JPS63148994A - Monoclonal antibody, hybridoma, production of monoclonal antibody and separation of human protein s - Google Patents
Monoclonal antibody, hybridoma, production of monoclonal antibody and separation of human protein sInfo
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- JPS63148994A JPS63148994A JP61296766A JP29676686A JPS63148994A JP S63148994 A JPS63148994 A JP S63148994A JP 61296766 A JP61296766 A JP 61296766A JP 29676686 A JP29676686 A JP 29676686A JP S63148994 A JPS63148994 A JP S63148994A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
a、産業上の利用分野
本発明はヒト・プロテインSを特異的に認識し結合する
モノクローナル抗体、ヒト・プロテインSとヒト補体系
制御因子のC4b結合タンパク(C4b bindi
ng protein ; C4bp)との複合体を
特異的に認識し、結合するヒト・プロテインSに対する
モノクローナル抗体、これらの抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ、これら抗体の17 ’4方法及びヒト・プロテ
インSの分離方法に関する。Detailed Description of the Invention a. Industrial Application Field The present invention is directed to a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to human protein S, a C4b binding protein (C4b bindi) of human protein S and human complement system regulator.
ng protein; C4bp) that specifically recognizes and binds to the complex with human protein S, hybridomas that produce these antibodies, 17'4 methods for these antibodies, and methods for separating human protein S. .
b、従来技術
プロティンSはプロティンCと同様にビタミンに依存性
蛋白で、1977年D; りcipioらによりウシと
ヒトから分離された[Di 5cipio 、 R。b. Prior art Protein S, like protein C, is a vitamin-dependent protein and was isolated from cows and humans by Dicipio et al. in 1977 [Di 5cipio, R.
G、計1ermodson、 M、 A、、Yat
es、 3. G、 andDavie、 E、
W、 : Biochenistry 、、16:
698〜706、 (1977)参照]。G, total 1ermodson, M, A,, Yat
es, 3. G. andDavie, E.
W.: Biochenistry,,16:
698-706, (1977)].
ヒト・プロテインSはヒト血漿中には約10rng7/
Ω含まれ、分子量約69,000の一本鎖の糖蛋白であ
る。また、他のビタミンに依存性因子とのその構造はよ
く似ており、NH2末端に約10個のγ−力ルボキシグ
ルタミン酸(Gla)を有している。プロティンSは血
中では2つの形で存在する。その1つはフリーのプロテ
ィンSであり、このフ・り一のものが、活性化プロティ
ンCの補助因子として動く。もう1つは、補体系の制御
因子である高分子C4b結合タンパク(以下このタンパ
クをC4bp”と略称することがある)と非共有結合し
て存在する。このフリーと結合(bt+und ) し
ているプロティンSの比率はほぼ1:1とされている。Human protein S is present in human plasma at approximately 10rng7/
It is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of approximately 69,000. In addition, its structure is very similar to that of other vitamin-dependent factors, and it has about 10 γ-ruboxyglutamic acid (Gla) groups at the NH2 terminal. Protein S exists in two forms in the blood. One of them is free protein S, and this free protein acts as a cofactor for activated protein C. The other exists in a non-covalent bond with the polymeric C4b-binding protein (hereinafter this protein may be abbreviated as "C4bp"), which is a regulator of the complement system. The protein S ratio is said to be approximately 1:1.
このヒト・プロテインSの機能の重要性はリン脂質の陰
性荷電表面と非常に親和性強いことにある[Ne1se
stuen 、 G、 L、、K15iel 、 W、
and[)i 3cipio 、 R,G、 :
3iochemistry 、 17;2134〜21
38. (1978) ]。The importance of this function of human protein S is that it has a very strong affinity for the negatively charged surface of phospholipids [Ne1se
stuen, G., L., K15iel, W.
and[)i 3cipio, R,G, :
3iochemistry, 17; 2134-21
38. (1978)].
細胞が傷害されたり又は活性化を受(プると、Ca2゛
の存在下でプロティンSのQ Ia−、domainは
リン脂質に結合し、さらにこのプロティンSにC4bp
が複合体を形成して結合してその機能を発揮するものと
考えられている[[)ahlbjck 、 B、:Se
m1n、 Thromb 、 HaelnO3taS、
、10: 139〜148゜(1984) ]。When cells are injured or activated, the QIa-, domain of protein S binds to phospholipids in the presence of Ca2, and C4bp also binds to this protein S.
It is thought that they form a complex and combine to exert their functions [[)ahlbjck, B,:Se
m1n, Thromb, HaelnO3taS,
, 10: 139-148° (1984)].
プロティンS、プロティンCの凝固、PJ溶系に関する
機能については、最近の研究からその制御機構に関して
極めて重要な@Jさをしていることが解明され、その生
理的意義についても血栓症との関わりで注目されている
。プロティンSの先天性欠乏は血栓症の原因となり得る
ことが報告されている[Comp 、 P、 C,、N
1xon、 R,R1゜Cooper 、 M、 R,
and Esmon、 C,T、 : J。Regarding the functions of protein S and protein C related to coagulation and PJ lysis system, recent research has revealed that they play an extremely important role in the control mechanism, and their physiological significance has also been investigated in relation to thrombosis. Attention has been paid. It has been reported that congenital deficiency of protein S can cause thrombosis [Comp, P, C,,N
1xon, R, R1゜Cooper, M, R,
and Esmon, C.T.: J.
