JPS6314691A - モノクロ−ナル抗体,およびそれを用いたダイオキシンおよびジベンゾフランの検出方法 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体,およびそれを用いたダイオキシンおよびジベンゾフランの検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、ダイオキシン:l; 、及びジベンゾフラン
の検出方法、その検出および定量分析に有用な新規のモ
ノクローナル抗体、そして該抗体を生産し得るハイブリ
ドーマに関する。
の検出方法、その検出および定量分析に有用な新規のモ
ノクローナル抗体、そして該抗体を生産し得るハイブリ
ドーマに関する。
アメリカ合衆国政府は、ローレンスリバーモア国立研究
所が本発明を行使する権利を有する。これはアメリカ合
衆国エネルギー省とカリフォルニア大学の間で交わされ
た契約(No、 W−7405−ENG−48)に準す
るものである。
所が本発明を行使する権利を有する。これはアメリカ合
衆国エネルギー省とカリフォルニア大学の間で交わされ
た契約(No、 W−7405−ENG−48)に準す
るものである。
(従来の技術)
ポリハロゲン化ジベンゾダイオキシン(PCDD )お
よびポリハロゲン化ジベンゾフラン(PCDF)は。
よびポリハロゲン化ジベンゾフラン(PCDF)は。
一般に生物圏のみならず人類の健康に対しても脅威を与
える。持続性の有毒汚染物質である。これらの化合物は
、オレンジ剤(Agent Orange)のよう′な
除草剤の不純物であるが、各種の工業上の化学的プロセ
ス、およびプラスチックやポリクロル化ビフェニール(
PCB)のような他のポリクロル化有機化合物の燃焼過
程または灰化過程における副産物としても発生する。こ
のようなプロセスが大規模に使用されたり、あるいは存
在することを考慮すれば、ダイオキシンおよびジベンゾ
フランは環境中に広範囲に拡がっている。これらの物質
の有害な性質が十分に認識されつつあるので、その発生
源をつきとめることが非常に重要なことになっている。
える。持続性の有毒汚染物質である。これらの化合物は
、オレンジ剤(Agent Orange)のよう′な
除草剤の不純物であるが、各種の工業上の化学的プロセ
ス、およびプラスチックやポリクロル化ビフェニール(
PCB)のような他のポリクロル化有機化合物の燃焼過
程または灰化過程における副産物としても発生する。こ
のようなプロセスが大規模に使用されたり、あるいは存
在することを考慮すれば、ダイオキシンおよびジベンゾ
フランは環境中に広範囲に拡がっている。これらの物質
の有害な性質が十分に認識されつつあるので、その発生
源をつきとめることが非常に重要なことになっている。
重要であり、かつ重大な第1のステップは、汚染箇所を
同定することである。これには。
同定することである。これには。
食料品のみならず土壌や大または動物の組織から採取し
た試料における。これらの化合物の存在を検出する。簡
単かつ経済的な、そして迅速な試験方法が必要である。
た試料における。これらの化合物の存在を検出する。簡
単かつ経済的な、そして迅速な試験方法が必要である。
望ましい試験方法の重要な点は特異性に関することであ
る。PCIと同様に、 、PCDDおよびPC叶には非
常に多数の異性体が存在する。これらの異性体には、毒
性が非常に高いものからそれほど毒性を有さないものま
で存在するが、他の比較的無害である化合物と化学的に
類似している。第2の問題点は、これらの化合物のうち
、環境中で最も毒性の高い異性体、すなわち2,3,7
.8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシンが非常
に少量で毒性を有し、そして食物連鎖の中を移動するに
つれて。
る。PCIと同様に、 、PCDDおよびPC叶には非
常に多数の異性体が存在する。これらの異性体には、毒
性が非常に高いものからそれほど毒性を有さないものま
で存在するが、他の比較的無害である化合物と化学的に
類似している。第2の問題点は、これらの化合物のうち
、環境中で最も毒性の高い異性体、すなわち2,3,7
.8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシンが非常
に少量で毒性を有し、そして食物連鎖の中を移動するに
つれて。
濃縮され得るということである。従って、望ましい試験
方法としては、これらの有毒物質の存在を非常に低濃度
で検出することが可能でなければならない。土壌試料の
汚染に対する化学分析は、さらにいくつかの他の要因に
よって妨害される=(1)ダイオキシンは土壌に堅固に
結合し、水への溶解度は無視し得る程度であること、そ
して(2)多数の異性体および関連する化学的汚染物質
の従来のガスクロマトグラフィーおよび質量分析法によ
る定量分析は、費用と時間を要すること。費用と分析時
間を考慮すると、ある領域における汚染範囲を決定する
ために、サンプリングを詳細に行うことができず、また
複雑な設備を有する集中的に管理された実験室を必要と
