JPS63212863A - 超構造分析のための生物学的組織を凍結調製する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料自身を調製する際の、組織の超構造（ｕ
ｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の重大な変化を防ぐこと
による、超構造分析もしくはその他の医学的使途、即ち
移植のための生物学的組織試料を調製するための装置及
びその方法に関するものである。組織試料の試験やその
細胞構造や機能を決定するためには、はとんど全ての分
析方法を使用する前にその組織は“固定”しなければな
らないことは医学の分野では、よく知られてい墨ことで
ある。

“組織試料”という語句（“組織”という語も同義で用
いられている）は、本明細書中を通して用いられている
が、この語句は、単独又は、いかなるマトリックスとの
複合物又はいかなる化学物質との会合物であろうと、１
個以上の細胞を含むいかなる物質をも包含すると理解す
べきである。

その定義は、いかなる生物学的もしくは有機物質、そし
ていかなる細胞の一部分、その生産物又は副生産物をも
含む。組織試料の定義は、限定することなしに、***、
卵、胎児及び血液成分を含むと理解すべきである。本発
明の装置の配慮された有用性は、組織の特別な型、もし
くは大きさを規定しない０本発明の装置は、いかなる大
きさ、形、もしくは型の細胞組織に対しても設計又は適
用することができる。それ故、“組織”及び“組織試料
”という語は同義として用い、そして本発明の方法及び
装置の使用に関して制限を受けない。

〔従来の技術〕

種々の顕微鏡又はそれに関連した拡大装置の使用による
組織の試験が多年に渡り行なわれてきたが、点解像度２
〜３オングストロームで、５００Ｘからｓｏｏ、ｏｏｏ
　ｘの倍率でのＸ線分析による試料構成物の試験を可能
にする、ＳＴＥＭ電子顕微鏡のような、最近の高分解能
分析顕微鏡の使用のための、組織の調製には本質的な問
題がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

特に、組￥ａ調製プロセス中で生ずる種々のアーテファ
ク）　（ａｒｔｉｆａｃｔ）の程度を評価しつつ同時に
、組織分析の結果を説明するのは難かしいことである。

このように、アーチファクトは可能なかぎり除くことが
基本となる。“アーチファクト”という語は、外因的作
用による人工的性格をもつ生成物を意味している。もう
一つの問題は、現行の定説中に残っている、良好な調製
のためには必要であるが、過激な操作を行ったときの組
織試料自身の物理的収縮から生ずる。最近使用されてい
る組織調製ステップにおける、組織収縮は４０％から５
０％のオーダーである。この収縮は、超構造の変化及び
下部構造分解の多量の再配列を評価不能にしている。こ
の正味の結果は、現存する分析手段による、超構造解釈
の損傷及び詳細な記述における不正確さである。

“形態学における黄金時代”と呼ばれる時期に、定性的
及び定量的顕微鏡における有力で、基本的ゴールは、審
美的に好ましい像であった。このゴールは、固定法と、
現在入手できる装置を用いれば容易に到達できる。しか
し、調製プロセスにより作り出される審美的に好ましい
像は、また生きている生物中の組織の真の条件、即ち、
“生きている状態”に近い条件を正確に反映する組織試
料を生ずるということが基本的となっている。これは、
本発明の装置が目指し、そして、解決する問題である。

現在分析的使用のために入手できる拡大装置は、以前か
ら採用してきた現行の組ＩＮ調製技術よりも技術的に進
歩している。この発明の方法により既知の拡大及び分析
装置で容易に使用することができる組織試料を調製でき
る。

本出願の第一の目的は、現存の拡大装置による分析のた
めの組織試料の調製にあるが、本発明をそのような分析
のためのみに限定する意図はない。

特に、組織の“調製”は、分析のための組織の調製と同
様に、移植、修飾、試験管中もしくは、生体中での細胞
増殖、発酵、生気のある（ａｎｉｍａｔｅｄ）懸濁液又
はより典型的な樹脂充填、沈降、浸透及び分析に先立つ
組織の凍結固定のことを意味すると理解すべきである。

本発明の装置は凍結調製で避けることができないと考え
られてきた超構造の損傷を起こすことなしに、いかなる
医学的もしくは分析的操作のための組織を調製するのに
用いることができる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の装置は、現存する凍結乾燥装置と区別すべきで
ある。凍結乾燥は、凍結乾燥を行うのに必要な装置と共
に、この分野ではよく知られている技術である。例えば
、米国特許第４．２３２．４５３号を参照せよ、ある凍
結乾燥技術においては、冷却媒体として液体窒素を用い
るが、その組織もしくは、試料自体は、そのような温度
に達することはない。通常、凍結乾燥は、−５０℃から
一８０℃の試料温度を想定している。一方、本発明の凍
結調製は、−１２０℃以下の試料温度を想定している。

それ故、本出願の目的に対し、“凍結調製”及び“凍結
固定”という語は、従来の“凍結乾燥”技術（−５０℃
から一８０℃）と区別して用いられる。

本発明の装置の実施にあたって用いられる極端な低温度
及び真空度は、凍結乾燥装置では出くわさない独特の問
題を引き起こす。例えば、弾性物質でできている、圧力
で縮むＯ−リングのようなシール部材は、このような想
定される温度及び真空度においては効果的に機能しない
。それ故、凍結調製装置は、液体窒素環境外で出くわす
、即ち、試料室とその他の装置の間の極端な圧力及び極
端の温度で、種々の構造物をシールするよう設計するこ
とが必要である。これは、凍結調製装置の設計中に出合
う、そして独特の問題の一例である。

本発明の装置において、公開され、用いられている真空
度レベルは、従来技術の凍結乾燥用の装置では、安全に
達成することができない。凍結乾燥法及び装置中での真
空度を上げる典型的な従来法は、上述のガラスコンテナ
中のモレキュラー・シーブスの使用を開示した米国特許
第４，２３２，４５３号のものである。簡単に処理した
コンテナ中のモレキュラー・シープスは、この公開され
た発明の装置により作られる想定温度（−１２０℃以下
）での水の昇華に必要な部分圧を達成するのに要求され
る真空度レベルを安全に作り、且つ維持することはでき
ない。

分析のための組織試料を調製する最も一般的従未決は化
学的固定及び有機溶媒を使った脱水によるものである。

付随的アーチファクトの生成、試料の収縮、及び組織特
性への損傷及びその変化の生成は、従来技術プロセスに
おいて本質的なものである。アーチファクト又はそれに
類するものの形での、これらの組織特性の変化は、その
試料を分析する、もしくは評価する個人又は装置による
評価を必要とする。これは、多くの場合、不満足な誤差
の危険性を招く。

化学的固定は、よく知れた技術であり、多年の間分析的
生物学者によく用いられてきており、疑いなく、これか
らも、ある限定された用途においても採用されつづかれ
ていくであろう、しかしながら、組織試料分析の使用は
より複雑となり、そしてそのような分析の使用がより広
範囲となってくるにつれ、化学的固定に代る代替法が望
まれてきている。特にこのことは、入手できる拡大及び
分析装置が進歩するにつれて真にせまってきた。

試料を分析するのに用いる分析道具、即ち電子顕微鏡の
進歩とともに、組織試料を調製するのに必−要な装置及
び組織調製法が等しく進歩することが必要である。明ら
かに、もし、組織試料調製技術が顕微鏡技術に遅れをと
ると、進歩した顕微鏡は形態学者又はその他の組織試験
者によって、その利点を十分に生かすよう用いられない
。

