CN114957378B - 疏水性包涵体抗原蛋白的复性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了包涵体抗原蛋白的透析复性方法,尤其是疏水性包涵体抗原蛋白的透析复性方法,具体地,本发明公开了在包涵体的透析复性过程中引入了高温透析步骤,进而得到纯度高、单位活性高、稳定性显著增加、溶解度好的目标蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,具体地涉及包涵体抗原蛋白、特别是疏水性抗原蛋白的透析复性方法。
背景技术
体外诊断试剂被广泛用于各种疾病的诊断和筛查,其中,抗原是免疫诊断中重要的检测原料。抗原的制备是一个非常关键的问题,活性低、稳定性差的抗原会严重影响检测的准确性和有效性。重组蛋白抗原制备常采用原核表达***进行表达,大肠杆菌被广泛地用做宿主细胞。重组蛋白抗原设计时,抗原表位识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点,选择这些具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性区域有利于免疫产生出高亲和力、高特异性的抗体。但一些蛋白,比如说HCV核心蛋白(HCV core protein),是高度疏水的,包含该区段的抗原往往也具有高疏水性。这类疏水性抗原在宿主细胞中表达时,往往形成包涵体。包涵体要经过细胞裂解,提取洗涤、变复性及纯化步骤才能得到有生物活性的抗原蛋白质。
包涵体蛋白的复性通常有稀释、透析、色谱复性等几种方法。透析法通过逐渐降低外透液浓度控制变性剂去除速度,达到包涵体复性的目的,具有操作简单的,不增加体积的优点。透析复性时,蛋白在折叠过程中,分子内的疏水基团暴露在溶液中,多肽链的疏水基团之间相互作用、碰撞,可能形成不正确的折叠而导致聚集。因此,蛋白质复性是蛋白折叠(refolding)和聚集(aggregation)的平衡,温度升高,则疏水作用力增强,蛋白质折叠速度增加,但会使得二硫键更易错配,更容易发生蛋白聚集,进而大大降低复性蛋白的活性及复性回收率,故透析复性温度一般选择在较低的温度中进行,例如2℃至28℃的温度,尤其是2℃至8℃的低温环境,而对于高于30℃的高温,传统包涵体蛋白的透析复性方法是尽量避免的。
此外,包涵体中包含重组蛋白,以及不同程度的来自宿主菌的蛋白、核酸以及细胞膜等杂质成分。通常认为,这些杂质在复性过程中,容易引起蛋白聚集,导致产率降低。因此,为了减少由这些杂质引起的蛋白聚集,也使得复性通常需要在低温下进行。
蛋白质复性是一个非常复杂的过程,其方法很大程度上与该蛋白质本身的特性有关系。分泌型蛋白、可溶性蛋白、包涵体蛋白的复性方法有巨大的差异。就包涵体蛋白而言,不同的包涵体蛋白的疏水性有所差异。采用传统的包涵体低温透析复性方法,能够实现疏水性较低、亲水性较好的蛋白的较高复性效率,比如巨细胞病毒抗原蛋白、疱疹病毒抗原蛋白、猪瘟病毒抗原蛋白、结核分枝杆菌抗原蛋白。但在一些抗原蛋白,如弓形虫、风疹病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、柯萨奇病毒、***、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒等的疏水性相对较强的抗原蛋白的透析复性中,包涵体低温透析复性的效果不理想,低温透析复性得到的产物中掺杂有大类非目标蛋白,导致产物纯度低,活性差,稳定性也不好,放置后产物常常再次聚集,产生沉淀。
考虑到目前对蛋白质体外折叠聚集平衡机制的不完全理解,为特定的包涵体蛋白寻找合适的复性方法往往并不容易。因此,本领域仍需要对特定蛋白的复性方法进一步探索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对包涵体抗原蛋白,特别是疏水性强的包涵体抗原蛋白的透析复性方法。本发明的复性方法获得的目标蛋白的纯度高、单位活性高、稳定性显著增加、溶解度好、并且产物经长期放置后仍保持稳定。
本发明的发明人意外的发现,对于经前期处理的包涵体抗原蛋白的溶液,特别是疏水性包涵体抗原蛋白的溶液,在较高温度的透析复性条件下,包涵体中来自宿主菌和表达载体的非目标蛋白会发生特异性的沉降,进而得到高纯度、高单位活性的抗原蛋白产物。由此得到本发明。
在本发明的第一方面,提供了一种用于包涵体抗原蛋白的透析复性方法,包括以下步骤:
1)用第一复性缓冲液在2℃至8℃的第一透析温度对包涵体蛋白溶液进行第一次透析;
2)用第二复性缓冲液在2℃至28℃的第二透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第二次透析;
3)用第三复性缓冲液在2℃至28℃的第三透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第三次透析;以及
4)用更新的第三复性缓冲液在30℃至45℃的第四透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第四次透析,
所述第一复性缓冲液至第三复性缓冲液中的尿素浓度依次下降。