CIin 、 I nvest 、 74: 20
82〜2088. (1984) ] 。CIin, Invest, 74: 20
82-2088. (1984) ].
したがって、プロティンSの作用機構を明らかにし、ま
た、プロティンSの血中における抗原m。Therefore, the mechanism of action of protein S was clarified, and the antigen m of protein S in blood was clarified.
活性量を測定し、その動向を把握することができれば、
されは基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な
意味を持つと考えられる。If we can measure the amount of activity and understand its trends,
This is considered to have a very important meaning in the fields of basic medicine and clinical medicine.
一方モツクローナル抗体は単一の抗原決定基に対して特
異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的に
産生できるという利点から抗原蛋白質の機能及び構造の
解析あるいは免疫測定(EIA、RIA)に近年、一般
的に広く利用されるようになって来た。特に抗原蛋白質
の機能解析。On the other hand, motuclonal antibodies are specific for a single antigenic determinant, and have the advantage of being able to stably produce antibodies with the same specificity. RIA) has recently become widely used in general. Especially functional analysis of antigen proteins.
分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位、または特
殊な構造部位を認識する抗体を見出すことが有力な手段
となり1りる。A powerful means for molecular analysis is to find antibodies that recognize sites involved in the function of antigenic proteins or special structural sites.
そこぐ本発明者らは、プロティンSが補体系の制御因子
であるC4b結合タンパク(C4bp)と複合体を形成
することに着目し、フリーのプロティンSとプロティン
SとC4bpの複合体とを選択的に認識するモノクロー
ナル抗体について研究を進めた結果、本発明に到達した
。The present inventors focused on the fact that protein S forms a complex with C4b binding protein (C4bp), which is a regulator of the complement system, and selected free protein S and a complex of protein S and C4bp. As a result of conducting research on monoclonal antibodies that recognize
C8発明の構成
すなわち、本発明はプロティンSに対して特異的に結合
するモノクローナル抗体、ならびにC4bp−プロティ
ンSに対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド
ーマを培養し、その産生物から前記ヒト・プロテインS
に対するモノクローナル抗体を得るヒト・プロテインS
に対するモノクローナル抗体の製造方法である。Structure of the C8 Invention That is, the present invention involves culturing a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to protein S and a monoclonal antibody to C4bp-protein S, and extracting the human protein S from the resulting product.
Obtaining monoclonal antibodies against human protein S
This is a method for producing monoclonal antibodies against.
さらに他の本発明は、ヒト・プロテインSに対するモノ
クローナル抗体を不溶性担体と結合させた吸着体に、ヒ
ト・プロテインS含有混合物を接触せしめて、該吸着体
にヒト・プロテインSを結合せしめることを特徴とする
ヒト・プロテインS含有混合物からのヒト・プロテイン
Sの分離方法である。Still another feature of the present invention is that a human protein S-containing mixture is brought into contact with an adsorbent in which a monoclonal antibody against human protein S is bound to an insoluble carrier, so that human protein S is bound to the adsorbent. This is a method for separating human protein S from a human protein S-containing mixture.
本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
細胞はケーラーとミルシュタインの方法[K 6hle
r & M 1lstein ; N atu
re :ユ阻。Hybridoma cells producing the monoclonal antibodies of the present invention can be prepared by the method of Köhler and Milstein [K6hle
r&M 1lstein; N atu
re: Yu-sei.
495−497(1975) ]としてそれ自体知られ
た方法によって得られる。すなりら、ヒl−・プロティ
ンSでマウスを免疫した後、このマウスの牌臓細胞をマ
ウスミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドー
マ細胞はマイクロタイタープレートに固定されたヒト・
プロテインSど反応する抗体に対し、系統的に検査し、
選択される。495-497 (1975)] by a method known per se. After immunizing a mouse with Hi-Protein S, the spleen cells of the mouse were fused with mouse myeloma cells, and the resulting hybridoma cells were immobilized on a microtiter plate.
Systematically tested for antibodies that react with protein S,
selected.
本発明のモノクローナル抗体はかかる新規なハイブリド
ーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒト・プロディ
ンSに対し、特異的に作用する。The monoclonal antibodies of the present invention are obtained from products produced by such novel hybridoma cells, and act specifically against human prodin-S.
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト・プロテインSに
対し高度に特異的に結合する性質を有するため、ヒト・
プロテインSの分離・精製に利用覆る場合、非常に右利
である。すなわち、不溶性担体に本発明におけるモノク
ローナル抗体の1種類を固定化し、結晶または、他のヒ
ト・プロテインS@有混合物、あるいはそれらの粗抽出
物、粗精製物および溶液からヒト・プロテインSを吸着
。The monoclonal antibody of the present invention has the property of highly specific binding to human protein S.
It is very useful when used for the separation and purification of Protein S. That is, one type of monoclonal antibody according to the present invention is immobilized on an insoluble carrier, and human protein S is adsorbed from crystals, other human protein S@containing mixtures, or crude extracts, crude purified products, and solutions thereof.
