JPS63137697A - Analytical element for measuring alkaline phosphatase activity - Google Patents
Analytical element for measuring alkaline phosphatase activityInfo
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Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、液体試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性
を測定するための多層分析素子に係り、更に詳しくは、
水性液体試料の分析、特に体液を試料とする臨床検査に
有用なアルカリ性ホスファターゼ活性測定用多層゛分析
素子に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a multilayer analytical element for measuring alkaline phosphatase activity in a liquid sample, and more specifically,
The present invention relates to a multilayer analytical element for measuring alkaline phosphatase activity useful for the analysis of aqueous liquid samples, particularly for clinical tests using body fluid samples.
臨床検査上、人の体液中のアルカリ性ホスファターゼの
活性を測定することは極めて重要である。すなわち、骨
腫瘍を含む骨疾患、閉塞性黄痘を始めとする肝障害等の
診断に体液中のアルカリ性ホスファターゼ（以下、ＡＬ
Ｐと略す）活性の測定がなされてきた。In clinical testing, it is extremely important to measure the activity of alkaline phosphatase in human body fluids. In other words, alkaline phosphatase (hereinafter referred to as AL
P) activity has been measured.
ムＬＰ活性の測定法は、１！、 Ｄ、ケイ（Ｌ Ｄ、
ｍａｙ ）の方法〔ジャーナル オプ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ、 Ｂ１１１． Ｃｈ＠ｍ、 ）第８
９巻ｇ２３５頁（１９５０））以来種々の方法が検討が
なされてきた。それらのうちでＩｎ、 Ｊ、キング（１
！！、、Ｔ。The method for measuring MuLP activity is 1! , D, Kay (LD,
may) method [Journal of Biological Chemistry (J, B111. Ch@m, ) No. 8
Since then, various methods have been studied. Among them In, J. King (1
! ! ,,T.
Ｋｉｎｇ） （ザ バイオケミカル ジャーナル（Ｂ工
ｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ）第５５巻第１１８５頁（１９５
９））等によって開発されたアリールホスフェート類、
更Ｋｔｊ： ｐ−二トロフェニルホスフ！−）ｅＪ［と
して導入したことが測定方法の簡便化に著るしい効果を
もたらした。次いで至適ｐＨ１及びリン酸のトラップ剤
としてのアミノアルコール類、活性化剤としてのマグネ
シウムイオンの存在が明確になＣｐ−ニトロフェニルホ
スフェートジナトリウム塩を基質とするＩｙｃｃ法（ク
リニカケミカ アクタＣ０１ｉｎ、 Ｏｈｅｍｉｃａ
Ａａｔａ ）（１９８５）５５９Ｆ−５６７ＩＦ）とし
て確立された。King) (The Biochemical Journal (Bochem, J, ) Vol. 55, p. 1185 (195
9)) Aryl phosphates developed by et al.
Sara Ktj: p-nitrophenylphosph! -)eJ[ has had a significant effect on simplifying the measurement method. Next, the Iycc method (Clinica Chemica Acta C01in, Ohmica Co., Ltd.
(1985) 559F-567IF).
更に、臨床検査の領域において、簡便で迅速な測定を求
める強い要請から近年乾式分析法、特に取扱いの簡便な
多層分析素子が開発され、ＡＬＰ測定においてもヨーロ
ツノく特許出願公開第１５２８５０号公報に記載された
透明支持体上に、親水性バインダーを含む試薬層及び多
孔性展開層を有する多層分析素子が知られている。Furthermore, in the field of clinical testing, due to the strong demand for simple and quick measurements, dry analysis methods, especially easy-to-handle multilayer analytical elements, have been developed in recent years, and also for ALP measurements, which is described in European Patent Application Publication No. 152850. A multilayer analytical element is known that has a reagent layer containing a hydrophilic binder and a porous spreading layer on a transparent support.
更には、特公昭Ａｓ−５４８７２号公報に記載すれたｐ
−ニトロフェニル ホスフェートの有機アミン塩を用い
た分析素子に適用したものが、特開昭６１−１１００５
８号公報に記載されている。Furthermore, p described in Japanese Patent Publication No. Sho As-54872
JP-A No. 61-11005 applied it to an analytical element using an organic amine salt of -nitrophenyl phosphate.
It is described in Publication No. 8.
しかしながら、これらは十分な感度、及び安定性を有し
ているとは言い難い。However, it cannot be said that these have sufficient sensitivity and stability.
本発明の目的は、感度を増大させただけでなく、安定性
をも飛躍的に増大させたＡＩ＋Ｐ活性測定用分析素子を
提供することにある。An object of the present invention is to provide an analytical element for measuring AI+P activity that not only has increased sensitivity but also dramatically increased stability.
本発明を概説すれば、本発明はＡＬＰ活性測定用分析素
子に関する発明であって、透明支持体上に試薬層及び多
孔性展開層を有する、液体試料中のＡＬＰ活性を測定す
るための分析素子において、該素子が、酸化型ニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチド リン酸又はその塩
、脱水素酵素、該酵素の基質、電子伝達剤、色素形成性
前駆物質及び緩衝剤を含んでいることを特徴とする。To summarize the present invention, the present invention relates to an analytical element for measuring ALP activity, which is an analytical element for measuring ALP activity in a liquid sample, which has a reagent layer and a porous spreading layer on a transparent support. The device is characterized in that it contains oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or a salt thereof, a dehydrogenase, a substrate for the enzyme, an electron transfer agent, a pigment-forming precursor, and a buffer.
本発明において、ＡＬＰの基質としては、酸化型ニコチ
ンアミド アデニン ジヌクレオチドリン酸（以下、Ｎ
ＡＩ）Ｐ＋と略す）又はその塩を用いる。基質であるＮ
ＡＤＰ＋は、好ましくは多孔性展開層に含有される。多
孔性展開層中のＮＡＤＰ”は、至適ｐＴ１条件下で液体
試料中のＡＩ＋Ｐにより、酸化型ニコチンアミド アデ
ニン ジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略す）、及び
リン酸又はその塩に変成される。生成した１ｉＡＤ＋は
試薬層中の脱水素酵素及び前記脱水素酵素の基質と共に
反応して、遺元型ニコチンアミド アデニンジヌクレオ
チド（以下、ＮＡＤＨ２と略す）を生成する。この際、
脱水素酵素は、ＮＡＤ＋依存のものであることが必要で
ある。In the present invention, the substrate for ALP is oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter, N
AI) P+) or a salt thereof is used. The substrate N
ADP+ is preferably contained in the porous spreading layer. NADP'' in the porous spreading layer is denatured by AI+P in the liquid sample under optimal pT1 conditions into oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter abbreviated as NAD+) and phosphoric acid or its salt. The 1iAD+ reacts with the dehydrogenase in the reagent layer and the substrate of the dehydrogenase to generate original nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter abbreviated as NADH2). At this time,
The dehydrogenase needs to be NAD+ dependent.
生成したＭＡＤＨ，の吸収を５６０ ｎｍで反射濃度を
測定することにより、ＡＬＰ活性を決定することは十分
可能である。It is fully possible to determine ALP activity by measuring the reflection density of the generated MADH at 560 nm.