するが、これらは上記のような健康に対する害毒を現場
で、モニターするには適していない。
方法としては、これらの有毒物質の存在を非常に低濃度
で検出することが可能でなければならない。土壌試料の
汚染に対する化学分析は、さらにいくつかの他の要因に
よって妨害される=(1)ダイオキシンは土壌に堅固に
結合し、水への溶解度は無視し得る程度であること、そ
して(2)多数の異性体および関連する化学的汚染物質
の従来のガスクロマトグラフィーおよび質量分析法によ
る定量分析は、費用と時間を要すること。費用と分析時
間を考慮すると、ある領域における汚染範囲を決定する
ために、サンプリングを詳細に行うことができず、また
複雑な設備を有する集中的に管理された実験室を必要と
するが、これらは上記のような健康に対する害毒を現場
で、モニターするには適していない。
従来の分析法を凌駕する免疫分析法の潜在的な利点は、
以前より認識されている。特に免疫分析法は、ガスクロ
マトグラフィーおよび/または質量分析法と同程度の感
度を有しながら9分析がより迅速であって、費用も高価
ではない方法を提供する。
以前より認識されている。特に免疫分析法は、ガスクロ
マトグラフィーおよび/または質量分析法と同程度の感
度を有しながら9分析がより迅速であって、費用も高価
ではない方法を提供する。
環境中のダイオキシンを検出する際の上記問題を解決す
る。従来のあるアプローチがP、帽^l br。
る。従来のあるアプローチがP、帽^l br。
らによる論文(“クロル化ジベンゾ−p−ダイオキシン
のラジオイムノアッセイ”、酵素化学における方法、
−84: 619−639.1982)および、八Ib
r−oらによる米国特許第4,238,472号(クロ
ル化ジベンゾ−p−ダイオキシン)のラジオイムノアッ
セイ。
のラジオイムノアッセイ”、酵素化学における方法、
−84: 619−639.1982)および、八Ib
r−oらによる米国特許第4,238,472号(クロ
ル化ジベンゾ−p−ダイオキシン)のラジオイムノアッ
セイ。
1980年12月9[1出願)に考察されている。八l
br。
br。
らによって述べられた分析法はラジオイムノアッセイで
あって、1−アミノ−3,7,8−” )リクロロジベ
ンゾーp−ダイオキシンによって免疫を与えたウサギに
よって産生されたポリクローナル抗血清に基づくもので
ある。
あって、1−アミノ−3,7,8−” )リクロロジベ
ンゾーp−ダイオキシンによって免疫を与えたウサギに
よって産生されたポリクローナル抗血清に基づくもので
ある。
八1broらの分析法は、多くの制限があるために広く
適用されてはいない。
適用されてはいない。
この方法は、 ”54−TCODをしばしば合成する必
要があり1分析を完了するのに3日を必要とし。
要があり1分析を完了するのに3日を必要とし。
そして非特異的なウサギ抗血清を使用するため。
2.3,7.8−TCODに対して必ずしも十分に特異
的ではない。
的ではない。
別のアプローチが5tephen J、 Kennel
らによる論文(“クロル化ジベンゾ−p−ダイオキシン
に対するモノクローナル抗体°゛、毒物学および応用薬
物学2羽、 256−263.1986)のなかに報告
されている。ダイオキシンに対するこの試験方法は、ダ
イオキシンのサイログロブリン複合体、すなわちサイロ
グロブリン−2−アジプアミド、3,7.8−トリクロ
ロジベンゾ−p−ダイオキシンによって免疫を与えたB
ALB/cマウスによって産生されたモノクローナル抗
体に基づいている。免疫脾臓細胞。
らによる論文(“クロル化ジベンゾ−p−ダイオキシン
に対するモノクローナル抗体°゛、毒物学および応用薬
物学2羽、 256−263.1986)のなかに報告
されている。ダイオキシンに対するこの試験方法は、ダ
イオキシンのサイログロブリン複合体、すなわちサイロ
グロブリン−2−アジプアミド、3,7.8−トリクロ
ロジベンゾ−p−ダイオキシンによって免疫を与えたB
ALB/cマウスによって産生されたモノクローナル抗
体に基づいている。免疫脾臓細胞。
および5P210. P3またはNSIと呼ばれる骨髄
腫細胞の細胞融合によってハイブリドーマが産生された
。しかしながら、 Kennelらによって開発された
方法は2選択性が不適当であるという欠点が問題になる
。この問題点は、抗体が同定すべき標的ではない化合物
と反応する一方、溶液中のタンパク非融合2,3,7.
8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン、すなわ
ちダイオキシ異性体の中で最も毒性の高いダイオキシン
、および他のダイオキシン異性体と反応しないというこ
とである。他の問題点は、この試験方法が欠点を伴うラ
ジオイムノアッセイ法を利用することである。
腫細胞の細胞融合によってハイブリドーマが産生された
。しかしながら、 Kennelらによって開発された
方法は2選択性が不適当であるという欠点が問題になる
。この問題点は、抗体が同定すべき標的ではない化合物
と反応する一方、溶液中のタンパク非融合2,3,7.
