JPS6320440B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新抗生物質ネオビリドグリゼイン−
MP（Neoviridogrisein−MP）及びその製造法に
関する。 本発明者らは、ストレプトマイセスSP.P8648
（Streptomyces sp.P8648）ATCC31289を培養
し、その培養物中から次の一般式（） 式中、R₁が水素原子でR₂がエチル基を表わす
（ネオビリドグリゼイン）；R₁が水素原子でR₂
がメチル基を表わす（ネオビリドグリゼイン
）；R₁が水酸基でR₂がエチル基を表わす（ネオ
ビリドグリゼイン）、で示される新抗生物質ネ
オビリドグリゼイン類を製造し、それぞれを単離
することに成功し、開示した（例えば、特公昭55
−3339号公報参照）。本発明者等は、さらに有用
なネオビリドグリゼインアナログを見い出すべく
研究を進めた結果４−メチルプロリン又は４−メ
チルプロリン含有物を栄養培地中に添加し培養す
ることにより新抗生物質ネオビリドグリゼイン−
MPを蓄積、生産させる事に成功し本発明を完成
した。 すなわち本発明はネオビリドグリゼイン類を生
産する能力のあるストレプトマイセス属に属する
菌株を培養し、培地中に４−メチルプロリン又は
その含有物を添加して生じる新抗生物質ネオビリ
ドグリゼイン−MPに関するものである。 まず、ビリドグリゼイン、ネオビリドグリゼイ
ン生産菌を用いて本発明の抗生物質ネオビリドグ
リゼイン−MPを製造する方法を述べる。ネオビ
リドグリゼイン−MPを生産するにはビリドグリ
ゼイン、ネオビリドグリゼイン類生産能を有する
菌株、例えばストレプトマイセスグリゼオビリデ
イスATCC23920、ストレプトマイセス sp.
P8648ATCC31289（微工研菌寄第3562号）および
それらの変異株等を生産に適した栄養培地に接種
し、これを20℃〜33℃好ましくは24〜30℃で２日
ないし14日好気的に培養し、その培養物中より抽
出単離精製する。培地成分としては、ストレプト
マイセス属に属する菌株の培養に用いられる公知
のものが使用できる。適当な炭素源、例えば溶性
でん粉、グルコース、およびシユークロース等、
窒素源、例えば、大豆粉、綿実粕、乾燥酵母等、
無機塩、例えば第二りん酸カリウム、食塩等より
なる培地へ適当濃度の４−メチルプロリン又は４
−メチルプロリン含有物を添加して培養を行な
う。培養は好気的条件下20℃〜33℃好ましくは24
〜30℃で行ない培養開始および培養中PHを5.5〜
8.0に調節する事が望ましい。 培養液中に蓄積した抗生物質ネオビリドグリゼ
イン−MPおよびそれを含むネオビリドグリゼイ
ン類はデプシペプタイド抗生物質を単離するため
の公知の方法および本物質の物性に基づく各種の
精製法により単離できる。又、必要に応じてネオ
ビリドグリゼイン類混合物として又はこれらとグ
リゼオビリデインとの混合物としても回収する事
ができる。 例えば、培養液中に存在するネオビリドグリゼ
イン−MPを含むネオビリドグリゼイン類は、ベ
ンゼン、トルエン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ｎ
−ブタノール、メチレンクロライド、クロロホル
ム、メチルイソブチルケトン等の難水溶性有機溶
剤により抽出される。有機溶剤による抽出法のほ
か活性炭、アンバライトXAD（ロームアンドハー
ス社製）等による吸脱着、セフアデツクスLH−
20（フアルマシア社製）等によるゲルろ過、アル
ミナ．シリカゲルによる吸着クロマト等をカラム
法又は薄層法により適宜組み合せて使用し回収す
る事ができる。場合によつて適当な溶媒を用いた
向流分配法も併用し回収精製する事ができる。 次に本発明のネオビリドグリゼイン−MPの物
理化学的性状について述べる。 ネオビリドグリゼイン−MPはメタノール、エ
タノール、プロパノール、ｎ−ブタノール、ジオ
キサン、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトン、メ
チルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ベ
ンゼン、トルエン、メチレンクロライド、クロロ
ホルム、四塩化炭素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルフオキサイド、ジエチルエー