更に、生成したＨＡＤ−とテトラゾリウム塩を、電子伝
達剤の共存下、ホルマザン色素に導くことで、大幅な感
度上昇が可能である。Furthermore, by introducing the generated HAD- and tetrazolium salt to the formazan dye in the coexistence of an electron transfer agent, it is possible to significantly increase the sensitivity.
本発明で用いられるムＬＰ活性測定のための反応を説明
したが、以下にその反応式を示す。The reaction for measuring MuLP activity used in the present invention has been described, and the reaction formula is shown below.
ＩＪＰ
ＮＡＤＰ” −一→リン酸＋ ＮＡＤ”前記反応は、特
開昭６１−９２８６号公報に記載されている。しかし壜
から、該公報に開示された方法は、反応を２段階から数
段階に分けて実施せざるを得ない。IJP NADP"-1→phosphoric acid+NAD"The above reaction is described in JP-A-61-9286. However, due to the nature of the bottle, the method disclosed in the publication must carry out the reaction in two to several stages.
しかしながら、本発明に従えば、試料を点着するのみで
測定が可能である。However, according to the present invention, measurement can be performed simply by spotting a sample.
更に本発明素子の層構成について詳細に説明する。Furthermore, the layer structure of the device of the present invention will be explained in detail.
本発明のムＬＰ活性測定用多層分析素子は支持体として
、光透過性かつ水不浸透性のものが好ましい。光透過性
、水不浸透性支持体の例として、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリス
チレン、セルロースエステル（例ｔばセルロースジアセ
テート、セルローストリアセテート、セルロースアセテ
ートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５
０μ惰から約１−の範囲のフィルム好ましくは約８０μ
惧から約５００μ惰の範囲のフィルム又はシート状の透
明支持体を挙げることができる。支持体の表面には必要
に応じて、下塗シ層を設けることができる。゛これは、
支持体上に設けられる試薬層又はその他の層と支持さと
の接着を強固にすることができる。また、下塗り層の代
りに支持体の表面を物理的又は化学的な活性化処理を施
し、接着力の強化を図っても良い。In the multilayer analytical element for measuring muLP activity of the present invention, the support is preferably one that is transparent to light and impermeable to water. Examples of light-transparent, water-impermeable supports include polymers such as polyethylene terephthalate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, and cellulose esters (e.g., cellulose diacetate, cellulose triacetate, cellulose acetate propionate, etc.). About 5
Films ranging from 0μ to about 1- preferably about 80μ
Mention may be made of transparent supports in the form of films or sheets with a diameter ranging from about 500 μm to about 500 μm. An undercoat layer can be provided on the surface of the support, if necessary.゛This is
It is possible to strengthen the adhesion between the reagent layer or other layer provided on the support and the support. Further, instead of the undercoat layer, the surface of the support may be subjected to a physical or chemical activation treatment to strengthen the adhesive force.
支持体上には（場合によっては下塗シ層等の他の層を介
して）試薬層が設けられる。本発明のムＬＰ活性測定用
多層分析素子に偏見られる試薬層は、親水性バインダー
より成る層、すなわち水を吸収して膨潤する親水性ポリ
マーを層形成剤として用いることが好ましい。試薬層の
製造に用いることができる親水性ポリマーは、一般に水
吸水時の膨潤度が、５０℃で約１５（１ｑＩ６から約２
００（１％好ましくは約２５０チから約１５００−の範
囲の天然又は合成親水性ポリマーである。このような親
水性ポリマーの例としては特開昭５９−１７１８６４号
公報等に開示されているゼラチン（例えば酸処理ゼラチ
ン、脱イオン化ゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、７
タル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフト化ゼ
ラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、
ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルアルコール等カ挙げられる。A reagent layer is provided on the support (depending on the case, via another layer such as an undercoat layer). The reagent layer of the multilayer analytical element for measuring muLP activity of the present invention is preferably a layer made of a hydrophilic binder, that is, a hydrophilic polymer that swells by absorbing water is used as a layer forming agent. Hydrophilic polymers that can be used to manufacture the reagent layer generally have a swelling degree of about 15 (from 1 qI6 to about 2 qI6) at 50°C when water is absorbed.
00 (1%), preferably a natural or synthetic hydrophilic polymer in the range of about 250 to about 1500. Examples of such hydrophilic polymers include gelatin disclosed in JP-A-59-171864, etc. (e.g. acid-treated gelatin, deionized gelatin, etc.), gelatin derivatives (e.g., 7
gelatin, hydroxyacrylate grafted gelatin, etc.), agarose, pullulan, pullulan derivatives,
Examples include polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, and polyvinyl alcohol.
試薬層は、乾燥時の厚さが約１μ惧から約１００μ悔の
範囲が好ましく、更に好ましくは約５−から約４５μ鴨
の範囲である。また、試薬層は実質的に透明であること
が好ましい。Preferably, the reagent layer has a dry thickness ranging from about 1 micron to about 100 microns, more preferably from about 5 to about 45 microns. Moreover, it is preferable that the reagent layer is substantially transparent.
試薬層には、脱水素酵素、及び前記脱水素酵素の基質を
含有する。脱水素酵素は、ＮＡＤ＋依存性のものが好ま
しい。The reagent layer contains a dehydrogenase and a substrate for the dehydrogenase. The dehydrogenase is preferably NAD+ dependent.
本発明に用いられる脱水素酵素は、「酵素ハンドブック
」（丸尾文治、田宮信雄監修、１９８２年、朝倉書店発
行）に詳述されているが酵素番号としては１．１．１．
．１．２．１．．１．５．１．．１．４．１．．１、５
．１．．１．８．１．で分類される酵素の中から選択さ
れる。The dehydrogenase used in the present invention is detailed in the "Enzyme Handbook" (edited by Bunji Maruo and Nobuo Tamiya, published by Asakura Shoten in 1982), and the enzyme number is 1.1.1.
．． 1.2.1. ．． 1.5.1. ．． 1.4.1. ．． 1, 5
．． 1. ．． 1.8.1. Selected from among the enzymes classified by.
本発明に用いられる脱水素酵素の代表例を以下に示す。Representative examples of dehydrogenases used in the present invention are shown below.
アルコール脱水素酵素（ＩＩｔｏｌ、 １．１．１ ）
、Ｄ＠−ブタンジオール脱水素酵素（ｚｃ １．１．
１．４ ）、アセトイン脱水素酵素（１０１，１，１，
５） 、グリセロール脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，６
） 、プロパンジオールホスフェート脱水素酵素（１！
ｉｏ １．１．１．７ ）、グリセロール−３−リン酸
脱水素酵素（１０１゜１．１．８）、Ｄ−中シルロール
脱水素酵素（Ｉｆ：０１゜１．１．９）、Ｄ−アラビニ
トール脱水素酵素（ＥＣ１，１，１，１０） 、Ｌ−ア
ラビニトール脱水素酵素（ｌｌ１０１．１．１．１５
） 、Ｄ−又は−−イブイトール脱水素酵素（１０１，
１，１，Ｉ Ａ又は１０１．１．Ｌ１５）、ガラクチト
ール脱水素酵素（ｍａ １．１．１．１６ ）、マンニ
トール−１−リン酸脱水素酵素（ＫＯｌ、１．１゜１７
）、ミオ−イノシトール脱水素酵素（ＩＣＣＩ。Alcohol dehydrogenase (IItol, 1.1.1)
, D@-butanediol dehydrogenase (zc 1.1.