8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン、すなわ
ちダイオキシ異性体の中で最も毒性の高いダイオキシン
、および他のダイオキシン異性体と反応しないというこ
とである。他の問題点は、この試験方法が欠点を伴うラ
ジオイムノアッセイ法を利用することである。
(本発明の目的)
上述から明らかなように、有毒なダイオキシンを検出す
る有効的かつ実用的な試験方法が依然として必要とされ
ている。
る有効的かつ実用的な試験方法が依然として必要とされ
ている。
従って1本発明の主要な目的は、ダイオキシンに対する
免疫分析法を提供することであり、この方法は必要な選
択性およびダイオキシンの存在を数ppB (試料当た
りナノグラム)、の濃度で決定的に示し得る選択性を有
する。
免疫分析法を提供することであり、この方法は必要な選
択性およびダイオキシンの存在を数ppB (試料当た
りナノグラム)、の濃度で決定的に示し得る選択性を有
する。
本発明の他の目的は、迅速に実施することが可能であり
、また容易に移動ができ、野外で実施し得る試験方法を
提供することにある。
、また容易に移動ができ、野外で実施し得る試験方法を
提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、最も有毒なポリクロル化ダ
イオキシンおよびポリクロル化ジベンゾフランを決定的
に感知し、得る抗体を提供することにある。
イオキシンおよびポリクロル化ジベンゾフランを決定的
に感知し、得る抗体を提供することにある。
本発明のさらに他の1°1的は、毒素の検出感度を1兆
分の1 (part per trillion、 p
pt)のレベルにまで高め得る方法を明確にすることに
ある。
分の1 (part per trillion、 p
pt)のレベルにまで高め得る方法を明確にすることに
ある。
本発明のさらに別の目的、利点および新規の特徴は、一
部分は以下の記述に示されており、一部分は以下の実施
例により当業者に明らかとなるか。
部分は以下の記述に示されており、一部分は以下の実施
例により当業者に明らかとなるか。
あるいは本発明を実施することによって学び得る。
本発明の目的および利点は、特に付加された特許請求の
範囲に指摘されている方法および組み合わせによって実
現し、そして達成し得る。
範囲に指摘されている方法および組み合わせによって実
現し、そして達成し得る。
(発明の要旨)
本発明は酵素連結免疫吸着分析(Enzyn+e−Li
nked−1[mn+unosorbent−Assa
y) ELISA法に関する。この方法では、特異的な
モノクローナル抗体を用いて試料を検査することにより
、ポリクロル化ダイオキシン、特に2.3,7.8−テ
トラクロロジベンゾ−p −ダイオキシン(TCOD)
の存在を決定し得る。特異的なモノクローナル抗体は、
特異的なハイブリドーマ細胞系(以後、 DD−1,D
D−3,DD−4,DD−5およびDD−6と呼ぶ)か
ら得られる。細胞系およびこれらの細胞系に由来の抗体
の生産は、以下により詳細に述べられている。これらの
抗体は、 TCODに対する高い親和力および15ft
J<性によって特徴付けられる。提案されたl1LIS
A試験のプロトコル(protocol)にこれらの抗
体を用いるごとにより、検査試料中のダイオキシンの7
?在を数11 It’ll以下のレベルで決定し得る。
nked−1[mn+unosorbent−Assa
y) ELISA法に関する。この方法では、特異的な
モノクローナル抗体を用いて試料を検査することにより
、ポリクロル化ダイオキシン、特に2.3,7.8−テ
トラクロロジベンゾ−p −ダイオキシン(TCOD)
の存在を決定し得る。特異的なモノクローナル抗体は、
特異的なハイブリドーマ細胞系(以後、 DD−1,D
D−3,DD−4,DD−5およびDD−6と呼ぶ)か
ら得られる。細胞系およびこれらの細胞系に由来の抗体
の生産は、以下により詳細に述べられている。これらの
抗体は、 TCODに対する高い親和力および15ft
J<性によって特徴付けられる。提案されたl1LIS
A試験のプロトコル(protocol)にこれらの抗
体を用いるごとにより、検査試料中のダイオキシンの7
?在を数11 It’ll以下のレベルで決定し得る。
この試験は数11ではなく、数時間で完了し得る。また
、放射椋識化合物を使用する必要もない。本発明0月J
′を体を用いれば、 TCIlIIに対する試験は、水
性媒体中で音波処理することによって実施し得る。好7
+−シい実施様式では2本試験方法の感度は、 0.0
5体積%稈度の濃度の洗浄剤を添加することによっ°(
増大さ・lるごとが可能であり。
、放射椋識化合物を使用する必要もない。本発明0月J
′を体を用いれば、 TCIlIIに対する試験は、水
性媒体中で音波処理することによって実施し得る。好7
+−シい実施様式では2本試験方法の感度は、 0.0
5体積%稈度の濃度の洗浄剤を添加することによっ°(
増大さ・lるごとが可能であり。
tppt程度以[このし・\ルのT C1111を検出
し得る。
し得る。
(本発明の実施様式)
ハイブリー1−ニマお、Lび一抗体の一牛産2本発明の
ハイプリトーマ11+1−1. DD−2,DD−3,
DD−4゜DD−5およびDD−6は、 Sl’2/(
+マウス骨髄腫細胞を。
ハイプリトーマ11+1−1. DD−2,DD−3,
DD−4゜DD−5およびDD−6は、 Sl’2/(
+マウス骨髄腫細胞を。
免疫化された11 A L 11 / cマウスおよび
ビオチイーマウスから得た脾臓細胞と融合させることに
よって生産された。動物が小さな有機分子に対して免疫
応答を行うためには、ハプテン(またはその類似体)が
担体タンパクに結合しなければならない。従って、抗体
を生産する第1ステツプは、タンパクに結合し得る官能
基を有する類似体を合成することである。このような免
疫化に対して選択されたTCOD類似体は、1−アミノ
−3,7,8−トリクロロジベンゾ−p−ダイオキシン
(A−triCDD)である。この化合物は、 Cha
