JPS6265680A - プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 - Google Patents
プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法Info
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- JPS6265680A JPS6265680A JP60205263A JP20526385A JPS6265680A JP S6265680 A JPS6265680 A JP S6265680A JP 60205263 A JP60205263 A JP 60205263A JP 20526385 A JP20526385 A JP 20526385A JP S6265680 A JPS6265680 A JP S6265680A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
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- Cell Biology (AREA)
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、イネ科穀物のプロトプラストを作出、培養
することにより、争−細胞起源の植物体を復原・育成す
る方法に関する。
することにより、争−細胞起源の植物体を復原・育成す
る方法に関する。
新品種の創生には、次のような手法ないしは原理がある
。
。
（１）特定の形質を交雑によって組合わせを変え、新し
い遺伝的形質を持たせて変異を起こさせる。
い遺伝的形質を持たせて変異を起こさせる。
（２）倍数体などにみられる染色体数の増減によって形
質に変異を起こさせる。
質に変異を起こさせる。
（３）化学物質、放射線等により突然変異を起こさせる
。
。
（４〉組換えＤＮＡにより異種遺伝子を導入する。
（５）細胞融合による異種細胞質あるいは異種遺伝子の
絹込みによって新しい形質を付与する。
絹込みによって新しい形質を付与する。
しかして、植物体の細胞壁を除去して得られるプロトプ
ラストからの植物体の育成は、突然変異体の作出、その
選択、異種遺伝子の導入、細胞融合による育種のために
は必須の技術である。
ラストからの植物体の育成は、突然変異体の作出、その
選択、異種遺伝子の導入、細胞融合による育種のために
は必須の技術である。
プロトプラストの作出は古くから知られており、酵素を
用いた作出方法（Ｔａｋａｂｅ等、１９６８年）が広範
に研究され、その結果、多種の植物でプロトプラストの
分離が可能となった。
用いた作出方法（Ｔａｋａｂｅ等、１９６８年）が広範
に研究され、その結果、多種の植物でプロトプラストの
分離が可能となった。
たとえば、タバコでは分離したプロトプラストを培養し
、植物体に復原することが可能となった（Ｔａｋａｂｅ
等、１９７１年）。また、分離した２種の植物のプロト
プラストを融合させてから培養し、植物体に復原するこ
とも可能となった（Ｃａｒｌｓｏｎ等、１９７２年）。
、植物体に復原することが可能となった（Ｔａｋａｂｅ
等、１９７１年）。また、分離した２種の植物のプロト
プラストを融合させてから培養し、植物体に復原するこ
とも可能となった（Ｃａｒｌｓｏｎ等、１９７２年）。
しかしながら、単子葉植物では、プロトプラストの分離
、培養は極めて困難であった。
、培養は極めて困難であった。
イネ以外のイネ科植物では、プロトプラストからの植物
体の復原例は、僅かに２例が報告されて等、１９８１年
）について、肝葉体形成状態の液体培養細胞からのプロ
トプラストを分離培養し、植物体を復原させることに成
功しているが、花粉や種子を起源とする任意のカルスＭ
Ｉ織から植物体を復原することは成功していない。
体の復原例は、僅かに２例が報告されて等、１９８１年
）について、肝葉体形成状態の液体培養細胞からのプロ
トプラストを分離培養し、植物体を復原させることに成
功しているが、花粉や種子を起源とする任意のカルスＭ
Ｉ織から植物体を復原することは成功していない。
また、イネにあっては、プロトプラストの培養は長い間
成功せず、僅かにカルスの作出およびそれからの発根が
認められるのみであった（１′１ｅｋａ及びＳｅｎ、１
９７６年）。
成功せず、僅かにカルスの作出およびそれからの発根が
認められるのみであった（１′１ｅｋａ及びＳｅｎ、１
９７６年）。
本発明者等は、上記の技術水準に鑑みて、イネのｍ織培
養において培養条件、培地成分等が再分化能と培養細胞
の遺伝的特性に及ぼす影響、およびプロトプラスト由来
のカルスからの植物体の再分化法について詳細に検討し
た結果、カルスを長期間安定して継代培養すること、お
よび継代しもしくは継代しない花粉もしくは種子起源の
カルスからイネ植物体を復原させることに成功した。花
粉もしくは種子起源のカルスから植物体を復原させえた