本发明的透析复性方法的有益之处在于:本发明的透析复性方法克服了包涵体蛋白的传统透析复性通常选择在较低温度下进行的常规方式,通过在透析复性过程中增加30℃至45℃的高温步骤,使包涵体中的非目标蛋白发生特异性的沉降,进而使得经高温透析得到的目标蛋白产物收率高、纯度好、单位活性高。特别是对疏水性抗原蛋白的复性,增加高温步骤的透析复性方法得到的抗原蛋白的单位活性和溶解度远远优于传统低温复性方法得到的抗原蛋白。此外,通过本发明的透析复性方法得到的抗原蛋白稳定性好,经长期放置后产物仍能够保持稳定。
附图说明
本发明附图与本发明的实施例一起提供了对本发明的进一步解释,并且构成说明书的一部分。显而易见地,下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施方案,旨在示出本发明的原理,而无意以任何方式构成对本发明的限制。对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1示出了实施例1中五种方案复性得到的肺炎支原体抗原蛋白的胶体金试纸结果。
图2示出了实施例2中三种方案复性得到的艾滋病毒抗原蛋白的胶体金试纸结果。
图3示出了实施例3中四种方案复性得到的丙肝病毒抗原蛋白的胶体金试纸结果。
图4示出了实施例5中三种方案复性得到的巨细胞抗原蛋白的胶体金试纸结果。
具体实施方式
下面对本发明进行详细的描述。需理解,以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明,无意于对本发明的范围进行限制,本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且,本领域技术人员理解,在不背离本发明的精神和主旨的情况下,可以对本发明技术方案进行修改。
若并未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前,提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中,例如浓度范围、百分比范围或比率范围,应当理解,除非上下文另有明确规定,否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中,并且此类实施方案也包括在所述主题内,受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中,排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中,很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述,表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外,还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外,在本文中,表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述,表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤,而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时,该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围,除非另外指出,否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此,除非相反地指出,否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值,其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少,每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
在本发明的第一方面,提供了一种用于包涵体抗原蛋白的透析复性方法,包括以下步骤:
1)用第一复性缓冲液在2℃至8℃的第一透析温度对包涵体蛋白溶液进行第一次透析;
2)用第二复性缓冲液在2℃至28℃的第二透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第二次透析;
3)用第三复性缓冲液在2℃至28℃的第三透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第三次透析;以及
4)用更新的第三复性缓冲液在30℃至45℃的第四透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第四次透析,
所述第一复性缓冲液至第三复性缓冲液中的尿素浓度依次下降。
在一个具体的实施方案中,所述第四透析温度高于所述第三透析温度,所述第三透析温度高于或等于、优选高于所述第二透析温度,以及所述第二透析温度高于或等于、优选高于第一透析温度。
在一个优选的实施方案中,所述第二透析温度是22℃至28℃。
在一个优选的实施方案中,所述第三透析温度是22℃至28℃。
在一个优选的实施方案中,所述第四透析温度是35℃至42℃。
在一个更优选的实施方案中,所述第四透析温度是37℃至40℃。
在一个最优选的实施方案中,所述第一透析温度是4℃,第二透析温度是25℃,所述第三透析温度是25℃,以及所述第四透析温度是38℃。
在又一个具体的实施方案中,所述抗原蛋白是疏水性抗原蛋白。