eら(“パブテン化合物としての1−アミノ−3,7,
8−)ジクロロジベンゾ−p−ダイオキシンおよび1−
アミノ−2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−
ダイオキシンの合成゛。
ビオチイーマウスから得た脾臓細胞と融合させることに
よって生産された。動物が小さな有機分子に対して免疫
応答を行うためには、ハプテン(またはその類似体)が
担体タンパクに結合しなければならない。従って、抗体
を生産する第1ステツプは、タンパクに結合し得る官能
基を有する類似体を合成することである。このような免
疫化に対して選択されたTCOD類似体は、1−アミノ
−3,7,8−トリクロロジベンゾ−p−ダイオキシン
(A−triCDD)である。この化合物は、 Cha
eら(“パブテン化合物としての1−アミノ−3,7,
8−)ジクロロジベンゾ−p−ダイオキシンおよび1−
アミノ−2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−
ダイオキシンの合成゛。
Agr、 Food Chem、、 25.1207
−1209 (1977))によって公表されている方
法に従って合成した。従って、 A−tricDDは、
サイログロブリン、ウサギ血清アルブミン(BSA)、
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)など
のような担体タンパクに結合し得る。本実験においては
、ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた。′そして、
以下の表に示すようにBALB八マウへおよびビオチイ
ーマウスに注射した。
−1209 (1977))によって公表されている方
法に従って合成した。従って、 A−tricDDは、
サイログロブリン、ウサギ血清アルブミン(BSA)、
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)など
のような担体タンパクに結合し得る。本実験においては
、ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた。′そして、
以下の表に示すようにBALB八マウへおよびビオチイ
ーマウスに注射した。
、表−り
坑l/〕]野G仁−久ローン
抹 口1 イソタイプ
ビオチイー DD−I IgG1カ
ッパーBALB/c DD−31gG1
力・ンパービオチイ−DD−51gG2aカッパーBA
LB/c DD−4IgG2aカツパー
ビオチイDD−61gG2aカッパー (以下余白) それに続く免疫化プロトコルは、典型的には。
ッパーBALB/c DD−31gG1
力・ンパービオチイ−DD−51gG2aカッパーBA
LB/c DD−4IgG2aカツパー
ビオチイDD−61gG2aカッパー (以下余白) それに続く免疫化プロトコルは、典型的には。
10ケ月間にわたりマウス−匹につき1ケ月あたり10
μg(アジュバント中)を注射することを包含し、最終
の注射は、その動物の肺臓を取り出す数日前に行った。
μg(アジュバント中)を注射することを包含し、最終
の注射は、その動物の肺臓を取り出す数日前に行った。
注射プロトコルを完了後、脾臓細胞を取り出し。
それらを骨髄腫細胞と融合させることにより培地中で生
育することを誘発させた。本件の場合においては、脾臓
細胞は5P210マウス骨髄腫細胞に融合された。これ
らの融合細胞またはハイブリドーマは培地中で生育し、
モノクローナル抗体を分泌する。各細胞クローンはただ
1種の抗体のみを分泌するが、脾臓細胞の任意の融合に
より、典型的には10,000のハイブリドーマが得ら
れる。それゆえ、スクリーニング方法は、極めて重要で
ある。
育することを誘発させた。本件の場合においては、脾臓
細胞は5P210マウス骨髄腫細胞に融合された。これ
らの融合細胞またはハイブリドーマは培地中で生育し、
モノクローナル抗体を分泌する。各細胞クローンはただ
1種の抗体のみを分泌するが、脾臓細胞の任意の融合に
より、典型的には10,000のハイブリドーマが得ら
れる。それゆえ、スクリーニング方法は、極めて重要で
ある。
本件の場合においては、上記ハイブリドーマは次に、
BS^およびR5八からA−)すCDII−BSAお
よび^−1−IJ CDD−BSAを区別する能力がス
クリーニングされる。最初のスクリーニングをもとにし
て、安定した抗体産生コロニー25個が単離され、これ
はサブクローン化され、凍結された。残りのクローンは
、懸濁液中の遊離TCODを認識する能力について、再
びスクリーニングされた。実験的には、 TCDDを1
0〜1100nのオーダーで含むヘキサンを乾燥させ、
BSAを含む生理食塩水(Img/1ffi)
0.5mlを加え、2分間音波処理した。” C−TC
ODを用いた実験によれば、約半量のTCrll)が水
相に懸濁するようになり、これは約100ppbの濃度
に相当する。次いで、他のダイオキシン異性体について
も同一の工程を実施した。次にマイクロタイタープレー
トのウェルに入れられた種々の割合の希釈物が懸濁TC
ODによって調製され、抗体を加えて競合113A測定
を行った。競合1j1.lsA測定のf−法は次の文献
に詳細に述べられている: flute、 W、 Il
、 (1984)“Practi−cal Immu
noassay: T11+! 5LaL(! o
r Lhe Art”、 MarcelDekk
er、 Inc、、 N、Y、、 N、Y、。
BS^およびR5八からA−)すCDII−BSAお
よび^−1−IJ CDD−BSAを区別する能力がス
クリーニングされる。最初のスクリーニングをもとにし
て、安定した抗体産生コロニー25個が単離され、これ
はサブクローン化され、凍結された。残りのクローンは
、懸濁液中の遊離TCODを認識する能力について、再
びスクリーニングされた。実験的には、 TCDDを1
0〜1100nのオーダーで含むヘキサンを乾燥させ、
BSAを含む生理食塩水(Img/1ffi)
0.5mlを加え、2分間音波処理した。” C−TC