分離し、適当な緩衝液(例えば20mM Tris
−HCア、 0.5M Na CR,pH7,4)
テ洗浄後、溶液をカオトロピックイオンを含む溶液3
M Na5CN I)87.0)に置き換えてヒ
ト・プロテインSを溶出することができる。Separate and add in a suitable buffer (e.g. 20mM Tris
-HCa, 0.5M Na CR, pH 7,4)
After washing, transform the solution into solution 3 containing chaotropic ions.
Human Protein S can be eluted by replacing M Na5CN I)87.0).
次に本発明におけるモノクローナル抗体を製造する具体
的方法について詳細に説明する。Next, a specific method for producing a monoclonal antibody according to the present invention will be explained in detail.
A、JJの単離・精−:
抗原に用いるヒト・プロテインSは、B ajajらの
方法[Bajaj SP、Rapaport Sr
。Isolation and purification of A, JJ: Human protein S used as an antigen was prepared by the method of Bajaj et al. [Bajaj SP, Rapaport Sr.
.
Maki SL 、 Brown SF : Pr
ep 、 Biochem。Maki SL, Brown SF: Pr
ep, Biochem.
13、 191. (1983) ]によりヒト・血
漿から単離・精製される。13, 191. (1983)] was isolated and purified from human plasma.
B、ヒト・プロテインSによるマウスの免疫:11Ba
lb/Cマウスを用いることができるが他の系(Str
ain)のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画
、及びヒト・プロテインSの濃度は十分な最の抗原刺戟
を受けた、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに50μ3のヒト・プロテインSを2
週間間隔で腹腔に3回免疫の後、さらに30μびを静脈
に投与づる。B. Immunization of mice with human protein S: 11Ba
Although lb/C mice can be used, other strains (Str
ain) mouse may be used. The immunization regimen and the concentration of human protein S should then be chosen so that lymphocytes with sufficient antigenic stimulation are formed. For example, 50 μ3 of human protein S was given to mice for 2 days.
After three intraperitoneal immunizations at weekly intervals, an additional 30 μl of the vaccine is administered intravenously.
最終免疫の数日後に融合の為に牌臓細胞をとり出す。A few days after the final immunization, spleen cells are removed for fusion.
Ω−」L1屡」L二
上記の如く免疫したマウスの牌臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの牌臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。牌臓細胞対、骨髄腫
細胞の好ましい比率は約20:1〜約2;1の範囲であ
る。約108個の牌臓細胞についで0.5〜1.5−の
融合媒体の使用が適当で市る。Ω-"L1 屡"L2 The spleen of the mouse immunized as above was removed aseptically.
From there, prepare a single cell suspension. These spleen cells are fused with mouse myeloma cells from an appropriate line using an appropriate fusion promoter. A preferred ratio of splenic cells to myeloma cells ranges from about 20:1 to about 2:1. For approximately 108 spleen cells, use of 0.5-1.5 fusion media is suitable.
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知られてい
るが、本発明では、P 3− X63−”Ag8−Ul
細胞(P3−U 1 ) [Yelton 、 D、
E。Mouse myeloma cells used for cell fusion are well known, but in the present invention, P3-X63-"Ag8-Ul
Cell (P3-U1) [Yelton, D,
E.
et al、 Current、Topics in
Microbiologyand l mmu
nology 、 81. 1 (1978)参照]を
用いj;。et al, Current, Topics in
Microbiology and l mmu
nology, 81. 1 (1978)].
好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子1+o
oo〜4000のポリエチレングリコールを有利に使用
できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を使
用することもできる。本発明においては、平均分子ff
i 1540のポリエチレングリコールを用いた。Preferred fusion promoters include, for example, an average molecular weight of 1+o
Polyethylene glycols from 0 to 4000 can be advantageously used, although other fusion promoters known in the art can also be used. In the present invention, the average molecule ff
i 1540 polyethylene glycol was used.
D、融合した細 の ;
別の容器内(例えばマイクロタイタープレート)で未融
合の牌臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間(約1週間)培養する。培地は
、薬物抵抗性(例えば8−アザグアニン抵抗性)で未融
合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、(例えばHA
T培地)が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の牌臓細胞は非腫瘍
性細胞なので、ある一定期間後(1週間後)死滅する。D, fused cells; mix the unfused spleen cells, unfused mouse myeloma cells, and fused hybridoma cells in a separate container (e.g., microtiter plate) without supporting the unfused mouse myeloma cells. Dilute with selective medium and culture for a sufficient time (about 1 week) to kill unfused cells. The medium should be one that is drug resistant (e.g. 8-azaguanine resistant) and does not support unfused mouse myeloma cells (e.g. HA
T medium) is used. In this selective medium, unfused myeloma cells die. Since these unfused spleen cells are non-tumor cells, they die after a certain period of time (one week).
これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍
性と、親稗細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中で
生存できる。Cells fused to these cells have both the tumor properties of the parent cells of myeloma and the properties of the parent flimsy cells, so they can survive in the selective medium.