在本发明的上下文中,术语“疏水性抗原蛋白”是指总平均亲水性(Grand averageof hydropathicity,GRAVY)分值在-0.6以上的那些抗原蛋白。蛋白的疏水性与其组成的氨基酸类型有关,每种氨基酸有其特定的亲水指数(Kyte J.,Doolittle R.F.etal.J.Mol.Biol.157:105-132,1982)。用Kyte&Doolittle算法可对蛋白质的疏水性进行计算打分,得到蛋白的总平均亲水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)。通常来说GRAVY分值越高,蛋白疏水性越强,GRAVY分值越低蛋白亲水性越好。在GRAVY得分在-0.6以上的那些抗原蛋白的复性中,特别是GRAVY得分在-0.4以上的那些抗原蛋白,低温透析复性得到的产物中掺杂有大量非目标蛋白,进而导致产物纯度低,活性差,稳定性也不好,放置后产物常常再次聚集,产生沉淀。
在一个进一步具体的实施方案中,所述抗原蛋白是支原体、衣原体、病毒、细菌、寄生虫等的抗原蛋白,但不限于此。
在一个优选的实施方案中,所述支原体是肺炎支原体,所述抗原蛋白包含肺炎支原体P1蛋白片段,但不限于此。
在一个优选的实施方案中,所述衣原体是肺炎衣原体,但不限于此。
在又一个优选的实施方案中,所述病毒是风疹病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、柯萨奇病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒,但不限于此。
在又一个优选的实施方案中,所述寄生虫是弓形虫,所述抗原蛋白包含弓形虫棒状体蛋白片段,但不限于此。
在又一个优选的实施方案中,所述细菌是***。
在再一个优选的实施方案中,所述病毒是艾滋病毒,所述抗原蛋白包含gp41片段和/或gp36片段。
在再一个优选的实施方案中,所述病毒是丙肝病毒,所述抗原蛋白包含丙肝病毒核心蛋白(CORE)片段。
包涵体蛋白溶液首先在低温(4℃)透析缓慢复性,然后转移至室温(22~28℃)复性,最后跳跃到高温(30~45℃)透析,加速复性。不希望被理论束缚,在加速复性的过程中,疏水性蛋白的包涵体中来自宿主菌和表达载体的非目标蛋白会特异性的发生沉降,而目标抗原蛋白沉降不明显,冷冻离心后,得到的产物抗原蛋白纯度高、单位活性好、且稳定性高。
在又一优选的实施方案中,所述高温为35~42℃。
在又一优选的实施方案中,所述高温为37~40℃。
在一个更优选的实施方案中,所述高温为38℃。
在又一个优选的实施方案中,所述包涵体蛋白溶液的浓度为0.1mg/ml至5mg/ml。
在又一个优选的实施方案中,所述包涵体蛋白溶液的浓度为0.4mg/ml至2mg/ml。
在一个更优选的实施方案中,所述包涵体蛋白溶液的浓度为0.5mg/ml至1mg/ml。
在一个进一步具体的实施方案中,所述第一透析时间为2至8小时,优选为4小时。
在又一个具体的实施方案中,所述第二透析时间为2至8小时,例如为4小时。
在又一个具体的实施方案中,所述第三透析时间为2至8小时,例如为4小时。
在又一个具体的实施方案中,所述第四透析时间为大于4小时,优选为至少16小时。
在又一个具体的实施方案中,所述复性缓冲液选自Tris缓冲液、精氨酸缓冲液、山梨糖醇缓冲液、胱氨酸缓冲液、硫酸铜缓冲液、脱氧抗坏血酸缓冲液和硫代硫酸钠缓冲液。本领域技术人员可以根据实际需要对复性缓冲液进行选择,举例来说,所述第一、第二或第三复性缓冲液可以都是例如Tris缓冲液,也可以都是精氨酸缓冲液或其他类型的缓冲液。
在一个进一步优选的实施方案中,所述复性缓冲液还包括浓度为0.5M至3M的尿素、浓度为100mM至500mM的NaCl、以及蛋白保护剂。所述蛋白保护剂可以包含1至10mM EDTA和0.5至5mM二硫苏糖醇(DTT)。所述蛋白保护剂还可以包含5%至20%的甘油,或0.01%至1%的Tween20,或0.01%至1%的PEG。所述PEG可以为选自PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000中的任一种,所述蛋白保护剂还可以包含糖醇类物质,如葡萄糖、蔗糖、海藻糖等。
本领域技术人员熟知,在透析复性的过程中,复性缓冲液中的尿素浓度需随着透析复性的进行而依次下降,例如,第一复性缓冲液中的尿素浓度可以为3M,第二复性缓冲液中的尿素浓度可以为1.2M,第三复性缓冲液中的尿素浓度可以为0.5M。
在又一个具体的实施方案中,所述复性缓冲液的pH为7.0至8.5。所述第一、第二和第三复性缓冲液的pH相同,优选为大于目标蛋白等电点(PI)一个pH值。
在又一个具体的实施方案中,所述包涵体蛋白溶液通过以下步骤获得:
-通过重组大肠杆菌诱导表达产生所述包涵体抗原蛋白,并收集菌体;
-裂解所述菌体,所得菌液经超声破碎或者匀浆破碎,冷冻离心,收集所述包涵体抗原蛋白;
-洗涤所述包涵体抗原蛋白2~3次,收集沉淀;以及
-溶解所述沉淀,并冷冻离心,上清即所述包涵体蛋白溶液。
在又一个具体的实施方案中,还包括稀释所述包涵体蛋白溶液至0.1mg/ml至5mg/ml,优选地,将所述包涵体蛋白溶液至0.4mg/ml至2mg/ml。
下文中,结合示例性的实施方案会更详细地描述本发明。然而,本文公开的示例性的实施方案仅出于示例的目的,而不应该被认为旨在解释本发明的范围。