同様に、凍結調製法及び装置は他の医学技術即ち、外科
移植技術、生物工学及び生物遺伝学と共に発達すること
が重要である。簡単に言えば、凍結調製法は細胞又は組
織を使用、もしくは分析するプロセスを進歩させること
における重要な中間ステップである。もし、凍結調製装
置が進歩しなかったら、未説明及び未調査の医学分野へ
の医学技術の発展は鈍るであろう。本発明の装置は、生
物学的組織の使用及び調製への研究を可能にし、医学技
術における他の進歩との歩調を合せる凍結調製の躍進で
ある。

化学的固定及び有機溶媒による脱水に対する最も一般的
代替法は、試料を凍結固定する凍結乾燥である。凍結乾
燥につづく凍結固定はよく調査されており、かつ組織保
存のためのよく知られた技術である。凍結乾燥は細胞代
謝をほぼ瞬間的に停止させる。また、その試料と接する
溶媒の除去を通して、可溶性細胞構成物の安定化及び維
持をする。既知の組織調製プロセスへの凍結固定及び凍
結乾燥技術の応用を企てる、多くの研究を可能にすると
いう凍結固定及び凍結乾燥に対する重大な利点がある。

不幸にも、凍結乾燥技術は本質的に、組織調製の方法論
に関する多くの短所を有している。現在入手できる凍結
乾燥技術及び装置における第一の短所は、本質的な氷結
晶の形成である。容易に説明かつ（ように、氷結晶の形
、成は、検査している組織試料の超構造の完全性を破壊
する。その像はゆがみ、そして細胞質は網状になってし
まう、試料中の氷結晶の形成は、かなりの高分子の異常
な三次元構造を生ずる組織（融解形成）の微区画内での
ｐＨを変化させる。またタンパク賞が変性及び沈殿化す
る可能性もある。それ以外にも凍結乾燥プロセスに内在
するいくつかの短所がある。

この一般的論題は、その他の従来法とともに、ルイス・
テラジオ（Ｌｏｕｔｓ　Ｔｅｒｒａｃｉｏ）及びカール
・Ｇ、−シュウニイブ（Ｍａｒｌ　Ｇ、　Ｓｃｈｗａｂ
ｅ）により、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・
アンド・サイトケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）、２９巻、９号、１０２１〜１０２８頁
（１９８１年）に、“電子顕微鏡のための生物学的組織
の凍結及び乾燥”という題で詳しく議論されている。ア
ーチファクトの形成に関する問題は、ロイヤル・マイク
ロスコピアル・ソサイアティ−（Ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）、（１９
８２年）１０３〜１２３頁、レビュー“凍結−破壊応答
におけるアーチファクト問題の理解”に記述されている
。

組織試料調製における有用性を説明する、凍結技術に応
用できることが分った一般的原則は、冷却速度が増加す
るにつれ、組織の液体は、細胞外空隙への水の分離なし
にガラス状化されることである。冷却速度とは無関係に
、氷結晶はなお形成するが、冷却速度が増加するにつれ
、細胞内氷結晶の大きさは減少することが仮定されてい
る。高速冷却による氷結晶の微小化又は不在は、もちろ
ん、これが最小限のアーチファクト形成及び組織脱水に
おける超構造の損傷をもたらすことで、形態学的保持に
おいて実質的な利点である。本発明の装置は、組織試料
の１秒以内のガラス相への高速超冷却と、水の減少した
介在状態での組織試料の脱水を、組繊細胞への超構造の
損傷することなく行うことを要求する。

この出願の目的に対し、“ガラス状の゛又は“ガラス状
化”又は“ガラス相２という語は、溶解性氷結晶が存在
せず、そして、または、溶解性氷結晶を形成させる速度
で核とならない条件下及び超高速冷却における組織の物
理的状態を意味していると理解すべきである。

歴史的に、高速超冷却のための技術を判断する基準は、
そのシステムの冷却速度マはなく、単に、その組織が凍
結する環境温度であった。このように、高速超冷却とい
う語は、超冷却剤が一１５０℃以下の温度を有している
すべてのシステムにも適用されている。冷却システムの
有効性は、その試料から熱を除く速度に依存している。

熱伝達は、その凍結システムの温度のみならず、その組
織のサイズ及び熱特性と同様にその物理的及び熱的特性
に依存する。

高速超冷却のための最も一般的に使用されている技術は
、液体冷却浴に試料を浸す又は“クエンチ”することで
ある。クエンチングに最も一般的に用いられる液体は、
液体窒素、イソペンタン、プロパン及びフレオン１２及
びフレオン２２のようなフルオロカーボンである。その
低い温度（−１９６℃）のために液体窒素は一般的に理
想的なりエンチング液と考えられているが、液体窒素の
使用には、液体窒素の低い蒸発熱により、少な（とも部
分的に起こる組織表面膜の沸騰の発生に帰因する本質的
短所が存在する。膜沸騰は、その試料を実際に絶縁する
ことによる熱伝達を阻害する液体窒素の特徴である。

高速冷却のためのもう一つの従来技術は、冷却した金属
塊の研磨面上での凍結である。これは典型的には、その
金属面に対し、試料をしっかりと押しつけることにより
研磨した平坦な金属面へ、組織試料面を接触させること
を含んでいる。銀及び銅が、研磨した金属塊としてよく
用いられる。

この方法は、液体窒素又は液体ヘリウム温度にまで冷却
したときの、これらの金属の高い熱伝導性及び高容量を
利用するよう設計されている。金属表面上で冷却する際
の重要なステップは、回転、並進、反発的な動きなしに
、乾燥した冷却金属面にしっかりと接触させることであ
る。医学分野でよく知られた有用性をもつ、ある市販の
装置は、“反発なし”の凍結を目指し、かつ提供してい
る。

この装置の開発のための基礎は、−ａに、メリーランド
医科大学のアラン・ポイン（Ａｌａｎ　Ｂｏｙｎｅ）博
士によるものである。

最近、冷却速度及び、クエンチング液中での超構造保存
の間に、比例関係があることの正当性が示された。−秒
当り、１００℃から４１００℃の範囲に渡り（液体窒素
−プロパン）、凍結速度を増加させると、形成する氷結
晶の大きさがそれに応じて減少し、それにより、形態学
的保存における改良がなされた。１秒以下で、組織試料
をガラス化する、上記クエンチング液又は他の超冷却装
置の使用が望ましい。

引きつづく組織調製における重要なステップは、活性化
された“分子蒸留”プロセスとして最近述べられてきて
いる超冷却組織液の、定常、的に活性化された昇華−脱
水である。一度、適当な超冷却法が選ばれ、そして行な
われると、凍結された水和標本を視覚化させる電子顕微
鏡又はその他の拡大装置は簡単に入手できないので、時
々顕微鏡肖評価のためにその組織をさらに処理すること
が必要となる。それ故、脱水は、保存のための生物学的
組織試料の調製における重要なステップであり、そして
、その組織の下部構造及び超構造の綱状化を経由する破
壊を生するステップである。脱水による組繊細胞の破壊
は、拡大装置による分析を妨害するばかりでなく、使用
される、即ち移植される組織の機能特性及び生存能力に
悪影響を及ぼす。

ある従来の乾燥技術においては、組織試料は、細胞液可
溶物が結合水区画中で濃縮されるにつれ、融解物質形成
により完全に固体化することはない。

ゆっくりと冷却すると、この可溶物の移動が起こる一方
、その物質は液体状態となる。高速冷却技術を用いたと
きは、凍結乾燥のこれらの特徴と異なる独特の操作を、
脱水ステップで採用しなければならない。問題は、液体
状態よりもむしろ固体状態から、即ち昇華により、脱水
を行なわねばならない（氷が除かれねばならない）とい
う事実がら生ずる。うまく使用されているもう一つの操
作は、活性化した分子蒸留である。活性化した分子蒸留
とは、表面分子の反結合軌道中のエネルギー量を上昇さ
せ、それらをガス相に逃がし、そして、固相に再捕縛さ
れないようにするプロセスを意味している。

