JPH0789997A - 新規蛋白質sp38および避妊ワクチン - Google Patents
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Abstract
んでなる、ペプチド。 【効果】 図1に示されるペプチドは、先体反応後に精
子表面に露出する蛋白質であって、このペプチドに対す
る抗体は、***に特異的に作用して、卵細胞と***との
結合を阻害する。よって、このペプチドは避妊ワクチン
としての有用である。
Description
クチンに使用される、ヒト及び動物の体内において抗原
性を有する新規なタンパク質(sp38)並びにそのペ
プチドフラグメントおよびその製造法に関する。更に、
本発明はそのような抗原に対する抗体およびその避妊薬
としての用途に関する。
(子宮内避妊器具)、コンドーム、不妊手術、***の数
や運動性を低下させる低分子合成物質の経口投与などが
試みられてきた。しかし、これらの避妊法は、副作用や
処置の煩雑性などの点で問題がある。
ており、例えばhCGワクチンなどにより受精卵の着床
を阻止する方法が知られている。
阻止する方法がより望ましいと考えられることから、卵
透明帯蛋白質や***の蛋白質を避妊ワクチンとして用い
たり、またこれらに対する抗体を投与することによっ
て、受精を阻止し、避妊の目的を達成する方法が試みら
れてきている。この方法を簡単に説明すれば次の通りで
ある。
た卵が、雌の性管を通過する過程で受精能を獲得した精
子と、卵管膨大部で遭遇することによって開始される。
卵の細胞膜の外側には卵の細胞外マトリックスである透
明帯(zona pellucida:ZP)と呼ばれる糖蛋白質の層
があり、***は、卵の細胞膜と融合する前に、このZP
に特異的に結合し、これを貫通しなければならない。ヒ
トを含むいくつかの種では、いわゆる先体反応(acroso
me reaction)を起こした***のみがZPに結合し貫通す
る。この反応は***前頭部の先体の外膜と細胞膜とが融
合し、それが離脱するものであり、これらの種では、こ
の先体反応後に露出される***抗原が透明帯との結合の
主役を担っていると考えられる。従って、このようなZ
P結合性を持つ***抗原に対する抗体を効率良く誘導す
ることにより、適格な避妊効果が期待できるものと考え
られる。
性を持つ蛋白質としては、ブタ***中のプロアクロシン
(proacrosin)が知られている。プロアクロシンは、セ
リンプロテアーゼの一種であるアクロシン(acrosin)の
酵素前駆体である。この分子はトリプシンなどの他の臓
器に豊富に存在するセリンプロテアーゼ群と30〜40
%のアミノ酸のホモロジーがあり、***特異的な抗体を
産生させるための免疫原としては問題がある。
透明体の糖蛋白質ZP4や、ハムスター輸卵管由来のZ
P0を含むものなどが考えられている。しかし、これら
はいずれもヒトでのこれらに相当する分子構造が不明で
あるため、適格な抗原とはなりえない。また、ヒト***
先体内蛋白質sp10を抗原とするワクチン法も考えら
れているが、sp10の生理機能が全く不明であるた
め、作用機序が明らかでない。
抗体の利用も考えられている。しかし、これに対応する
抗原が不明であったり、また特異性に欠けるため長期的
効果を期待できる能動免疫原には利用できないなどの欠
点がある。
ワクチンとして用いることのできる、作用機序の明らか
な新規な抗原としてのペプチドおよびそれをコードする
DNA配列の提供をその目的としている。さらに本発明
は、そのようなペプチドの配列を知ることによって、そ
のペプチドの全部または一部を含んでなる避妊ワクチン
の提供をその目的としている。さらにまた本発明は、そ
のペプチドに対する抗体を含んでなる避妊薬の提供をそ
の目的としている。今般、我々は、ZP結合能を有する
蛋白質を探索した結果、従来知られたZP結合能を有す
る蛋白質(例えば、プロアクロシン)とは異なる新規な
蛋白質を見出し、その配列を決定した。本発明は、この
知見に基づいてなされたものである。
提供される新規蛋白質sp38の第一は、図1に示され
る配列を有するブタ由来のsp38(以下、ブタsp3
8という)である。また、本発明により提供される新規
蛋白質の第二は、図3に示される配列を有するヒト由来
のsp38(以下、ヒトsp38という)である。さら
に本発明によるDNA配列は、上記ブタsp38または
ヒトsp38の全部または一部をコードするもの、であ
る。さらにまた本発明による避妊ワクチンは上記本発明
による新規蛋白質の全部またはその部分ペプチドであっ
て、ZP蛋白質への結合活性および/または***とZP
蛋白質との結合を阻止する抗体を生体内で産生し得る抗
原性を有するものを含んでなるもの、である。また、本
発明による避妊薬は、上記本発明による新規蛋白質の全
部に対する抗体、または、その部分ペプチドであってZ
P蛋白質への結合活性および/または***とZP蛋白質
との結合を阻止する抗体を生体内で産生し得る抗原性を
有する部分に対する抗体を含んでなるもの、である。
列 本発明により提供されるブタsp38は、ブタの精巣上
体尾部より採取された***から、ZP結合能を指標とす
ることによって単離された蛋白質である。このブタsp
38は、先体反応誘導前には表出されず、先体反応後に
***表面に露出する蛋白質であり、このsp38が***
とZPとの結合を担い、その後、***はZPを通過し、
受精に至ると考えられる。
かなように、ZP蛋白質に対し特異的な結合活性を有
し、それはプロアクロシンと競合的である。さらに、こ
のブタsp38に対する抗体は、***に特異的に作用し
て、***とZP蛋白質との結合を阻害し、また***を凝
集させる作用を有することが確認された。
物に投与することによって、ブタsp38に対する抗体
を産生させ、その結果、***と卵細胞との結合を阻害す
ることができる。これはすなわち、避妊ワクチンとして
の用途を有することを意味する。また、ブタsp38に
対する抗体をヒトを含む動物に投与することにより、精