E、各容器中のヒト・プロテインSに対する抗体の確認
;
かくして、ハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、ヒト・プロテインSに対する抗体につ
いて酵素免疫定量法(F nzymeL 1nked
l mmunosobent A 5Say)によ
りスクリーニングする。E. Confirmation of antibodies against human protein S in each container; thus, after hybridoma cells are detected, their culture supernatants are collected and analyzed for antibodies against human protein S by enzyme immunoassay (FzymeL 1nked).
1 mmunosobent A 5Say).
目的の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を適当な方法
(例えば限界希釈法)でクローン化すると、抗体は2つ
の異なった方法で産生される。その第1の方法によれば
、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。Once a hybridoma cell producing the antibody of interest is cloned by an appropriate method (eg, limiting dilution), the antibody can be produced in two different ways. According to the first method, monoclonal antibodies produced by hybridoma cells can be obtained from the culture supernatant by culturing hybridoma cells in an appropriate medium for a certain period of time.
第2の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺伝子
、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射すること
ができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中
より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナ
ル抗体を得ることができる。According to a second method, hybridoma cells can be injected into the peritoneal cavity of isogenic or semi-isogenic mice. Monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells can be obtained from the blood and ascites of the host animal after a certain period of time.
前記ヒト・プロテインSに対するモノクローナル抗体を
不溶性担体に固定化又は結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬又は測定用キットの基材として一般的
に使用されるものであればよい。例えば材質としてセフ
ァローズ、ポリアクリルアミド、セルロース、デキスト
ラン、またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの混合物
が好ましく用いられる。これら不活性担体の形態として
は、粉末状2粒状、ペレット状、ビーズ状。The monoclonal antibody against human protein S is immobilized or bound to an insoluble carrier to obtain an adsorbent. The insoluble carrier used in this case may be one that is commonly used as a base material for measurement reagents or measurement kits using monoclonal antibodies. For example, Sepharose, polyacrylamide, cellulose, dextran, maleic acid polymer, or a mixture thereof is preferably used as the material. These inert carriers may be in the form of two powders, pellets, or beads.
繊維状など種々の形態であることができる。また一般に
血漿、またはその分画成分の測定や分離に用いられる多
数の凹状のくぼみを有するプレート(ウェル)を用いる
ことが有利である。It can be in various forms such as fibrous. Furthermore, it is advantageous to use a plate (well) having a large number of concave depressions, which is generally used for measuring or separating plasma or its fractionated components.
前記吸着体を用い、これにヒト・プロテインS含有混合
物を接触せしめると、該吸着体に固定したモノクローナ
ル抗体とヒト・プロテインSとが結合して、結果的にヒ
ト・プロテインSが該吸着体に結合する。かくすること
によりヒト・プロテインSを分離、除去することが可能
である。When the human protein S-containing mixture is brought into contact with the adsorbent, the monoclonal antibody immobilized on the adsorbent binds to human protein S, and as a result, human protein S is attached to the adsorbent. Join. In this manner, human protein S can be separated and removed.
又前記の如くしてヒト・プロテインSを吸着体に結合さ
せ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、次いで吸
着体に結合したヒト・プロテインSをカオトロピックイ
オン(SCN−)等を含む適当な溶液と接触又は洗滌す
ると、ヒト・プロテインSは該吸着体から離脱し、これ
を単離することによって、ヒト・プロテインSを単離す
ることができる。In addition, human protein S is bound to the adsorbent as described above, the residual mixture is washed away if possible, and then the human protein S bound to the adsorbent is treated with a suitable solution containing chaotropic ions (SCN-), etc. When contacted with or washed with a suitable solution, human protein S detaches from the adsorbent, and by isolating it, human protein S can be isolated.
かくして前記本発明の分離法によれば、ヒト・プロテイ
ンSを含有する混合物からのヒト・プロテインSの除去
、該混合物からのヒト・プロテインSの分離及び精製、
該混合物中のヒト・プロテインSの含有量の測定などが
極めで簡単な操作で達成される。Thus, according to the separation method of the present invention, removal of human protein S from a mixture containing human protein S, separation and purification of human protein S from the mixture,
Measurement of the content of human protein S in the mixture can be accomplished with extremely simple operations.
以下実施例を上げ本発明の詳細な説明する。以下実施例
ではプロティンSをPSと略称することがある。The present invention will be described in detail below with reference to Examples. In the following examples, protein S may be abbreviated as PS.
実施例1
精製したヒh・PSを雌のBa1b/Cマウスく4周齢
)2匹に対して14日間隔で4回免疫した。Example 1 Two female Balb/C mice (4 weeks old) were immunized four times at 14-day intervals with purified bunny PS.
初回の免疫はPBSに溶解した。50μ9のヒ]〜・P
Sを等量のフロイントの完全アジュバント(Compl
ete Freund ’ s adjuvant
)と混合し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与した(
0.5Rg/head) 、 2回目、3回目は、
同じ<50μ3のヒト・PSをフロイントの不完全アジ
ュバント(Freund ’ s incomple
te adjuvant)と混合し、同じく腹腔内に
投与した。最終免疫は30μ7のヒト・PSをPBS溶
液のまま、マウス尾静脈から追加投与した。最終免疫の
3日後に免疫したマウスの牌臓細胞を細胞融合に用いた
。The first immunization was dissolved in PBS. 50 μ9 Hi]~・P
S with an equal amount of complete Freund's adjuvant (Compl.
ete Freund's adjuvant
) and the emulsion was administered intraperitoneally (
0.5Rg/head), the second and third times,
The same <50μ3 of human PS was added to Freund's incomplete adjuvant (Freund's incomplete adjuvant).
te adjuvant) and similarly administered intraperitoneally. For the final immunization, 30 μ7 of human PS was additionally administered as a PBS solution through the mouse tail vein. Spleen cells from immunized mice 3 days after the final immunization were used for cell fusion.