ことはイネ科穀物では始めてであり、また、種子カルス
を４年以上の長期にわたって継代培養し、ついでこのも
のから植物体を復原させえたことも勿論始めての知見で
ある。
養において培養条件、培地成分等が再分化能と培養細胞
の遺伝的特性に及ぼす影響、およびプロトプラスト由来
のカルスからの植物体の再分化法について詳細に検討し
た結果、カルスを長期間安定して継代培養すること、お
よび継代しもしくは継代しない花粉もしくは種子起源の
カルスからイネ植物体を復原させることに成功した。花
粉もしくは種子起源のカルスから植物体を復原させえた
ことはイネ科穀物では始めてであり、また、種子カルス
を４年以上の長期にわたって継代培養し、ついでこのも
のから植物体を復原させえたことも勿論始めての知見で
ある。
本発明者等が開発し、以下に詳述する手法によって、カ
ルス細胞の培養期間中に、種々の突然変異誘発操作、異
種遺伝子の移入、異種植物間のプロトプラスト融合、お
よびこれらの操作を組合わせた細胞選択を容易に行うこ
とが可能となった。
ルス細胞の培養期間中に、種々の突然変異誘発操作、異
種遺伝子の移入、異種植物間のプロトプラスト融合、お
よびこれらの操作を組合わせた細胞選択を容易に行うこ
とが可能となった。
本発明の方法によれば、培養細胞の再分化能と遺伝的安
定性とを保持させつつ、カルスを誘導し、また誘導され
たカルスを継代培養するには、培地中にオーキシンの他
、高濃度の塩あるいは糖の存在が必須である。このよう
な塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カル
シうム、マグネシウム、マンガン等の塩化物や、硫酸塩
があげられる。これらの塩類は、単独であってもよく、
また２種以上配合されていてもよい。含有量は、たとえ
ば食塩の場合、培地１ρ中に２〜３０ｇ、好適には３〜
２０ｇ程度である。
定性とを保持させつつ、カルスを誘導し、また誘導され
たカルスを継代培養するには、培地中にオーキシンの他
、高濃度の塩あるいは糖の存在が必須である。このよう
な塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カル
シうム、マグネシウム、マンガン等の塩化物や、硫酸塩
があげられる。これらの塩類は、単独であってもよく、
また２種以上配合されていてもよい。含有量は、たとえ
ば食塩の場合、培地１ρ中に２〜３０ｇ、好適には３〜
２０ｇ程度である。
一方、塩とともに培地中に含まれる糖は、たとえば、マ
ニトール、ソルビトール、デキストリン等でありえ、こ
れらも単独または配合して使用される。培地中の糖の含
有量は、０．２〜１．０Ｍ、好適には０．３〜０．聞程
度である。
ニトール、ソルビトール、デキストリン等でありえ、こ
れらも単独または配合して使用される。培地中の糖の含
有量は、０．２〜１．０Ｍ、好適には０．３〜０．聞程
度である。
このようにして培養されたカルスを植物体分化させるに
は、上記の培地から、再分化培地へ移すことによって行
われる。再分化培地は、その目的で通常知られた組成を
有しており、たとえば、オーキシン、サイトカイニン等
の植物ホルモンおよび糖、イースト・エキストラクト、
カザミノ酸等あるいはプロリン等のアミノ酸が含有され
、場合によっては、さらにアブサイシン酸、ジベレリン
等の植物ホルモンが含まれることもある。
は、上記の培地から、再分化培地へ移すことによって行
われる。再分化培地は、その目的で通常知られた組成を
有しており、たとえば、オーキシン、サイトカイニン等
の植物ホルモンおよび糖、イースト・エキストラクト、
カザミノ酸等あるいはプロリン等のアミノ酸が含有され
、場合によっては、さらにアブサイシン酸、ジベレリン
等の植物ホルモンが含まれることもある。
本発明において、材料としての植物体はどの部分であっ
てもよく、たとえば、葉、種子、花粉、茎、根等であり
うるが、花粉および種子はとくに好適である。植物体か
ら分離したプロトプラストを培養して得られたカルスを
直ちに再分化させてもよいし、または、カルスを上記し
た条件下で継代培養し、任意の時期に取り出して再分化
処理を行ってもよい。
てもよく、たとえば、葉、種子、花粉、茎、根等であり
うるが、花粉および種子はとくに好適である。植物体か
ら分離したプロトプラストを培養して得られたカルスを
直ちに再分化させてもよいし、または、カルスを上記し
た条件下で継代培養し、任意の時期に取り出して再分化
処理を行ってもよい。
また、イネのプロトプラストを他のイネ科植物のプロト
プラストと融合させた融合プロトプラストも、本発明の
方法に従って継代培養し、また必要に応じて分化させる
ことが可能であり、それ故、本発明に包含される。
プラストと融合させた融合プロトプラストも、本発明の
方法に従って継代培養し、また必要に応じて分化させる
ことが可能であり、それ故、本発明に包含される。
次に、実施例をあげて本発明をより詳細に説明する。
実施例１
イネ（品種：日本晴）の朽を液体浮遊培養して花粉起源