1.4), acetoin dehydrogenase (101,1,1,
5) , glycerol dehydrogenase (EC1,1,1,6
), propanediolphosphate dehydrogenase (1!
io 1.1.1.7), glycerol-3-phosphate dehydrogenase (101°1.1.8), D-middle silurol dehydrogenase (If:01°1.1.9), D- Arabinitol dehydrogenase (EC1,1,1,10), L-arabinitol dehydrogenase (ll101.1.1.15
), D- or --ibuitol dehydrogenase (101,
1,1,I A or 101.1. L15), galactitol dehydrogenase (ma 1.1.1.16), mannitol-1-phosphate dehydrogenase (KOl, 1.1°17)
), myo-inositol dehydrogenase (ICCI).
１．１．１ａ ）、ＵＤＰグルコース脱水素酵素（１０
１゜１．１．２２）、ヒスチジノール脱水素酵素（ｍｃ
ｌ。1.1.1a), UDP glucose dehydrogenase (10
1゜1.1.22), histidinol dehydrogenase (mc
l.
１、１．２５ ）、キナ酸脱水素酵素（１０１，１，１
，２ａ ）、グリコール酸脱水素酵素（ＩＣＯ１，１，
１，２６）、乳酸脱水素酵素（１０１，１，１，２７又
はコ０１．１．１．２８）、グリセリン酸脱水素酵素（
１０１，１，１，２９）、ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（
ｙｒ、ｏ １．１．１．ｓ ｏ ） 、ｓ−ヒドロキシ
イソ酪酸脱水素酵素（Ｉｔ！０１．１．１．５１ ）、
メバロン酸脱水素酵素（ｘｃｌ、１．１．ｓ２）、５−
ヒドロ中ジアシルーＣｏム脱水素酵素（Ｘｏ １．１．
１゜３５）、リンゴ酸脱水素酵素（ＦｉＯ１，１，１，
５７又は］１：０１．１．１．５８又は１１ｔＯ１，１
，１，５９）、イソクエン酸脱水素酵素（１！！０１，
１．１．４１ ）、Ｌ−グロン酸脱水素酵素（］！ｔｏ
１．１．１．４５）、−−アラビノース脱水素酵素（Ｉ
Ｏｌ、１．１．４６）、ガラクトース脱水素酵素（１１
ｉＣ１，１，１，４８）、Ｓα−ヒドロキシ胆汁酸脱水
素酵素（ｌｌ１Ｏ１，１，１，５２）、２０β−ヒドロ
キシステロイド脱水素酵素（ｚａ １．ｔ、１．ｓ ｓ
）、リビトール脱水素酵素（ＦｉＯ１，１，１，５６
）、フルクツロン酸脱水素酵素（１０１，１，１，５７
）、タガッロン酸脱水素酵素（Ｋ Ｏ１，１，１，５８
）、３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素（ｍａｌ、
１．１．５９）、４−に：）’ｏ中クシ酪酸脱水素酵素
ｍａｔ、１．１．６１）、エストラジオール１７−β
脱水素酵素（ＩＣ１，１，１，６２）、テストステロン
脱水素酵素（１！ｉｏ １．１．１．６５ ）、ω−ヒ
ドロキシデカン酸脱水素酵素（］！ｉｏ １．１．１．
６６）、マンニトール脱水素酵素（１０１，Ｌｌ、６７
）、グルコン酸５−脱水素酵素（ＩＩ！０１．１．１
．６９）、グリセロナルデヒドー３−リン酸脱水素酵素
（ＫＯｌ、２゜１．１２ ）、５．６−シヒドロウラシ
ル脱水素酵素（１！！０１，５．１．１ ）、オクトピ
ン脱水素酵素（ＩＣ１，５，１，１１）、ヒポタウリン
脱水素酵素（ＦｉＯ１゜８．１．５）等が挙げられる。1,1.25), quinic acid dehydrogenase (101,1,1
, 2a), glycolic dehydrogenase (ICO1, 1,
1,26), lactate dehydrogenase (101,1,1,27 or co01.1.1.28), glycerate dehydrogenase (
101,1,1,29), hydroxybutyrate dehydrogenase (
yr, o 1.1.1. s o ), s-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (It!01.1.1.51),
Mevalonate dehydrogenase (xcl, 1.1.s2), 5-
Diacyl-Co dehydrogenase (Xo 1.1.
1゜35), malate dehydrogenase (FiO1,1,1,
57 or] 1:01.1.1.58 or 11tO1,1
, 1, 59), isocitrate dehydrogenase (1!!01,
1.1.41), L-gulonate dehydrogenase (]!to
1.1.1.45), -- arabinose dehydrogenase (I
Ol, 1.1.46), galactose dehydrogenase (11
iC1,1,1,48), Sα-hydroxy bile acid dehydrogenase (ll1O1,1,1,52), 20β-hydroxysteroid dehydrogenase (za 1.t, 1.s s
), ribitol dehydrogenase (FiO1,1,1,56
), fructuronic acid dehydrogenase (101,1,1,57
), tagallonate dehydrogenase (KO1,1,1,58
), 3-hydroxypropionate dehydrogenase (mal,
1.1.59), 4-:)'o combinbutyrate dehydrogenase mat, 1.1.61), estradiol 17-β
Dehydrogenase (IC1,1,1,62), Testosterone dehydrogenase (1!io 1.1.1.65), ω-Hydroxydecanoate dehydrogenase (]!io 1.1.1.
66), mannitol dehydrogenase (101, Ll, 67)
), gluconate 5-dehydrogenase (II!01.1.1
．． 69), glyceronaldehyde 3-phosphate dehydrogenase (KOl, 2°1.12), 5.6-sihydrouracil dehydrogenase (1!!01,5.1.1), octopine dehydration Examples include hypotaurine dehydrogenase (IC1, 5, 1, 11) and hypotaurine dehydrogenase (FiO1°8.1.5).
好ましい脱水素酵素としては乳酸脱水素酵素、アルコー
ル脱水素酵素が挙げられる。Preferred dehydrogenases include lactate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase.
ＭＡＤＥ、を検知するためには、前記試薬層には、脱水
素酵素及びその基質が含有されれば良い。In order to detect MADE, the reagent layer only needs to contain a dehydrogenase and its substrate.
この際、緩衝剤は試薬層に含有してもよく、又は試薬層
に隣接する別の層に含有しても良い。At this time, the buffer may be contained in the reagent layer or in another layer adjacent to the reagent layer.