従来法における、凍結置換アプローチは、−５０℃から
一８０℃で固相水を、溶剤又は溶媒−固定剤混合物で置
換することによる組織水の除去を含んでいる。これは、
過去のルーチン化している化学的固定による方法論と比
べ、組織試料に対して、それ程激しい溶媒相分離及び化
学的に変化を伴うアーチファクトを招くことはない。実
行する立場からすると、凍結乾燥は、組織試料が温めら
れ、超冷却化した水の蒸気圧が増加し、納得のいく時間
内に昇華を進行させる要請により、複雑なものになって
いる。蒸気圧の増加に加えて、上昇した温度は、氷結晶
の膨張及びそれに伴う組織試料の超構造の形態の損傷を
招く一連の物理的事象を起こしうる。昇温プロセスに起
こる多くの物理的事象は、存在する水の物理的状態の転
移に関わるに相違いない、よく出くわす変化には、ガラ
ス転移、脱ガラス化及びそれに続く一連の結晶格子構造
転移を伴う再結晶化である。

このように、凍結乾燥技術及び凍結調製技術は、形態学
的試験のための組織試料の調製に例外的機会を与えてい
るといえよう。しかし、凍結乾燥技術を使う上で、試料
の脱水及び固定に関連する問題は本質的なものである。

ここに本発明の力落及び装置が目指す問題がある。

本発明の凍結調製プロセスは、角膜移植へのこれまでに
ない応用を示している。本発明以前に、提供者からの摘
出後の角膜に必要な凍結又は凍結乾燥を含む角膜移植の
企ては、移植に際して必ず曇った角膜を生成した。この
移植された角膜の物理的状態は角膜自体の中の氷結晶の
形成と、それに伴う基質（ｓｔｒｏｍａ）の損傷を引き
起こした。本発明の装置の使用は、眼科医による角膜の
凍結調製及び受容者へのこれらの角膜移植を、実質的に
は、曇りや結晶形成ない状態で実現させた。そのように
角膜を移植できるということは、角膜移植手術における
医学的躍進と同様、本発明の方法に対して異常な利点を
示した。

本発明の装置の１つの利点は、組繊細胞の超構造の形態
学的特性の明白な破裂及び破壊なしに、組織を凍結調製
できることである。本発明の装置は従来の分析装置によ
る解釈を制限する不必要なアーチファクトを生ずること
なしに、固体ガラス相に維持された組織を脱水すること
による組織の凍結調製を可能にした。

本発明は、生物学的組織試料の凍結調製のための装置及
び方法に関するものである。その装置は、激しい減圧条
件下での生物学的組織の脱水を活性化する要素を含んで
いる。減圧化し、ガラス化した組織試料を、−１４０℃
以下の温度に平衡化する。それから、その組織試料を平
衡状態を維持しつつ、脱水する。組織水の除去後、その
組織試料を脱ガスした樹脂で随意に浸透し、つづいてそ
の樹脂を重合することにより、固定化した組織試料を形
成させる。本発明の装置及び方法のその他の応用におい
て、脱水した組織試料は、浸透又は脱ガスステップなし
し、即ち移植に用いることができる。

本発明の装置はガラス状化した生物学的Ｕ織を維持する
試料ホルダーを含んでいる。その試料ホルダー及びガラ
ス状化組織を凍結温度に維持しつつ、その組織試料を脱
水する。超高真空装置を、その試料ホルダーの大気を減
圧するのに用い、望ましい昇華；平衡化及び脱水操作を
可能とする。

生物学組織をガラス状化するのに（溶解性氷結晶が生成
しないような条件下及び速度での超高速冷却）本発明の
装置を従来の装置と組合せて用いる。好ましいガラス状
化装置とは、−１２３℃以下の温度で、その組織をガラ
ス相に転移させるのに適した金属棒である。ガラス状化
した組織を、凍結塔からの出し入れが可能な試料室に、
ぴったりと納まる試料ホルダーに挿入する。

試料室を減圧するのに用いる超高真空装置は、Ｉ　Ｘ　
１０−７ｍｂａｒ〜Ｉ　Ｘ　１０−１００−１Ｏの圧力
を提供する。超高真空装置は試料室から脱着可能である
。

実際には、本発明の装置は、分析又はその他の医学的最
終用途、即ち、移植のための生物学的組織を凍結調製す
るのに用いる。この装置は、限りなく多彩な組織の形、
大きさ及び構造のものに適用することができる。本発明
の装置は、その超構造が実質的に変化を受けていない最
終生成物を生み、分析及び、これまで医学の分野で不可
能であった最終用途を容易にする生物学的組織の凍結調
製物を生成する。

本発明の装置において、望ましい組織が得られることが
基本的必要事項である。組織試料を種々の手段、即ち、
外科的摘出、抜き取った血液試料、バインダー及びよく
知られそして伝統的な種々のその他の技術によって採集
する。本発明の装置については、生物学的試料を得る方
法は、特別なものに限定されることはない。しかし、も
し、その組織試料を切除後、可能なかぎり早く処理した
ならば、本発明の装置における組織試料の調製の質は向
上する。

組織試料を受は入れると直ちにその調製を始める。輸送
、貯蔵又はその他の必要とされる操作の間に、その試料
を維持するために、その組織試料を固定剤、即ちホルム
アルデヒド、又はその他の生物学的に活性のある安定化
溶液中で維持することはできない。また、その試料は、
本発明の方法に従う調製の前に、ルーチン的に凍結又は
その他の物理的変化を与えないことが重要である。後に
その試料を物理的に区分されるか、もしくは、装置内で
の長期間に渡る貯蔵又は種々の現在入手可能な市販の分
析装置での使用のためのその他の物理的調製が行なわれ
る。

本発明の装置の１つの応用においては、組織試料は分析
用に調製される０本発明の装置における調製のために好
ましい至適生物学的試料は新鮮な一片１ミリメートルの
立方体の生検試料である。

この試料をできる限り早くガラス状化しなければならな
い。ガラス状化により、“凍結”とは異なる試料の凍結
固定するプロセスについて言及するするつもりである。

ガラス状化のプロセスにおいて、用いられる冷却装置は
、組織中に含まれる可溶性及び不溶性部分を歪めず、移
動せず、又は変化させず、もしくは、それらが濃縮（融
解する）させることのないよう、その試料をガラス相に
する。定義により、ガラス状化液体は、窓ガラスのよう
に剪断能力がかかると破壊する。このガラス相化は液状
の水をアモルファス又は“ガラス”相への転換を含む。

このことは、組織を約−１９６℃に維持した金属棒の非
常によく研磨しく鏡のように）、凝縮物のない表面に“
反発のないよう”対面させることにより、その組織試料
を迅速に超冷却することにより行なわれる。これらの操
作は本明細書の従来技術のセクションで先に議論してき
た。このような迅速な超冷却は１秒以下で行なわれるこ
とが望ましい。

本発明の方法及び装置においては、メリーランド医科大
学のアラン・ポイン（Ａｌａｎ　Ｂｏｙｎｅ）博士と共
同して開発した“反発しない”凍結装置が特に有用であ
る。この凍結装置においては、銅の塊りを組織試料のガ
ラス状化に使用する。液体窒素、ヘリウム、プロパン又
は種々のフレオンのような超冷却液を用いた、このガラ
ス状化は、その組織試料の液体を超冷却し、確認できる
、もしくは溶解性の細胞水の氷結晶形成前、そして、ま
たはそれなしにアモルファス状態とする。好ましい態様
において、このガラス状化組織試料は、組織水の除去の
前の、貯蔵及び転移操作の間、約−１２０℃以下そして
、好ましくは一１４０℃以下の温度に維持することが望
まれる。