实施例
在下述实施例中,本发明人分别采用本发明的透析复性方法和现有技术的低温复性方法对一些疏水性包涵体抗原蛋白和亲水性包涵体抗原蛋白进行了测试,以验证根据本发明的透析复性方法及其技术效果。如无特殊说明,其中采用的试验方法均为常规方法,并且如无特殊说明,下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。
应注意,本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的,无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下,本发明的范围由随附的权利要求书确定。
前处理步骤:配制包涵体蛋白溶液
1.采用TB培养基培养2L重组大肠杆菌,诱导表达使其产生包涵体蛋白。在2℃至8℃、8000~8500rpm下冷冻离心5min,收集菌体。
2.除去上清后用适量的裂解缓冲液(例如20mM至100mM Tris缓冲液,pH 7.0~8.5)重悬菌体。将重悬后的菌液超声破碎或者匀浆破碎(破碎程度视情况而定)。在2℃至8℃、13500rpm下冷冻离心15min,除去上清收集包涵体。
3.将收集到的包涵体用适量的洗涤缓冲液(例如20mM至100mM Tris缓冲液,100mM至500mM NaCl,1mM至5mM EDTA,含1%至2%Triton-100,pH7.0~8.5)洗涤2~3次。每次洗涤后超声波分散,然后在4℃、13500rpm下冷冻离心10min,收集沉淀。
4.将洗涤后收集到的沉淀重悬于适量的溶解缓冲液中(例如20mM至100mM Tris缓冲液,含8M Urea,pH7.0~8.5)。然后用超声波促进溶解。在4℃、14000rpm下冷冻离心20min,收集上清,即为溶解好的包涵体蛋白溶液,4℃保存备用。
5.将得到的溶解好的包涵体蛋白溶液用低浓度尿素溶液(含20mM至100mM Tris缓冲液,4M Urea,pH7.0~8.5)稀释一倍,4℃复性过夜。
单位活性评估步骤
用胶体金免疫层析的方法对经透析复性获得的目标蛋白样品进行评估,将抗原蛋白进行胶体金标记(标记抗原),在玻璃纤维上与含有阳性抗体的质控品混合,质控品中的抗体与标记抗原蛋白结合,形成胶体金混合物,混合物继续往醋酸纤维膜上层析,抗原蛋白(包被抗原)已预先固定于硝酸纤维膜(T线),混合物经过包被抗原时,便会被T线捕获,显示出颜色。显示条带颜色的深浅,可以指示出标记抗原与抗体结合的活性。将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡进行比较,选出最接近的颜色,将该颜色对应的色号的档数来标记产物的活性。色卡分为C1-C9九档,其中,C1为强阳性,表示单位活性最高,中间梯度递增,C9为最弱阳性,表示单位活性最低。
物理状态稳定性评估步骤
将经透析复性获得的目标蛋白样品分别置于4℃低温环境下保存3个月,然后观察样品,对蛋白的稳定性作出评判,其中,沉淀量按从多到少排列顺位为:有沉淀>有少量沉淀>有微量沉淀>沉淀肉眼不可见。
产品总收率的计算
将经过前处理步骤得到的包涵体蛋白溶液样品采用紫外分光光度法测出浓度,计算出样品总量x;该包涵体蛋白溶液样品经透析复性后,得到的目标蛋白样品再次采用紫外分光光度计测出浓度,计算出样品总量y;总收率=100%*y/x。
以下实施例1-5中采用的样品均通过上述方法制得,并且以下实施例1-5中给出的结果均通过上述方法评估得到。
实施例1:肺炎支原体包涵体抗原蛋白的复性
通过前处理步骤配制肺炎支原体包涵体蛋白溶液(GRAVY分值为-0.319)。将前处理步骤得到的稀释后的样品装袋,分别以以下五种透析方案进行透析复性:
(1)先在4℃下用第一复性缓冲液(100mM Tris缓冲液,含3M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(100mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在4℃下继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(100mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在4℃下继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在4℃下透析16小时。
(2)先在4℃下用第一复性缓冲液(100mM Tris缓冲液,含3M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(100mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在4℃下继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(100mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在4℃下继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在35℃下透析16小时。