ODを用いた実験によれば、約半量のTCrll)が水
相に懸濁するようになり、これは約100ppbの濃度
に相当する。次いで、他のダイオキシン異性体について
も同一の工程を実施した。次にマイクロタイタープレー
トのウェルに入れられた種々の割合の希釈物が懸濁TC
ODによって調製され、抗体を加えて競合113A測定
を行った。競合1j1.lsA測定のf−法は次の文献
に詳細に述べられている: flute、 W、 Il
、 (1984)“Practi−cal Immu
noassay: T11+! 5LaL(! o
r Lhe Art”、 MarcelDekk
er、 Inc、、 N、Y、、 N、Y、。
モノクローナル抗体c体の結合1,1異性を特徴づける
ことについて成功したのは、主として、信頼できる競合
ELIS^測定プ1−+1−コルを開発したことによる
。好ましい測定法によれば、まず1表Iに挙げられる種
々の化合物をヘキサンに10μlmの割合で添加した貯
蔵溶液を調製する。ヘキサン溶液の10μlを小バイア
ルに入れ、窒素ガス気流下でエバボレートし、リン酸緩
衝化食導水を用いたlll1g/ml BSA溶液(B
S八へ、1%が添゛加されている)500μffiを加
える。そのバイアルに栓をし、超音波洗浄水槽中に2時
間入れる。2時間音波処理を行うと1時間行った場合よ
りも再現性がよい。音波処理の間にヘキサンは完全にエ
バポレートされるようであり、ダイオキシンを含む水性
溶液が残留する。
ことについて成功したのは、主として、信頼できる競合
ELIS^測定プ1−+1−コルを開発したことによる
。好ましい測定法によれば、まず1表Iに挙げられる種
々の化合物をヘキサンに10μlmの割合で添加した貯
蔵溶液を調製する。ヘキサン溶液の10μlを小バイア
ルに入れ、窒素ガス気流下でエバボレートし、リン酸緩
衝化食導水を用いたlll1g/ml BSA溶液(B
S八へ、1%が添゛加されている)500μffiを加
える。そのバイアルに栓をし、超音波洗浄水槽中に2時
間入れる。2時間音波処理を行うと1時間行った場合よ
りも再現性がよい。音波処理の間にヘキサンは完全にエ
バポレートされるようであり、ダイオキシンを含む水性
溶液が残留する。
A−トリC0D−R5^で被覆されたマイクロタイター
は。
は。
オボアルブミンの3%溶液で阻害され、そして音波処理
されたダイオキシン−BSAの各種2倍希釈液(100
ppb−0,1ppbの範囲にわたる)が調製される。
されたダイオキシン−BSAの各種2倍希釈液(100
ppb−0,1ppbの範囲にわたる)が調製される。
上記プレートの各ウェルの音波処理ダイオキシン−BS
A溶液100μlは2等容量の抗体と混合される。
A溶液100μlは2等容量の抗体と混合される。
この抗体は、 BS八に吸着されたダイオキシン、お
よびプレート上のA−)すCDD−BSAの間で分配さ
れる。
よびプレート上のA−)すCDD−BSAの間で分配さ
れる。
第1図のグラフは、モノクローナル抗体DD−1を用い
た競合IELIsA測定の結果を示す。このグラフには
、他の抗体を使用した不法の結果も示されている。^−
トすC1)+1−11s^はマイクロタイタープレート
のウェル表面I−に吸着された。表に示される種々の競
合物:は、ウシ胎児血清−I′ルブミン(nsA )を
含有する生理食塩水中に懸i’!lThされた。これら
の溶液は、ダイオキシンのへ−1−リン溶液10μlと
生理食塩水−BSA 500711.とを音波処理する
ことにより調製された。これらのダイオキシン−BSA
溶液の各種の希釈物は3次に、 100〜0.2pp
bの範囲とされ、マイクロタイターウェルに入れられた
。次に。
た競合IELIsA測定の結果を示す。このグラフには
、他の抗体を使用した不法の結果も示されている。^−
トすC1)+1−11s^はマイクロタイタープレート
のウェル表面I−に吸着された。表に示される種々の競
合物:は、ウシ胎児血清−I′ルブミン(nsA )を
含有する生理食塩水中に懸i’!lThされた。これら
の溶液は、ダイオキシンのへ−1−リン溶液10μlと
生理食塩水−BSA 500711.とを音波処理する
ことにより調製された。これらのダイオキシン−BSA
溶液の各種の希釈物は3次に、 100〜0.2pp
bの範囲とされ、マイクロタイターウェルに入れられた
。次に。
等量のDD−1モノク「l−ナル抗体を添加し、そして
1時間反応させた。この抗体は、プレート」二の八−ト
リC0D−BSA 、または溶液中のダイオキシンに結
合する。1時間の反応後に、溶液相を除去し、プレート
を洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリンとともに、再び1時間インキュベートする。二
度目の洗浄を行い、そして。
1時間反応させた。この抗体は、プレート」二の八−ト
リC0D−BSA 、または溶液中のダイオキシンに結
合する。1時間の反応後に、溶液相を除去し、プレート
を洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリンとともに、再び1時間インキュベートする。二
度目の洗浄を行い、そして。
基質(IIBTs)を上記ペルオキシダーゼに加えた。
上記酵素−抗体結合物およびノ1(質は「現像剤」とし
て機能し、プレート上でA−1−リCDD−R3Aに結
合したDD−1を可視化する。結果は、競合物が存在し
ない場合のウェル内の応答に比較した割合として表され
る。この例において、 DD−1はオクタクロロジベン
ゾダイオキシンと反応しない。約20ppbの2゜3.
7.8−TCODにおいて、比較I!LIS^応答は、
対照の半分である。このことは、 00−1抗体の半分
が溶液相のダイオキシンに結合し、そして、半分はプレ
ート上の八−トリC0D−1?SAに結合したことを示
す。
て機能し、プレート上でA−1−リCDD−R3Aに結
合したDD−1を可視化する。結果は、競合物が存在し
ない場合のウェル内の応答に比較した割合として表され
る。この例において、 DD−1はオクタクロロジベン
ゾダイオキシンと反応しない。約20ppbの2゜3.