温度制御は氷の結晶化を防ぐのに重要である。

氷の結晶化は約−１２３℃で始まると考えられている。

しかしこれは細胞水の化学的構成物に依存している。そ
れ放出願人は、好ましい温度とじて−１４０℃を選択し
てきている。、望ましい結果とは、氷が結晶しはじめ、
そして、−１２３℃から一１４０℃が現在の実験に基づ
いて選択されている、温度を維持することである。それ
故、本出願の目的に対し、維持すべき好ましい組織試料
温度は一１２３℃以下であり、またより好ましい温度は
、−１４０℃以下であり、そして、最も好ましい温度は
一１９６℃以下である。

試料の超冷却及び脱水の間の予想される時間のずれに依
存して、試料を、液体窒素のジュワー瓶中に浸して保存
する。一度試料が乾燥し、そして適当に固定すると、そ
の組織の分析データーを説明不能にする変化及び結晶格
子転移を引き起こす、細胞質の網状化又はその他の細胞
異化作用なしに事実上無限に保存することができる。

ガラス軟化後、−１４０℃以下の温度に試料を維持した
まま、試料を標本輸送機関を経由して移行し、そして減
圧下の標本ホルダーに移す。標本ホルダー（これも一般
には試料ホルダーとも呼ぶ）を、温度制御コンテナ中に
維持する。そのコンテナ及び標本ホルダーを両方とも、
うま＜−１４０℃以下の温度に維持する。本発明の最も
好ましい態様においては、−１９６℃の液体窒素温度を
維持する。−１４０℃が好ましい理由は、液体窒素温度
のとき、そのガラス相中に存在する純水は、−１２３℃
で立方体の氷結晶化を開始しはじめるであろうというこ
とである。本明細書の従来技術の中で議論されているよ
うに、氷の結晶化は、超構造的損傷、即ち、組織試料の
形態の網状化を引き起こす。

次に、組織試料、標本ホルダー及びコンテナをとり囲む
大気を減圧する。典型的には、これは、従来の機会的真
空装置を使って、試料ホルダーに関し、真空を引くこと
により行なわれる。真空は３０分以内に３　Ｘ　１０−
９ｍｂａｒのレベルまで引く。

本発明のその他の態様においては、３０分間以内に達成
する真空度はＩ　Ｘ　１０−７ｍｂａｒからｌＸｌ０−
’。

ｌ１ｂａｒである。この圧力は、全ての組織水が除かれ
るまでの、先に述べた以下の操作を通じて、およソ３　
Ｘ　１０−”ｍｂａｒに維持する。このシステムの平衡
化を通して（１０〜１００時間）、その標本温度を液体
窒素又はその他の適切な冷却手段で維持する一方その真
空度も引きつづけられ、維持される。

この時点で、この組織試料は、超低圧及び異常な低平衡
凍練一温度にさらされている。平衡が得られた後（−１
４０℃以下の平衡温度で）、組織試験中に見られるガラ
ス状水は、昇華熱に等しいエネルギーが、組織に見られ
る昇華前線に断続的に及び増加的に供給されるにつれ、
昇華しはじめる。これは、ゆっくりとしたプロセスであ
るが試料の調製にとって重要なことである。その試料に
、各々のエネルギーの付加後、平衡化させるのに十分な
時間を与えることは重要な必要条件である。

平衡化により、組織試料温度は１から５時間の間、そし
て、好ましくは、２から４時間の間隔でもはや変化はし
ないことが意味される。典型的な組織調製プロセスにお
いては、試料は素早＜−１９６℃でガラス状化され、そ
して、貯蔵又は昇華（乾燥）装置中の試料ホルダーへの
移行の間−１４０℃以下に維持される。適当な平衡時間
の後、平衡温度は一１４０℃及び−１９６℃の間になる
であろう。この全平衡化プロセスの間に、重要な超低圧
は、３　Ｘ　１０−９ｍｂａｒ以下に維持する。

平衡化プロセスの後、そのシステムに昇華エネルギー（
熱）が与えられないならば、適当な量の水が蒸発するの
に、異常な長さの時間を要する。

この発明の方法に従った温度及び圧力でその水を蒸発さ
せようとすると、年のオーダーの時間となると見積られ
る。それ故、本発明の好ましい態様においては、乾燥組
織試料の超構造に損傷を起こすことなく、昇華しようと
する水分子を励起するために、第二のエネルギー源（加
熱）が加えられる。

特別の波長を持つ、輻射光子エネルギーは、この目的を
達成するのに特に有用な方法であると考えられている。

マイクロ波、レーザーシステム及び磁力エネルギーによ
る昇華エネルギーも適している。最も好ましい第二のエ
ネルギー源は、上記のものと組合せた核磁気共鳴及び電
子スピン共鳴法である。平衡時には、その組織の温度は
、隣接する環境のパラメータ（輻射エネルギーが優勢で
ある、即ち室温２７℃）が変化しないかぎり変化しない
であろう。このことは、システム平衡の最終目標である
不変の一般的説明である。

組織試料の平衡への到達に引きつづいて、超冷却された
固体水そして、又は、ガラス軟化操作中にその組織中に
形成した現存する未溶解性の氷結晶（２０ナノメーター
以下の直径）を取り除く必要がある。脱水プロセスのこ
の部分は絶対的に重要で、そして、組織中の超構造の最
も基本的な破壊及び網状化現れるステップでもある。こ
れは、時間当りの促進エネルギーを僅かに増加させて、
その試料中の昇華エネルギーを置き換えることにより行
なわれる。至適条件は、組織温度を上昇させないことで
ある。

昇華の潜熱に等しい熱エネルギーを与えることにより、
全ての固体水（微氷結晶又は、アモルファス状超冷却水
）は、それを取り囲む凍結システムにより、その組織試
料から効果的に取り除がれる。その乾燥は、−１５０℃
及び−８０℃間の温度で行なわれる。より高い温度範囲
でのこの体制は種々の結果を与えるであろうし、又、種
々の濃度で細胞水中に溶けている溶解物により、脱ガラ
ス化する温度の上昇の可能性もある。適切な装置、即ち
、残留ガス分析器を用いて、全ての細胞水が除かれたか
どうか決定することも可能である。その時点で、そのエ
ネルギー増加が加速し、室温より３℃高い最終的標本温
度（２８℃〜３０℃）となる。このようにして、この装
置を使って、本発明の方法における重要な利点を得るこ
とができる。

この脱水した組織試料を、室温より３℃高い温度になる
のは許される。室温に到達したとしても、真空度は、そ
の周囲温度の試料が有している、本来の極端な超低圧を
維持する。本出願における室温とはおよそ２４℃〜２７
℃と理解すべきである。

この温度レベルは、必然的に変化することもある。

この分野において普通に熟錬している人は、基本的なガ
ラス化、平衡化、昇華及び、脱水のプロセスを通しての
温度制御を容易に行うことができる。種々の細胞構造に
よって異なるけれども、組織を維持する精密な温度及び
組織温度を変化速度は重要である。角膜のような細胞物
質に対する典型的ルーチン操作は、まず−１９０℃以下
の角膜組織のガラス化が必要である。その試料をおよそ
４時間の間に一１５０℃に直ちに加熱する。平衡化、昇
華及び脱水の間、組織試料を、６０時間かけて、−１５
０℃から一７０℃に（速度＝　１．３３３”Ｃ／ｈｒ）
加熱する。乾燥プロセスはおよそ一１１９℃で始め、そ
して、−８０℃での脱ガス化前に完了している。さらに
その試料を４時間かけて一７０℃から＋２５℃に加熱す
る。一般にその試料は室温のわずか上の温度まで加熱さ
れ、凝縮水が試料に侵入するのを妨いた。