(3)先在4℃下用第一复性缓冲液(100mM Tris缓冲液,含3M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(100mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(100mMTris缓冲液,含0.5M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在35℃下透析16小时。
(4)先在4℃下用第一复性缓冲液(100mM Tris缓冲液,含3M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(100mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(100mMTris缓冲液,含0.5M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在45℃的室温环境透析16小时。
(5)先在4℃下用第一复性缓冲液(100mM Tris缓冲液,含3M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(100mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(100mMTris缓冲液,含0.5M Urea,500mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH7.5),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在25℃的室温环境透析16小时。
收集透析复性后的样品溶液,在4℃、14000rpm冷冻离心10分钟,去除沉淀物,收集上清液。并根据前述单位活性评估步骤和物理状态稳定性评估步骤对收集的肺炎支原体抗原蛋白样品分别进行评估,结果如下表1所示。这五种方案得到的肺炎支原体抗原蛋白的胶体金试纸结果如图1所示。
表1:采用上述五种方案复性得到的肺炎支原体抗原蛋白的性状
对于上述五种方案,相比复性过程中一直采用保持4℃的对比方案(1)和复性温度在复性步骤后期升高至仅25℃的对比方案(5),本发明的方案(2)-(4)在最后的复性步骤中采用了35℃或45℃的高温,得到的肺炎支原体抗原蛋白样品在产物单位活性和保存稳定性方面明显优于对比方案(1)和(5)。具体来说,由表1可知,对比方案(1)和(5)的总收率相对较高,但收集得到的目标蛋白的杂质含量很高,单位活性低,长期放置会产生大量沉淀。相比之下,本发明的方案(2)-(4)的总收率相对低,但收集得到的目标蛋白的纯度好,单位活性好,长期放置物理状态稳定。其中,又以在复性过程的中期采用25℃的室温环境透析的本发明的方案(3)和(4)得到的产物单位活性最优。
由此可知,在肺炎支原体包涵体蛋白的透析复性后期,采用30℃至45℃的高温能够显著提高目标抗原蛋白的纯度和单位活性,进而使得目标抗原蛋白在4℃放置3个月后仍能够保持物理状态的稳定。
实施例2:艾滋病毒(HIV)包涵体抗原蛋白的复性
通过前处理步骤配制艾滋病毒包涵体蛋白溶液(GRAVY分值为-0.342)。将前处理步骤得到的稀释后的样品装袋,分别以以下三种透析方案进行透析复性:
(1)先在4℃下用第一复性缓冲液(25mM Tris缓冲液,含3M Urea,300mM NaCl,5mMEDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(25mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,300mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0),在4℃下继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(25mM Tris缓冲液,含0.5MUrea,300mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0),在4℃下继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在4℃下透析16小时。
(2)先在4℃下用第一复性缓冲液(25mM Tris缓冲液,含3M Urea,300mM NaCl,5mMEDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(25mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,300mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(25mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,300mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在25℃的室温环境透析16小时。
