JPH031959B2 - - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】
ａ 産業上の利用分野
本発明ヒト・プロテインＣに対してカルシウム
イオン（Ca++）の非存在下では認識せず、カル
シウムイオン（Ca++）存在下で認識するモノク
ローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、
その抗体の製造方法及びヒト・プロテインＣの分
離方法に関する。
ｂ 従来技術
プロテインＣはビタミンＫ依存性血漿蛋白質す
なわちγ−カルボキシグルタミン酸含有蛋白の一
つであり、血管内皮細胞表層のトロンボモジユリ
ン存在下トロンビンにより活性されて［Esmon，
C.T＆Owen，W.G：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
78：2249−2251（1981）参照］活性化プロテイン
Ｃ（APC）となる。活性化プロテインＣはセリン
プロテアーゼの一種であり、血液凝固系の補酸素
である第Ｖ因子（FV.FVa）と第因子（Ｆ，
Ｆａ）を分解し、強い抗凝固作用［Suzuki.K.
et.al.：J.Biol.Chem.258：1914−1920（1983），
Vehar，G.A.＆Davie，E.W.：
Biochemistry.19：401−409（1980）参照］を示す
と共に血管壁からプラスミノーゲン・アクチベー
タを放出させ、線溶系を促進させる［Comp，P.
C.＆Esmon，C.T：J.Clin.Invest.８：1221−1228
（1981）参照］ことが知られている。
さらにプロテインＣ欠損症は重度の血栓症を呈
することも報告されており、［Griffin，J.H.et
al：J.Clin.Invest.，68，1370−1373（1980），
Bertina，R.M.et al：Thromb.Haemostas.，48
１〜５（1982）］プロテインＣは血液凝固線溶系の
重要な制御因子であることが明らかにされてい
る。
したがつてプロテインＣの作用機構を明らかに
すること、また、プロテインＣの血中における抗
原量、活性量を測定し、その動向を把握すること
ができれば、それは基礎医学、臨床医学の領域に
おいて非常に重量な意味を持つと考えられる。
一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定基に
たいして特異的であり、かつ同一の特異性を有す
る抗体を安定的に産生できるという利点から抗原
蛋白質の機能および構造の解析、あるいは免疫測
定（EIA，RIA）に近時一般的に広く利用される
ようになつて来た。特に抗原蛋白質の機能解析、
分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位、ま
た特殊な構造部位を認識する抗体を見出すことが
有力な手段となり得る。
ヒト・プロテインＣの構造は、分子量約41000
のＨ鎖と分子量的21000のＬ鎖がＳ−Ｓ架橋で結
合されており、Ｈ鎖にセリンプロテアーゼ活性部
位を有し、また、Ｌ鎖アミノ末端には、９個のカ
ルシウムイオン結合性アミノ酸、すなわち、γ−
カルボキシグルタミン酸（Gla）残基を含むGla
ドメインが存在することが知られている。Glaド
メインを有する血液凝固因子は、プロテインＣを
含め、第因子（プロトロンビン）、第因子、
第因子、第因子いずれもカルシウムイオン
（Ca++）存在下でGlaに依存した立体的構造変化
を生じることが知られており、この機構は、血液
凝固系発現の上で重要な役割を果していることが
知られている。
従来、ヒト・プロテインＣのモノクロナール抗
体は鈴木らにより作成されたことが報告されてお
り［鈴木宏治他：“血液と脈管”，15：171−174
（1984）参照］、この抗体はヒト・プロテインＣの
抗原量の測定、活性の測定に利用されているが、
カルシウムイオン（Ca++）存在下で構造変化を
受けたヒト・プロテインＣを認識するモノクロナ
ール抗体についての報告はまだなされていない。
そこで本発明者らは、プロテインＣがカルシウ
ムイオン（Ca++）存在下で立体的構造変化を受
けることに着目し、カルシウムイオン（Ca++）
の存在下で構造変化を受けたプロテインＣを特異
的に認識するモノクローナル抗体について研究進
めた結果本発明に到達した。
ｃ 発明の構造
すなわち、本発明は、カルシウムイオン
（Ca++）の非存在下ではヒト・プロテインＣに対
して認識せず且つカルシウムイオン（Ca++）の
存在下ではヒト・プロテインＣに対して特異的に
認識するヒト・プロテインＣに対するモノクロー
ナル抗体である。
また他の本発明は、前記ヒト・プロテインＣに
対するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマであり、そのハイブリドーマの産生する産生
物からの前記ヒト・プロテインＣに対するモノク
ローナル抗体の製造方法である。
さらに他の本発明は、カルシウムイオン
（Ca++）の非存在下では、ヒト・プロテインＣに
対して認識せず且つカルシウムイオン（Ca++）
の存在下ではヒト・プロテインＣに対して特異的
に認識するヒト・プロテインＣに対するモノクロ
ーナル抗体を不溶性担体と結合させた吸着体に、
ヒト・プロテインＣ含有混合物を、カルシウムイ
オン（Ca++）の存在下に接触せしめて、該吸着
体にヒト・プロテインＣを結合せしめることを特
徴とするヒト・プロテインＣ含有混合物からのヒ
ト・プロテインＣの分離法である。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞はケーラーとミルシユタインの方法
［Ko¨hler＆Milstein，Nature：256495−497
（1975）］として知られた方法によつて得られる。
すなわち、ヒト・プロテインＣでマウスを免疫し
た後、このマウスの脾臓細胞をマウス・ミエロー
マ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞
はマイクロタイタープレートに固定されたヒト・
プロテインＣと反応する抗体に対し、系統的に検
査し、選択される。この際に、カルシウムイオン
（Ca++）存在下における検査と、カルシウムイオ
ン非存在下における検査を同時に行い前者におい
てのみ陽性を示すハイブリドーマを選別すること
により、目的とする抗体を合成し分泌するハイブ
リドーマを単離することができる。
本発明のモノクローナル抗体はかかる新規なハ
イブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、
カルシウムイオン（Ca++）の存在下におけるヒ
ト・プロテインＣ分子上の特定の抗原決定基に対
して単一特異的に作用する。
本発明のモノクローナル抗体はその特性からヒ
ト・プロテインＣの精製に利用する場合非常に有