免疫したマウスの稗臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
(PIJl)を約2:1〜約15:1の割合で混合し、
50%ポリエステルグリコール1540(和光補薬(製
)を融合促進剤としてK 0hlerとM 1lste
inの方法に従い細胞融合を行った。融合後の細胞は、
1x10’ cells /adlの細胞濃度となるよ
うに10%FC3・−RI)M I −1640培地に
懸濁し、96wells ?イクロプレート(Cost
er )に1ウェル当り 100μρずつ分注した。Mixing immunized mouse milia cells and syngeneic mouse myeloma cells (PIJl) at a ratio of about 2:1 to about 15:1,
50% polyester glycol 1540 (manufactured by Wako Hyakuyaku Co., Ltd.) as a fusion promoter and K0hler and M1lste.
Cell fusion was performed according to the method of In. The cells after fusion are
Suspend in 10% FC3-RI)MI-1640 medium to a cell concentration of 1x10' cells/adl, and place in 96 wells. Microplate (Cost)
er) at a rate of 100 μρ per well.
融合細胞は、CO2インキユベータ−(5%C○2,3
7℃)中で培養し、ヒボキサンチン、アミノプテリン:
チミジンを含む培地(HAT培地で培地交換を行い、H
AT培地中で増殖させて、牌臓細胞と、骨髄腫細胞から
成るハイブリドーマのスクリーニングを行った。The fused cells were incubated in a CO2 incubator (5% C○2,3
Hyboxanthin, aminopterin:
Replace the medium with a medium containing thymidine (HAT medium, and
Hybridomas consisting of spleen cells and myeloma cells were screened by growing them in AT medium.
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・PSを
コーティングしたマイクロタイターブレー1・を用いE
LISA法により検出した。第2抗体には、アルカリホ
スファターゼ標識ウサギ抗体マウスIgG抗体を用い、
抗原PSに対する結合性を調べた。融合細胞をまいた合
計494のウェルのうち、487ののウェルにコロニー
の形成が認められ、このうち抗原PSに対して結合性を
示す抗体産生陽性ウェルは94ウエルであった。Antibodies in the culture supernatant of hybridomas were extracted using a microtiter plate coated with antigen human PS.
Detected by LISA method. For the second antibody, an alkaline phosphatase-labeled rabbit antibody and mouse IgG antibody was used,
The binding to antigen PS was examined. Out of a total of 494 wells in which the fused cells were seeded, colony formation was observed in 487 wells, and among these, 94 wells were positive for producing antibodies that showed binding to the antigen PS.
これらの抗体産生陽性ウェルのうち4つのウェルについ
て限界希釈法によるクローニロングを2回繰り返して行
ない、6個のクローンを得た。得られたクローン90%
はFe2−10%DMS○中に懸濁させ液体窒素中に保
存した。Out of these antibody-producing positive wells, four wells were subjected to cloning tests using the limiting dilution method twice, and six clones were obtained. 90% clones obtained
was suspended in Fe2-10% DMS○ and stored in liquid nitrogen.
各クローンの産生ずるモノクローナル抗体をクローンを
3alb/Cマウス腹腔内で増殖させ、そ) の腹水
からプロティンA −S epharose4 Bカラ
ムを用いて精製した。The monoclonal antibodies produced by each clone were grown intraperitoneally in 3alb/C mice and purified from the ascites using a protein A-Sepharose 4 B column.
表1 (細胞融合)
実施例2(精製したちのモノクローナル抗体の性質)
マウス腹水から精製した各クローンのICIGについて
クラス及びヒト・プロテイン5(PS)に対する結合性
を調べた。Table 1 (Cell fusion) Example 2 (Properties of purified monoclonal antibodies) ICIG of each clone purified from mouse ascites was examined for class and binding to human protein 5 (PS).
マウスモノクローナル抗体のクラスは、各クラス特貸性
の抗マウス抗血清を用いて、オフタロニー法により決定
した。The class of mouse monoclonal antibodies was determined by the Ophthalony method using anti-mouse antiserum specific to each class.
この結果を下記表2に示した。The results are shown in Table 2 below.
ヒト・プロテインSに対する結合性は、マイクロタイタ
ープレートに固相化したヒト・プロテインSと適当な!
1度になるように希釈したモノクローナル抗体とを反応
させ、アルカリ性フォスファクターゼ標識化したヤギ抗
マウスIQGで検出することにより評価した。The binding property to human protein S is suitable for human protein S immobilized on a microtiter plate!
Evaluation was made by reacting with a monoclonal antibody diluted once and detecting with goat anti-mouse IQG labeled with alkaline phosfactorase.
