作を3回繰り返した後、
固形分濃度が15重量%となるように蒸留水中に再分散
させた。
を蒸留水にて洗浄するという操作を3回繰り返した後、
固形分濃度が15重量%となるように蒸留水中に再分散
させた。
(b)ジスルフィド化合物の結合
と記にて得た重合体粒子を含むラテックス40dに10
ii量%のシスタミン水溶液40 dを加え。
ii量%のシスタミン水溶液40 dを加え。
40℃で24時間、撹拌しながら反応させた。次に、水
相中に存在する未反応のシスタミン全除去するために、
遠心分離し、蒸留水にて5回洗浄したのち、0.01m
oJ/lホウ酸緩衝液(pH7,0)に再分散させた。
相中に存在する未反応のシスタミン全除去するために、
遠心分離し、蒸留水にて5回洗浄したのち、0.01m
oJ/lホウ酸緩衝液(pH7,0)に再分散させた。
得られた重合体粒子の表向に結合したジスルフィド結合
の量は、水素化ホウ素ナトリウムにて開裂させ、完全に
チオール基に還元したのち、4゜4′−ジチオジピリジ
ンにて定量したところ、6.7X10 mol/rr
?であった。
の量は、水素化ホウ素ナトリウムにて開裂させ、完全に
チオール基に還元したのち、4゜4′−ジチオジピリジ
ンにて定量したところ、6.7X10 mol/rr
?であった。
むラテックス(固形分濃度15@量%)5alに。
2−メルカプトエチルアミン水m1(1mo!乙の20
ゴを加え、撹拌しながら25℃にて3時間反応させた。
ゴを加え、撹拌しながら25℃にて3時間反応させた。
次に、0.01moJ/Jホウ酸緩衝液(1)H7、O
)にて5回遠心分離による洗浄を行ない、h記と同じ緩
衝液に固形分濃度が51債%となるように再分散させた
。
)にて5回遠心分離による洗浄を行ない、h記と同じ緩
衝液に固形分濃度が51債%となるように再分散させた
。
この分散液4dにβ−D−ガラクトシダーゼ(4m9/
ld ) J ml f力Uえ、撹拌しながら5℃にて
12時間ジスルフィド結合交換反応させ念。次いで遠心
分離により3回洗浄したのち、 0.01 mad/
lホウ酸緩衝液(pi(7,0)に再分散させて、β−
D−ガラクトシダーゼ固定化担体を得た1、β−D−ガ
ラクトシダーゼの固定化量は担体粒子111当り36m
gであり、活性収率は64%であった。尚、活性収率は
酵素活性の理論量に対する実際の活性割合として定義さ
れ1本発明においてはラクトースを基質として、NAD
およびガラクトースデヒドロゲナーゼの共存下にて反応
させ、生成したNADHe340nmKhける吸光度か
ら測定して実際の酵素活性とし、これと等しい活性を有
する遊離の酵素量を酵素固定量で除して求めた。
ld ) J ml f力Uえ、撹拌しながら5℃にて
12時間ジスルフィド結合交換反応させ念。次いで遠心
分離により3回洗浄したのち、 0.01 mad/
lホウ酸緩衝液(pi(7,0)に再分散させて、β−
D−ガラクトシダーゼ固定化担体を得た1、β−D−ガ
ラクトシダーゼの固定化量は担体粒子111当り36m
gであり、活性収率は64%であった。尚、活性収率は
酵素活性の理論量に対する実際の活性割合として定義さ
れ1本発明においてはラクトースを基質として、NAD
およびガラクトースデヒドロゲナーゼの共存下にて反応
させ、生成したNADHe340nmKhける吸光度か
ら測定して実際の酵素活性とし、これと等しい活性を有
する遊離の酵素量を酵素固定量で除して求めた。
一方、h記(b)にて得られた生理活性物質固定用担体
を含むラテックスを、25℃にて保存したのち、J:、
記と同様にしてβ−D−ガラクトシダーゼを固定した。
を含むラテックスを、25℃にて保存したのち、J:、
記と同様にしてβ−D−ガラクトシダーゼを固定した。
固定された酵素iおよび保存θか月目の単位重量ポリマ
ー粒子当りの酵素活性を100%とした相対活性を第1
表に示した。
ー粒子当りの酵素活性を100%とした相対活性を第1
表に示した。
第1表
第1表から明らかなように1本発明の生理活性物質固定
用担体は4ケ月保存後においても粒子表面に存在するジ
スルフィド結合が酵素の固定化のために有効に機能する
ものである。
用担体は4ケ月保存後においても粒子表面に存在するジ
スルフィド結合が酵素の固定化のために有効に機能する
ものである。
比較例1
実施例1の(b)において結合させたジスルフィド化合
物としてのシスタミンの代わりに、チオール化合物とし
ての2−メルカプトエチルアミン塩酸塩を同量用いた以
外は全て実施例1と同一条件にて反応を行ない、β−D
−ガラクトシダーゼ固定化担体を得た。固定化前の固定
用担体粒子表面に存在するチオール基の量は3.9X
10 mol/rrlであつた。
物としてのシスタミンの代わりに、チオール化合物とし
ての2−メルカプトエチルアミン塩酸塩を同量用いた以
外は全て実施例1と同一条件にて反応を行ない、β−D
−ガラクトシダーゼ固定化担体を得た。固定化前の固定
用担体粒子表面に存在するチオール基の量は3.9X
10 mol/rrlであつた。
β−D−ガラクトシダーゼ固定化担体の固定化量および
保存0か月目の単位重量ポリマー粒子当りの酵素活性t
−100%とした相対活性を実施例1と同様に保存前、
保存後に測定し、その結果を第2表に示した。
保存0か月目の単位重量ポリマー粒子当りの酵素活性t
−100%とした相対活性を実施例1と同様に保存前、
保存後に測定し、その結果を第2表に示した。
第2表
第2表から明らかなように、ジスルフィド化合物の代わ
りに、チオール化合物を結合した生理活性物質固定用担
体では、保存中にチオール基が酸化されて固定化に必要