利である。すなわち、不溶性担体に本発明におけ
るモノクローナル抗体を固定化し、カルシウムイ
オン（Ca++）が存在する溶液中で血漿（カルシ
ウムイオン存在下で凝固しないように調製したも
の）または、他のヒト・プロテインＣを含む原
料、あるいはそれらの粗抽出物、粗精製物および
溶液からヒト・プロテインＣを吸着・分離しカル
シウムイオン（Ca++）存在下で洗浄後、溶液を
カルシウムイオンを含まないもの（例えば
EDTAが存在する溶液）に置き換えて、ヒト・
プロテインＣを溶出することができる。この方法
によれば、従来の不溶化抗体による抗原蛋白質の
精製のように、過激な条件下（例えば、0.2Mグ
リシン塩酸あるいは8M尿素のような）に蛋白質
をさらすことなく、穏和な条件下で精製を行うこ
とができる。
また、ヒト・プロテインＣその他のγ−カルボ
キシグルタミン酸含有蛋白質にはGlaを含まず、
Glaに依存する構造変化を受けない異常分子が存
在することが知られているが、本発明におけるモ
ノクローナル抗体を用いることにより、この異常
分子の測定が可能になると考えられる。すなわ
ち、カルシウムイオン（Ca++）の存在の有無に
拘らず、ヒト・プロテインＣを認識する抗体を用
いて免疫学的手段（例えばEIA，RIA）により血
漿その他の試料中のヒト・プロテインＣ抗原量を
測定し、更に本発明によるモノクローナル抗体を
用いて、血漿、その他の試料中のヒト・プロテイ
ンＣをカルシウムイオン存在下で免疫学的手法
（EIA，RIA）により測定すれば、その測定値の
差から、異常ヒト・プロテインＣの量を把握する
ことができる。
次に本発明におけるモノクローナル抗体を作性
する具体的方法について詳細に説明する。
Ａ 抗原の単離・精製；
抗原に用いるヒト・プロテインＣは鈴木らの
方法［Suzuki.K.et al，J.Biol.Chem.258：
1914−1920（1983）］によりヒト・血漿から単
離・精製される。
Ｂ ヒト・プロテインＣによるマウスの免疫；
雌Balb／Ｃマウスを用いることができるが
他の系（Strain）のマウスを使用してもよい。
その際、免疫計画、及びヒト・プロテインＣの
濃度は十分な量の抗原刺戟を受けた、リンパ球
が形成されるよう選ばれるべきである。例えば
マウスに50μgのヒト・プロテインＣを２週間
間隔で腹腔に３回投与の後、さらに30μgを静
脈に投与する。最終免疫の数日後に融合の為に
脾臓細胞をとり出す。
Ｃ 細胞融合；
上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に
取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。
それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス
骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により、
細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫細胞の好
ましい比率約20：１〜約２：１の範囲である。
約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5mlの融合媒
体の使用適当である。
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く
知られているが、本発明では、P3−X63−Ag8
−U1細胞（P3−U1）［Yelton，D.E et al，
Current.Topics in Microbiology and
Immunology，81１（1978）参照］を用いた。
好ましい融合促進剤としては、例えば、平均
分子量1000〜4000のポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている
他の融合促進剤を使用することもできる。本発
明においては、平均分子量1540のポリエチレン
グリコールを用いた。
Ｄ 融合した細胞の選択；
別の容器内（例えばマイクロタイタープレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄
腫細胞および融合したハイブリドーマ細胞の混
合物を未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しない
選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させる
のに十な時間（約１週間）培養する。培地は、
未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、
（例えばHAT培地）が使用される。この選択
培地中では、未融合の骨髄腫細胞は死滅する。
この未融合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なので、
ある一定期間後（１週間後）死滅する。これら
に対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫
瘍性と、親脾細胞の性質を合わせ持つため、選
択培地中で生存できる。
Ｅ 各容器中のヒト・プロテインＣ抗体の確認；
かくして、ハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒト・プロテイン
Ｃに対する抗体について酵素免疫定量法
（Enzyme Linked Immunosobent Assay）に
よりスクリーニングする。この際、培養上清、
酵素標識抗体溶液および洗浄液に一定濃度の
CaC2を加えた条件下の測定と、CaCl2を加えな
い条件下の測定の両方を行い、前者に対しての
み陽性を示すハイブリドーマを選択することに
より、カルシウムイオン非存在下では、ヒト・
プロテインＣを認識せず、カルシウムイオン存
在下で、ヒト・プロテインＣを認識する抗体を
産生、分泌するハイブリドーマを選別すること
ができる。
Ｆ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クローン化と抗体の産生
目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によれば、ハイブリドーマ
細胞を一定時間、適当な培地で培養することに
より、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生するモノクローナル抗体を得ることが
できる。第２の方法によれば、ハイブリドーマ
細胞は同質遺伝子、又は半同質遺伝子を持つマ
ウスの腹腔に注射することができる。一定時間
後の宿主動物の血液中および腹水中より、その
ハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル
抗体を得ることができる。
Ｇ ヒト・プロテインＣ含有混合物からのヒト・
プロテインＣの分離；
本発明におけるモノクローナル抗体は、前記
した如く、カルシウムイオン（Ca++）の非存
在下ではヒト・プロテインＣに対して認識せ
ず、且つカルシウムイオン（Ca++）の存在下
ではヒト・プロテインＣに対して特異的に認識
するという性質を有しているので、この性質を
利用して、ヒト・プロテインＣを含有している
混合物（例えばヒト血漿など）からヒト・プロ
テインＣを簡単に分離することができる。
そのため、先ず前記ヒト・プロテインＣに対
するモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化
又は結合させて吸着体を得る。その際使用され
る不溶性担体としては、モノクローナル抗体を
用いた測定試薬又は測定用キツトの基材として
一般的使用されるものであればよい。例えば材
質としてアガロース、ポリアクリルアミド、セ
ルロース、デキストラン、またはマレイン酸ポ
リマー或いはこれらの混合物が好ましく用いら
れる。これら不活性担体の形態としては、粉末
状、粒状、ペレツト状、ビーズ状、フイルム
状、繊維状などの種々の形態であることができ
る。また一般に血漿、またはその分画成分の測
定や分離に用いられる多数の凹状のくぼみを有
するプレート（ウエル）を用いることが有利で
ある。
前記吸着体を用い、これにヒト・プロテイン
Ｃ含有混合物を、カルシウムイオン（Ca++）
の存在下に接触せしめると、該吸着体に固定化
したモノクローナル抗体とヒト・プロテインＣ
とが結合して、結果的にヒト・プロテインＣが
該吸着体に結合する。かくすることによりヒ
ト・プロテインＣを分離、除去することが可能
である。
又前記の如くしてヒト・プロテインＣを吸着
体に結合させ、出来れば残余の混合物を洗滌し
て除去し、次いで吸着体に結合したヒト・プロ
テインＣをカルシウムイオン（Ca++）を実質
的に含まない液体と接触又は洗滌すると、ヒ
ト・プロテインＣは該吸着体から離脱し、これ
を取得することによつて、ヒト・プロテインＣ
を単離することができる。
かくして前記本発明の分離法によれば、ヒ
ト・プロテインＣを含有する混合物からのヒ
ト・プロテインＣの除去、該混合物からのヒ
ト・プロテインＣの分離及び精製、該混合物中
のヒト・プロテインＣの含有量の測定などが極
めて簡単な操作で達成される。
以下実施例を上げ本発明を詳細に説明する。以
下実施例ではプロテインＣをPCと略称すること
がある。
実施例 １
精製したヒト・PCを雌のBalb／Ｃマウス（４
週齢）２匹に対して14日間隔で４回免疫した。
初回の免疫はPBSに溶解した。50μgのヒト・
PCを等量のフロントの完全アジユバント
（Complete Freund's adjuvant）と混合し、その
エマルジヨンを、腹腔内に投与した（0.5mg／
head）、２回目，３回目は、同じく50μgのヒト・
PCをフロントの不完全アジユバント（Freund's
incomplete adjuvant）と混合し、同じく腹腔内
に投与した。最終免疫は30μgのヒト・PCをPBS
溶液のまま、マウス尾静脈から投与した。最終免
疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融
合に用いた。
免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨
髄腫細胞（P3U1）を約２：１〜約15：１の割合
で混合し、50％ポリエチレングリコール1540（和
光）を融合促進剤としてKo¨hlerとMilsteinの方
法に従い細胞融合を行つた。融合後の細胞は、１
×106cell／mlの細胞濃度となるように10％FCS−
RPMI−1640培地に懸濁し、96we11sマイクロプ
レート（Coster）に１ウエル当り100μずつ分
注した。
融合細胞は、CO2インキユベーター（５％
CO2，37℃）中で培養し、ヒポキサンチン，アミ
ノプリテン；チミジンを含む培地（HAT培地）
で培地交換を行い、HAT培地中で増殖させて、
脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成るハイブリドーマ
のスクリーニングを行つた。
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒ
ト・PCをコーテイングしたマイクロタイタープ
レートを用いELISA法により検出した。第２抗
体には、アルカリホスフアターゼ標識ウサギ抗マ
ウスIgG抗体を用い、カルシウムイオン存在下非
存在下におけるヒト・PCとの結合の違いを見る
ため、一方の培養上清には5mMCaCl2を添加した
TBS（0.02MTris／HCl，0.14MNaCl，PH7.4）ま
たもう一方にはTBSを加えた。更に第２抗体の
希釈液、および洗浄液には、5mMCaCl2添加
TBS，0.05％Tween20，0.02％NaN3または
TBS，0.05％Tween20，0.02％NaN3を使用し
た。
融合細胞をまいた合計541のウエルのうち523の
ウエルにコロニーの形成が認められ。このうち抗
体産生陽性ウエルは下記表−１に示すようにカル
シウムイオン存在下で44，カルシウムイオン非存
在下で32であつた。
これらの抗体産生陽性ウエルのうち12のウエル
について限界希釈法によるクローニングを２回繰
り返して行ない、13個のクローンを得た。得られ
たクローンは90％FCS−10％DMSO中に懸濁さ
せ液体窒素中に保存した。
各クローンの産生するモノクローナル抗体はク
ローンをBalb／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、そ
の腹水からプロテインＡ−SepharoseBカラムを
用いて精製した。
【表】
【表】
実施例 ２
（精製したIgGの性質）
マウス腹水から精製した各クローンのIgGにつ
いてサブクラス，ヒト・PC活性への影響Ｌ鎖あ
るいはＬ鎖への結合性を調べた。
サブクラスは、各クラス特異性の抗マウス抗血
清を用いて、オクタロニー法により決定した。ヒ
ト・PC活性への影響は、ヒト・PCにIgGをモル
比１：５で加えて４℃で一夜インキユベーシヨン
し、トロンビン−トロンボモジユリンコンプレツ
クスによりヒトPCを活性化し、その活性は次合
成基質の分解活性を測定することにより測定し
た。この合成基質としては
［ここでVelはＤ形の光学活性のバリン，Leuは
Ｌ形の光学活性のロイシン，ArgはＬ形の光学活
性のアルギンを示す。KabiVitrumAB（スウエー
デン）社製のＳ−2266を用いた］を使用した。Ｌ
鎖、Ｈ鎖への結合性は、ヒト・PCを還元条件で
電気泳動し、ニトロセルロース膜及びHRP標識
Goat anti−mouse IgGを用いたイムノブロツテ
イングを行つて判定した。
各性質について得られた結果を下記表−２に示