更に、テトラゾリウム塩を用いる場合には、テトラゾリ
ウム塩化合物及び電子伝達剤を本発明の多層分析素子に
含有する必要がある。テトラゾリウム塩化合物を試薬層
に含有する場合、緩衝剤は隣接する別層に含有されるこ
とが好ましい。更に電子伝達剤は、その種類により試薬
層又は多孔性展開層又は緩衝剤層を除くその他の層に含
有される。電子伝達剤としては、ジアホラーゼ、フェナ
ジンメトサル７＝−ト、１−メトキシ−フェナジンメト
サルフェート、メルトラブル等が挙げられる。このうち
シアホラ−Δ
ゼ以外は、多孔性展開層又は緩衝剤層を除くその他の層
に含有することが好ましい。Furthermore, when using a tetrazolium salt, it is necessary to contain the tetrazolium salt compound and an electron transfer agent in the multilayer analytical element of the present invention. When the tetrazolium salt compound is contained in the reagent layer, the buffer is preferably contained in an adjacent separate layer. Further, depending on the type of electron transfer agent, it may be contained in the reagent layer, the porous development layer, or other layers except the buffer layer. Examples of the electron transfer agent include diaphorase, phenazine methosulfate, 1-methoxy-phenazine methosulfate, and meltlab. Among these, it is preferable that the components other than sheaphorase-Δase be contained in other layers except the porous development layer or the buffer layer.
一方、本発明に係る色素形成性前駆物質としては、テト
ラゾリウム塩類が通常用いられる。On the other hand, tetrazolium salts are usually used as the dye-forming precursor according to the present invention.
本発明において用いられる上記テトラゾリウム塩類は、
色素形成後はほとんどが水に対して難溶ないしは不活性
になシ、通常ウェット・ケミストリー法では使用が難し
いものの、形成される色素が耐拡散性であり、不所望の
りンギングを防止し、測定の定量性を向上させる点で、
好ましく使用することができる。The above tetrazolium salts used in the present invention are:
After pigment formation, most of the pigments are poorly soluble or inert in water, making them difficult to use with wet chemistry methods. In terms of improving the quantitative nature of
It can be preferably used.
本発明において有用とされる上記テトラゾリウム塩とし
ては、例えばＳ、Ｓ’−（５，５’−ジメトキシ−４，
４′−ビフェニレン）−ビス（２−（ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニルテトラソリウムクロリド〕、５．５
’−（５，５’−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン
）−ビス〔２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド
］、５−（’′ｔダージメチルー２−テア／＋フル）−
２，４−ジフェニルテトラゾリウムプロミド、’−（Ｐ
−ヨードフェニル）−２−（ｐ−二トロフェニル）−５
−フェニル−テトラゾリウムクロリド、２．２’。Examples of the above-mentioned tetrazolium salts useful in the present invention include S, S'-(5,5'-dimethoxy-4,
4'-biphenylene)-bis(2-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrasolium chloride], 5.5
'-(5,5'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)-bis[2,5-diphenyltetrazolium chloride], 5-(''tdadimethyl-2-thea/+fur)-
2,4-diphenyltetrazolium bromide,'-(P
-iodophenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5
-Phenyl-tetrazolium chloride, 2.2'.
５、ダーテトラー（ｐ−ニトロフェニル）−５，５’−
（５，５’−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）−
ジテトラゾリウムクロリド、２，５．５− ）ジフェニ
ルテトラゾリウムクロリド、５．５’−（５，５’−ジ
メトキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス−［２，５
−ビス（ｐ−ニトロフェニル）テトラゾリウムクロリド
］及び５ 、５１− （４、４１−ビフェニレン）−ビ
ス〔２，５−ジフェニルテトラゾリウムクロリド〕等を
挙げることができる。5, Dertetra (p-nitrophenyl)-5,5'-
(5,5'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)-
ditetrazolium chloride, 2,5.5- ) diphenyltetrazolium chloride, 5.5'-(5,5'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)-bis-[2,5
-bis(p-nitrophenyl)tetrazolium chloride] and 5,51-(4,41-biphenylene)-bis[2,5-diphenyltetrazolium chloride].
上記テトラゾリウム塩の中で好ましく用いられるものと
しては、５．５’−（５，５’−ジメトキシ−４，４’
−ビフェニレン）−ビス（２−（ｐ−二トロフェニル）
−５−フェニルテトラソリウムクロリド〕及び５ 、５
１− （４、４１−ビフェニレン）−ビス〔２，５−ジ
フェニルテトラゾリウムクロリド〕を挙げることができ
、本発明に係る第１の試薬層に含有させることが好まし
い。Among the above tetrazolium salts, those preferably used include 5,5'-(5,5'-dimethoxy-4,4'
-biphenylene)-bis(2-(p-nitrophenyl)
-5-phenyltetrasolium chloride] and 5,5
1-(4,41-biphenylene)-bis[2,5-diphenyltetrazolium chloride] can be mentioned, and it is preferably contained in the first reagent layer according to the present invention.
本発明に係る第１の試薬層及び第２の試薬層を構成する
バインダの特性は重要でちる。第２の試薬層のバインダ
は第１の試薬層のノくインダに対して不溶性を示す溶媒
により積層されることが望ましい。すなわち、第２の試
薬層のノ（イ／ダの溶媒が第１の試薬層のバインダを溶
解させないバインダの組合せが好ましい。例えば第１の
試薬層のバインダは水溶性ポリマーであり、第２の試薬
層のバインダは親水性且つ有機溶媒可溶性のポリマーの
組合せが好ましい。The properties of the binder constituting the first reagent layer and the second reagent layer according to the present invention are important. It is desirable that the binder of the second reagent layer is laminated using a solvent that is insoluble in the binder of the first reagent layer. That is, it is preferable to use a binder combination in which the solvent of the second reagent layer does not dissolve the binder of the first reagent layer. For example, the binder of the first reagent layer is a water-soluble polymer, and the binder of the second reagent layer is a water-soluble polymer. The binder of the reagent layer is preferably a combination of hydrophilic and organic solvent soluble polymers.
本発明に係る第１の試薬層を形成するためのバインダと
してはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体
、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロースナトリウム塩等の水溶液性セルロース誘導体、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタク
リルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル置換）アクリル
アミド、ポリ（モノ又はジアルキル置換）メタクリルア
ミド及びこれらの水溶性共重合体等が挙げられる。好ま
しくは、ゼラチン及びその誘導体が用いられる。Binders for forming the first reagent layer according to the present invention include gelatin, gelatin derivatives such as phthalated gelatin, aqueous cellulose derivatives such as hydroxyethyl cellulose and carboxymethyl cellulose sodium salt, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, and polymethacrylamide. , poly(mono- or dialkyl-substituted) acrylamide, poly(mono- or dialkyl-substituted) methacrylamide, and water-soluble copolymers thereof. Preferably, gelatin and its derivatives are used.
本発明の第２の試薬層を形成するためのバインダとして
は、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル
イミダゾール）、ポリ（Ｎ−ビニルトリアゾール）及び
これらの誘導体又はそれらの共重合体、エチルセルロー
ス、メチルセルロース等のセルロース誘導体、特願昭６
０−１０４７７６号明細書に記載の共重合体等が挙げら
れる。これらの重合体は主としてアルコール類、例えば
エタノール、プロパツール、ブタノール等に溶解し且つ
親水性の高分子物質である。好ましくは特願昭６０−１
０４７７６号明細書に記載の共重合体が用いられる。The binder for forming the second reagent layer of the present invention includes poly(N-vinylpyrrolidone), poly(N-vinylimidazole), poly(N-vinyltriazole), derivatives thereof, or copolymers thereof. , cellulose derivatives such as ethyl cellulose and methyl cellulose, patent application 1986
Copolymers described in 0-104776 and the like can be mentioned. These polymers are mainly hydrophilic polymeric substances that are soluble in alcohols such as ethanol, propatool, butanol, and the like. Preferably patent application 1986-1
The copolymer described in 04776 is used.