子とZP蛋白質の結合を阻害することができ、避妊効果
が期待できる。
8は、前記ブタsp38の配列を参考にしてプローブを
得て、そのプローブを用いてヒト精巣cDNAライブラ
リーより得られたcDNAの発現産物の分析からその存
在が確認された蛋白質である。このヒトsp38も、ブ
タsp38と同様に、先体反応後に***表面に露出する
蛋白質と思われ、このsp38が***とZPとの結合を
担い、その後、***はZPを追加し、受精に至ると考え
られる。従って、ヒトsp38も、ブタsp38と同様
にZP蛋白質対し特異的な結合活性を有し、またそれに
対する抗体は***に特異的に作用して、***とZP蛋白
質との結合を阻害する。よって、ヒトsp38も上記ブ
タsp38と同様に避妊ワクチンとしての用途を有し、
またそれに対する抗体についても避妊効果が期待でき
る。
または、***とZP蛋白質との結合を阻止する抗体を生
体内で産生し得る抗原性を保持する、図1または図3に
記載の配列の一部を含んでなるペプチドも、本発明の範
囲に包含されるものとする。とりわけ、後記する実施例
から明らかなように、図1に示される配列の少なくとも
253番から269番の配列を有する部分ペプチドは、
sp38とZP蛋白質との結合を阻害し、またこの部分
ペプチドに対する抗体は***−卵結合を阻害する。以下
の理論に拘束されるわけではないが、下記の通り、この
部分ペプチドのさらに256番から266番には、プロ
アクロシンの365番から372番の配列とホモロジー
が見られる。さらにヒトsp38についてこれらの配列
とのホモロジーは257番から267番に見られる。 ブタsp38 KRLSKAKNLIE (K256
−E266残基) ヒトsp38 KRLFKAKNLIE (K257
−E267残基) プロアクロシン KRLQQLIE (K365
−E372残基) よって、これらの部分ペプチドを抗原として得られた抗
体についても避妊効果が期待できる。
***とZP蛋白質との結合を阻止する抗体を生体内で産
生し得る抗原性を保持する限り、アミノ酸の付加、挿
入、削除、欠失または置換が生じたブタsp38および
ヒトsp38も本発明の範囲に包含される。
びヒトsp38をコードするDNAが提供される。これ
らの蛋白質をコードするDNAの典型的な配列はそれぞ
れ図2および図4に示される塩基配列の全部または一部
を有する。
タまたはヒトのmRNA由来のライブラリーから得られ
たクローンの遺伝子に相補的な配列、すなわちcDNA
である。図2に示される塩基配列中には、配列の15−
17番のATGコドンからはじまり1065−1067
のTAG終始コドンで終わるコーディング領域が存在し
ている。この配列は、図1に示されるアミノ酸配列、す
なわちブタsp38をコードする。また同様に図4に示
される配列には37−1092番のコーディング領域が
存在しており、この配列が図3に示されるアミノ酸配
列、すなわちヒトsp38をコードする。
られれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、
その結果、図1または図3に示される配列の全部または
一部をコードする種々の塩基配列を適宜選択することが
できる。従って、本発明による図1または図3に示され
る配列の全部または一部をコードする塩基配列とは、そ
の塩基配列が図2または図4に示される塩基配列の全部
または一部に加え、縮退(degeneracy)関係にあるコド
ンが使用されている以外はその塩基配列が同一であっ
て、同一のペプチドをコードする配列も意味するものと
する。さらに、上記のようにその一部のアミノ酸の付
加、挿入、削除、欠失または置換が生じたブタsp38
およびヒトsp38をコードする塩基配列も本発明の範
囲に包含されるものとする。
でも、全合成したものでも、あるいは、天然物由来のも
のの一部を利用して合成を行ったもの(すなわち半合
成)ものものであってもよい。このようなDNAの典型
的な取得法の一つは、ブタまたはヒトの***由来のゲノ
ムライブラリーから、この遺伝子を切り出す方法であ
る。この方法の具体例としては、ブタまたはヒトの***
由来のゲノムライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣
用されている方法、例えば適当なプローブを用いてスク
リーニングを行う方法、が挙げられる。この方法の具体
例については後記する実施例において詳述する。
るDNA配列を、宿主細胞内で複製可能でかつそのDN
A配列がコードする蛋白質を発現可能な状態で含んでな
る発現ベクターが提供される。さらに、本発明によれ
ば、この発現ベクターによって形質転換された宿主細胞
が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定され
ず、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、動物細
胞、ウィルスなどを用いた系、および、それらを用いた
他の蛋白質との融合蛋白質発現系などを用いることが出
来る。本発明によるベクター構築の手順および方法は、
遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることが
できる。本発明による発現ベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望の蛋白質を発現させるためには、
前記の本発明によるDNA配列の他に、その発現を制御
するDNA、すなわちプロモーター、転写開始信号、リ
ボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号な
どの転写調節信号や翻訳調製信号など、を有するのが好
ましい。これらは常法に従い発現ベクターに存在させて
よい。また、このベクターによる宿主細胞の形質転換の
方法も、この分野で慣用されているものを用いることが
できる。
の培養物から上記した本発明による蛋白質を単離して得
ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、
前記の本発明による新規蛋白質の製造法が提供される。
形質転換体の培養およびその条件は、使用する宿主につ
いてのそれと本質的に同様であってよい。また、培養液
からの本発明による新規蛋白質の回収、精製も常法に従
って行うことが出来る。
る抗体は、***とZP蛋白質との結合を阻害する。従っ
て、本発明の別の態様によれば、図1または図3に示さ
れるペプチドの全部または一部と、薬学的に許容される
担体とを含んでなる避妊ワクチンが提供される。さら
に、本発明の更に別の態様によれば、図1または図3に
示されるペプチドの全部または一部を抗原として生産さ
れた抗体と、薬学的に許容される担体とを含んでなる、
避妊薬が提供される。
よる蛋白質は、ヒトに投与される場合には、ヒトsp3
8、または、その部分ペプチドであって***とZP蛋白
質との結合を阻止する抗体を生体内で産生し得る抗原性
を保持するものであるのが好ましい。
非経口(例えば、静注、筋注、皮下投与、経皮投与)の
いずれかの投与経路で、ヒトおよびヒト以外の動物に投
与することができる。従って、本発明による避妊ワクチ
ンは、その投与経路に応じて、適当な薬学的に許容され
る担体と、さらに所望により安定化剤、防腐剤などのと
もに適当な剤形とされる。
的には専門医の指導のもとに決定されるが、有効成分と
しての蛋白質10μgから10mg/個体を1回の投与
量として、2週間ないし4週間の間隔で数回投与するこ
とが可能である。
ての抗体は、ヒトに投与される場合には、ヒトsp38
に対する抗体、または、その部分ペプチドであって***
とZP蛋白質との結合を阻止する抗体を生体内で産生し
得る抗原性を保持するものに対する抗体であるのが好ま
しい。
疫して得られる抗血清、それを精製して得られたポリク
ローナル抗体、さらにはモノクローナル抗体を用いるこ
とができ、モノクローナル抗体が好ましい。モノクロー
ナル抗体はこの分野で常法とされている方法に従って得
ることができる。
(例えば、静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投
与)のいずれかの投与経路で、ヒトおよびヒト以外の動
物に投与することができる。従って、本発明による避妊
薬は、その投与経路に応じて、適当な薬学的に許容され
る担体と、さらに所望により安定化剤、防腐剤などのと
もに適当な剤形とされる。
的には専門医の指導のもとに決定されるが、作用部(卵
管)において十分な抗体価が得られ、かつ副作用のない
量の範囲であることが好ましい。
るが、本発明の実施はこれらに限定されるものではな
い。 実施例1.ブタ***からのsp38の精製 ブタ精巣上体尾部の***(2.5ml)よりディタージ
ェントを含む緩衝液で蛋白質を抽出した(1)。この抽
出物をプロアクロシン精製法(2)に従ってゲルろ過カ
ラムにかけ、その溶出画分について固相結合アッセイを
用いてZP結合活性を評価した。ZP結合活性を有する
蛋白画分(蛋白10mg)を回収し、HClにてpH3
に調製した7M尿素液に対して透析した。この透析液を
7M尿素、0.2M NaCl、pH3にてあらかじめ
平衡化しておいた陽イオン交換HPLCカラムTSK gel
SP-5PW(7.5×75mm:東ソー)に添加し、室温に
て200分間かけてpH3、7M尿素中、0.2〜1M
NaClの直線濃度勾配により流速0.5ml/分で
各フラクション1mlにて溶出した(図5)。
(1.2mg)を回収し、逆相HPLCカラムBakerbon
d Wide Pore Butyl 5μm(4.6×250mm:J.T.
Baker)に添加し、0.1%トリフルオロ酢酸存在下、ア
セトニトリルの濃度勾配を最初の5分間で0〜38%
に、次の120分で43%にして、流速0.5ml/
分、各フラクション1mlにて溶出した(図6)。この
カラムクロマトグラフィーによってZP結合活性は明白
な2つのピークに分離した(図6:ピークa、ピーク
b)。各溶出フラクション番号14〜24に関してSD
S−PAGEを用いて解析した結果、主な蛋白としてピ
ークaには分子量55KDaと53KDa、ピークbに
は38KDa(sp38)のものが存在することが分か
った(図7)。
の結合活性を確認するために、 125Iで標識されたZP
蛋白質をプローブとしてウェスタンブロッティング解析
を行なった(図8)。その結果、55KDa及び53K
Da蛋白のみならずsp38にもプローブとの結合能が
確認された(レーン1、2)。フラクション番号15中
に存在する55KDa及び53KDa蛋白は抗ブタ***
プロアクロシン抗体と免疫反応性があるためプロアクロ
シンと同定された(レーン3)。sp38には同抗体と
の免疫反応性は無かった(レーン4)。このことにより
sp38はプロアクロシンの分解産物ではないことが分
かった。フラクション番号20、21をsp38のサン
プルとして回収した。2.5mlのパックした***から
約40μgのこの蛋白質が得られた。sp38は精巣上
体液中には存在せず、この蛋白質が精管浸出液から***
の表面に吸着したものではないことが明らかにされた。
活性の測定方法」は次の通りである。ZP糖蛋白質を常
法(3)に従い、卵巣の卵胞卵子から調製し、ビオチン
化した(1)。溶出した***由来の蛋白各フラクション
を、0.1M NaHCO3および2mM p-aminoben
zamidine(p−AB)の存在下、ELISAプレートの
各ウエルにそれぞれコーティングした。洗浄緩衝液(1
0mM Tris−HCl、pH7.4、0.15M
NaCl、2mM CaCl2、2mM p−AB、
0.05%Tween−20)にて洗浄した後、37
℃、1時間、ブロッキング緩衝液(5%BSA、10m
M Tris−HCl、pH7.4、0.15M Na
Cl、2mM CaCl2、2mM p−AB)にてブ
ロッキングした。更に希釈緩衝液(2%BSA、10m
M Tris−HCl、pH7.4、0.15M Na