テルに可溶、水、イソプロピルエーテルに難溶、
石油エーテル、ヘキサンに不溶の白色無定形固体
である。 ネオビリドグリゼイン−MPは水溶液中PH9.0以
下では37℃以下の温度で１カ月は安定である。
又、60℃30分処理の場合PH2.5〜8.0の範囲で安定
である。 メタノール中で測定した紫外線吸収極大ならび
にその波長におけるＥ１％ 1cm値（カツコ内）は
305nm（90）である。又0.1Nメタノール性カ性ソ
ーダ溶液中での紫外線吸収極大ならびにその波長
におけるＥ１％ 1cm値（カツコ内）は340nm（86）で
ある。 臭化カリウム錠剤法で測定したネオビリドグリ
ゼイン−MPの特徴的赤外線吸収極大は次に示め
す波数に認められる。 3350，2950，2920，2870，1740，1670（sh），
1630，1575（sh），1520，1460，1405，1380，
1365，1320（sh）cm^-1 質量分析法でもとめた分子量は876である。 メルク社製シリカゲルプレート60F254を用い
て上昇法で展開した薄層クロマトグラフイーによ
るR_f値を次に示めす。 １ 溶媒系１（クロロホルム：メタノール＝30：
１）の場合 ネオビリドグリゼイン−MP R_f0.40 ネオビリドグリゼイン（対称） R_f0.35 ２ 溶媒系２（ベンゼン：酢酸エチル：メタノー
ル：酢酸：水＝50：50：10：10：３）の場合 ネオビリドグリゼイン−MP R_f0.65 ネオビリドグリゼイン（対照） R_f0.60 ネオビリドグリゼイン−MPを6N塩酸中110℃
16時間加水分解し濃縮乾固して充分塩酸を除き、
薄層クロマトグラフイー（アビセルセルロース
SFフナコシ薬品社製を用いｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：１の溶媒系又はメタノール：ピ
リジン：水＝80：３：20の溶媒系を用いて展開）、
高圧ろ紙電気泳動（東洋ろ紙No.51A、東洋ろ紙社
製を用いギ酸：酢酸：水＝25：75：900のPH1.8緩
衝液を用い０℃で60分間、60V／cmで通電）およ
びアミノ酸分析計（日立製835−50型）にかけて
アミノ酸分析を行なつた所、次に示めすアミノ酸
及び有機酸、スレオニン、ロイシン、４−メチル
プロリン、アラニン、サルコシン、フエニルサル
コシン、β，Ｎ−ジメチルロイシンと３−ヒドロ
キシピコリン酸が検出された。 これらのうち３−ヒドロキシピコリン酸は、薄
層クロマトグラフイー（メルク社製シリカゲルプ
レート60F254を使用しクロロホルム：メタノー
ル＝２：１で展開した場合R_f値0.46、アビセルセ
ルロースSF、フナコシ薬品製を用い、ｎ−ブタ
ノール：酢酸：水＝４：１：１で展開した場合
R_f値0.60で標準サンプルのR_f値と一致）および質
量分析でその存在を確認した。 以上の結果を総合してネオビリドグリゼイン−
MPの化学構造は次式（） と決定された。 引き続き当該物質の生物学的性質を挙げ、その
有用性を述べる。 ネオビリドグリゼイン−MPは他のネオビリド
グリゼイン類と同様広い抗菌スペクトルを示めす
が、in vitro試験においてスタフイロコツカスア
ウレウス（Staphylococcus aureus）およびその
耐性菌を含めたぶどう球菌、ならびにストレプト
コツカス ニユーモニエ（Streptococcus
pneumoniae）等の肺炎球菌に対して強い抗菌力
を示めす。 ネオビリドグリゼイン−MP，およびの寒
天希釈法で行なつた各種微生物に対する最小阻止
濃度を次表に示めす。

【表】 またネオビリドグリゼイン−MPは他のネオビ
リドグリゼイン類と同様グリゼオビリデインとの
間に相乗作用を示めす。これは、ネオビリドグリ
ゼイン−MP、グリゼオビリデイン単独では阻止
円を示めさない濃度をペーパーデイスクにつけ被
験菌を接種した寒天培地上に一定の距離をおいて
置き一夜培養した時に、各々のデイスク周辺では
阻止円が認められず両者の中間に阻止円を生じる
事から明らかである。それ故、本発明の新抗生物
質ネオビリドグリゼイン−MPは単独でも有効な
抗生物質であるが、グリゼオビリデインと混合す
る事により一層有効な抗生物質となる。実用上は
各物質を分離することなくネオビリドグリゼイン