緩衝剤として用いられるものは、アナライトであるＡＬ
Ｉ’の至適ｐｕ９．５〜１１．５付近を緩衝し、且つ反
応を阻害する等の悪影響のないものから選択することが
好ましい。上記緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩
、リン酸塩やグツド（Ｇｏｏｄ ）の緩衝剤等の公知緩
衝剤を挙げることができる。What is used as a buffer is the analyte AL
It is preferable to select from those that buffer around the optimum pu of I' of 9.5 to 11.5 and have no adverse effects such as inhibiting the reaction. Examples of the buffers include known buffers such as carbonate, borate, phosphate and Good's buffer.
好ｔしくけ、ジェタノールアミン、２−（エチルアミノ
）エタノール、トリス（ヒドロキシメチル アミノ）メ
タン、ジエチルアミン、２−（メチぶアミノ）エタノー
ル、２−（イソプロピルアミノ）エタノール、２−アミ
ノエタノール、２−（ジエチルアミノ、）エタノール、
２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール、２−アミ
ノ−２−メチル−１，５−プロパンジオール等から選択
される。Preferably, jetanolamine, 2-(ethylamino)ethanol, tris(hydroxymethylamino)methane, diethylamine, 2-(methylamino)ethanol, 2-(isopropylamino)ethanol, 2-aminoethanol, 2 -(diethylamino,)ethanol,
Selected from 2-amino-2-methyl-1-propatol, 2-amino-2-methyl-1,5-propanediol, and the like.
上記第１の試薬層及び第２の試薬層には、また他の付加
的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活性剤等種々の
添加剤を所望に応じて添加することができる。Various other additives such as preservatives and surfactants can be added to the first reagent layer and the second reagent layer as desired.
特に界面活性剤は、塗布性の向上あるいは本発明に係る
反応の促進等に有効に用いることができる。In particular, surfactants can be effectively used to improve coating properties or promote reactions related to the present invention.
使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又′はカチオン性）、非イオン性を問わず使用すること
が可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。As the surfactant that can be used, both ionic (anionic or cationic) and nonionic surfactants can be used, but nonionic surfactants are effective.
非イオン性界面活性剤の例としては、例えば２，５−ジ
−ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−
オクチルフエノキシボリエテレングリコール、ｐ−イソ
ノニルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキル
置換フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高
級脂肪酸のポリアルキレンクリコールエステル系、ソル
ビタンエステル、ポリグリセリンエステル等の多価アル
コール部分エステル系、ポリオキシエチレンソルビタン
エステル等のエステルエーテル系などが挙げられる。Examples of nonionic surfactants include 2,5-di-t-butylphenoxypolyethylene glycol, p-
Polyalkylene glycol derivatives of alkyl-substituted phenols such as octylphenoxybolyetelene glycol and p-isononylphenoxypolyethylene glycol, polyalkylene glycol esters of higher fatty acids, polyhydric alcohol partial esters such as sorbitan ester, polyglycerin ester, etc. and ester ethers such as polyoxyethylene sorbitan ester.
これらの界面活性剤を上記第１の試薬層及び第２の試薬
層に含有させる量は、通常は１０ｒｎ９／−〜２０ ｆ
／ ｍ”、好ましくは１００Ｍ９／−〜１０ ｆ／ｆ
ＩＩである。The amount of these surfactants contained in the first reagent layer and the second reagent layer is usually 10rn9/- to 20f.
/ m”, preferably 100M9/- to 10 f/f
II.
本発明に係る基質、酸化型補酵素、電子伝達剤等は第１
の試薬層、第２の試薬層及び多孔性展開層のいずれに含
有させてもよい。The substrate, oxidized coenzyme, electron transfer agent, etc. according to the present invention are the first
It may be contained in any of the reagent layer, the second reagent layer, and the porous spreading layer.
本発明に用いられる電子伝達剤を本発明の分析素子に含
有させる量は、脱水素酵素の量に応じて変るが、ジアホ
ラーゼ以外の電子伝達剤の場合、通常は１ダ／−〜１
ｆ ／ ｍ”、好ましくは１０〜５００〜／−である。The amount of the electron transfer agent used in the present invention to be contained in the analytical element of the present invention varies depending on the amount of dehydrogenase, but in the case of electron transfer agents other than diaphorase, it is usually 1 da/- to 1 da/-.
f/m”, preferably 10-500-/-.
更に１ジアホラーゼを電子伝達剤として用いる場合、前
記特定成分の量に応じて変るだけでなく、ジアホラーゼ
の由来及び活性値の測定法に応じて変わる。通常は１０
０１７／−〜１００，０００Ｕ／−１好ましくは５００
Ｔ：Ｊ／ｆＩ？〜ｓｏ、ｏｏ。Furthermore, when using 1-diaphorase as an electron transfer agent, the amount varies not only depending on the amount of the specific component, but also the origin of the diaphorase and the method for measuring the activity value. Usually 10
017/- to 100,000U/-1 preferably 500
T:J/fI? ~so,oo.
Ｕ ／ ｍＷを含有させることができる。It can contain U/mW.