Cl、2mM CaCl2、2mM p−AB、0.0
5%Twenn−20)にて250ng/mlに調整し
たビオチン化ZP蛋白質を、1時間室温にてインキュベ
ートした後、1000倍希釈したストレプトアビジン
(ZYMED)を37℃にて1時間インキュベートし
た。丁寧に洗浄した後発色させて、492nmの吸光度
を測定した。
試験」は次の通り行なった。抗プロアクロシンウサギ抗
血清(10000倍希釈)と抗ウサギIgG F(a
b′)2(CAPPEL、5000倍希釈)をプローブ
として用いる他は、前述の「ZP結合活性の測定方法」
に準じた固相結合アッセイを行なった。
ブロッティング」は次の通り行なった。常法に従い、S
DS−PAGEとエレクトロブロッティングを行なっ
た。非特異的結合をブロックした後、 125Iで標識され
たZP蛋白質を結合させ丁寧に洗浄し、Kodack X-Omat
ARにてオートラジオグラフィーをとるか、あるいは抗プ
ロアクロシンウサギ抗血清(2000倍希釈)を結合さ
せた後、パーオキシダーゼが結合した抗ウサギIgG
F(ab′)2(1000倍希釈)と3,3,′‐ジア
ミノベンチジンテトラクロライドを用いて発色させ、目
的のバンドを同定した。洗浄緩衝液、ブロッキング緩衝
液、及び希釈緩衝液は、前述の「ZP結合活性の測定方
法」において用いたものと同様のものを使用した。な
お、ZP蛋白質とsp38の 125Iによる標識はクロラ
ミンT法を用いた。
ノ酸配列の解析 3μgのsp38を10%SDS−PAGEにかけ、目
的のバンドをpolyvinilidenedifluoride(PVDF)膜
にエレクトロブロットを行なった。転写した蛋白質をヨ
ード酢酸にてS‐カルボキシメチル化後、プロテアーゼ
(Achromobacter protease I-和光)を用いてin situ
的に酵素消化を行なった(4)。酵素消化によって膜よ
り遊離してきたペプチド断片を逆相HPLC(μ−Bond
asphere5uC8-300A 2.1×150mm−WATER
S)カラムにより分離した。この際のペプチド断片の溶
出は40分間、2〜50%の溶媒B、流速0.25ml
/分の条件下濃度勾配分離法を用い行なった(溶媒A:
0.05%トリフルオロ酢酸水、溶媒B:0.02%ト
リフルオロ酢酸含2‐プロパノール/アセトニトリル
(7/3、V/V))。
ー(Applied Biosystems model 470A)を用いた。得られ
たPTH−アミノ酸の同定は、均一濃度HPLCを用い
て行なった。これらのペプチドの逆相HPLCによる溶
出パターンは図9に示される通りである。ペプチドフラ
グメントのAP−1〜AP−6とN末のアミノ酸配列は
同様に図9に示される通りであった。AP−3のアミノ
酸配列はN末のアミノ酸配列と一致した。また、AP−
3のC末端とAP−4のN末端とは連続するものである
ことがわかった。これらいずれのペプチドのアミノ酸配
列にもthe National Biochemical Research Foundation
(NBRF)における既知のアミノ酸配列とのホモロジ
ーは見られなかった。
アクロシンとの比較) 固相結合アッセイにおいて、sp38とZP蛋白質との
結合が特異的に行なわれることは、100倍過剰の未標
識のZP蛋白質を添加することによって、ビオチン標識
したZP蛋白質のsp38に対する結合が完全に阻害さ
れることにより確かめられた。更にこの結合は、デキス
トラン硫酸(分子量範囲=5000〜7000)によっ
て効果的に阻害(ID50=1μg/ml)され、またウ
シ角膜由来のケラタン硫酸でわずかながら阻害(ID50
=0.5mg/ml)された。
群、90KDa、55KDaαおよび55KDaβの各
群から成り、それぞれの群に属する分子は共通のペプチ
ド配列で異なった糖鎖を有している(5)。sp38、
及びプロアクロシンが、これらのZP糖蛋白質のどの群
に特異的に結合するのかを調べるために、ビオチン化Z
P糖蛋白質を逆相HPLCで各コンポーネントに分離
し、これを固相結合アッセイに用いた。ZP蛋白質をコ
ンポーネントに分離するためには、ZP蛋白質25μg
を7M尿素に溶解し、Bakerbond Wide Pore Butyl 5μ
mに添加し、室温で、60分間、0〜100%アセトニ
トリルの濃度直線勾配にて、流速0.5ml/分各フラ
クション1mlにて溶出した。この操作で、90KDa
の蛋白質群のほとんどは55KDaα及び55KDaβ
蛋白質群から分離された(図10および図11)。この
分離されたZP蛋白質コンポーネントを固相結合アッセ
イに用いることによって、sp38とプロアクロシンが
いずれも90KDaの糖蛋白質群と特異的に結合するこ
が分かった(図11)。興味深いことにCa2+非存在下
においてはZP蛋白質のsp38、およびプロアクロシ
ンへの結合能は消失した。
P蛋白質に対する結合特性が非常に類似していることが
分かり、それはsp38とプロアクロシンが90KDa
型のZP蛋白質の同じ結合部位に結合していることを示
唆している。
の拮抗阻害実験により確認された。つまり、ZP蛋白質
50μg/mlにてコートしたプレートに、 125Iで標
識されたsp38(5×105cpm/ウエル)を様々
の濃度の未標識のsp38あるいはプロアクロシンの存
在下で1時間、室温にてインキュベートした。丁寧にプ
レートを洗浄した後、ZP蛋白質に結合している標識s
p38を10%SDSにて溶離し、その放射能活性をγ
線測定装置にて定量した。なお、この結合アッセイにお
いて洗浄緩衝液、ブロッキング緩衝液、及び希釈緩衝液
は「ZP結合活性の測定法」で使用したものと同じもの
を用いた。
ZP蛋白質への結合がプロアクロシンを添加することに
よsp38それ自身を添加した場合と同じように効果的
に阻害されることが確認された(図12)。
築とスクリーニング及び配列決定 オスブタ睾丸poly(A)+ RNAを逆転写酵素で処
理する前に10mMのmethylmercury hydroxide で5分
間変性させること以外はPharmacia LKB Biotechnology