した。カルシウムイオン依存性抗体はいずれもＬ
鎖結合性であり、ヒト・PCの活性には影響を及
ぼさなかつた。
【表】
実施例 ３
（カルシウムイオンの影響）
ヒト・PCと精製したIgGとの反応に及ぼすカ
ルシウムイオンの影響について検討した。
ヒト・PCをコーテイングしたELISA法におい
てカルシウムイオン依存性の抗体B12及び10E12
を5mMCaCl2添加TBS−Tween（0.02M Tris／
HCl，0.14M NaCl，PH7.4 0.05％Tween20，
0.02％NaN3）またはTBS−Tweenで希釈してヒ
ト・PCと反応させアルカリホスフアターゼ標識
ウサギ抗マウスIgGを用いた発色から結合量を測
定すると、5mMCaCl2を添加したバツフアーで希
釈した場合には抗体濃度に依存したヒト・PCと
の結合を示したが、CaCl2を添加しないバツフア
ーで希釈した場合には、抗体濃度を高くしても結
合は認められなかつた。その結集を下記表−３に
示した。
なお、カルシウムイオン非依存性の抗体6B10
−１及び10H11を用いて同様にカルシウムイオン
の影響について調べた結果も同表−３に併記して
示した。
【表】
実施例 ４
（カルシウムイオン濃度の影響）
前記実施例３におけるカルシウムイオン依存性
の抗体7B12及び10E12を用い、それらの濃度を一
定（1μg／ml）とし、抗体溶液中のカルシウムイ
オン濃度を変化させたところ、ヒト・PCとの結
合はCaCl2濃度が高まるにつれて増加し、約1mM
の濃度で飽和となつた。その結果を下記表−４に
示した。またカルシウムイオン非依存性の抗体
6E2を用い同様にCaCl2濃度の変化の影響を調べ
た結果を、下記表−５に示した。表−５の結果か
らカルシウムイオン非存在性の抗体では、カルシ
ウムイオン濃度に影響なく、ヒト・PCとの結合
はほぼ一定の値を示していることがわかる。
なお、測定は、所定濃度のCaCl2を含むTBS−
Tweenで1μg／mlIgG溶液を調製し、100μを、
ヒト・PCをコーテイングしたwellに加えて行つ
た。インキユベーシヨン後のwellの洗浄にも各濃
度のCaCl2を含むTBS−Tweenを用いた。
【表】
【表】
【表】
実施例 ５
(1) 抗体の不溶性担体への固定化；
ブロムシアン活性化セフアロース4B（フアル
マシア・フアイン・ケミカルズ社製）の乾燥ゲ
ル0.5gを、G3グラスフイルター上で100mlの
1mM HClを用いて膨潤、洗浄し、更にカツプ
リングバツフアー（0.5M NaClを含む
0.1MNaHCO3PH8.3）で洗浄した。カツプリン
グバツフアーを吸引除去した後、直ちにゲルを
抗体（6H2）のカツプリングバツフアー溶液
（３mg／ml）２ml中に加えて懸濁させ、４℃で
一夜ゆるやかに振とうした。次にゲルと1Mエ
タノールアミン−HCl（PH8.0，２ml）中に移
し、室温で２時間振とうして残存する活性基を
ブロツクした。ブロツキング後、抗体結合セフ
アロースゲルをグラスフイルター上で、0.5M
NaClを含む0.1M酢酸バツフアーPH4.0，と
0.5M NaClを含む0.1Mホウ酸バツフアーPH‐
8.0を交互に用いて洗浄した。液の280nmに
おける吸光度が0.01以下になつたところで、
5mM CaCl2、および1mMベンザミジンを含む
0.05M Tris／HClPH7.4で平衡化し、カラムに
充てんした。このようにして調製した抗ヒト
PCモノクローナル抗体（6H2）結合セフアロ
ース4Bカラムを用いてアフイニテイクロマト
を行つた。
(2) プロテインＣの抗体結合セフアロース4Bへ
の吸着、溶出；
血漿100mlに1M BaCl2溶液８mlを加え４℃
で１時間撹拌した。沈澱を遠心分離して集め
5mM BaCl2，5mMベンザミジンを含む0.1M
NaClで洗浄した後、15mlの5mMベンザミジン
を含む0.2M EDTAPH7.4で沈澱物を溶解し、
バリウム吸着分画を得た。このバリウム吸着分
画を1mMベンザミジンを含む0.05M Tris／
HClPH7.4に透析し、終濃度5mMとなるように
CaCl溶液を加え、5mM CaCl2および1mMベ
ンザミジンを含む0.05M Tris／HClで平衡化
した抗体（6H2）結合カラムにかけた。5mM
CaCl2，1mMベンザミジンおよび1MNaClを含
む0.05M Tris／HClで洗浄し、50mM EDTA
および1mMベンザミジンを含む0.05M Tris／
HClで溶出したところ、PCを含むシングルピ
ークが得られた。抗体セフアロース4B溶出分
画のPCはバリウム吸着分画に比べ約52倍に精
製されており、回収率は約48.2％であつた。 [Detailed Description of the Invention] a. Industrial Application Field The present invention does not recognize human protein C in the absence of calcium ions (Ca ++ ), but recognizes it in the presence of calcium ions (Ca ++ ). Monoclonal antibodies, hybridomas that produce them,
The present invention relates to a method for producing the antibody and a method for separating human protein C. b. Prior Art Protein C is a vitamin K-dependent plasma protein, that is, a protein containing γ-carboxyglutamic acid, and is activated by thrombin in the presence of thrombomodulin on the surface layer of vascular endothelial cells [Esmon,
C.T & Owen, WG: Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
78:2249-2251 (1981)] becomes activated protein C (APC). Activated protein C is a type of serine protease, and is a type of serine protease that acts as an oxygen supplement for the blood coagulation system, such as factor V (FV.FVa) and factor (F,
Fa) and has a strong anticoagulant effect [Suzuki.K.