本発明に係る色素形成性部属物質を本発明の分析素子に
含有させる量は、通常は１０■／−〜１ｏ ｔ／ｌｌ、
好ましくは５０■／−〜５ｔ／−である。更に、本発明
に係る酸化型補酵素を本発明の分析素子に含有させる量
は、通常は１゜ｍｙ／−〜５０１／−２、好ましくは５
０ダ／−〜１０ｆ／−である。′
本発明に係る多孔性展開層は、（１）一定容量の流体試
料を単位面積当り試薬層に均一に配布する機能を有する
ものである。その上、更に、特公□昭５５−２１６７７
号公報に記載された性能、すなわち（２）流体試料中の
分析反応を阻害する物質又は要因を除去する機能及び／
又は（３）分光光度分析を行うときに支持体を経て透過
する測定光を反射するパックグランド作用を行う機能を
有するものであれば好ましい。したがって、本発明に係
る多孔性展開層は、上記（１）の機能のみを有する層、
（１）に加えて（２）及び／又は（３）の機能を併せて
有する層のいずれかとすることができ、あるいは（１）
を包含する複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の
層を使用することも可能である。更に（１）、（２）及
び（３）の機能のうち、２つの機能を有する層と、残り
の１つの機能を有する層を組合せて使用することもでき
る。例えば、前述の特公昭５５−２１６７７号公報に記
載された二酸化チタン及び二酢酸セルロースから成るプ
ラッシュポリマーと呼称される非繊維多孔質媒体の展開
層、特開昭５５−１６４５５６号明細書に記載された親
水化処理した織物の展開層、特開昭５７−９４４５８号
、同５７−１２５８４７号、同５７−１９７４６６号及
び同５Ｂ−７０１６１号等の各明細書に記載された繊維
構造展開層、特開昭５１３−９０１６７号明細書に記載
された粒子結合体構造展開層が挙げられる。特に、上記
繊維構造展開層及び粒子結合体構造展開層は、血球部分
も速やかに移送することが可能な素材として特に有用で
ある。本発明の分析素子における展開１の膜厚は、その
空隙率によって決定されるべきであるが、好ましくは約
１００〜６００μ惰、更に好ましくは約１５０〜４００
μ鴨である。また、空隙率は好ましくは約２０〜８５係
である。The amount of the pigment-forming substance according to the present invention contained in the analytical element of the present invention is usually 10 t/- to 10 t/ll,
Preferably it is 50 t/- to 5 t/-. Furthermore, the amount of the oxidized coenzyme according to the present invention contained in the analytical element of the present invention is usually 1° my/- to 501/-2, preferably 5
0 da/- to 10 f/-. ' The porous spreading layer according to the present invention has the function of (1) uniformly distributing a fixed volume of fluid sample to the reagent layer per unit area; Moreover, the special public □Sho 55-21677
The performance described in the publication, i.e. (2) the ability to remove substances or factors that inhibit analytical reactions in fluid samples;
or (3) it is preferable that it has the function of performing a pack-ground effect to reflect measurement light transmitted through the support when performing spectrophotometric analysis. Therefore, the porous spreading layer according to the present invention is a layer having only the function (1) above;
In addition to (1), it can be a layer that also has the functions of (2) and/or (3), or (1)
It is also possible to appropriately separate multiple functions including , and use a separate layer for each function. Furthermore, it is also possible to use a combination of a layer having two of the functions (1), (2), and (3) and a layer having the remaining one function. For example, the spread layer of a non-fibrous porous medium called a plush polymer consisting of titanium dioxide and cellulose diacetate is described in the above-mentioned Japanese Patent Publication No. 55-21677; The fiber structure spreading layer described in the specifications of JP-A-57-94458, JP-A-57-125847, JP-A-57-197466 and JP-A-5B-70161, etc. An example is the particle combination structure development layer described in Japanese Patent Publication No. 513-90167. In particular, the fiber structure spreading layer and particle combination structure spreading layer are particularly useful as materials capable of rapidly transporting blood cell portions. The film thickness of the development 1 in the analytical element of the present invention should be determined by its porosity, but is preferably about 100 to 600 μm, more preferably about 150 to 400 μm.
It is μ duck. Further, the porosity is preferably about 20 to 85.
上記多孔性展開層には、基質、酸化型酵素、電子伝達剤
等の試薬を含有させることもできる。The porous spreading layer can also contain reagents such as a substrate, an oxidized enzyme, and an electron transfer agent.
また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活
性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加することがで
きる。Furthermore, various other additives such as preservatives and surfactants may be added as desired.
本発明の多孔性展開層には、基質であるＮＡＤＰ”又は
その塩が含有される。The porous spreading layer of the present invention contains NADP" or a salt thereof as a substrate.
ＮＡＤＰ＋ は、塩の場合、ナトリウム塩、カリウム塩
等が一般的であるが、例えば特公昭４５−５４８７２号
公報に記載のようにアミン塩にしても良い。ＮＡＤＰ＋
は、展開層中に溶解、含浸、分散等の方法によって含有
される。好ましい含有方法としては分散が良い。In the case of a salt, NADP+ is generally a sodium salt, a potassium salt, etc., but it may also be made into an amine salt, for example, as described in Japanese Patent Publication No. 45-54872. NADP+
is contained in the spreading layer by methods such as dissolution, impregnation, and dispersion. A preferred method of containing it is dispersion.
更に、ＡＬＰの活性化剤として、２価陽イオン、例えば
塩の形（例えば硫酸塩、塩化物、酢酸塩、アスパラギン
酸塩等）で用いられる、Ｍｇ冨十、Ｃｏ”、Ｍｎｎ＋１
□ ａ２＋、ｚｎ２＋、Ｂｒ”、ＩＰｅ”十等が用いら
れる。一般Ｋ Ｍｇｌ＋が用いられ、いずれの層に含有
してもよいが、本発明の基質を含有する層と同−又は隣
接する層に含有することが好ましい。Furthermore, as activators of ALP, divalent cations, such as Mg-to, Co'', Mnn+1, used in salt form (e.g. sulfate, chloride, acetate, aspartate, etc.)
□ a2+, zn2+, Br", IPe", etc. are used. General K Mgl+ is used and may be contained in any layer, but it is preferably contained in the same layer as or adjacent to the layer containing the substrate of the present invention.
更に、必要に応じて、ＮＡＤＰ＋からＡＬＰの作用によ
シ生成したリン酸をトラップするためのリン酸受容体を
含有させることが可能である。リン酸受容体は、Ｌ Ｂ
、−ｒッコーブ（孔Ｂ、 ＭＯｏＯａｂ ）等の報文〔
クリニカル ケミストリー（０ｌｉｎ。Furthermore, if necessary, it is possible to contain a phosphate receptor for trapping phosphoric acid generated from NADP+ by the action of ALP. The phosphate receptor is L B
, - rkoob (hole B, MOoOab) etc. [
Clinical Chemistry (0lin.
ｏｈｅｍ、 ）第１８巻、第２号第９７〜ＩＱ４頁（１
９７２））等の公知文献を参考に選択使用することがで
きるが、例えばｐＫａ値が約８．０以上のアミノアルコ
ール化合物が用いられる。ohem, ) Volume 18, No. 2, No. 97-IQ4 pages (1
For example, an amino alcohol compound having a pKa value of about 8.0 or more is used.
リン酸受容体とは、ＡＬＰの作用によシ基質から生成し
たリン酸に対する反応が、リン酸と水との氷解反応より
も速い水酸基等の官能基を有する化合物のことをいう。A phosphate receptor refers to a compound having a functional group such as a hydroxyl group, which reacts faster with phosphoric acid generated from a substrate by the action of ALP than the ice-melting reaction between phosphoric acid and water.
リン酸受容体は、緩衝剤と同一の層に含有することが好
ましい。The phosphate receptor is preferably contained in the same layer as the buffer.