7.8−TCODにおいて、比較I!LIS^応答は、
対照の半分である。このことは、 00−1抗体の半分
が溶液相のダイオキシンに結合し、そして、半分はプレ
ート上の八−トリC0D−1?SAに結合したことを示
す。
1.2,3.7. (8)−TCODについては、 5
0%阻害は約4 ppbにおいて起こり、このことは、
DD−1が2.3.7.8−TCDDよりも選択的に
1.2,3.7(8)−TCODと結合することを示す
。
0%阻害は約4 ppbにおいて起こり、このことは、
DD−1が2.3.7.8−TCDDよりも選択的に
1.2,3.7(8)−TCODと結合することを示す
。
この試験をもとにし、さらに研究を進めるために5つの
ハイブリドーマ(00−1,DD−2,DD−4,DD
−5およびDD−6と命名される)が選抜された。表■
はこの分析を2種々のダイオキシン、ジベンゾフラン、
PCBおよび他のクロル化炭化水素に用いたときの、
これらの抗体の特異性を示す。
ハイブリドーマ(00−1,DD−2,DD−4,DD
−5およびDD−6と命名される)が選抜された。表■
はこの分析を2種々のダイオキシン、ジベンゾフラン、
PCBおよび他のクロル化炭化水素に用いたときの、
これらの抗体の特異性を示す。
第1図のグラフおよび表■は、競合物としていくつかの
クロル化化合物を用いた典型的な競合データを示す。そ
のようなデータから、抗体の結合を50%(I5゜)だ
け阻害するのに必要な濃度を決定することができる。表
Hには抗体を用いて試験したすべての化合物に対するI
、。が挙げられている。
クロル化化合物を用いた典型的な競合データを示す。そ
のようなデータから、抗体の結合を50%(I5゜)だ
け阻害するのに必要な濃度を決定することができる。表
Hには抗体を用いて試験したすべての化合物に対するI
、。が挙げられている。
これらの値を報告する際には、2つの要素が非常に中I
y1である。6つの抗体すべてがテトラクロロジ・\メ
ゾダイオキシン類に対して高い親和性を有し、 1,3
,7.8異性体混合物に対して最も高い親和性を有する
。それらは、 2,3,7.8−TCDDおよび2,3
゜7.8 TCIIIIFに対してはやや低い親和性を
有する。
y1である。6つの抗体すべてがテトラクロロジ・\メ
ゾダイオキシン類に対して高い親和性を有し、 1,3
,7.8異性体混合物に対して最も高い親和性を有する
。それらは、 2,3,7.8−TCDDおよび2,3
゜7.8 TCIIIIFに対してはやや低い親和性を
有する。
+111./lは1.2’、3,6.7.8−ヘキサ−
CIIDとある程度の反応性を1.1つ。試験を行った
最も高い濃度(100ppb)までの範囲において、す
べての抗体はへキサクロロ−DIll’ 、オクタクロ
ロ−DBF、オクタクロロ−〇〇およびpcrt 類に
反応しないか、あるいはかろうじて反応する程度である
。これらの抗体の結合特異性はJl:常に望ましい。な
ぜなら、それらは、ダイオキシンおよびジベンゾフラン
異性体のうちの最も毒性のあるものに、1、す’M J
J<的に結合するからである。
CIIDとある程度の反応性を1.1つ。試験を行った
最も高い濃度(100ppb)までの範囲において、す
べての抗体はへキサクロロ−DIll’ 、オクタクロ
ロ−DBF、オクタクロロ−〇〇およびpcrt 類に
反応しないか、あるいはかろうじて反応する程度である
。これらの抗体の結合特異性はJl:常に望ましい。な
ぜなら、それらは、ダイオキシンおよびジベンゾフラン
異性体のうちの最も毒性のあるものに、1、す’M J
J<的に結合するからである。
我々の経験からl:1.1% 1.1″るマウスは異な
る結合特異性および親和1−1のり1:I−ンを生産す
る。各マうスはひとつのIK l+にに対し゛C応答す
るという点において、はぼ’1.’+有である。同一・
のマウスからの複数のクローンは、しばしば非常に類似
している。
る結合特異性および親和1−1のり1:I−ンを生産す
る。各マうスはひとつのIK l+にに対し゛C応答す
るという点において、はぼ’1.’+有である。同一・
のマウスからの複数のクローンは、しばしば非常に類似
している。
それゆえ、我々は、異なるマウスから一組のモノクロー
ナル抗体を誘導することに興味をもった。
ナル抗体を誘導することに興味をもった。
我々は同一の基本的プロトコルを用いて、異なったマウ
スから5つのハイブリドーマを選択した。
スから5つのハイブリドーマを選択した。
すべてが2.3,7.8−TCDllを認識する。これ
らの分析は高度に再現性があり、 TCDDについて繰
り返して測定を行うと、 Is。値の変動は20%未満
であった。
らの分析は高度に再現性があり、 TCDDについて繰
り返して測定を行うと、 Is。値の変動は20%未満
であった。
これらの細胞系は寄託することが予定されており、 、
ATCC受託機関で維持される。
ATCC受託機関で維持される。
試11−g′)−分4屋
ダイオキシンおよびジベンゾフランの存在を決定する試
験方法としては、ノに本市には1本明細書中で述べた」
こ記lfL体を使用した競合1’it、Is^測定がま
た。採用される。これらのシ1(利は、土壌試料。
験方法としては、ノに本市には1本明細書中で述べた」
こ記lfL体を使用した競合1’it、Is^測定がま
た。採用される。これらのシ1(利は、土壌試料。
組織試料または食物試料であり得る。これらの試料は、
まず、ダイオキシンまたはジベンゾフランを抽出してそ
れらが定量的に媒質(免疫分析の方法に適する)中に移
行するように前処理される。
まず、ダイオキシンまたはジベンゾフランを抽出してそ
れらが定量的に媒質(免疫分析の方法に適する)中に移
行するように前処理される。
土壌試料は1例えば9次のプロトコルに従って処理され
る。まず、ダイオキシンまたはジベンゾフランが、標準
EPA法613に従い、ヘキサン中に抽出される。この
時点において、その抽出物は。
る。まず、ダイオキシンまたはジベンゾフランが、標準
EPA法613に従い、ヘキサン中に抽出される。この
時点において、その抽出物は。
1もしくはそれ以上の清浄工程を経て妨害物質が除去さ
れる。これについては、詳細に後述する。
れる。これについては、詳細に後述する。