カルスを誘導し、１穂由来の８０個の単一花粉起源カル
スを分離した。これらのカルスをそれぞれ増殖させたの
ち、その全ＤＮＡを抽出し、制限酵素 Ｂａｍ旧で切断
させたのち、サザーン・ブＤ ７テイング（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行い、り［１−ン化した
イネリポソーム遺伝子ＤＮＡとハイブリット形成を行っ
た。
カルスを誘導し、１穂由来の８０個の単一花粉起源カル
スを分離した。これらのカルスをそれぞれ増殖させたの
ち、その全ＤＮＡを抽出し、制限酵素 Ｂａｍ旧で切断
させたのち、サザーン・ブＤ ７テイング（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行い、り［１−ン化した
イネリポソーム遺伝子ＤＮＡとハイブリット形成を行っ
た。
５０カルス中３カルスで、３．８〜３．９ｋｈの本来の
２本のりホソームＤＮＡのハント以外に、７．７ｋｂ付
近に分子量の大きなハントが見出された。このような解
析を含めて細胞の？１′長が安定している１カルスから
プロトプラストを分離して培養した。
２本のりホソームＤＮＡのハント以外に、７．７ｋｂ付
近に分子量の大きなハントが見出された。このような解
析を含めて細胞の？１′長が安定している１カルスから
プロトプラストを分離して培養した。
酵素条件はマセ［２チーム旧００．５％、ペクトリアー
ゼＹ−２３０，０４％、セルラーゼＲＳ ２％、マニト
ール０．４５Ｍであり、また培地は、Ｃｈｕ → ナフ
タレン酢酸ソーダ １０−５Ｍ ＋カイネチン １０−
６Ｍであった。
ゼＹ−２３０，０４％、セルラーゼＲＳ ２％、マニト
ール０．４５Ｍであり、また培地は、Ｃｈｕ → ナフ
タレン酢酸ソーダ １０−５Ｍ ＋カイネチン １０−
６Ｍであった。
３回の独立した分離、培養で得られたコロニーから、４
１個を分離し、カルス増殖を行った。
１個を分離し、カルス増殖を行った。
得られた全４１カルスのうち、色調が異なるものが９個
、オーキシン３Ｆ：要求性のものが１５個であった。そ
れぞれのコロニーの生長には大きな差異が認められ、プ
レートあたり生体重が１．５〜２ｇのものから４．５〜
５ｇのものまでに分布した。カルスの一部を分化培地（
大野、１９７５年）に移植し、再分化能の有無を検討し
たところ、１カルスで芽と根とが分化し、また２カルス
では根の分化が認められ、再分化、復原が確認された。
、オーキシン３Ｆ：要求性のものが１５個であった。そ
れぞれのコロニーの生長には大きな差異が認められ、プ
レートあたり生体重が１．５〜２ｇのものから４．５〜
５ｇのものまでに分布した。カルスの一部を分化培地（
大野、１９７５年）に移植し、再分化能の有無を検討し
たところ、１カルスで芽と根とが分化し、また２カルス
では根の分化が認められ、再分化、復原が確認された。
なお、ここで分化に用いたプロトプラスト・カルスは、
カルス誘導以来８回の継代培養を経ており、プロトプラ
スト分離培養期間を含めて約１５ケ月間経過している。
カルス誘導以来８回の継代培養を経ており、プロトプラ
スト分離培養期間を含めて約１５ケ月間経過している。
このことは、イネにおいても長期間培養カルスでの再分
化能の保持が可能なごとを示している。
化能の保持が可能なごとを示している。
実施例２
イネ（品種：日本晴）から注意深く１殖によって採取し
た種子を脱拌して用いた。種子を７０％エタノールで１
分間消毒し、さらに１０％晒粉水溶液の上澄液に２０分
間浸消して滅菌後、滅菌水で洗浄した。ついで種子をＭ
ｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２年）の基
礎培地またはＭｉｌｌｅｒ（１９６３年）の基礎培地に
１０−５Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を加えた
ｐＩ１６．０の寒天培地上に置床した。
た種子を脱拌して用いた。種子を７０％エタノールで１
分間消毒し、さらに１０％晒粉水溶液の上澄液に２０分
間浸消して滅菌後、滅菌水で洗浄した。ついで種子をＭ
ｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２年）の基
礎培地またはＭｉｌｌｅｒ（１９６３年）の基礎培地に
１０−５Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を加えた
ｐＩ１６．０の寒天培地上に置床した。
４０〜５０日後に、誘導されたカルスを食塩５〜１８ｇ
／ｌを含む培地で４年間紺代培養した。
／ｌを含む培地で４年間紺代培養した。
このようなカルスを、セルラーゼＲ３２％、ペクトリア
ーゼ Ｙ−２３０，０５％、マニト−ル０．２５Ｍ、ソ
ルビトール０．２Ｍ 、塩化カルシラＪ、 ３ｍＭ、燐
酸二水素カリウム０．３５ｍＭ 、ＭＦＳ ｌｌｉ÷ｉ
液 ３ｍＭで処理し、遊離したプロトプラス１をステン
レス・メソシュで選別し、−ン二トール・ソルビトール
合液で洗浄したのち培養した。このようにして分離した