類−グリゼオビリデインの混合物として利用でき
る。 次に本発明の実施例をあげ、本発明をより具体
的に示す。 実施例 １ 可溶性でん粉2.0％、酵母エキス0.2％、麦芽エ
キス0.2％、大豆粉0.1％（PH6.8に調整）からなる
培地50mlを250ml容三角フラスコに入れ、殺菌後
ストレプトマイセスsp.P8648FERMP−3562
（ATCC31289）を接種し、28℃で72時間ロータリ
ー振盪培養してこれを種母とした。可溶性でん粉
2.0％、Ｌ−アスパラギン0.5％、４−メチルプロ
リン0.01％、食塩0.1％、りん酸第二カリウム0.1
％、硫酸マグネシウム0.05％、硫酸亜鉛0.01％、
塩化マンガン0.001％（PH6.8に調整）からなる培
地20mlを100ml容三角フラスコに入れ殺菌後種母
を0.2ml接種し28℃で120時間ロータリー振盪培養
を行なつた。菌体を遠心分離で除去し、上清液を
５mlの酢酸エチルで二回抽出した。 酢酸エチル層を無水硫酸ソーダで脱水後濃縮乾
固し、これを0.5mlのベンゼンに溶解して調製用
薄層クロマトグラフイー（メルク社製シリカゲル
プレート60F254を用いクロロホルム：メタノー
ル＝30：１で展開）を行なつた。ネオビリドグリ
ゼイン−MP部分を3650Åの紫外線を照射して検
出しかき取つた。かき取つたシリカゲルから10ml
のメタノールで抽出し乾固した。それをメチレン
クロライドに溶解後ろ過して不溶物を除去し濃縮
乾固して100mcgを得た。 これを少量のベンゼンに溶解して薄層クロマト
グラフイーを行なつた。 プレートはメルク社製シリカゲルプレート
60F254を用いて、クロロホルム：メタノール＝
30：１およびベンゼン：酢酸エチル：メタノー
ル：酢酸：水＝50：50：10：10：３でそれぞれ展
開した。展開後溶媒を風乾して除き、スタフイロ
コツカス アウレウス（Staphylococcus
aureus）209Pを検定菌としてバイオオートグラ
フイーを行なつた所、それぞれR_f値0.40，0.65に
単一の生育阻止帯を与えた。 実施例 ２ 可溶性でん粉2.0％、酵母エキス0.2％、麦芽エ
キス0.2％、大豆粉0.1％（PH6.8に調整）からなる
培地50mlを250ml容三角フラスコに入れ殺菌後ス
トレプトマイセスsp.P8648FERM P3562
（ATCC31289）を接種し28℃、３日間ロータリー
振盪培養してこれを種母とした。可溶性でん粉
2.0％、Ｌ−アスパラギン0.5％、食塩0.1％、第二
りん酸カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.05％、
硫酸亜鉛0.01％、塩化マンガン0.001％（PH6.8に
調整）からなる培地50mlを250ml容三角フラスコ
に入れ殺菌後上記種母を１ml接種し28℃にてロー
タリー振盪培養を行なつた。24時間後に殺菌した
４−メチルプロリンを0.1％になる様添加し培養
を継続した。接種後６日間培養し培養液をろ過し
て48mlのろ液を得た。ろ液のPHを7.5に調整後20
mlの酢酸エチルで２回抽出し濃縮乾固した。 それを2.5mlのベンゼンに溶解した後ろ過して
不溶物を除去した。ベンゼン溶液10μをメルク
社製シリカゲル60F254薄層プレートにスポツト
しクロロホルム：メタノール＝30：１で展開後島
津製作所製TLC−クロマトスキヤナーCS−910で
定量したところ下表に示めす値を得た。

【表】 本実施例で４−メチルプロリンを添加しない区
は、４−メチルプロリンを添加しない他は同様に
処理した。 実施例 ３ 実施例２で述べたベンゼン溶液をメルク社製シ
リカゲル60F254薄層プレートにスポツトし調製
用薄層クロマトグラフイーを行なつた。展開はク
ロロホルム：メタノール＝30：１で行なつた。展
開後3650Åの紫外線を照射してネオビリドグリゼ
イン類を検出しネオビリドグリゼイン−MP部分
をかき取つた。かき取つたシリカゲルより10mlの
メタノールで抽出しそれを乾固した。さらに、乾
固物を５mlのメチレンクロライドに溶解しろ過に
て不溶物を除去した後に乾固してネオビリドグリ
ゼイン−MPの単一標品を２mg得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記式 で示されるデプシペプタイド抗生物質ネオビドグ
   リゼイン−MP。