のmanufactures.protocol(Pharmacia LKB Biotechnolog
y)に従い、ホストとして大腸菌Y1090R- を、ベク
ターとしてλgt11を用いて二重鎖cDNAを調製
し、ライブラリーを構築した。プローブとしてアミノ酸
配列KVYVMLHQKに相当するオリゴヌクレオチド
の混合物を用いたプラークハイブリダイゼイション法
(6)により、cDNAライブラリーよりの目的のcD
NAのスクリーニングを行なった。ハイブリダイゼーシ
ョンは50℃で行なった(7)。陽性クローンを単一化
し、その挿入ブタsp38cDNA断片をM13mp1
8、M13mp19あるいはpUC19にサブクローニ
ングし、プラスミドpPSP38−13を得た。このプ
ラスミドからダイデオキシ法によりM13シークエンス
キット(東洋紡)あるいは7−deazaシークエンス
キット(宝酒造)を用いてDNA塩基配列を決定した
(8)。cDNAの塩基配列から演算されるアミノ酸配
列は図1に示される通りである。
1(Lys)からK79(Lys)のアミノ酸配列をコ
ードするオリゴヌクレオチドの混合物をプローブとし
て、オスブタ精巣poly(A)+ RNAに関してノー
ザンプロット解析を行なった。その結果、完全なオープ
ンリーディングルームを含む完全長のメッセンジャーは
約1400塩基対であることが分かった。疎水性領域の
解析をKyte and Doolittle法を用いて行なった結果、N
末の領域(アミノ酸残基21〜37)のみが疎水性の高
い領域であることが分かった。von Heijine の開発した
シグナル配列切断部位予想法によると、もっともそれら
しい切断部位はA39(Ala)とP40(Pro)の
間であった。cDNAより推測されたアミノ酸配列より
計算した分子量は39KDa、シグナル配列を除いた分
子量は35KDaだった。N末のアミノ酸配列解析の結
果はS52(Ser)からはじまっていた。S52(S
er)からL350(Leu)までのポリペプチドの分
子量は34KDaと計算された。これは精巣上体由来の
sp38をN‐グリカナーゼでN結合型糖鎖を切断し、
SDS−PAGEにかけたもの(分子量34KDa、図
13)と一致している。N113(Asn)、N186
(Asn)およびN339(Asn)がアスパラギン結
合型糖鎖結合可能部位あった。sp38に関してNBR
F中の既知のアミノ酸配列と重要なホモロジーは見いだ
されなかった。
DNAの発現、及び発現されたsp38融合蛋白質に対
する抗体の作成 sp38蛋白質のS65(Ser)からL350(Le
u)までをコードするsp38のcDNAのSauIII
AI制限酵素消化断片を、バクテリオファージT7プロ
モーター発現プラスミドpGEMEX−1(プロメガ)
(9)のBamHI制限酵素部位に挿入し、ブタsp3
8蛋白質発現ベクターpGEMX/PSD38を得た。
このプラスミドで大腸菌を形質転換し、IPTGにより
発現の誘導を行なった。発現したsp38とT7gen
e10の融合蛋白とZPとの結合性は、ビオチン化ZP
をプローブとしたウェスタンブロット解析により確認さ
れた(図14)。SDS−PAGEによって精製したs
p38融合蛋白に対するポリクローナル抗体を、Freund
s complete adjuvant(Gibco.NY)を用いて免疫したNew
Zealand white ウサギより調製した。IgG画分をプロ
ティンGセファロースカラムにより精製した後、更に抗
原特異的抗体をPVDF膜に固定したブタ***sp38
抗原を用いて精製した(10)。このようにして得られ
た抗体は精巣上体***より精製したsp38と反応する
(図15;レーン1)。これによってsp38(の融合
蛋白質)が大腸菌にて発現されていることが確認され
た。
にかけ、精製した抗ブタsp38融合蛋白質ウサギ抗体
を用いて染色されるバンドを調べた。図15のレーン2
に示す様にHPLCより精製したsp38と同様のサイ
ズを示す38KDaのバンドが得られた。このことは、
精巣上体の***においてsp38は38KDa型として
発現されていること、および、蛋白質のN末端P40
(Pro)からR51(Arg)までのproteolytic な
切断は蛋白質精製中に起こる人工的なものでなく蛋白質
のマチュレイションによるものであることを示してい
る。
RNAよりオリデオキシTカラム(Pharmacia LKB Biot
echnology)を用いて各臓器のpoly(A)+RNAを
調製した。poly(A)+ RNAはglyoxal で変性後
(10)、1.2%のアガロースゲルに電気泳動し、Ge
neScreen Plus TM膜に転写した。プローブとして上記と
同様のオリゴヌクレオチド混合物を用いてハイブリダイ
ゼーション(7)を行なった。その結果、sp38のm
RNAは精巣でのみ強く発現されていた(図16;レー
ン1)。
せた(12)。一部の***は先体反応を誘導するために
カルシウムイオノホアー(A23187:Sigma 社)を
終濃度5μMになるように添加し、37℃にてCO2イ
ンキュベーターに30分、あるいは60分間静置した。
これらの***をPBSで洗浄し、***溶液を20分間か
けて1%パラホルムアルデヒド含有PBSで固定した。
***懸濁液を0.5mlのFCSに上層し、遠心操作を
行なった。FCS中で遠心沈降した***を数回PBSで
洗浄した後、非特異的染色を避けるために2%FCS含
有PBSで、4℃オーバーナイトプレインキュベートし
た。また、抗原特異的に精製した抗sp38融合蛋白質
ウサギ抗体あるいは感作していないウサギIgGを2%
BSA−PBSで10μg/mlに希釈して加え、1時
間37℃にてインキュベートした。この***懸濁液を
0.5mlのFCSに上層し遠心した。遠心沈降した精
子をPBSで洗浄した後、2%BSA−PBSで200
倍に希釈したペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ウサギ