一般に、リン酸受容体としてアミノアルコールが知られ
ているが、特にｐＫａ値８．０以上のものが効果がある
。例えば、ジェタノールアミン（ｐＫａ ＆ ７ ）、
２−アミノ−２−メチＡ／−１，５−プロパンジオール
（ｐＫａ ａ ６ ）、トリス（ヒドロキシメチルアミ
ノ）メタン（ｐＫａ ａ５ ）、２−アミノエタノール
（ｐＫａ ９．２ ）、２−（エチルアミノ）エタノー
ル（ｐｘａ ｑ、 ｑ ）、２−（メチルアミノ）エタ
ノール（ｐＫａ ９．６ ）、２−（ジメチルアミノ）
エタノール（ｐＫａ ９．２ ）、２−（イソプロピル
アミノ）エタノール（ｐＫａ ９．９）、２−アミノ−
２−メチル−＃＝プロ／くノール（ｐＫ！Ｌ ｑ、 ５
）、３−アミノプロ／＜ノール（ｐＫａ９．４）、ＤＬ
−２−アミノープロノ（ノール（１）Ｋ！ＬＬｌａ ）
、ヒトｃＩ−？シブロリン（ｐＫａ ９．４ ）等のア
ミノアルコール類をり／酸受容体として用いることがで
きる。当然のことながら、緩衝剤としてアミノアルコー
ルを選択した場合、リン酸受容体としても機能するから
、別にリン酸受容体を添加する必要は力い。このリン酸
受容体は、いずれの層〈も含有できるが、好ましくは緩
衝剤と同一の層に含有される。Amino alcohols are generally known as phosphate receptors, and those with a pKa value of 8.0 or higher are particularly effective. For example, jetanolamine (pKa & 7),
2-amino-2-methyA/-1,5-propanediol (pKa a6), tris(hydroxymethylamino)methane (pKa a5), 2-aminoethanol (pKa 9.2), 2-(ethylamino ) ethanol (pxa q, q ), 2-(methylamino)ethanol (pKa 9.6), 2-(dimethylamino)
Ethanol (pKa 9.2), 2-(isopropylamino)ethanol (pKa 9.9), 2-amino-
2-Methyl-#=pro/kunor (pK!L q, 5
), 3-aminopro/<nol (pKa9.4), DL
-2-aminoprono(nor(1)K!LLla)
, human cI-? Amino alcohols such as cibroline (pKa 9.4) can be used as acid/acid acceptors. Naturally, when an amino alcohol is selected as a buffer, it also functions as a phosphate acceptor, so there is no need to add a phosphate acceptor separately. The phosphate acceptor can be contained in either layer, but is preferably contained in the same layer as the buffer.
本発明のＡＬｉ’Ｌｉ側定用分析素子は、試薬層内に脱
水素酵素を含有している。この脱水素酵素が試料である
血液、血清、血漿、尿、髄液等に存在する場合、必要に
応じて前記脱水素酵素の阻害剤を含有することが可能で
ある。その際、該阻害剤は、多孔性展開層又は緩衝剤層
に含有され、好ましくは多孔性展開層に含有される。The ALi'Li side analytical element of the present invention contains dehydrogenase in the reagent layer. If this dehydrogenase is present in the sample, such as blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, etc., an inhibitor of the dehydrogenase can be included as necessary. In this case, the inhibitor is contained in the porous spreading layer or the buffer layer, preferably in the porous spreading layer.
本発明の実施態様として、支持体上に順次、色素形成性
前駆物質、脱水素酵素及び脱水素酵素の基質を含む第１
の試薬層、緩衝剤を含む第２の試薬層及び基質であるＮ
ＡＤＰ”、電子伝達剤を含む多孔性展開層から成る。更
に、この態様にｉ衝剤を含む層に更にリン酸受容体を含
有させても良い。In an embodiment of the invention, a first dye comprising a dye-forming precursor, a dehydrogenase, and a substrate for the dehydrogenase, sequentially on a support, is provided.
a second reagent layer containing a buffer and a substrate N
In this embodiment, the layer containing the i-transfer agent may further contain a phosphate acceptor.
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples.
The invention is not limited to these examples.
実施例−１
透明な下塗り済み厚さ１ＢＯｐｔｎのポリ（エチレンテ
レフタレート）支持体上に、下記組成の層を頭次塗布し
た。Example-1 A layer having the following composition was coated onto a transparent undercoated poly(ethylene terephthalate) support having a thickness of 1BOptn.
試薬１ｉ−１
ゼラチｙ １５ ｔ／ｌｒｙ”Ｎ
ｅｏ −ＴＢ Ｏ，５ｆ／Ｊ
乳酸脱水素酵素 １５０００ＴＪ／’ｍ
Ｆジアホラーゼ １５００Ｕ／ｍ”
ビスビニルスルホニルメチルエーテル ０
．１９％ｍ”トリトン！ −１００Ｌ５ｆ／ｌｎ”
試％層−２
ルビＸ：Ｆ−ルＶＡ−２８５９７ｍ”
炭隈二ナトリウム ４ ｆ／−ト
リス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン １２
９／−２乳酸リチウム α８ｔ
／−多孔性展開層
Ｆ’紙原材料用Ｊ１［（ａｏ 〜１００メツ％）
１ｏｓｓｔ／Ｗ？ト リ ト ン Ｘ−１００
ａａｙ／Ｊスチレン−グリシジルメタクリレート共重合
体（９：１） ２ｓｔ／ｍＩＮＡＤＰ・ジナトリウム
塩 ａ、ａｔ／１１Ｍ
ｇ８０４・７’Ｈ＊Ｏ（１５ｆ／ｙｘ”上記本発明の実
施態様に従って作製した素子を本発明の分析素子（１）
とした。Reagent 1i-1 Gelatiny 15t/lry”N
eo-TB O,5f/J
Lactate dehydrogenase 15000TJ/'m
F diaphorase 1500U/m”
Bisvinylsulfonyl methyl ether 0
．． 19% m" Triton! -100L5f/ln" Test% layer -2 Ruby
9/-2 lithium lactate α8t
/- Porous spreading layer F' J1 for paper raw material [(ao ~ 100%)
1osst/W? Triton X-100
aay/J styrene-glycidyl methacrylate copolymer (9:1) 2st/mINADP disodium salt a, at/11M
g804・7'H*O(15f/yx") The element produced according to the embodiment of the present invention described above is referred to as the analytical element (1) of the present invention.
And so.
次いで比較分析素子として同様に１８０μ愼の厚さの透
明な下塗り済みポリ（エチレンテレフタレート）支持体
上に順次以下の層を横１した。A comparative analytical element was then similarly coated with the following layers in sequence on a 180 micron thick clear primed poly(ethylene terephthalate) support.
試薬層
アクリルアミド−メチルメタクリレート共重合体
１５９／ｍ”（重合比 ９：１）
炭酸二ナトリウム ４３ｔ／惰３
トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン
ａ、ａ ｔ／ｇ”接着層
ルビＸ：７−ルＶＡ −２８１８ｆ／Ｊ多孔性展開層
ｆ紙厚材料用繊維（４０〜１００メツシユ） １
０１．７ ｆ／ｌｐ？スチレン−グリシジルメタクリレ
ート共重合体 ２ｓ、、６ｔ／Ｊ（重合比 ９：１）
トリトｙ！−１００１４ｔ／１１
ｐ−ニトロフェニルリン酸トリス塩１４１７ｍ”Ｍｇ８
０．＃ ７％Ｏ（Ｌ５ ｆ／−
上記本発明の分析素子及び比較分析素子を４０℃ｓｏｌ
相対湿度に７日間さらした後にカブリ反射濃度（ＩＦｏ
ｇ Ｄｒ）を、本発明の分析素子は５４６Ｈｍ、比較分
析素子は４０５Ｈｍで測定した。Reagent layer acrylamide-methyl methacrylate copolymer
159/m” (polymerization ratio 9:1) Disodium carbonate 43t/inert3
Tris(hydroxymethylamino)methane
a, a t/g” Adhesive Layer Ruby
01.7 f/lp? Styrene-glycidyl methacrylate copolymer 2s, 6t/J (polymerization ratio 9:1) Toritoy! -10014t/11 p-nitrophenyl phosphate tris salt 1417m”Mg8
0. # 7% O (L5 f/- The analytical element of the present invention and comparative analytical element were heated at 40°C
Fog reflection density (IFo) after 7 days exposure to relative humidity
g Dr) was measured at 546 Hm for the analytical element of the present invention and at 405 Hm for the comparative analytical element.