なチオール基が減少するので、保存時間の経過と共に固
定化量が減少し、単位重量ポリマー粒子当りの酵素活性
も低下するととが判明した。
りに、チオール化合物を結合した生理活性物質固定用担
体では、保存中にチオール基が酸化されて固定化に必要
なチオール基が減少するので、保存時間の経過と共に固
定化量が減少し、単位重量ポリマー粒子当りの酵素活性
も低下するととが判明した。
即ち、本発明の生理活性物質固定用担体に存在するジス
ルフィド結合はそのまま、もしくはチオール基に還元し
て固定化反応に使用できるが、固定化するまではジスル
フィド結合のままで保存しておく必要があることを示唆
するものである。
ルフィド結合はそのまま、もしくはチオール基に還元し
て固定化反応に使用できるが、固定化するまではジスル
フィド結合のままで保存しておく必要があることを示唆
するものである。
実施例2
グリシジルメタクリレート18p、スチレン15y1
メチルメタクリレート13g、ジビニルベンゼン2Iお
よびアクリロニトリル12yを蒸留水340 、pに加
え、実施例1と同様の条件下にて乳化共重合を行ない、
固形分濃度約15重量%、平均粒掻0.47μ鴨の表面
にエポキシ基を有する重合体粒子を含むラテックスを得
た。重合反応は非常に安定して行なわれ、凝集物量に約
0.05重t%であった。
メチルメタクリレート13g、ジビニルベンゼン2Iお
よびアクリロニトリル12yを蒸留水340 、pに加
え、実施例1と同様の条件下にて乳化共重合を行ない、
固形分濃度約15重量%、平均粒掻0.47μ鴨の表面
にエポキシ基を有する重合体粒子を含むラテックスを得
た。重合反応は非常に安定して行なわれ、凝集物量に約
0.05重t%であった。
得られたラテックスを遠心分離し、沈降した1合体粒子
f:蒸留水にて洗浄するという操作金3回繰り返した後
、t!!形分製分濃度5i!量%となるように蒸留水中
に再分散させた。
f:蒸留水にて洗浄するという操作金3回繰り返した後
、t!!形分製分濃度5i!量%となるように蒸留水中
に再分散させた。
と記にて得ft−M合体粒子を含むラテックス40m1
KLo重量%のジチオジグリコール酸水溶液40m1を
加え、 40℃で48時間、撹拌しながら反応させた
。次に、水相中に存在する未反応のシスタミンを除去す
るために、遠心分離し、蒸留水にて5回洗浄したのち、
0.01 mol/ lホウ酸緩衝液(pH7,0
)に再分散させた。
KLo重量%のジチオジグリコール酸水溶液40m1を
加え、 40℃で48時間、撹拌しながら反応させた
。次に、水相中に存在する未反応のシスタミンを除去す
るために、遠心分離し、蒸留水にて5回洗浄したのち、
0.01 mol/ lホウ酸緩衝液(pH7,0
)に再分散させた。
得られた重合体粒子の表面に存在するジスルフィド結合
の量は、 1.9 X 10 mol/r!?であ
った。
の量は、 1.9 X 10 mol/r!?であ
った。
(e)担体への酵素の固定化
得られた本発明の生理活性物質固定用担体を含むラテッ
クスに、実施例1と同様にしてβ−D−ガラクトシダー
ゼを固定し九ところ、固定化量は担体粒子1g当り27
報であり、活性収率は68%であった。
クスに、実施例1と同様にしてβ−D−ガラクトシダー
ゼを固定し九ところ、固定化量は担体粒子1g当り27
報であり、活性収率は68%であった。
一方、上記(b)にて得られた生理活性物質固定用担体
を含むラテックスを、25℃にて保存したのチ、 41
:記と同様にしてβ−D−ガラクトシダーゼを固定した
。固定され九酵素量および保存0か月目の単位重量ポリ
マー粒子当りの酵素活性f:100%とした相対活性を
第3表に示した。
を含むラテックスを、25℃にて保存したのチ、 41
:記と同様にしてβ−D−ガラクトシダーゼを固定した
。固定され九酵素量および保存0か月目の単位重量ポリ
マー粒子当りの酵素活性f:100%とした相対活性を
第3表に示した。
第 3 表
Claims (3)
- (1)表面にエポキシ基を有する平均粒径0.03〜3
μmの重合体粒子を含むラテックスに、分子末端にアミ
ノ基またはカルボキシル基を有する鎖状ジスルフィド化
合物が、上記エポキシ基と結合されていることを特徴と
する生理活性物質固定用担体。 - (2)重合体粒子がグリシジル(メタ)アクリレート、
多官能性内部架橋用単量体および(メタ)アクリロニト
リルを含む単量体混合物を乳化共重合させて得られるも
のである特許請求の範囲第1項記載の生理活性物質固定
用担体。 - (3)多官能性内部架橋用単量体が多価アルコールのポ
リ(メタ)アクリレートである特許請求の範囲第2項記
載の生理活性物質固定用担体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6363087A JPS63230086A (ja) | 1987-03-17 | 1987-03-17 | 生理活性物質固定用担体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6363087A JPS63230086A (ja) | 1987-03-17 | 1987-03-17 | 生理活性物質固定用担体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63230086A true JPS63230086A (ja) | 1988-09-26 |
Family
ID=13234857