その結果6種類のモノクローナル抗体のヒト・プロテイ
ンSに対する結合の強さは、289F12〜239C1
0>3C3G8>3C4G4>289G3>>2E12
C7であることが判明した。As a result, the binding strength of six types of monoclonal antibodies to human protein S was 289F12 to 239C1.
0>3C3G8>3C4G4>289G3>>2E12
It turned out to be C7.
この結果を添付図1に示した。The results are shown in attached Figure 1.
表2 モノクローナル抗体のクラス
実施例3[ヒトC4b結合タンパクとプロティンS複合
体(C4bp−P S複合体)に対する反応性]
精製した前記6種類のモノクローナル抗体を10μg/
−の濃度でマイクロタイタプレー1・にコーティングし
、1%BS八でB locking 111、iM 当
i:濃度になるように希釈したヒト健常人血漿を加え、
血漿中のC4bp−プロティンS複合体とモノクローナ
ル抗体とを反応させた。次に、アルカリ性フォスファタ
ーゼ標識化した抗C4bp抗体を加え、6種類のモノク
ローナル抗体のC4bp−ブロティンS複合に対する結
合性を検出し、調べた。Table 2 Monoclonal antibody class example 3 [Reactivity towards human C4b binding protein and protein S complex (C4bp-PS complex)]
Coat Microtiter Plate 1 at a concentration of -, add healthy human plasma diluted with 1% BS8 to a concentration of Blocking 111, iM,
The C4bp-Protein S complex in plasma was reacted with a monoclonal antibody. Next, an alkaline phosphatase-labeled anti-C4bp antibody was added to detect and examine the binding properties of the six monoclonal antibodies to the C4bp-brotin S complex.
その結果、モノクローナル抗体2E12C7は、フリー
のプロディンSに対しては非常に結合性が弱いが、C4
bp−プロティンS複合体に対しては、高度に持責的に
結合性を示すことが判明した。As a result, monoclonal antibody 2E12C7 has very weak binding to free prodin S, but
It was found that it showed highly responsible binding to the bp-protein S complex.
この結果を図2に示した。The results are shown in FIG. 2.
このような各種抗体を免疫学的3111定手段(、E
I△、RI△)に用いることにより、溶液状態(例えば
ヒト血漿)にあるフリーのヒト・プロテインS及びC4
bp−プロティンS複合体の測定に応用が可能と考えら
れる。These various antibodies were analyzed using immunological 3111 assay methods (,E
I△, RI△), free human protein S and C4 in solution state (e.g. human plasma)
It is thought that it can be applied to the measurement of bp-protein S complex.
実施例4(ヒト・プロテインSの分離方法)(1)抗体
の不溶性担体への固定化;
ブロムシアン活性化セファロース4B(ファルマシア・
ファイン・ケミノJルズ社製)の乾燥ゲル0.5gを、
G3グラスフィルター上で1001d!の11+1M
HCIを用いて膨潤、洗浄し、更にカンプリングバツ
クファ −(0,5M Na C1を含む0.1MN
a HCO3DI−18,3>で洗浄した。カップリン
グバッフ1−を吸引除去した後、直ちにゲルを抗体(6
H2>のカップリングバッファー溶液(3IffL/m
1)2d中に加えて懸濁させ、4度で一夜ゆるやかに撮
とうした。次にゲルを1 Mエタノールアミン−Hap
(II 8,0. :2Id)中に移し、室温で2時
間振とうして残存する活性基をブロックした。ブロッキ
ング後、抗体結合セファロースゲルをグラスフィルター
上で、0,5M NaC9を含む0.1Ml!!¥酸
バッファー pH4,0,と0,5M NaC2を含
む0.1Mホウ酸バッファーp)(8,0を交互に用い
て洗浄した。濾液の280nmにおける吸光度が0.0
1以下になったところで、1mMベンザミジンを含む0
.05 M Tris /HCf pH7,4テ平
衡化し、カラムに充てんした。このようにして調製した
抗ヒトPSモノクローナル抗体(289C10)結合セ
ファロース4Bカラムを用いてアフイニテイクロクトを
行った。Example 4 (Separation method of human protein S) (1) Immobilization of antibody on insoluble carrier; Bromcyan-activated Sepharose 4B (Pharmacia)
0.5 g of dry gel (manufactured by Fine Chemino J's),
1001d on G3 glass filter! 11+1M
Swell and wash using HCI, and further add camping buffer (0.1M NaCl containing 0.5M NaCl).
a Washed with HCO3DI-18,3>. After removing the coupling buffer 1- by suction, immediately remove the gel from the antibody (6).
Coupling buffer solution of H2> (3IffL/m
1) Add the solution to 2 d of water, suspend it, and slowly photograph it at 4 degrees Celsius overnight. The gel was then diluted with 1 M ethanolamine-Hap.
(II 8,0.:2Id) and shaken at room temperature for 2 hours to block remaining active groups. After blocking, run the antibody-bound Sepharose gel on a glass filter with 0.1Ml! containing 0.5M NaC9! ! Acid buffer pH 4.0, and 0.1M boric acid buffer p containing 0.5M NaC2 (8.0) were used alternately for washing.The absorbance of the filtrate at 280 nm was 0.0.
When it becomes less than 1, add 0 containing 1mM benzamidine.