IgGF(ab′)2(cappel)で1時間37℃
にてインキュベートし、その後FCSに上層し、遠心し
た。FCS中で遠心沈降した***を何段階かにわけPB
Sで洗浄後、3,3′‐ジアミノベンチジンテトラクロ
ライドを用いて発色させ、光学顕微鏡下で観察した。ま
た、受精能獲得操作後の***にメタノールで透過処理を
行ない、同様に免疫染色を施したものについても鏡見し
た。抗sp38融合蛋白抗体を用いた場合、図17Aに
示されるように、先体反応前***にはいずれの部分にも
陽性染色は見られなかった。カルシウムイオノホアーを
加えて30分後には典型的な染色パターンとして前頭部
において強い染色が見られた(図17B)。60分後に
は、赤道部において多少の染色を残しながらも強い発色
はほとんどの***細胞から衰微していった。***細胞を
メタノールによって透過生処理を行なった際にはカルシ
ウムイオノホアーを加える前でも前頭部において陽性染
色パターンが得られた(図17C)。一方非感作ウサギ
IgGを用いた場合は、いずれの操作を施した***も全
く染色されなかった。これらの結果は、sp38は先体
内蛋白質として存在し、先体反応の誘導に伴なって表面
に発現してくることを示している。
p38のアミノ酸配列の特定化 ZP結合特性の類似性にもかかわらずプロアクロシンの
アミノ酸配列とsp38のcDNA塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列の間には重要なホモロジーは見いださ
れなかった。しかし、短いアミノ酸配列に関して考慮し
てみると部分的ホモロジーがsp38の256から26
6番目のアミノ酸配列に相当するKRLSKAKNLI
E(K256−E266残基)とプロアクロシンの36
5から372番目のアミノ酸配列に相当するKRLQQ
LIE(K365−E372残基)の間で観察された。
このプロアクロシンの塩基配列の中のK365(Ly
s)とR366(Arg)との間のペプチド結合はプロ
アクロシンからアクロシンへのマチュレイションの際切
断されることは報告されているとおりである(7)。プ
ロアクロシンからアクロシンへの変換の際、これらへの
ZPの結合活性を固相結合アッセイを用いて評価した結
果、図18に示されるように、pH8でインキュベート
している間に自己活性化機構によってプロアクロシンか
ら成熟アクロシンへ変化していく過程において、ZPの
プロアクロシンへの結合は時間依存的に減少した。この
結果は、前述のようなsp38と部分的にホモロジーの
あるプロアクロシンのアミノ酸配列の中に、ZP結合活
性に関与している配列が含まれている可能性を示唆して
いる。
の各合成ペプチドフラグメントの固相結合アッセイ この可能性を調べるために次の表1に示すsp38とプ
ロアクロシンの部分アミノ酸配列をそれぞれ合成し、こ
の合成ペプチドフラグメントのZP結合活性、並びにs
p38とZP蛋白質との結合に対する阻害活性を固相結
合アッセイによって調べた。
に固定化したプロアクロシンの合成ペプチドフラグメン
ト、sp38の合成ペプチドフラグメントのいずれも、
ビオチンで標識されたZP蛋白質と結合した。また、こ
れらの合成ペプチドフラグメントの阻害活性は、ZP糖
蛋白質(50μg/ml)をELISAプレートに固定
化し、様々の濃度の合成ペプチドフラグメント存在下、
125I標識sp38(5×105cpm/ml)のZP
蛋白質への結合を調べることによって測定した。その結
果、どのペプチドフラグメントもELISAのプレート
上に固定化されたZP蛋白質への 125I標識sp38の
結合を阻害した(図19)。これらの結果は、プロアク
ロシンのK365−E372のみでなくsp38のK2
56−E266のアミノ酸配列がこれら2つの蛋白のZ
P蛋白質への結合に関与していることを示唆している。
の各合成ペプチドフラグメントに対する抗体の作成 表1に示すsp38及びプロアクロシンの部分アミノ酸
配列を有する各合成ペプチドフラグメントは、C末端に
付加したシスティン残基を介してブタ由来チログロブリ
ンに結合させた。これをFreunds complete adjuvant を
用いて家兎に免疫した。抗体価の上昇は、表1に示され
る各合成ペプチドを高吸着性ELISAプレートに吸着
させたものを用いてELISA法にて確認した。IgG
画分の精製はプロティンGセファロースカラムより行な
い、更に特異抗体を、PVDF膜に固定したブタ***s
p38抗原、あるいはプロアクロシン抗原を用いて精製
した(10)。
サギ血清(抗体I)、表1に示されるsp38の部分ア
ミノ酸配列を持つペプチドフラグメントに対するウサギ
抗体(抗体II)、及び、表1に示されるプロアクロシン
の部分アミノ酸配列を持つペプチドフラグメントに対す
るウサギ抗体(抗体III)それぞれについて、その***‐
卵結合に対する阻害効果を、非感作ウサギIgGと比較
して次の方法で調べた。ブタ***を精巣上体尾部から回
収し、改変したKrebs-Ringer-bicarbonate溶液(m−K
RB)で受精能力を与えた(12)。一方、ブタ卵巣卵
は高塩保存溶液に保存し(13)、使用前にm−KRB
の数段階のステップを経て脱塩した。m−KRBで30
μg/mlに希釈した各抗体50μlを受精能力を与え
た***の懸濁液(5×106個/ml)50μlに加
え、その後10個から20個の卵を加え、60分間37
℃にてCO2インキュベータの中に静置した。インキュ
ベーション後、結合されなかった***をパイペットを用
いて前後に数回パイペッティングすることによって洗浄
除去した。卵のZP蛋白質に結合した***の個数を顕微
鏡下で数えた。まず、抗体I、抗体II、抗体III および
非感作ウサギIgG画分の添加が実験に用いられた濃度
(最終濃度で15μg/ml)ではこの状態の***の運
動性に影響を与えないだけではなく、***の凝集も引き
起こさないことを確認した。非感作IgG画分を添加し
たところ、各々の卵に対して50以上の***細胞が結合
した(図20、a)がそれに対し、抗体Iを添加した場