(3)先在4℃下用第一复性缓冲液(25mM Tris缓冲液,含3M Urea,300mM NaCl,5mMEDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(25mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,300mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(25mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,300mM NaCl,5mM EDTA,1mM DTT,0.1%Tween,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在37℃下透析16小时。
收集透析复性后的样品液,在4℃、14000rpm冷冻离心10分钟,去除沉淀物,收集上清液。并根据前述单位活性评估步骤和物理状态稳定性评估步骤对收集的目标抗原蛋白样品分别进行评估,结果如下表2所示。这三种方案复性得到的艾滋病毒抗原蛋白的胶体金试纸结果如图2所示。
表2:采用上述三种方案复性得到的艾滋病毒抗原蛋白的性状
由上表2可知,对于上述三种方案,相比复性过程中一直采用保持4℃的对比方案(1)和复性温度在复性步骤后期升高至仅25℃的对比方案(2),本发明的方案(3)在最后的复性步骤中采用了37℃的高温,得到的艾滋病毒抗原蛋白样品在产物单位活性方面显著优于对比方案(1)和(2)。
实施例3:丙肝病毒(HCV)包涵体抗原蛋白的复性
通过前处理步骤配制丙肝病毒包涵体蛋白溶液(GRAVY分值为-0.271)。将前处理步骤得到的稀释后的样品装袋,分别以以下四种透析方案进行透析复性:
(1)先在4℃下用第一复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含3M Urea,300mM NaCl,3mMEDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(50mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在25℃下透析16小时。
(2)先在4℃下用第一复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含3M Urea,300mM NaCl,3mMEDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(50mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在32℃下透析16小时。
(3)先在4℃下用第一复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含3M Urea,300mM NaCl,3mMEDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(50mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在37℃下透析16小时。
(4)先在4℃下用第一复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含3M Urea,300mM NaCl,3mMEDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(50mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,300mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在45℃下透析16小时。
收集透析复性后的样品溶液,在4℃、14000rpm冷冻离心10分钟,去除沉淀物,收集上清液。并根据前述单位活性评估步骤和物理状态稳定性评估步骤对收集的目标抗原蛋白样品分别进行评估,结果如下表3所示。这四种方案复性得到的丙肝病毒抗原蛋白的胶体金试纸结果如图3所示。
表3:采用上述四种方案复性得到的丙肝病毒抗原蛋白的性状
由上表3可知,对于上述五种方案,相比复性温度在复性步骤后期升高至仅25℃的对比方案(1),本发明的方案(2)-(4)在最后的复性步骤中分别采用了32℃、37℃和45℃的高温,尽管得到的丙肝病毒抗原蛋白样品的总收率相对低,但收集得到的目标抗原蛋白的纯度好,在产物单位活性和保存稳定性方面显著优于对比方案(1)。
实施例4:一些其他疏水性包涵体抗原蛋白的复性
根据实施例1-3的类似方法,进一步测试了其他疏水性包涵体抗原蛋白如风疹病毒(GRAVY分值为-0.297)、乙肝病毒(GRAVY分值为-0.41)、柯萨奇病毒(GRAVY分值为-0.561)、***(GRAVY分值为-0.43)、肺炎衣原体(GRAVY分值为-0.445)、单纯疱疹病毒I(GRAVY分值为-0.282)和单纯疱疹病毒II(GRAVY分值为-0.292)的抗原蛋白的透析复性,透析温度和产物的性状结果如下表4所示。
表4:一些其他疏水性包涵体抗原蛋白的复性
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上述结果证实了本发明的复性方法得到的产物具有更高的纯度、更好的单位活性和物理稳定性。
实施例5:亲水性的巨细胞包涵体抗原蛋白的复性
通过前处理步骤配制亲水性的巨细胞包涵体蛋白溶液(GRAVY分值为-1.256)。将前处理步骤得到的稀释后的样品装袋,分别以以下三种透析方案进行透析复性:
(1)先在4℃下用第一复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含3M Urea,200mM NaCl,3mMEDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(50mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,200mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在4℃下继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含0.5MUrea,200mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在4℃下继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在4℃下透析16小时。
(2)先在4℃下用第一复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含3M Urea,200mM NaCl,3mMEDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(50mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,200mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,200mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在25℃的室温环境透析16小时。
(3)先在4℃下用第一复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含3M Urea,200mM NaCl,3mMEDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0)透析4小时。然后,将样品透析袋转移到第二复性缓冲液中(50mM Tris缓冲液,含1.2M Urea,200mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。接着,将透析袋转移到第三复性缓冲液(50mM Tris缓冲液,含0.5M Urea,200mM NaCl,3mM EDTA,1mM DTT,10%甘油,pH8.0),在25℃的室温环境继续透析4小时。然后,将透析袋转移到新的第三复性缓冲液中,继续在37℃下透析16小时。
收集透析复性后的样品液,在4℃、14000rpm冷冻离心10分钟,去除沉淀物,收集上清液。并根据前述单位活性评估步骤和物理状态稳定性评估步骤对收集的目标抗原蛋白样品分别进行评估,结果如下表5所示。这三种方案得到的巨细胞抗原蛋白的胶体金试纸结果如图4所示。
表5:采用上述三种方案复性得到的巨细胞抗原蛋白的性状
方案 | 产物单位活性 | 总收率 | 保存稳定性 |
(1) | C1 | 99% | 4℃保存3个月状态稳定 |
(2) | C4 | 56% | 回收时少部分降解 |
(3) | C8 | 21% | 回收时大部分已降解 |
由上表5可知,对于亲水性的巨细胞抗原蛋白而言,在复性步骤中,无论是采用25℃的中温方案(2),还是37℃的高温方案(3),都没有得到好的复性结果,即产物单位活性差,并且抗原蛋白出现降解。也就是说,采用4℃低温复性的结果在产物抗原蛋白的单位活性和物理稳定性方面都显著优于中温和高温复性。
Claims (23)
1.一种用于包涵体抗原蛋白的透析复性方法,包括以下步骤:
1)用第一复性缓冲液在2℃至8℃的第一透析温度对包涵体蛋白溶液进行第一次透析;
2)用第二复性缓冲液在22℃至28℃的第二透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第二次透析;
3)用第三复性缓冲液在22℃至28℃的第三透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第三次透析;以及
4)用更新的第三复性缓冲液在30℃至45℃的第四透析温度对所述包涵体蛋白溶液进行第四次透析,
所述第一复性缓冲液至第三复性缓冲液中的尿素浓度依次下降;并且所述第三透析温度高于或等于所述第二透析温度;
其中,所述抗原蛋白是支原体、衣原体、病毒、细菌、寄生虫的总平均亲水性得分在-0.6以上的抗原蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第三透析温度高于所述第二透析温度。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述第四透析温度是35℃至42℃。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述第四透析温度是37℃至40℃。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一透析温度是4℃;第二透析温度是25℃;所述第三透析温度是25℃;以及所述第四透析温度是38℃。