この際に、研究者によって、約１時間、その試料をオス
ミウムの蒸気にさらして、電子密度により、コントラス
トを高めることもある。このことは、もし、目的とする
領域に有害であると分っていたり、又は、最終目標が診
療的用途の場合には省略される。オスミウム蒸気は、凍
結沈殿による再結晶化により取除かれる。その他の確立
された固定操作においては、バッファ溶液中に、バラホ
ルムアルデヒドそして、またはグルタルアルデヒドを用
いる。一般的に、これらの物質は化学的固定物質と呼ば
れる。典型的に添加される最も好ましい物質は四酸化オ
スミウムである。この物質は、そのＭｉ織試料を解釈す
るのに用いる種々の分析装置に対し、その組織の種々の
構成物質の分解能及びコントラストを高める。

分析のために調製した試料に対して、脱ガスした樹脂が
その組織に加えられ、同時にその減圧条件を維持される
。このことは一般的に樹脂浸透と呼ばれ、固定した組織
を生む。過去の方法で有用性が示された樹脂は本発明の
方法に等し４応用できる。例えば、米国特許第３．６７
９．４５０号、４，１００゜１５８号、４，１２０，９
９１号、及び４，２７８，７０１号を参照せよ。

これらのステップに引きつづいて、組織試料及び樹脂を
、樹脂ボートを通してゆっくり空気を供給することによ
り大気圧にもってくる。樹脂適用プロセスから生成した
固定化した組織試料を取り出し、そして、その樹脂を、
先に述べた温度で重合する。重合の特別の方法は、用い
る樹脂に大きく依存する。典型的には、その組織試料は
、１２時間にわたるオープン中での熱を用いて重合した
。

通常の温度は６０℃であるが、必要ならば一８０℃はど
の温度も用いる。重合ステップは、組織の超構造への損
傷なしに行うことが重要である。

重合につづいて、組織試料は室温で貯蔵、薄く区分、染
色又は他の分析用の調製を行うことができる。しかし、
本発明で開示された方法での脱水により、試料は、従来
のウルトラミクロトーム及び電子顕微鏡により容易に解
釈できる凍結固定状態を維持し、そして、視覚化分析の
ための試料の固定そして、又は調製に遍在すると考えら
れる。

これまでの圧迫を同時に減少又は除去するアーチファク
トの有意な変化及び減少を伴う、組織試料の非常に意味
のある分析の基礎を与える。

これら生物学的組織における機能と構造との事実上の関
係づけは、従来の電子顕微鏡法（即ち、全ての可溶性領
域、糖脂質及び可溶性タンパク質の免疫学的分析）、酵
素細胞化学、Ｘ線ＳＴＥＭ分析、組織移植調製、マイク
ロプローブ分析、オートラジオグラフィー（特に可溶性
化合物）及び薬学的調製を通して、これまでは接近不能
と考えられてきた、実行可能な染色法を大きく拡張して
、ルーチン化している超薄区分化により行なわれる。

他の装置は、この階層のものの実行に対するものは入手
できるが、先に議論された、必要とする、限定されたパ
ラメータを全体として取り入れていないので、誰も期待
される結果を出してはいない。

本発明の方法の実行に用いる装置は図２から図６の図式
で説明しである。

アラン・ポイン（Ａｌａｎ　Ｂｏｙｎｅ）型の装置で得
られる高速凍結は、本発明の方法の実行に適している。

本発明の方法において、１秒以下で細胞水のガラス相を
提供するならば、液体窒素及び冷却した金属の使用と組
合せて、その他の型のクエンチング浴を使用する。液体
窒素クエンチング浴は、組織ホルダー中に置かれた組織
試料の温度をより低く維持するのに用いる０組織試料を
液体窒素条件下に維持する一方、重合前に、本発明の組
織試料を最終的に固定するのに用いる種々の樹脂同様、
本発明の方法中随意に好まれる種々の染色及び固定物質
を導入する管をも液体窒素条件中に置くことが必要があ
ることに、注意すべきである。再び、これらの機能の各
々は、付随する図に図式で説明しである。しかし、これ
らは、本発明の特性を制限する意図はなく、単に、使用
できる技術を説明を意図していることを理解すべきであ
る。

本発明の方法において用いる装置を設計又は選択する際
、種々の物質に関する、異常に低い温度及び圧力の効果
を理解することが必要である。これらの理由で、それら
の物質あるいはガラス状態にある物質を処理するのに用
いる、本発明の装置の一部は、典型的にはステンレスス
チールでできている。他の物質でも同様にうまく行うこ
とができる。同様に、本発明の装置の一部分は、大部分
がテトラフルオランでできているデュポン製の物質のテ
フロンでできているか、又はテフロンでコートシである
。

図２は、本発明の装置を図で説明しである。図２に示し
たように、その装置はコントロール・パネル１０及び組
織をガラス化、昇華及び平衡化するのに用いるその装置
の残りの部分に大きく分かれる。コントロールパネル１
０のマイクロプロセッサ１１は、ターボモレキュラー・
ポンプ３０をコントロールする。マイクロプロセッサ１
１によるコントロールは、基本的にターボモレキュラー
・ポンプ３０の要素が回転する、１分当りの回転数及び
ターボモレキュラー・ポンプ中の２つのメイン・ベアリ
ングの温度に対するものである。

コントロール・パネル１０のデジタル・真空計１２は、
何ケ所かの装置と連結している。さらに、そのデジタル
真空計はメカニカル・ポンプに付いており、メカニカル
・ポンプによる低真空及びターボモレキュラー・ポンプ
による超高真空の値をデジタルで与える。

コントロール・パネル１０の次の要素は、残留ガス分析
器１３である。この残留ガス分析器１３の機能は試料室
９０中の各ガスの分圧を測定することである。その分析
器１３中には、四極マススペクトロメータが含まれてい
る。この装置は、試料室９０中に存在する各ガスの原子
量を読みとることができる。加えて、残留ガス分析器１
３は、脱水の最終目標を決定するのに用いることができ
る、その室中の水渾気レベルを測定することができる。

マイクロプロセッサ−１４は、試料ホルダー１００中の
組織試料の温度を読み取り及びコントロールに用いるコ
ントロール・パネル１０の要素である（図４参照）。マ
イクロプロセッサ−１４は試料ホルダー１００中の組織
試料を支持する金属の温度を読み取り、そして、試料そ
のものには接することはない。マイクロプロセッサ１４
のプログラマブル能は温度モニター機能同様温度コント
ロール機能の実行をも可能にする。

コントロール・パネル１０の要素１５は、マイクロプロ
セッサ１４のチャート・レコーダである。

チャートレコーダ１５は、マイクロプロセッサ１４によ
り測定された温度をグラフ表示する。

メカニカル・ポンプ２０　（バッキング・ポンプ）及び
２１　（ラフポンプ）は、主要装置と共に、コントロー
ル・パネル中１０に存在する。メカニカル・ポンプ２０
はターボモレキュラー・ポンプ・システムにおける逆行
真空を引くよう活動させる。

初期真空は、典型的にはＩ　Ｘ　１０−３ｍｂａｒであ
る。

また、メカニカル・ポンプは、メカニカル・ポンプ２０
からターボモレキュラー・ポンプ３０へ逆行する全ての
炭化水素をトラップする為のモレキュラー・シーブ・ト
ラップ２２に連結しである。

炭化水素はターボモレキュラー・ポンプ３ｏに到達しな
いことが重要である。メカニカル・ポンプ２０及びモレ
キュラー・シーブ・トラップ２２は、直列に並んでいる
ので、その結果、炭化水素は、モレキュラー・シーブ・
トラップ２２を回避することはできない。