et.al.: J.Biol.Chem. 258 :1914-1920 (1983),
Vehar, GA & Davie, EW:
Biochemistry.19:401-409 (1980)] and releases plasminogen activator from the blood vessel wall, promoting the fibrinolytic system [Comp, P.
C. & Esmon, CT: J. Clin. Invest. 8 : 1221-1228
(1981)]. Furthermore, it has been reported that protein C deficiency causes severe thrombosis [Griffin, JHet
al: J.Clin.Invest., 68 , 1370-1373 (1980),
Bertina, RMet al: Thromb.Haemostas., 48
1-5 (1982)] Protein C has been shown to be an important regulator of the blood coagulation and fibrinolytic system. Therefore, if we can clarify the mechanism of action of protein C, measure the amount of antigen and activity of protein C in the blood, and understand their trends, this will be extremely important in the fields of basic and clinical medicine. It is thought that it has a significant meaning. On the other hand, monoclonal antibodies are specific for a single antigenic determinant, and have the advantage of being able to stably produce antibodies with the same specificity. It has recently become widely used. In particular, functional analysis of antigen proteins,
For molecular analysis, finding antibodies that recognize sites involved in the function of antigenic proteins or special structural sites can be a powerful means. The structure of human protein C has a molecular weight of approximately 41,000
The H chain and the L chain with a molecular weight of 21,000 are linked by an S-S bridge, and the H chain has a serine protease active site, and the amino terminal of the L chain contains nine calcium ion-binding amino acids, That is, γ−
Gla containing carboxyglutamic acid (Gla) residues
It is known that the domain exists. Blood coagulation factors with Gla domains include protein C, factor (prothrombin), factor
Both factors are known to undergo Gla-dependent conformational changes in the presence of calcium ions (Ca ++ ), and this mechanism plays an important role in the expression of the blood coagulation system. It is known that there are Previously, it has been reported that a monoclonal antibody against human protein C was created by Suzuki et al.
(1984)], this antibody is used to measure the antigen amount and activity of human protein C.
There has been no report yet on a monoclonal antibody that recognizes human protein C that undergoes a structural change in the presence of calcium ions (Ca ++ ). Therefore , the present inventors focused on the fact that protein C undergoes a steric structural change in the presence of calcium ions (Ca ++ ).
The present invention was achieved as a result of research into monoclonal antibodies that specifically recognize protein C, which undergoes a structural change in the presence of. c. Structure of the invention That is, the present invention does not recognize human protein C in the absence of calcium ions (Ca ++ ), and does not recognize human protein C in the presence of calcium ions (Ca ++ ). This is a monoclonal antibody against human protein C that specifically recognizes human protein C. Another aspect of the present invention is a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the human protein C, and a method for producing the monoclonal antibody against the human protein C from a product produced by the hybridoma. Still another aspect of the present invention is that it does not recognize human protein C in the absence of calcium ions (Ca ++ ) and does not recognize human protein C in the absence of calcium ions (Ca ++ ).
The monoclonal antibody against human protein C, which specifically recognizes human protein C in the presence of the adsorbent bound to an insoluble carrier,
Human protein from a human protein C-containing mixture, characterized in that the human protein C-containing mixture is brought into contact with the human protein C-containing mixture in the presence of calcium ions (Ca ++ ) to bind human protein C to the adsorbent. This is a separation method for C. Hybridoma cells producing the monoclonal antibodies of the present invention can be prepared by the method of Koehler and Milstein [Ko¨hler & Milstein, Nature: 256 495-497
(1975)].
That is, after immunizing a mouse with human protein C, the mouse's spleen cells are fused with mouse myeloma cells, and the resulting hybridoma cells are immobilized on a microtiter plate.
Antibodies that react with protein C are systematically tested and selected. At this time, a test in the presence of calcium ions (Ca ++ ) and a test in the absence of calcium ions are conducted at the same time, and hybridomas that are positive only in the former are selected to identify hybridomas that synthesize and secrete the target antibody. can be isolated. The monoclonal antibodies of the present invention are obtained from products produced by such novel hybridoma cells,
It acts monospecifically on a particular antigenic determinant on the human protein C molecule in the presence of calcium ions (Ca ++ ). The monoclonal antibody of the present invention is very advantageous when used for the purification of human protein C due to its characteristics. That is, the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on an insoluble carrier, and plasma (prepared so as not to coagulate in the presence of calcium ions) or other human protein C is added in a solution containing calcium ions (Ca ++ ). Human protein C is adsorbed and separated from raw materials containing , or their crude extracts, crude purified products, and solutions, and after washing in the presence of calcium ions (Ca ++ ), the solution is converted to a material containing no calcium ions (e.g.
solution in which EDTA is present), human
Protein C can be eluted. According to this method, proteins are purified under mild conditions without exposing them to extreme conditions (e.g., 0.2M glycine hydrochloride or 8M urea) as in conventional purification of antigenic proteins using insolubilized antibodies. It can be performed. In addition, human protein C and other γ-carboxyglutamic acid-containing proteins do not contain Gla.