結果を第１表に示す。The results are shown in Table 1.
第１表
実施例−２
前述の実施例−１で作製した処理前及び処理後の本発明
の分析素子（１）及び比較分析素子をｔ５ｄ角に裁断し
、プラスチックマウントに入れ、本発明のＡＬＩ’活性
分析フィルム（１）及び比較分析フィルムを用意した。Table 1 Example-2 The analytical element (1) of the present invention before and after the treatment prepared in Example-1 above and the comparative analytical element were cut into a t5d angle, placed in a plastic mount, and placed in the ALI of the present invention. 'An activity analysis film (1) and a comparative analysis film were prepared.
ＩＦｏＯ法に準拠して、ヒト血清のＡＬＰ活性を検定し
、５０．２５５及び５１８工Ｕ／ｌのものを用意した。The ALP activity of human serum was assayed according to the IFoO method, and samples with concentrations of 50.255 and 518 U/l were prepared.
この血清を１０μｌ展開層から点着し、５７℃で水分蒸
発を制御しつつ点着後、２分及び４分それぞれのフィル
ムを、５４６Ｈｍ及びＡＯ５ｎｍで反射濃度を測定して
その差を七った。結果を以下の第２表に示す。10 μl of this serum was spotted from the developing layer, and after spotting at 57°C while controlling moisture evaporation, the reflection density was measured at 546 Hm and AO 5 nm for 2 minutes and 4 minutes after spotting, and the difference was calculated. . The results are shown in Table 2 below.
第２表
実施例−１及び−２から明らかなように、本発明の分析
素子は良好な保存安定性及び感度を有していることが明
らかである。As is clear from Examples-1 and -2 in Table 2, it is clear that the analytical element of the present invention has good storage stability and sensitivity.
実施例−５
透明な下塗り済み厚さ１８０μ惟のポリ（エチレンテレ
フタレート）支持体上に、下記の組成の各１を塗布した
。Example 5 Each of the following compositions was coated onto a transparent, primed, 180 μm thick poly(ethylene terephthalate) support.
試薬層−１
ゼラチン １５９／Ｊアルコー
ル脱水素酵素 ２８０００Ｕ／Ｊジ
アホラーゼ １８００ＴＴ／ｍ
”ヘキサノール α５ｔ／−ビ
スビニルスルホニルメチルエーテル ａ
１ ｆ／ｆｌ？トリドアＸ−１００αＳｔ／ｌｌ？
試薬９−２
ルビｘコールＶＡ−２８（Ｂｉ１２社）
４．５ｆ／１Ｊ２−アミノ−２−メチル−プロパツ
ール 五５ｔ／Ｊ多孔性展開層
ｒ紙原材料用礒維（４０〜１００メツシユ） １
０１．７１Ｆ／ジスチレン一グリシジルメタクリレート
共重合体 ２５６り／−（重合比９：１）
トリトン！−１００１４ｒ／Ｊ
ＮＡＩ１１’−ジナトリウム塩
五８ｆ／−Ｍｇ８０．−７Ｈ，Ｏα３ｔ／−
上記本発明の分析フィルム１）を、前述ノ実施例−２と
同様Ｋ ＡＬＰ活性５０．２５５及び５１８ＸＴＪ／ｌ
のヒト血清を用いて血清点着後、２分後と４分後の反射
濃度を測定し、その差を求めた。Reagent layer-1 Gelatin 159/J alcohol dehydrogenase 28000U/J diaphorase 1800TT/m
"Hexanol α5t/-bisvinylsulfonyl methyl ether a
1 f/fl? Toridor X-100αSt/ll? Reagent 9-2 Rubixcol VA-28 (Bi12)
4.5f/1J 2-amino-2-methyl-propertool 55t/J porous spreading layer r paper raw material fiber (40-100 mesh) 1
01.71F/distyrene-glycidyl methacrylate copolymer 256/- (polymerization ratio 9:1) Triton! -10014r/J NAI11'-disodium salt
58f/-Mg80. -7H,Oα3t/- The analysis film 1) of the present invention was prepared with K ALP activity of 50.255 and 518XTJ/l as in Example-2 above.
Using human serum, the reflection density was measured 2 minutes and 4 minutes after serum spotting, and the difference was determined.
結果を第５表に示す。The results are shown in Table 5.
第５表
以上のように、本発明のＡＬＰ分析素子は良好な感度を
有していることが明らかである。As shown in Table 5 and above, it is clear that the ALP analysis element of the present invention has good sensitivity.
Claims (1)
液体試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定する
ための分析素子において、該素子が、酸化型ニコチンア
ミド アデニンジヌクレオチド リン酸又はその塩、脱
水素酵素、該酵素の基質、電子伝達剤、色素形成性前駆
物質及び緩衝剤を含んでいることを特徴とするアルカリ
性ホスファターゼ活性測定用分析素子。 ２、該脱水素酵素が、ニコチンアミド アデニン ジヌ
クレオチド依存性の脱水素酵素である特許請求の範囲第
１項記載の分析素子。 ３、該緩衝剤が、ｐＫａ値８．０以上の化合物である特
許請求の範囲第１項記載の分析素子。 ４、該酸化型ニコチンアミド アデニンジヌクレオチド
リン酸又はその塩が、多孔性展開層又は該層に隣接す
る層に含有されている特許請求の範囲第１項記載の分析
素子。 ５、該色素形成性前駆物質が、テトラゾリウム塩である
特許請求の範囲第１項記載の分析素子。 ６、該色素形成性前駆物質及び該緩衝剤が、互いに別異
の層に含有されている特許請求の範囲第１項記載の分析
素子。[Claims] 1. Having a reagent layer and a porous development layer on a transparent support,
In an analytical element for measuring alkaline phosphatase activity in a liquid sample, the element comprises oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or a salt thereof, a dehydrogenase, a substrate for the enzyme, an electron transfer agent, a pigment-forming precursor. An analytical element for measuring alkaline phosphatase activity, characterized by containing a substance and a buffer. 2. The analytical element according to claim 1, wherein the dehydrogenase is a nicotinamide adenine dinucleotide-dependent dehydrogenase. 3. The analytical element according to claim 1, wherein the buffer is a compound having a pKa value of 8.0 or more. 4. The analytical element according to claim 1, wherein the oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or its salt is contained in the porous spreading layer or a layer adjacent to the layer. 5. The analytical element according to claim 1, wherein the dye-forming precursor is a tetrazolium salt. 6. The analytical element according to claim 1, wherein the dye-forming precursor and the buffer are contained in different layers.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28183286A JPS63137697A (en) | 1986-11-28 | 1986-11-28 | Analytical element for measuring alkaline phosphatase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP28183286A JPS63137697A (en) | 1986-11-28 | 1986-11-28 | Analytical element for measuring alkaline phosphatase activity |
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| JPS63137697A true JPS63137697A (en) | 1988-06-09 |
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| JP (1) | JPS63137697A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009222692A (en) * | 2008-03-19 | 2009-10-01 | Jsr Corp | Signal enhancer of immunochemical reaction, and immunological measurement method |
-
1986
- 1986-11-28 JP JP28183286A patent/JPS63137697A/en active Pending
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