.. The column was equilibrated with 05 M Tris/HCf pH 7.4 and packed into a column. Affinity chromatography was performed using the thus prepared anti-human PS monoclonal antibody (289C10)-coupled Sepharose 4B column.
血漿100−にIM 5acf2溶液8dを13口え
4°Cで1時間撹拌した。沈澱を遠心分離して集め5m
M 8a CJz 、 5 mMベンザミジンを含む
0.1〜jNacfで洗浄した後、15dの5 mMベ
ンザミジンを含む0.2M’ EDTA I)H7
,4で沈澱物を溶解し、バリウム吸着分画を得た。この
バリウム吸着分画を1 mMベンザミジンを含む0,
05 MTris /HCj DI−17,4に投石し
、1 mMベンザミジンを含む0,05M Tri
S/H(Jで平衡化した抗体289C10結合カラムに
かけた。11′l1MベンザミジンおよびIMNaCf
fiを含む0,05 MTris /l−1(J l)
H7,4で洗浄し、3M Na5CN I)l−17
,0溶液で溶出したところ、PSを含むシングルビーク
が得られた。回収率は約75.4%であった。8 d of IM 5acf2 solution was added to 100 ml of plasma in 13 mouthfuls and stirred at 4°C for 1 hour. Centrifuge and collect the precipitate for 5 m
M8a CJz, after washing with 0.1~jNacf containing 5 mM benzamidine, 15d 0.2M' EDTA containing 5 mM benzamidine I) H7
, 4 to obtain a barium adsorption fraction. This barium-adsorbed fraction was mixed with 0,
0.05M Tris/HCj DI-17,4 and 0.05M Tri containing 1 mM benzamidine.
Antibody 289C10 binding column equilibrated with S/H (J.
0,05 MTris/l-1 (J l) including fi
Wash with H7,4, 3M Na5CN I) l-17
, 0 solution, a single beak containing PS was obtained. The recovery rate was about 75.4%.
添付図1は、本発明のモノクローナル抗体のヒト・プロ
テインSに対する結合性の強さを示したものであり、図
2は本発明モノクローナル抗体のC4bp−プロティン
S複合体に対する結合性の強さを示したものである。
手続ネrt) J−E書
昭和62年/ 月)kト1
’F4J’ i;T Jゴ」良百菖′殿1.21i例の
表示
特願昭 61 − 296766 号2、発明の名称
4、代理人
(1)明細書簡5頁5行の[されは基礎医学」を「基礎
医学」と訂正する。
(2)同第6頁5〜6行のrc4bp−プロティンSに
対するモノクローナル抗体」をrc4bl)−プロティ
ンS複合体に対して選択的に認識するモノクローナル抗
体」と訂正する。
(3)同第7頁15行の「結晶」を「ヒト自漿」と訂正
する。
(4)同第7頁末行の[溶液3MJを「溶液(例えば3
MJと訂正する。
(5)同第11頁1〜2行のl’ (Fnzyme L
inkedImmunosobent As5ay)
Jをr (Enzyme LinkedImmunos
orbent As5ay)Jと訂正する。
(6)同第14頁14行の1ポリエステルグリコール」
を「ポリエチレングリコール」と訂正する。
(7)同第14頁15行の[にohlerJを1に6h
lerJと訂正する。
(8)同第15頁10〜11行の[ウサギ抗体マウス1
gG Jを[ウサギ抗マウスI(IG Jと訂正する。
(9)同第15真下から2行の[クローン90%はFe
2−10%D)fsO中」を「クローンは、90%FC
3−10%DI−130中」と訂正する。
(10)同第16頁の表1中の左欄の「コロニー形式」
を1コロニー形成」と訂正する。
(11)同第17頁1行の「(精製したちのモノクロー
ナル抗体」を[(精製したモノクローナル抗体」と訂正
する。
(12)同第17頁下から4〜3行の12B9F12〜
239C10」を12B9F12ン2B9C10Jと訂
正する。
(13)同第19頁1行の「複合」を[複合体」と訂正
する。
(14)同第20頁1〜2行の「抗体(6112)Jを
[゛モノクローナル抗体(6N2)Jと訂正覆る。
(15)同第20頁3行の「4度で」を「4°Cで」と
訂正する。
(16)同第20頁16〜17行の「アフイニテイクロ
クト」を「アフイニテイクロマ1−」と訂正する。
(17)同第21頁7行の[“投石]を「透析」と訂正
する。
(18)同第21頁8行の「Tris/ト102」を[
丁ris/ト1α pH7,4Jと訂正する。
以上Attached Figure 1 shows the strength of the binding of the monoclonal antibody of the present invention to human protein S, and Figure 2 shows the strength of the binding of the monoclonal antibody of the present invention to the C4bp-Protein S complex. It is something that (Procedure NERT) J-E Book 1986/Mon) kto1 'F4J'i; , Agent (1) Correct "Basic Medicine" on page 5, line 5 of the detailed letter to "Basic Medicine." (2) On page 6, lines 5-6, "monoclonal antibody against rc4bp-protein S" is corrected to "monoclonal antibody that selectively recognizes rc4bl)-protein S complex". (3) "Crystal" on page 7, line 15 is corrected to "human self-plasma." (4) At the end of the same page 7, replace [Solution 3MJ with "Solution (e.g. 3
Correct MJ. (5) l' (Fnzyme L) on page 11, lines 1-2.