It is known that there are abnormal molecules that do not undergo Gla-dependent structural changes, and it is thought that the use of the monoclonal antibody of the present invention will make it possible to measure these abnormal molecules. That is, human protein C antigen in plasma and other samples can be detected by immunological means (e.g. EIA, RIA) using antibodies that recognize human protein C, regardless of the presence or absence of calcium ions (Ca ++ ). If human protein C in plasma or other samples is measured by immunological methods (EIA, RIA) in the presence of calcium ions using the monoclonal antibody according to the present invention, the measured value can be From the difference, the amount of abnormal human protein C can be determined. Next, a specific method for producing monoclonal antibodies according to the present invention will be explained in detail. A. Isolation and purification of antigen; Human protein C used as antigen was prepared by the method of Suzuki et al. [Suzuki.K.et al, J.Biol.Chem. 258 :
1914-1920 (1983)] was isolated and purified from human plasma. B. Immunization of mice with human protein C; female Balb/C mice can be used, but mice of other strains may also be used.
The immunization regimen and the concentration of human protein C should then be chosen so that a sufficient amount of antigen-stimulated lymphocytes are formed. For example, mice are administered 50 μg of human protein C intraperitoneally three times at two-week intervals, followed by an additional 30 μg intravenously. A few days after the final immunization, spleen cells are removed for fusion. C Cell fusion: The spleen of the mouse immunized as above is removed aseptically and a single cell suspension is prepared therefrom.
By using these spleen cells with mouse myeloma cells from an appropriate line and an appropriate fusion promoter,
Fuse the cells. The preferred ratio of spleen cells to myeloma cells ranges from about 20:1 to about 2:1.
It is appropriate to use 0.5-1.5 ml of fusion medium for approximately 10 8 splenocytes. Mouse myeloma cells used for cell fusion are well known, but in the present invention, P3-X63-Ag8
−U1 cells (P3−U1) [Yelton, DE et al,
Current.Topics in Microbiology and
Immunology, 81 1 (1978)] was used. As a preferred fusion promoter, for example, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 4000 can be advantageously used, but other fusion promoters known in the art can also be used. In the present invention, polyethylene glycol with an average molecular weight of 1540 was used. D. Selection of fused cells; selection that does not favor unfused mouse myeloma cells by adding a mixture of unfused spleen cells, unfused mouse myeloma cells, and fused hybridoma cells in a separate container (e.g., a microtiter plate) Dilute with culture medium and culture for sufficient time (about 1 week) to kill unfused cells. The medium is
those that do not support unfused mouse myeloma cells;
(e.g. HAT medium) is used. In this selective medium, unfused myeloma cells die.
Since these unfused spleen cells are non-neoplastic cells,
It dies after a certain period of time (one week). Cells fused to these cells have the tumor properties of the parent cells of myeloma and the properties of the parent splenocytes, so they can survive in the selective medium. E. Confirmation of human protein C antibodies in each container; thus, after hybridoma cells are detected, their culture supernatants are collected and screened for antibodies against human protein C by Enzyme Linked Immunosobent Assay. do. At this time, culture supernatant,
Add a certain concentration to the enzyme-labeled antibody solution and washing solution.
By conducting both measurements with and without CaCl 2 and selecting hybridomas that were positive only for the former, human
Hybridomas that do not recognize protein C but produce and secrete antibodies that recognize human protein C in the presence of calcium ions can be selected. F. Cloning of hybridoma cells that produce the antibody of interest and production of the antibody When hybridoma cells that produce the antibody of interest are cloned using an appropriate method (e.g., limiting dilution method), antibodies can be produced in two different ways. . According to the first method, monoclonal antibodies produced by hybridoma cells can be obtained from the culture supernatant by culturing hybridoma cells in an appropriate medium for a certain period of time. According to a second method, hybridoma cells can be injected into the peritoneal cavity of isogenic or semi-isogenic mice. Monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells can be obtained from the blood and ascites of the host animal after a certain period of time. G Human protein C from human protein C-containing mixture
Separation of protein C: As mentioned above, the monoclonal antibody of the present invention does not recognize human protein C in the absence of calcium ions (Ca ++ ), and does not recognize human protein C in the presence of calcium ions (Ca ++ ). Since it has the property of specifically recognizing human protein C, this property can be used to extract human protein C from a mixture containing human protein C (such as human plasma). can be easily separated. Therefore, first, a monoclonal antibody against human protein C is immobilized or bound to an insoluble carrier to obtain an adsorbent. The insoluble carrier used in this case may be one that is commonly used as a base material for measurement reagents or measurement kits using monoclonal antibodies. For example, agarose, polyacrylamide, cellulose, dextran, maleic acid polymer, or a mixture thereof is preferably used as the material. These inert carriers can be in various forms such as powder, granules, pellets, beads, films, and fibers. Further, it is advantageous to use a plate (well) having a large number of concave depressions, which is generally used for measuring or separating plasma or its fractionated components. Using the above adsorbent, a human protein C-containing mixture was added to it, and calcium ions (Ca ++ ) were added to it.