モレキュラー・シーブ・トラップ２２は、Ｔ字連結管２
３によりターボモレキュラー・ポンプ３０と連結してい
る。低真空計ヘッド２４が丁字連結管２３から伸びてお
り、そして、デジタル真空計１２に連結している。

本装置の好ましい態様において、電磁弁２５は、図２に
示されている点でＴ字連結管２３に接続している。その
電磁弁は、ターボモレキュラー・ポンプ３０に接続され
ている、乾燥窒素ガスのための逆行ライン（示されてい
ない）に用いられている。真空又は超高真空システムが
うまく機能しない、及び停止した場合、室内は、湿気及
び炭化水素を含む空気の代りに不活性な窒素ガスで充さ
れる。

ターボモレキュラー・ポンプ３０は、本発明の方法をう
まく実行するのに必要な超高真空ｌＸｌ０−９ｍｂａｒ
からＩ　Ｘ　１０−１００−１Ｏを生むのに用いられる
。

その超高真空ポンプ３０には、種々の市販の真空ポンプ
装置を用いることができる。好ましい態様はターボモレ
キュラー・ポンプであり、そして、特にレイボルド・ヘ
ラエウス（Ｌｅｙｂｏｌｄ　Ｈｅｒａｅｕｓ）（モデル
ＴＭＰ−３６０）製のターボモレキュラー・ポンプであ
る。超高真空ポンプは、それがターボモレキュラー・ポ
ンプであろうとなかろうと、炭化水素を含まない真空を
作ることが基本である。先に述べたように、メカニカル
・ポンプ２０は、試料室９０から超高真空ポンプ３０を
通して伝達してきたガスを汲み出すのに用いる。

本発明の好ましい態様において、ターボモレキュラー・
ポンプ又は他の超高真空ポンプ３ｏのベアリングを冷却
するのに冷却ファン３１を用いている。加熱用ベークア
ウト・ジャケット３２は、超高真空ポンプ３０の壁を加
熱し、その作動によりガスの超高真空ポンプの内面から
の脱離を保証する。これらのガス及び液体さえも、その
ターボモレキュラー・ポンプの内面上での凝縮からガス
に転換され、その結果、ターボモレキュラー・ポンプ３
０により生ずる真空度を高める。熱電対３３は、加熱用
ベークアウト・ジャケット３２のためのエネルギー源（
示されていない）へと接続されている。

コンフラツト・フランジ４０は、ターボモレキュラー・
ポンプを第１のスプール５０へとシールするのに用いた
。コンフラツトとはパリアン・インダストリー（Ｖａｒ
ｉａｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）の登録商標
で、フランジのブランドを述べている。“コンフラツト
３に関連するタイプのフランジは、当業者に熟知されて
おり、また、軟金属である第２の接触面に入り込むよう
設計されたナイフの刃を持つ第１の面と一般に記述する
ことができる。多くの階級の技術的シール部材が、望ま
しい超高真空及び温度でのその部品のシールに効果的に
機能するけれども、銅の０−リング・シールを持つステ
ンレス・スチール製のフランジである１００ｃｆコンフ
ラツト・フランジを用いることが最も好ましいことが分
った。コンフラツト・フランジ４０においては、それが
装置のベータアウトの間１５０℃までの温度で効果的に
機能するという事実が非常に重要である。このことは、
比較的標準的なシーリング手段を使ったシールを効果的
に形成させる。もしも、典型的な弾性物質からできてい
る従来の、変形性Ｏ−リングでフランジ４０をシールし
たなら、必要とするシールを得ることは実際には不可能
である。

スプール５０はターボモレキュラー・ポンプ３０から、
ゲート・バルブ６０への導管を提供する。スプール・ピ
ース５０は、４つのコンフラツト・フランジを含んでい
る。第１のものは、ターボモレキュラー・ポンプ３０と
の共通コンフラツト・フランジである。第２のものは、
コンフラツト・フランジ５１である。第３及び第４のコ
ンフラツト・フランジは、数字５２及び５３で示される
ものである。コンフラツト・フランジ５２は、スプール
５０と、残留ガス分析器１３の感知ヘッドを連結し、一
方、コンフラツト・フランジ５３は、スプール５０及び
ペイヤード・アルバート・ゲージの間のシールをしてい
る。

電気気宇的、超高真空振り子ゲートバルブ６０はターボ
モレキュラー・ポンプ３０を試料室９０から切り離すメ
イン・バルブを含む。ピストン・ハウジング６１内に含
まれるピストンは、ゲート・バルブ６０を開閉するメカ
ニズムを提供する。

電磁弁６２及び窒素ガスは、ゲート・バルブ６０の開閉
を働かせるのに用いられる。

第２のスプール・ピース７０は図２に示されているが、
より詳細には図３に説明しである。図３を参照すべきで
ある。第２のスプール・ピース７０は、振り子ゲート・
バルブ６０から試料室９０へのフィード・スルー（ｆｅ
ｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ）を供給している。スプール・ピ
ース７０はスプール・ハウジングと連結する延長物７１
．７２．７４及び７８を有している。フランジ７１は、
電気的フィード・スルー（ｆｅｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ）
に対し、試料室９０からコントロール・パネル１０への
管を供給している。フランジ７２は、低圧真空ヘッドの
ための管である。管７２の外側末端には、低真空ゲージ
ヘッドが存在する。低真空ゲージ・ヘッド７３はデジタ
ル真空針に接続している。メカニカル・ポンプ２１への
超高真空バルブ７５は、スプール・ピース７０からの延
長物７４の末端に存在する。バルブ７５は、試料室９０
を予備的又は“ラフ”な真空引きをコントロールするよ
うに働く。コンフラツト・フランジ７６及び７７は、ゲ
ート・バルブ６０及びセラミック・インスレータ−・ス
プール８０に対し、スプール・ピース７０をシールする
のに用いられている。第４のスプール・ピース７０から
の延長物は、図３の影像線で示されている過剰圧力安全
バルブ７８である。

セラミック・インスレータ−・スプール８０はスプール
・ピース７０及び試料室９０の間に挿入されている。イ
ンスレータ−・スプール８０は、大量の熱が、スプール
・ピース７０の上の装置の部品から、下の凍結用ジュワ
ー瓶９９に伝達する□のを妨ぐよう機能している（図４
参照）。インスレータ−・スプール８０がないと、しば
しば、超高真空ポンプ構造体３０及び他の連結要素の外
側に霜や氷が付着する。セラミック・インスレータ−・
スプール８０も、超冷却物質、即ち、液体窒素のより効
果的使用を可能にする。

試料室９０は、試料ホルダー１００を保持するのに使わ
れる。これらの要素は、図４及び図５に示されている。

試料室装置９０は、樹脂を含む部屋９５及びガラス窓を
含んでおり、その樹脂を含む部屋９５を目視できるよう
になっている。金で超高真空バルブ９７及び管９８をシ
ールし、試料室９０への樹脂の到達を許している。ガラ
ス管９１は、ガラス−金属アダプター９２及び金属製６
Ｔ″型フランジ９３の次に、つながっている管８８を介
して試料室９０に付属している。目盛付きのリーク・バ
ルブ９４は、乾燥窒素ガス又は他の不活性物質で試料室
９０を洗浄又は充満するのに用いる。管９１は染色操作
の際に、試料室９０へのオスミウム蒸気の導入のための
四酸化オスミウムを金色させるのに使用する。支持部品
９４は、試料室９０のハウジングから、管８８及び９８
の相対的空間を維持するのに用いる。凍結用ジュワ瓶９
９は、凍結用冷却手段、即ち、液体窒素を維持するのに
用いた。