inkedImmunosobent As5ay)
J to r (Enzyme LinkedImmunos
Orbent As5ay) Correct as J. (6) 1 Polyester Glycol, page 14, line 14”
is corrected to "polyethylene glycol". (7) On page 14, line 15, [to ohlerJ to 1 to 6h
Correct lerJ. (8) [Rabbit antibody mouse 1] on page 15, lines 10-11
gG J is corrected as [Rabbit anti-mouse I (IG J). (9) 90% of the clones are Fe
2-10% D) "Clone in fsO" in 90% FC
3-10% DI-130 medium” is corrected. (10) "Colony format" in the left column of Table 1 on page 16
is corrected to "formation of one colony." (11) "(Purified monoclonal antibody" on page 17, line 1) should be corrected to "(purified monoclonal antibody"). (12) 12B9F12~ on page 17, lines 4-3 from the bottom.
239C10" is corrected to 12B9F12-2B9C10J. (13) "Composite" in line 1 of page 19 is corrected to "complex". (14) "Antibody (6112) J" on page 20, lines 1-2 is corrected and reversed to "monoclonal antibody (6N2) J." (15) "4 degrees" on page 20, line 3 of the same page is changed to "4 degrees". C,” he corrected. (16) On page 20, lines 16-17, "Affinity Croc" is corrected to "Affinity Chroma 1-". (17) On page 21, line 7, [“stoning”] is corrected to “dialysis.” (18) Change “Tris/To 102” on page 21, line 8 to [
Corrected as pH 7,4J. that's all
Claims (1)
結合タンパクとの複合体を特異的に認識し結合するヒト
・プロテインSに対するモノクローナル抗体。 2、フリーのヒト・プロテインSを選択的に認識し、ヒ
ト・プロテインSとヒト補体系制御因子のC4b結合タ
ンパクとの複合体は認識しない、ヒト・プロテインSに
対するモノクローナル抗体。 3、前記第1項及び第2項記載のヒト・プロテインSに
対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 4、前記第3項記載のハイブリドーマを培養しその産生
物からヒト・プロテインSに対するモノクローナル抗体
を得ることを特徴とするヒトプロテインSに対するモノ
クローナル抗体の製造方法。 5、ヒト・プロテインSに対するモノクローナル抗体を
不溶性担体に結合された吸着体に、ヒト・プロテインS
含有混合物を接触せしめ、該吸着体にヒト・プロテイン
Sを結合せしめることを特徴とするヒト・プロテインS
含有混合物からのヒト・プロテインSの分離方法。[Claims] 1. Human protein S and human complement system regulator C4b
A monoclonal antibody against human protein S that specifically recognizes and binds to a complex with a binding protein. 2. A monoclonal antibody against human protein S that selectively recognizes free human protein S but does not recognize the complex of human protein S and the C4b binding protein of human complement system regulator. 3. A hybridoma that produces a monoclonal antibody against human protein S according to items 1 and 2 above. 4. A method for producing a monoclonal antibody against human protein S, which comprises culturing the hybridoma according to item 3 above and obtaining a monoclonal antibody against human protein S from the product. 5. A monoclonal antibody against human protein S was added to an adsorbent bound to an insoluble carrier.
Human Protein S, characterized in that human Protein S is bonded to the adsorbent by contacting a mixture containing the same.
A method for separating human protein S from a containing mixture.
Priority Applications (6)
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---|---|---|---|
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EP87118183A EP0271810B1 (en) | 1986-12-15 | 1987-12-08 | Immunological determination of free human protein s and c4bp-protein s complex |
DE19873789284 DE3789284T2 (en) | 1986-12-15 | 1987-12-08 | Immunological determination of free human protein S and c4bp protein S complex. |
DK654787A DK654787A (en) | 1986-12-15 | 1987-12-14 | PROCEDURE FOR IMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF FREE HUMANT PROTEIN S AND C4BP PROTEIN S COMPLEX |
NO875215A NO172084C (en) | 1986-12-15 | 1987-12-14 | MONOCLONAL ANTIBODY, USE thereof AND REAGENT SYSTEM FOR IMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF FREE PROTEIN S AND C4BP PROTEIN S COMPLEX |
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JP (1) | JPH0759600B2 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008525381A (en) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | Reduction of the amount of protein contaminants in a composition comprising a vitamin K-dependent protein of interest |
-
1986
- 1986-12-15 JP JP61296766A patent/JPH0759600B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
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PREPARATIVE BIOCHEMISTRY=1986 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008525381A (en) * | 2004-12-23 | 2008-07-17 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | Reduction of the amount of protein contaminants in a composition comprising a vitamin K-dependent protein of interest |
JP2013100300A (en) * | 2004-12-23 | 2013-05-23 | Novo Nordisk Health Care Ag | Reduction of content of protein contaminant in composition containing vitamin k-dependent protein of interest |
US9187549B2 (en) | 2004-12-23 | 2015-11-17 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin K-dependent protein of interest |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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JPH0759600B2 (en) | 1995-06-28 |
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