When the monoclonal antibody immobilized on the adsorbent and human protein C are brought into contact with each other in the presence of
As a result, human protein C binds to the adsorbent. In this manner, human protein C can be separated and removed. Alternatively, human protein C can be bound to the adsorbent as described above, the residual mixture preferably washed away, and then the human protein C bound to the adsorbent can be substantially freed of calcium ions (Ca ++ ). When it comes into contact with or is washed with a liquid that does not contain human protein C, human protein C detaches from the adsorbent, and by obtaining it, human protein C
can be isolated. Thus, according to the separation method of the present invention, human protein C is removed from a mixture containing human protein C, human protein C is separated and purified from the mixture, and human protein C is removed from the mixture. Measuring the content can be accomplished with extremely simple operations. The present invention will be described in detail below with reference to Examples. In the following examples, protein C may be abbreviated as PC. Example 1 Purified human PC was injected into female Balb/C mice (4
Two mice (age) were immunized four times at 14-day intervals. The first immunization was dissolved in PBS. 50 μg human
PC was mixed with an equal volume of Complete Freund's adjuvant and the emulsion was administered intraperitoneally (0.5 mg/
head), the second and third doses were 50 μg of human
PC on the front incomplete adjuvant (Freund's)
(incomplete adjuvant) and administered intraperitoneally. Final immunization: 30μg human PC in PBS
The solution was administered to mice through the tail vein. Spleen cells from mice immunized 3 days after the final immunization were used for cell fusion. Spleen cells from immunized mice and myeloma cells (P3U1) from syngeneic mice were mixed at a ratio of about 2:1 to about 15:1, and mixed with Ko¨hler using 50% polyethylene glycol 1540 (Wako) as a fusion promoter. Cell fusion was performed according to the method of Milstein. After fusion, the cells are 1
10% FCS- to give a cell concentration of ×10 6 cells/ml
The suspension was suspended in RPMI-1640 medium, and 100 μl was dispensed per well into a 96we11s microplate (Coster). The fused cells were grown in a CO2 incubator (5%
Cultured in CO 2 , 37°C), and cultured in a medium containing hypoxanthine, aminoprithene, and thymidine (HAT medium).
Change the medium and grow in HAT medium.
A hybridoma consisting of spleen cells and myeloma cells was screened. Antibodies in the hybridoma culture supernatant were detected by ELISA using a microtiter plate coated with the antigen human PC. An alkaline phosphatase-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody was used as the second antibody, and 5mMCaCl 2 was added to one culture supernatant to see the difference in binding to human and PC in the presence and absence of calcium ions. did
TBS (0.02MTris/HCl, 0.14MNaCl, PH7.4) was added to the other side. Furthermore, 5mMCaCl2 was added to the second antibody dilution solution and washing solution.
TBS, 0.05% Tween20, 0.02% NaN3 or
TBS, 0.05% Tween20, 0.02% NaN3 was used. Colony formation was observed in 523 wells out of a total of 541 wells seeded with fused cells. Among these, 44 wells were positive for antibody production in the presence of calcium ions and 32 in the absence of calcium ions, as shown in Table 1 below. Cloning by limiting dilution method was repeated twice for 12 of these antibody-producing positive wells, and 13 clones were obtained. The obtained clones were suspended in 90% FCS-10% DMSO and stored in liquid nitrogen. The monoclonal antibodies produced by each clone were grown intraperitoneally in Balb/C mice and purified from the ascites using a protein A-Sepharose B column. [Table] [Table] Example 2 (Properties of purified IgG) The IgG of each clone purified from mouse ascites was examined for subclass, influence on human/PC activity, L chain, or binding to L chain. Subclasses were determined by the Ouchterlony method using anti-mouse antisera specific for each class. The effect on human PC activity was determined by adding IgG to human PC at a molar ratio of 1:5 and incubating it at 4°C overnight to activate human PC by thrombin-thrombomodulin complex. This was determined by measuring the decomposition activity of the next synthesized substrate. As this synthetic substrate, [Here, Vel represents D-type optically active valine, Leu represents L-type optically active leucine, and Arg represents L-type optically active argine. S-2266 manufactured by KabiVitrum AB (Sweden) was used. L
The binding to the chain and H chain was determined by electrophoresing human PC under reducing conditions and using a nitrocellulose membrane and HRP label.
Determination was performed by immunoblotting using Goat anti-mouse IgG. The results obtained for each property are shown in Table 2 below. All calcium ion-dependent antibodies are L
It was chain-binding and had no effect on human PC activity. [Table] Example 3 (Influence of calcium ions) The influence of calcium ions on the reaction between human PC and purified IgG was studied. Calcium ion-dependent antibodies B12 and 10E12 in ELISA method coated with human PC
TBS - Tween (0.02M Tris/
HCl, 0.14M NaCl, PH7.4 0.05% Tween20,
When diluted with 0.02% NaN 3 ) or TBS-Tween and reacted with human PC, the amount of binding was measured by color development using alkaline phosphatase - labeled rabbit anti-mouse IgG. showed binding to human PC that was dependent on antibody concentration, but when diluted with buffer without CaCl 2 , no binding was observed even at high antibody concentrations. The results are shown in Table 3 below. In addition, calcium ion-independent antibody 6B10
The results of a similar study on the influence of calcium ions using -1 and 10H11 are also shown in Table-3. [Table] Example 4 (Influence of calcium ion concentration) Using the calcium ion-dependent antibodies 7B12 and 10E12 from Example 3, their concentrations were kept constant (1 μg/ml), and the calcium ion concentration in the antibody solution was When the CaCl2 concentration was varied, the binding to human PC increased as the CaCl2 concentration increased, and reached approximately 1mM.
saturation was reached at a concentration of The results are shown in Table 4 below. Also, calcium ion-independent antibodies
The results of similarly examining the influence of changes in CaCl 2 concentration using 6E2 are shown in Table 5 below. From the results in Table 5, it can be seen that with antibodies in the absence of calcium ions, the binding to human PC remains almost constant without affecting the calcium ion concentration. Note that the measurement was performed using TBS containing a predetermined concentration of CaCl2 .