その後、その試料はほぼ乾固するまで濃縮される。
この時点において、試料残渣は生理食塩水溶液中に再懸
濁される。その生理食塩水溶液を約2時間音波処理する
ことにより、再現性があり信頼しうる結果が得られる。
濁される。その生理食塩水溶液を約2時間音波処理する
ことにより、再現性があり信頼しうる結果が得られる。
このことにより、毒物の存在をppbの範囲で同定する
ことが可能な満足すべき測定が達成される。制御された
量の洗浄剤を添加することにより感度が劇的に改善され
る。好ましい洗浄剤は、 CutscumTI4およ
びトウィーン20である。これらの洗浄剤の濃度を約0
.05体積%に減少させることにより、ダイオキシンま
たはジベンゾフランを検出する分Jj1においてその感
度を著しく改善することができることをIQ )ンは見
い出した。
ことが可能な満足すべき測定が達成される。制御された
量の洗浄剤を添加することにより感度が劇的に改善され
る。好ましい洗浄剤は、 CutscumTI4およ
びトウィーン20である。これらの洗浄剤の濃度を約0
.05体積%に減少させることにより、ダイオキシンま
たはジベンゾフランを検出する分Jj1においてその感
度を著しく改善することができることをIQ )ンは見
い出した。
ダイオキシンまたはジベンゾフランは数Pl)hという
低濃度で検出される。
低濃度で検出される。
上記試料り、12次に、マイク1.1タイタープレート
に入れられ、抗体が添加され、競合ELIS^測定が行
われる。この試料は1次に2回収され、マイクロコンピ
ュータ−で分析される。この方法は、さらに、以下の実
施例により述べられる。
に入れられ、抗体が添加され、競合ELIS^測定が行
われる。この試料は1次に2回収され、マイクロコンピ
ュータ−で分析される。この方法は、さらに、以下の実
施例により述べられる。
(実施例)
本発明を実施例につき記載する。
尖旌炭上
湿土壌10gを5QOmeの褐色の容器に計量し、硫酸
ナトリウム20gと充分に混合する。メタノール20m
1lおよびヘキサン150mff1を加え、混合物を少
なくとも3時間振盪する。その混合物からヘキサン層を
デカントし、濾過し、ロータリーエバボレートで容量を
1 ml、に減らず。その残渣を短いディスポーザブル
りlI7トグラフイーカラム(シリカゲルまたはアル
ミナ、1g)にかけ、ヘキサンまたは20%メチレンク
ロリド/ヘキサンでそれぞれ溶出する。その溶媒を乾燥
窒素ガス気流下で除去し、残渣を免疫分析法に適したも
のとする。
ナトリウム20gと充分に混合する。メタノール20m
1lおよびヘキサン150mff1を加え、混合物を少
なくとも3時間振盪する。その混合物からヘキサン層を
デカントし、濾過し、ロータリーエバボレートで容量を
1 ml、に減らず。その残渣を短いディスポーザブル
りlI7トグラフイーカラム(シリカゲルまたはアル
ミナ、1g)にかけ、ヘキサンまたは20%メチレンク
ロリド/ヘキサンでそれぞれ溶出する。その溶媒を乾燥
窒素ガス気流下で除去し、残渣を免疫分析法に適したも
のとする。
上記クロマトグラフィーカラムにかける目的は。
分析を妨害する土壌中のいかなる余分な物質をも除去す
ることである。土壌は、ヘキサンに可溶な有機物を多量
に含有し、ダイオキシンは、免疫分析に使用される溶媒
に優先して、該有機物中に分配される。その結果、ダイ
オキシンは抗体と結合しなくなる。ある種の土壌のタイ
プについては。
ることである。土壌は、ヘキサンに可溶な有機物を多量
に含有し、ダイオキシンは、免疫分析に使用される溶媒
に優先して、該有機物中に分配される。その結果、ダイ
オキシンは抗体と結合しなくなる。ある種の土壌のタイ
プについては。
クロマトグラフィー処理を行わないと免疫分析がうまく
行われない。上記2つの条件においては。
行われない。上記2つの条件においては。
分析が同様にうまく達成され、さらに他の条件下におい
ても達成され得る。この方法により組織および食物の試
料についても同様に分析がなされ得る。
ても達成され得る。この方法により組織および食物の試
料についても同様に分析がなされ得る。
実施例2
ヘキサンに溶解させた土壌抽出物または試料化合物を乾
燥させ、洗浄剤(例えばCu tscum” )の5%
(v/v)メタノール溶液5μiを添加する。次に、こ
のメタノールをN2気流下でエバボレートする。リン酸
塩緩衝化食塩水500tt l (0,01Mリン酸塩
、 0.IM NaCl、 pH7,2) (PH1
−7) 500/71が加えられ2反応バイアノ囚J密
栓される。このバイアルを次に、 1lransoni
c 220超音波洗浄器に入れ。
燥させ、洗浄剤(例えばCu tscum” )の5%
(v/v)メタノール溶液5μiを添加する。次に、こ
のメタノールをN2気流下でエバボレートする。リン酸
塩緩衝化食塩水500tt l (0,01Mリン酸塩
、 0.IM NaCl、 pH7,2) (PH1
−7) 500/71が加えられ2反応バイアノ囚J密
栓される。このバイアルを次に、 1lransoni
c 220超音波洗浄器に入れ。
30分間音波処理を11・う。次に、この検体のダイオ
キシン含量を競合ri1.Is^測定法により滴定して
測定する。
キシン含量を競合ri1.Is^測定法により滴定して
測定する。
本発明の好適な実施態様についての前記記載は。
例示および説明のために行われζいる。それは完全な記
載を意図しだらのではなく、また2本発明を詳細な形で
開示して限定するものでもない。そして、上記教示を考
慮すると、明らかに、多くの修飾および改変が可能であ
る。その実施態様は。
載を意図しだらのではなく、また2本発明を詳細な形で
開示して限定するものでもない。そして、上記教示を考
慮すると、明らかに、多くの修飾および改変が可能であ
る。その実施態様は。
本発明およびその実際的適用の原理を最もよく説明する
ために選IRされ、記載された。それゆえ。
ために選IRされ、記載された。それゆえ。
当業者が1種々の実施態様および種々の修飾により1本
発明を特徴とする特定の使用に最も適した形として使用
するのを可能にする。本発明の権利範囲は、ここに添付
される特許請求の範囲により示される。
発明を特徴とする特定の使用に最も適した形として使用