合には、卵に対して***の結合がほとんど認められなか
った(図20,b)。抗体II、III についても、同様に
強い結合阻害効果が見られた。これらの結果をまとめて
表2に示す。
***に結合することが免疫染色法により示されたことか
ら、この抗体の***に対する凝集活性を調べた。***の
凝集試験は(14)の報告を若干改変したマイクロトレ
イテスト法を用いた。精巣上体尾部より回収したオスブ
タ***に受精能力を与え、更にカルシウムイオノファア
で先体反応を誘導した後、これをPBSに3×105/
mlになるように懸濁した。精製した抗sp38融合蛋
白質ウサギ抗体あるいは非感作IgGをPBSで様々な
濃度に希釈し、この溶液5μlを***の懸濁液1μlに
添加し、パラフィンオイル被膜下37℃にてインキュベ
ートした。60分後、プレートを位相差顕微鏡で観察
し、凝集の有無を調べた。結果は、表3に示される通り
である。
以上のように、抗sp38融合蛋白質抗体で90%以上
の***の凝集が起こった。これに比べ同濃度の非感作I
gGの場合は明らかに凝集が弱かった。
1090R- を、ベクターとしてλgt11を用いたヒ
ト精巣由来cDNAライブラリー(クローンテック社)
から、ブタsp38cDNAクローニングプラスミドp
PSP38−13のN末側の翻訳領域を含むEcoRI
断片(1030bP)をプローブとし、プラークハイプ
リダイゼイション法を用いて行なった。ハイプリダイゼ
ーションは60℃にて行ない、陽性クローンを単一化
し、そのヒトsp38cDNA挿入断片をpUC19に
サブクローニングして、プラスミドpHSP38−4を
得た。
腸菌における発現 ヒトsp38cDNAを大腸菌発現ベクターpGEX−
3T (Pharmacia LKBBiotechnology)を用いてグルタチ
オンS−トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質
として発現させた。制限酵素部位BamHIおよびHi
ndIIIを負荷したcDNA断片を得るために、成熟
蛋白質のN末端と思われる52残基目からのペプチドA
FRLTK及びC末端GAKTCLをそれぞれ含むDN
A部位に、各々BamHIおよびHindIII制限酵
素部位を付加したプライマー5′−ATAGGATCC
GCTTTTCGCTTGACCAAAG−3′と5′
−AATAAGCTTTTATAAGCACGTTTT
TGCTCC−3′を用いてpHHSP38−4を鋳型
にPCRを行なった。なおPCRはGeneAmp (商品名)
PCRSystem9600(PERKINELMERCETUS 社)を用い、94
℃1分間、58℃5秒間、72℃2分間で22サイクル
の条件下で行なった。得られたPCR産物をBamHI
およびHindIIIにて切断し、pGEX−3TのB
amHIおよびHindIII部位に挿入し、ヒトsp
38とグルタチオンS−トランスフェラーゼとの融合蛋
白質発現ベクターpGEX/HSP38を得た。このp
GEX/HSP38で大腸菌DH5形質転換し、IPT
Gにより発現の誘導を行なった。形質転換体DH5のS
DS−PAGEパターンを図21として示す。図21に
おいてレーン1は発現誘導前であり、レーン2は発現後
についてである。更にこの融合蛋白質の発現は、抗原特
異的に精製した抗ブタsp38融合蛋白抗体がヒトsp
38融合蛋白と交叉反応性を示すことにより確認され
た。図15、レーン4,5は各々ヒトsp38融合蛋白
質発現、非発現の大腸菌を可溶化しウェスタンブロット
解析を行なったもので、レーン4に示されるヒトsp3
8融合蛋白質のみがこの抗体と交叉反応性を示した。
l.Chem.Hoppe-Seyler.369,69-76 。 2 Polakoski,K.L.,and Parrish,R.F.(1977) J.Biol.C
hem.252,1888-1894 。 3 Noda,Y.,Mori,T.,Takai,I.,Kohda,H.,and Nishimur
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87) J.Biol.Chem.262,564-571 。 6 Benton,W.D.,and Davis,R.W.(1977) Sience 196,18
0-182 。 7 Baba,T.,Kashiwabara,S.,Watanabe,K.,Itoh,H.,Mic
hikawa,Y.,Kimura,K.,Takada,M.,Fukamizu,A.,and Ara
i,Y.(1989) J.Biol.Chem.264,11920-11927 。 8 Sanger,F.,Nicklen,S.,and Coulson,A.R.(1977) Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74,5463-5467。 9 Studier,F.W.,and Moffatt,B.A.(1986) J.Mol.Bio
l.189,113。 10 Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989)
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atory,Cold Spring Harbor,New York。 11 Mcmaster,G.K.,and Caemichael,G.G.(1977) Rroc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.74,4835-4838 。 12 Iritani,A.,Kasai,M.,Niwa,K.,and Song,H.B.(198
4) J.Reprod.Fert.70,487-492 。 13 Yanagimachi,aar.,Lopata,A.,Odom,C.B.,Bronson,
R.A.Mahi,C.A.,andNicolson,G.L.(1979) Ferti.Steril.