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6363087A Pending JPS63230086A (ja) | 1987-03-17 | 1987-03-17 | 生理活性物質固定用担体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63230086A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998020020A3 (en) * | 1996-11-06 | 1998-10-22 | Sequenom Inc | High density immobilization of nucleic acids |
US6133436A (en) * | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
US8722032B2 (en) | 2003-01-06 | 2014-05-13 | Nektar Therapeutics | Thiol-selective water-soluble polymer derivatives |
US9068953B2 (en) | 2007-09-17 | 2015-06-30 | Agena Bioscience, Inc. | Integrated robotic sample transfer device |
US9669376B2 (en) | 2000-10-30 | 2017-06-06 | Agena Bioscience, Inc. | Method and apparatus for delivery of submicroliter volumes onto a substrate |
WO2021039982A1 (ja) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | キヤノン株式会社 | 粒子、標的物質に対するリガンドを有するアフィニティー粒子、及び、これを含む体外診断用試薬およびキット、並びに標的物質の検出方法 |
-
1987
- 1987-03-17 JP JP6363087A patent/JPS63230086A/ja active Pending
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998020020A3 (en) * | 1996-11-06 | 1998-10-22 | Sequenom Inc | High density immobilization of nucleic acids |
US6133436A (en) * | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
USRE41005E1 (en) * | 1996-11-06 | 2009-11-24 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
USRE44693E1 (en) | 1996-11-06 | 2014-01-07 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
US9669376B2 (en) | 2000-10-30 | 2017-06-06 | Agena Bioscience, Inc. | Method and apparatus for delivery of submicroliter volumes onto a substrate |
US8722032B2 (en) | 2003-01-06 | 2014-05-13 | Nektar Therapeutics | Thiol-selective water-soluble polymer derivatives |
US9040658B2 (en) | 2003-01-06 | 2015-05-26 | Nektar Therapeutics | Thiol-selective water-soluble polymer derivatives |
US9333267B2 (en) | 2003-01-06 | 2016-05-10 | Nektar Therapeutics | Thiol-selective water-soluble polymer derivatives |
EP1581582B2 (en) † | 2003-01-06 | 2017-06-07 | Nektar Therapeutics | Thiol-selective water-soluble polmer derivatives |
US9068953B2 (en) | 2007-09-17 | 2015-06-30 | Agena Bioscience, Inc. | Integrated robotic sample transfer device |
WO2021039982A1 (ja) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | キヤノン株式会社 | 粒子、標的物質に対するリガンドを有するアフィニティー粒子、及び、これを含む体外診断用試薬およびキット、並びに標的物質の検出方法 |
CN114531879A (zh) * | 2019-08-30 | 2022-05-24 | 佳能株式会社 | 颗粒、具有针对目标物质的配体的亲和颗粒、包含其的体外诊断用试剂和试剂盒和目标物质的检测方法 |
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