するのを可能にする。本発明の権利範囲は、ここに添付
される特許請求の範囲により示される。
(発明の要約)
本発明は、ダイオキシンおよびジベンゾフランと反応す
る5つのモノクローナル抗体、およびこれらのモノクロ
ーナル抗体を生産する5つのハイプリドーマを開示する
。
る5つのモノクローナル抗体、およびこれらのモノクロ
ーナル抗体を生産する5つのハイプリドーマを開示する
。
さらに本発明は、ダイオキシンおよびジベンゾフランに
対して鋭敏な免疫分析に、これらの抗体を用いる方法を
提供する。この方法によれば、試料中に数1)pbの範
囲の濃度で存在する。これらの汚染物質を検出し得る。
対して鋭敏な免疫分析に、これらの抗体を用いる方法を
提供する。この方法によれば、試料中に数1)pbの範
囲の濃度で存在する。これらの汚染物質を検出し得る。
第1図は1本発明の方法を実施したときの競合物の濃度
に対するELISA応答の割合を示すグラフである。 以上
に対するELISA応答の割合を示すグラフである。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマまた
はその子孫であって、 該モノクローナル抗体がポリハロゲン化ジベンゾ−p−
ダイオキシンおよびポリハロゲン化ジベンゾフランの1
またはそれ以上の有毒な異性体に特異的であり、かつ他
の芳香族化合物との反応性を有さない、 ハイブリドーマまたはその子孫。 2、前記有毒な異性体が以下の化合物である、特許請求
の範囲第1項に記載のハイブリドーマ:2,3,7,8
−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン、 1,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキ
シン、 1,2,3,7−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキ
シン。 1,2,3,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキ
シン。 1,2,3,7,8−ペンタクロロジベンゾ−p−ダイ
オキシン、 2,3,7,8−テトラブロモジベンゾ−p−ダイオキ
シン、そして 2,3,7,8−テトラクロロジベンゾフラン。 3、前記有毒なダイオキシンの異性類似体により免疫化
されたマウスの脾臓細胞に由来し、該有毒なダイオキシ
ン異性体に特異的な結合親和力によって選別される、 特許請求の範囲第1項に記載のハイブリドーマ。 4、ポリハロゲン化ジベンゾ−p−ダイオキシンおよび
ポリハロゲン化ジベンゾフランの有毒な異性体に対して
特異的な親和力を有する、 モノクローナル抗体。 5、前記有毒な異性体が以下の化合物である、特許請求
の範囲第4項に記載のモノクローナル抗体: 2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキ
シン、 1,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキ
シン、 1,2,3,7−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキ
シン、 1,2,3,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキ
シン、 1,2,3,7,8−ペンタクロロジベンゾ−p−ダイ
オキシン、 2,3,7,8−テトラブロモジベンゾ−p−ダイオキ
シン、そして 2,3,7,8−テトラクロロジペンゾフラン。 6、表IIに与えられるような、おおよその親和力によっ
て特徴付けられる、 特許請求の範囲第4項に記載のモノクローナル抗体。 7、ダイオキシンまたはジベンゾフランの有毒な異性体
を検出する方法であって、 a)該異性体をハイブリドーマから得られたモノクロー
ナル抗体と接触させること、およびb)結合抗体の量を
測定すること、を包含する方法であり、 該ハイブリドーマが、ポリハロゲン化ジベンゾ−p−ダ
イオキシンおよびポリハロゲン化ジベンゾフランの1ま
たはそれ以上の有毒な異性体に特異的であり、かつ他の
芳香族化合物との反応性を有さないモノクローナル抗体
を分泌する、 検出方法。 8、前記異性体が試料から抽出され、音波処理によって
、洗剤を含有する生理食塩水中に再懸濁される、 特許請求の範囲第7項に記載の方法。 9、前記結合抗体が競合ELISA試験法によって測定
される、 特許請求の範囲第7項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/877,909 US4798807A (en) | 1986-06-24 | 1986-06-24 | Monoclonal antibodies and method for detecting dioxins and dibenzofurans |
US877909 | 1992-05-01 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6314691A true JPS6314691A (ja) | 1988-01-21 |
Family
ID=25370971
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62155270A Pending JPS6314691A (ja) | 1986-06-24 | 1987-06-22 | モノクロ−ナル抗体,およびそれを用いたダイオキシンおよびジベンゾフランの検出方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4798807A (ja) |
EP (1) | EP0251635B1 (ja) |
JP (1) | JPS6314691A (ja) |
AT (1) | ATE109825T1 (ja) |
CA (1) | CA1305929C (ja) |
DE (1) | DE3750354T2 (ja) |
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