本発明の装置の最も好ましい態様においては、凍結用ジ
ュワ瓶９９中の超冷媒、即ち液体窒素のレベルを感知し
、そして、自動的にそれをコントロールする素子が提供
される。液体窒素又はその他の同様な冷媒の使用におい
ては、経時的な冷媒の蒸散はまぬがれ得ない。それ故、
冷媒量は、望ましい冷却を維持するために、定期的に、
補給しなければならない。これは、人手により行なわれ
るか、さもなくば、冷媒量を自動的に感知し、そして補
給するメカニズムを備えることもできる。

図５及び図６に示したように、試料ホルダー１００は、
実際に組織試料を保持するのに使われる。典型的には、
凍結塔の周囲９９は、ジュワ瓶に含まれる液体窒素であ
る。重要な特性は、組織温度が一１４０℃を越えてはな
らないということである。凍結塔周囲９９から試料ホル
ダー１００への熱伝導性はその構造固有のものである。

ここでは特に図４が参考となる。

本発明の最も好ましい態様において、輻射加熱手段１２
５が与えられ、組織試料への輻射エネルギー源となる。

典型的には、輻射加熱手段は、加減抵抗器又はサーモス
タットによりコントロールする。コントロール・パネル
１０の要素１４で示されるような温度指示手段を用い、
その結果、その環境及び組織試料の温度を特別にコント
ロールすることができる。本発明の最も好ましい態様に
おいては、輻射加熱手段及び温度指示手段は、詳細に定
義した範囲内に、コンピュータのマイクロプロセッサに
より全てコントロールされている。

本発明の装置には、他の形のエネルギーも等しく有用で
ある。より特別な場合は、マイクロ波、ラジオ波、アコ
ースティック（ａｃｃｏｕｓｔｉｃ）・サウンド・ウェ
ーブ、可視光及び紫外又は近紫外光のような電磁エネル
ギー源が使用される。磁束も、上記の数多いエネルギー
のいずれかと、組合せた場合は特に有用である。上記の
ものとの組合せはその応用法や、装置に置かれる試料に
依存して使用される。試料の特性は、最終的に選択され
るエネルギー源を決定する上で最も重要である。

実際の運転においては、組織試料は、液体窒素温度、即
ち一１４０℃以下でガラス状化される。

さらにその組織を、予め冷却したピンセントを使って、
液体窒素温度の下、貯蔵ジュヮ瓶から試料ホルダー１０
０へと移す。

試料ホルダー１００を、予め冷却しておいた試料室９０
に置く。試料ホルダー１００から伸びている熱電対１０
２をスプール・ピース７０から下に伸びているメーティ
ング・ワイヤー１０４に接続する（図３参照）。同様に
、ヒーターワイヤー１０３を、スプール・ピース７０か
ら伸びているメーティング・フロースルー・ワイヤー１
０５に接続する。さらに標本室９０をコンフラツト・フ
ランジ７７を介してスプール７０に接続する。この接続
は、液体窒素浴中で行なわな（ではならない。それから
、メカニカル・ポンプ２１を動かし、そして試料室９０
を約Ｉ　Ｘ　１０−９ｍｂａｒに減圧（ラフにポンプで
引く）する。メカニカル・ポンプを試料室９０に連結し
ているバルブを閉じ、そして、ターボモレキュラー・ポ
ンプ３０及び試料室９０の間のメイン・バルブを開ける
。この時点で乾燥プロセスが始まる。

そのシステムを熱的に平衡化させ、一方、コントロール
・パネル１０中の装置により、常にモニターしつづける
。ターボモレキュラー・ポンプはおよそＩ　Ｘ　１０−
”ｍｂａｒからＩ　Ｘ　１０−”　ｍｂａｒの真空度に
まで引く。試料それ自身は、四極マススペクトロメータ
ーを含む残留ガス分析器１３によりモニターする。

組織が１から５時間、好ましくは２から４時間の量温度
変化しないと指示される平衡状態になった時、温度コン
トローラーを一１５０℃から一７０℃に上昇させる。好
ましくは、その温度を１時間当り１℃から少なくとも１
時間当り３℃の速度で上昇させる。最も好ましい態様に
おいては、その温度は、１時間当り１℃から１０℃の速
度で上昇させる。温度上昇後、その残留ガス分析器１３
が水蒸気の増加を示さない時、その組織は乾燥したと決
定する（典型的には一８５℃から一７０℃）。

さらにその温度を２５℃にまで上げる。その組織が２５
℃に到達したら、ジュワー瓶中の液体窒素レベルが落ち
、そして、試料室９０の外壁は室温にまで温まる。

随意にオスミウム蒸気をガラスを通して金属アダプター
９２に導入することができる。つづいてそのオスミウム
蒸気は、液体窒素トラップ中に再結晶により取除かれる
。また樹脂物質は、樹脂チャンバー９５から管９８を通
して加える。さらに、組織は樹脂を重合させるために取
り出される。

図１は本発明の装置の使用のだめのプロセスを図示して
いる。点線内に含まれる図１の個所は新規性は主張され
ない。これらのステップを実行するのに用いられる装置
のみ新しいものである。先の記述及び図１のフローチャ
ートから容易に理解されるように、本発明のエツセンス
はガラス化、分子蒸留、昇華、脱水及び組織平衡化であ
る。これは、これまで可能であると考えられてこなかっ
たプロセス及び結果である。本発明の装置の使用により
、これまで不可能であると考えられてきた医学的目標を
連成することができる。

これまで、ある詳しさで本発明の装置の好ましい態様が
述べられてきたが、種々の態様を、特別な最終的用途の
ために凍結調製装置を設計する人が容易に入手できるこ
とが望まれる。本発明の装置に関する記述は、本発明を
制限するつもりはなく、本発明の好ましい態様を単に説
明するためのものである。ここで述べたものと異なる修
正又は変化を含む、他の装置及び要素は本出願の範囲内
に等しく包含される。

試料ホルダー１００が試料室９０にぴったりと納まる大
きさに設計され、平衡化、昇華及び脱水の際、１つ以上
の組織試料を維持する投設することは、本発明の装置を
適正に機能させるために欠くことのできないことである
。本発明の装置において特別の有用性を示す試料ホルダ
ー１００は、図４．５及び６で特別に示されている。

さて、特に図５を参照してみると、試料ホルダー１００
は、金属固体塊、好ましくは、銅、銀、又は金及び銅、
銀及び金の合金からできている。

最も好ましい態様においては、金をメッキした銀と銅の
合金を用いている。金属塊１１０の１面に多くのウェル
１１１を作っである。輻射エネルギ一手段１２５は、ア
パーチャー１２６中に挿入する。ウェル１１１は組織の
リザーバーとなっている。凍結調製された組織試料を、
先に開示したように、予め冷却したビンセットで組織リ
ザーバー１１１中に個別に挿入する。

それから、組織試料をリザーバー・カバー１１３でカバ
ーする。リザーバー・カバー１１３は、ワイヤー・メツ
シュ・セクション１１４及び側壁１１５を含んでいる。

リザーバー・カバー１１３の構成がより特別な場合につ
いて、図６に示しである。ワイヤー・メツシュ・セクシ
ョン１１４は特殊な真空粘着物により側壁に付着してい
る。はとんどのハンダはガス放出性なので適当ではない
。

１１４のメツシュは細かければ細かい程、望ましいガス
の伝達はより効果的である。リザーバー・カバー１１３
もゲート・バルブ６０が開閉されたときのような、突然
の圧力変化から、組織試料を保護する機能を果たす。

テフロン■　スペーサは、固体の金属塊の外面の周辺に
断続的に置き、試料室９０の壁やその他の冷却した表面
から適当な間隔を与える。テフロン■　スリーブ１１９
を、中央のアパーチャー１２６へ通し、連結１０２及び
１０３を保護する。