Prepare a 1μg/ml IgG solution with Tween, add 100μ
This was done in addition to wells coated with human PC. TBS-Tween containing various concentrations of CaCl 2 was also used to wash the wells after incubation. [Table] [Table] [Table] Example 5 (1) Immobilization of antibody on an insoluble carrier; 0.5 g of dry gel of bromcyan-activated Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia Huain Chemicals) was placed on a G3 glass filter. 100ml
Swell with 1mM HCl, wash, and add a coupling buffer (containing 0.5M NaCl).
Washed with 0.1M NaHCO 3 PH8.3). Immediately after the coupling buffer was removed by suction, the gel was suspended in 2 ml of an antibody (6H2) coupling buffer solution (3 mg/ml) and gently shaken at 4°C overnight. The gel was then transferred into 1M ethanolamine-HCl (PH 8.0, 2 ml) and shaken at room temperature for 2 hours to block remaining active groups. After blocking, transfer the antibody-conjugated Sepharose gel to 0.5M on a glass filter.
0.1M acetic acid buffer PH4.0 containing NaCl, and
0.1M boric acid buffer PH- containing 0.5M NaCl
8.0 was used alternately for washing. When the absorbance of the liquid at 280 nm becomes 0.01 or less,
Contains 5mM CaCl 2 and 1mM Benzamidine
Equilibrated with 0.05M Tris/HClPH7.4 and packed into the column. Anti-human prepared in this way
Affinity chromatography was performed using a Sepharose 4B column conjugated with PC monoclonal antibody (6H2). (2) Adsorption and elution of protein C to antibody-bound Sepharose 4B; Add 8 ml of 1M BaCl 2 solution to 100 ml of plasma and incubate at 4°C.
The mixture was stirred for 1 hour. Collect the precipitate by centrifugation
0.1M with 5mM BaCl 2 , 5mM benzamidine
After washing with NaCl, dissolve the precipitate in 15 ml of 0.2 M EDTAPH7.4 containing 5 mM benzamidine.
A barium adsorption fraction was obtained. This barium adsorption fraction was mixed with 0.05M Tris containing 1mM benzamidine/
Dialyzed against HClPH7.4 to a final concentration of 5mM
CaCl solution was added and applied to an antibody (6H2) binding column equilibrated with 0.05M Tris/HCl containing 5mM CaCl2 and 1mM benzamidine. 5mM
Washed with 0.05M Tris/HCl containing CaCl 2 , 1mM benzamidine and 1M NaCl, and washed with 50mM EDTA.
and 0.05M Tris/containing 1mM benzamidine
When eluted with HCl, a single peak containing PC was obtained. PC in the antibody Sepharose 4B elution fraction was purified approximately 52 times as compared to the barium adsorption fraction, and the recovery rate was approximately 48.2%.
Claims (1)
ヒト・プロテインＣに対して認識せず且つカルシ
ウムイオン（Ca++）の存在下ではヒト・プロテ
インＣに対して特異的に認識するヒト・プロテイ
ンＣに対するモノクローナル抗体。 ２ ヒト・プロテインＣで免疫されたマウスの脾
臓細胞とマウスのミエローマ細胞を融合させたハ
イブリドーマであつて、カルシウムイオン
（Ca++）の非存在下ではヒト・プロテインＣに対
して認識せず且つカルシウムイオン（Ca++）の
存在下ではヒト・プロテインＣに対して特異的に
認識するヒト・プロテインＣに対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマの産生物から
カルシウムイオン（Ca++）の非存在下ではヒ
ト・プロテインＣに対して認識せず且つカルシウ
ムイオン（Ca++）の存在下ではヒト・プロテイ
ンＣに対して特異的に認識するヒト・プロテイン
Ｃに対するモノクローナル抗体を分離することを
特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。[Claims] 1. Does not recognize human protein C in the absence of calcium ions (Ca ++ ) and is specific for human protein C in the presence of calcium ions (Ca ++ ) A monoclonal antibody against human protein C that recognizes human protein C. 2 A hybridoma made by fusing mouse spleen cells immunized with human protein C with mouse myeloma cells, which does not recognize human protein C in the absence of calcium ions (Ca ++ ) and does not recognize human protein C. In the absence of calcium ions (Ca ++ ), the product of a hybridoma that produces a monoclonal antibody against human protein C that specifically recognizes human protein C in the presence of calcium ions (Ca ++ ) A monoclonal antibody characterized by isolating a monoclonal antibody against human protein C that does not recognize human protein C but specifically recognizes human protein C in the presence of calcium ions (Ca ++ ). Method for producing antibodies.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59254186A JPS61134399A (en) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | Monoclonal antibody, hybridoma, production of monoclonal antibody, and method of separating human protein c |
| US06/804,255 US4902614A (en) | 1984-12-03 | 1985-12-03 | Monoclonal antibody to human protein C |
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| JP59254186A JPS61134399A (en) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | Monoclonal antibody, hybridoma, production of monoclonal antibody, and method of separating human protein c |
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| JPS60120825A (en) * | 1983-10-18 | 1985-06-28 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | Antiprotein c monoclonal antibody and hybridoma producing the same |
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1984
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Patent Citations (1)
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