31,562-574 。 14 Friberg,J.A.(1974) J.Gynecol.Scad.(suppl) 36,2
1-29。
て、15−1067番のコーディング領域を含む。
て、37−1092番のコーディング領域を含む。
C分析結果およびその画分蛋白質のZP結合活性を表す
図である。
結果およびその画分のZP結合活性を示す図であって、
ZP結合活性について明確な2つのピークaおよびbが
観察された。
てのSDSポリアクリルアミド電気泳動図(SDS−P
AGE)の結果を示す写真である。
であって、レーン1および2:ZP結合蛋白質画分(ピ
ークb)とZP蛋白質との結果、レーン3:フラクショ
ン15(55kDaおよび53kDa蛋白質)と抗ブタ
***プロアクロシン抗体との結果、レーン4:ZP結合
蛋白質画分(ピークb)と抗ブタ***プロアクロシン抗
体とについての結果である。
断片の逆相HPLC分析結果およびそのペプチド断片の
アミノ酸配列を示す図である。
kDa、55kDaαおよび55kDaβの各コンポー
ネントに分離した結果を示す図であって、sp38、プ
ロアクロシンいずれにも結合活性を有する画分が得られ
たことを示している。
SDS−PAGEの結果を表す写真であって、sp3
8、プロアクロシンがいずれも90kDaのZP蛋白質
の同じ結合部位に結合していることを示唆する。
果を示す図であって、●−●はsp38についてであ
り、○−○はプロアクロシンについてである。
−PAGEの結果を示す写真であって、レーン1は消化
後であり、レーン2は消化前を示す。
質のSDS−PAGEの結果を示す写真(レーン1:C
BB染色)、および、ビオチン化ZP蛋白質をプローブ
としたウェスタンブロット解析(レーン2)の結果を示
す写真である。
タンブロット解析の結果を示す写真であって、レーン
1:精製したsp38、レーン2:ブタ***細胞、レー
ン3:ブタsp38とT7gene10の融合蛋白質を
発現させた大腸菌、レーン4:ヒトsp38とGSTの
融合蛋白質を発現させた大腸菌、レーン5:コントロー
ルとしての大腸菌である。
て、レーン1〜4はそれぞれオスブタの精巣、肝臓、腎
臓または脾臓由来のpoly(A)+RNAである。
て、A:先体反応誘導前の***、B:先体反応誘導後の
***、および、C:先体反応誘導前にメタノール透過処
理を施した***である。
うZP結合活性の減少を示す図である。
ペプチドのsp38とZP蛋白質との結合の阻害を示す
図であって、●−●はsp38の部分ペプチドの場合
を、○−○はプロアクロシンの部分ペプチドの場合を示
す。
写真であって、a:非感作IgGの存在下における卵細
胞の様子であり、多数の***細胞の結合が観察され、
b:抗sp38融合蛋白質抗体の存在下における卵細胞
の様子であり、この場合***細胞の結合が観察されな
い。
を示す図であって、レーン1は発現前を、レーン2は発
現後を表わす。
Claims (13)
- 【請求項1】図1に記載のアミノ酸配列の一部または全
部を含んでなる、ペプチド。 - 【請求項2】図3に記載のアミノ酸配列の一部または全
部を含んでなる、ペプチド。 - 【請求項3】ZP蛋白質への結合活性、および/また
は、***とZP蛋白質との結合を阻止する抗体を生体内
で産生し得る抗原性を有する、請求項1または2記載の
ペプチド。 - 【請求項4】図1の256番から266番の配列を有す
る請求項1記載のペプチド。 - 【請求項5】図3の257番から267番の配列を有す
る請求項2記載のペプチド。 - 【請求項6】図1に記載のアミノ酸配列の一部または全
部をコードする塩基配列を含んでなる、DNA配列。 - 【請求項7】図3に記載のアミノ酸配列の一部または全
部をコードする塩基配列を含んでなる、DNA配列。 - 【請求項8】請求項6または7記載のDNA配列を含ん
でなる、発現ベクター。 - 【請求項9】請求項8記載の発現ベクターによって形質
転換された原核生物または真核生物細胞宿主。 - 【請求項10】請求項9記載の宿主細胞を培養し、その
培養物から請求項1または2記載のペプチドを単離する
ことを含んでなる、請求項1または2記載のペプチドの
製造法。 - 【請求項11】請求項1〜5いずれか一項記載のペプチ
ドと、薬学的に許容される担体とを含んでなる、避妊ワ
クチン。 - 【請求項12】請求項1〜5いずれか一項記載のペプチ
ドに対する、抗体。 - 【請求項13】請求項12記載の抗体と、薬学的に許容
される担体とを含んでなる、避妊薬。
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