熱電子の接続部は、試料ホルダー１００の最上部の面上
の１２２の個所である。試料ホルダー１００は、分析の
ための組織試料の凍結調製に適する大きさ及び構成で示
しであるが、この分野での通常の熟錬者は等しく試料ホ
ルダーを、より大きい組織物質又は他の形の組織に適す
るよう調製できることを理解すべきである。

事実上の実行においては、個々の組織試料をリザーバー
１１１中に置き、そしてリザーバー・カバー１１３を、
組織試料の上に挿入する。図５で説明されているように
、そのカバー１１３は、試料ホルダー１００の表面の上
にわずかに張り出させ、挿入又は除去の際、そのカバー
１１３を握む手段を提供する。本発明の最も好ましい態
様においては、スリット１１６は側壁中に位置し、カバ
ー１１３へある柔軟性与えて、再び挿入及び除去の助け
となる。カバー１１３のアパーチャー表面１１２は、リ
ザーバー１１２の壁土の不必要な湿気を形成することな
しに脱水及び昇華を可能にする。また、固体の金属塊１
１０を形成するのに用いられる物質は、銀、金及び、銅
、銀及び金の合金又は組合せ等の物質を等しく用いるこ
とができるが、銅がより好ましいと理解しなければなら
ない。固体金属塊の特徴となる機能は超低温を組織試料
に伝達し、そして本発明の凍結調製装置及び方法の超高
真空及び超低温条件下での性能特性を維持する能力であ
る。

輻射加熱手段１２５は図５に説明してあり、そして、組
織試料への輻射熱源を提供する。輻射熱手段１２５は、
コントロール・パネルｌＯによりコントロールする。コ
ントロール・パネル１０は輻射加熱手段の無数の変化を
可能にする。特に、温度リーダー／レコーダー１４及び
チャートレコーダー１５は、組織リザーバー１１２及び
その中の組織試料の温度の情報を維持し、またコントロ
ールする。特に、これまでに指摘してきたように、試料
温度及びその組織試料を囲む環境温度のコントロールは
、本発明の装置の効果的な機能に絶対欠くことはできな
い。

試料ホルダー１００の最も好ましい態様は図５に示しで
ある。最も好ましい態様には、アパーチャー１２６中に
示されている輻射加熱手段１２５が含まれる。最も好ま
しい形の輻射加熱手段１２５は２２０ボルト／１００ワ
ツトのカートリッジ・ヒーターである。加熱システムは
、標本への輻射エネルギーの効率的伝達を可能にする物
質で、リザーバー・カバー１１３の側壁１１５の内部の
（スペクトル性（Ｓｐｅｃｔｒａｌ）に）研磨した面を
コーティングすることでより効果的となる。このように
、好ましい銅の態様においては、その壁１５５は硫化カ
リウムで処理し、その内面壁を黒くし、そして、組織試
料のコントロールした輻射加熱するためのメカニズムを
提供する。ある態様においては、ウェル１１１の内面は
同様にスペクトル（Ｓｐｅｃ　ｔｒａ　１）性である。

このように、輻射加熱手段、即ちカートリッジ・ヒータ
ー１２５は温度リーダー／レコーダーによりコントロー
ルされる。その加熱メカニズムは、手動、又好ましくは
プログラマブル・コンピューターもしくは、マイクロプ
ロセッサにより選択的に活性化し、望ましい温度又は温
度変化速度を維持する。加熱により、金属塊１１０が熱
エネルギーを組織リザーバーに導き、そして、その熱エ
ネルギーは、リザーバー・カバー１１３そして、または
側壁１１５上のスペクトル（Ｓｐｅｃｔｒａｌ）　　：
ｌ−ティングにより吸収される。それで、このスペクト
ルコーティングは、組織試料への輻射熱源として働く。

本発明の標本ホルダーの好ましい態様はある程度詳しく
これまでに述べてきたが、種々の態様は特別な最終用途
のための装置を設計する人が容易に使用することができ
るのが適当である。本発明の好ましい試料ホルダーの記
述は、本発明を制限するものではなく、本発明の好まし
い態様を単に説明することを意図したものである。これ
までに述べてきたものに修正又は変化を取り込んだ他の
標本ホルダーも等しく本発明に含まれる。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の装置の使用に関する方法の図式フローダ
イアグラムである。 図２は、本発明の装置の図である。 図３は、試料室へ真空手段を連結する、本発明の装置の
一部分の分解図である。 図４は、本発明の試料室及び試料ホルダーの分解図であ
る。 図５は、本発明の試料ホルダーの図である。 図６は、本発明の試料ホルダーで用いる組織リザーバー
・カバーの図である。 手続補正書（方式） １．事件の表示　　　昭和６２年特許願第２７８９９４
号２・鼾″鱈　　　　耀澹鵜貧誓￥Ｗ濤Ｒ告冑Ｖ組織を
３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）生物学的組織試料をガラス状化し、（ｂ）
   上記試料の周囲の空気を減圧し、 （ｃ）上記ガラス化組織試料を−１４０℃以下の温度に
   平衡化し、 （ｄ）上記試料の平衡状態を維持しつつ、上記ガラス化
   試料を脱水する 以上の工程を含む、超構造分析のための生物学的組織試
   料を凍結調製する方法。
2. （２）上記ガラス状化を−１４０℃以下の温度で行う、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）上記ガラス状化に液体窒素を用いる、特許請求の
   範囲第２項記載の方法。
4. （４）上記ガラス状化を１秒以内に完了する、特許請求
   の範囲第３項記載の方法。
5. （５）上記真空度が少なくとも３×１０＾−＾９ｍｂａ
   ｒである、特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）上記真空度を３００分間以内に達成する、特許請
   求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）上記ガラス状化組織試料の平衡化の指標に定常温
   度を用いる、特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）上記定常温度が−１４０℃から−１９６℃の範囲
   内にある、特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）上記脱水を昇華によって行う、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
10. （１０）上記脱水を、第二のエネルギー源からのエネル
    ギー付加により促進させる、特許請求の範囲第９項記載
    の方法。
11. （１１）上記第二のエネルギー源が熱源である、特許請
    求の範囲第１０項記載の方法。
12. （１２）上記第二のエネルギー源が輻射源である、特許
    請求の範囲第１０項記載の方法。
13. （１３）上記輻射エネルギーが核磁気共鳴による、特許
    請求の範囲第１２項記載の方法。
14. （１４）上記輻射エネルギーが、レーザーによって作ら
    れ、ファイバーオプティクスにより伝達される赤外線で
    ある、特許請求の範囲第１０項記載の方法。
15. （１５）（ａ）生物学的組織中の水をガラス状化するの
    に十分な速度で、かつ十分な温度に、上記組織を高速に
    冷却する工程、及び （ｂ）上記ガラス状態の組織から直接蒸発させることに
    より、上記水を除去する工程、 上記工程（ａ）、（ｂ）を含む、生物学的組織を凍結調
    製する方法。
16. （１６）（ａ）生物学的組織中の水をガラス状化するの
    に十分な速度で、かつ、十分な温度に上記組織を高速に
    冷却する工程、 （ｂ）上記ガラス状化水を含む上記組織を、そのガラス
    状態の組織から直接上記水が蒸発できる真空度及び温度
    の組合せ条件に付す工程、及び （ｃ）上記ガラス状態の組織から直接、上記ガラス状化
    した水を蒸発させることにより、上記組織を脱水するの
    に十分な速度で、かつ十分な量のエネルギーを上記組織
    にゆっくりと供給する工程、 上記工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を含む、生物学的組織
    を凍結調製する方法。