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述抗原蛋白是疏水性抗原蛋白。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述抗原蛋白是总平均亲水性(GRAVY)得分高于-0.4的抗原蛋白。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述支原体是肺炎支原体。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述衣原体是肺炎衣原体。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述病毒是风疹病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、柯萨奇病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒。
11.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述寄生虫是弓形虫。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述细菌是***。
13.根据权利要求1或2所述的方法,其中,包涵体蛋白溶液的浓度为0.1mg/ml至5mg/ml。
14.根据权利要求1或2所述的方法,其中,包涵体蛋白溶液的浓度为0.4mg/ml至2mg/ml。
15.根据权利要求1或2所述的方法,其中,包涵体蛋白溶液的浓度为0.5mg/ml至1mg/ml。
16.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述第一次透析时间为2至8小时;所述第二次透析时间为2至8小时;所述第三次透析时间为2至8小时;所述第四次透析时间大于4小时。
17.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述复性缓冲液选自Tris缓冲液、精氨酸缓冲液、山梨糖醇缓冲液、胱氨酸缓冲液、硫酸铜缓冲液、脱氧抗坏血酸缓冲液和硫代硫酸钠缓冲液,并且所述复性缓冲液中还包括浓度为0.5M至3M的尿素、浓度为100mM至500mM的NaCl、以及蛋白保护剂,所述蛋白保护剂含有1mM至10mM EDTA和0.5mM至5mM DTT。
18.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述复性缓冲液pH为7.0至8.5。
19.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述复性缓冲液pH为大于目标蛋白等电点的pH值。
20.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述包涵体蛋白溶液通过以下步骤获得:
-通过重组大肠杆菌诱导表达产生所述包涵体抗原蛋白,并收集菌体;
-裂解所述菌体,所得菌液经超声破碎或者匀浆破碎,冷冻离心,收集所述包涵体抗原蛋白;
-洗涤所述包涵体抗原蛋白2~3次,收集沉淀;以及
-溶解所述沉淀,并冷冻离心,上清即所述包涵体蛋白溶液。
21.根据权利要求20所述的方法,其中,所述方法还包括稀释所述包涵体蛋白溶液至0.1mg/ml至5mg/ml。
22.根据权利要求20所述的方法,其中,所述方法还包括稀释所述包涵体蛋白溶液至0.4mg/ml至2mg/ml。
23.根据权利要求20所述的方法,其中,所述方法还包括稀释所述包涵体蛋白溶液0.5mg/ml至1mg/ml。
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Control of aggregation in protein refolding: the temperature-leap tactic;Xie Y等;《Protein Sci.》;第5卷(第3期);摘要,第522页左栏第2段 * |
NM_178572.2;Sciaky,M.等;《GenBank》;参见CDS * |
包涵体及其复性研究概况;万雪,王磊,宁官保;畜牧兽医科技信息(第02期);全文 * |
原核表达的猪瘟病毒E2蛋白抗原多肽的复性和纯化;刘伯华,余兴龙,张茂林,肖昌,徐兴然,吴健敏,李作生,涂长春;中国兽医学报(第02期);全文 * |
蛇毒蛋白原核表达包涵体复性研究进展;刘晓飞;裴剑竹;杜国俊;杨章民;;中国生物工程杂志(第03期);全文 * |
重组人成骨蛋白-1复性条件的优化;李俊玲;王世立;韩金祥;王国栋;赵甜娜;;中国生物制品学杂志(第06期);全文 * |
重组蛋白在大肠杆菌中包涵体蛋白的表达及其复性;郭井利,彭永刚,刘鹏,孙文毅,刘冰;畜牧兽医科技信息(第08期);全文 * |
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Publication number | Publication date |
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CN114957378A (zh) | 2022-08-30 |
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