プロトプラストは１０［１後には***をおこなっており
、充分に大きなカルス塊となったところでＭｕｒａｓｈ
ｉｇｅ およびＳｋｏｏｇ の基礎培地に２＋４−
ジクロルフェノキシ酢酸 １０−’ Ｍを含む培地中で
増殖させた。
ーゼ Ｙ−２３０，０５％、マニト−ル０．２５Ｍ、ソ
ルビトール０．２Ｍ 、塩化カルシラＪ、 ３ｍＭ、燐
酸二水素カリウム０．３５ｍＭ 、ＭＦＳ ｌｌｉ÷ｉ
液 ３ｍＭで処理し、遊離したプロトプラス１をステン
レス・メソシュで選別し、−ン二トール・ソルビトール
合液で洗浄したのち培養した。このようにして分離した
プロトプラストは１０［１後には***をおこなっており
、充分に大きなカルス塊となったところでＭｕｒａｓｈ
ｉｇｅ およびＳｋｏｏｇ の基礎培地に２＋４−
ジクロルフェノキシ酢酸 １０−’ Ｍを含む培地中で
増殖させた。
このように作出したカルスから、２，４−ジクロルフェ
ノキシ酢酸を除去し、ついでナフタレン酢酸、ヘンシル
アデニン、ゼアチン、イースト・エキストラクトを加え
た分化培地に移植し、２０〜４０日後に復原植物体を得
た。
ノキシ酢酸を除去し、ついでナフタレン酢酸、ヘンシル
アデニン、ゼアチン、イースト・エキストラクトを加え
た分化培地に移植し、２０〜４０日後に復原植物体を得
た。
Claims (2)
- （１）イネ科穀物から分離、培養された細胞を塩あるい
は糖濃度が高い培地中で培養することを特徴とする培養
細胞の再分化能および遺伝的特性の保持方法。 - （２）イネ科穀物から分離、培養されたプロトプラスト
を継続して培養し、得られた培養細胞を植物ホルモンを
含有する分化倍地中で培養することを特徴とする復原・
育成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205263A JPH062054B2 (ja) | 1985-09-19 | 1985-09-19 | プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205263A JPH062054B2 (ja) | 1985-09-19 | 1985-09-19 | プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6265680A true JPS6265680A (ja) | 1987-03-24 |
| JPH062054B2 JPH062054B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=16504084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205263A Expired - Lifetime JPH062054B2 (ja) | 1985-09-19 | 1985-09-19 | プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062054B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01256381A (ja) * | 1988-03-31 | 1989-10-12 | Plant Genetics Inc | イネカルスの誘導・増植方法 |
| US5173423A (en) * | 1990-02-12 | 1992-12-22 | Sumitomo Chemical Company Limited | Process for breeding a glabrous variety of rice crop and a glabrous plant |
| JPH0638538U (ja) * | 1992-11-07 | 1994-05-24 | 株式会社釣研 | 中通しうき用棒状化学発光体取付け具 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265022A (ja) * | 1985-05-21 | 1986-11-22 | 三井東圧化学株式会社 | イネプロトプラストからの植物体の再生方法 |
-
1985
- 1985-09-19 JP JP60205263A patent/JPH062054B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265022A (ja) * | 1985-05-21 | 1986-11-22 | 三井東圧化学株式会社 | イネプロトプラストからの植物体の再生方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01256381A (ja) * | 1988-03-31 | 1989-10-12 | Plant Genetics Inc | イネカルスの誘導・増植方法 |
| US5173423A (en) * | 1990-02-12 | 1992-12-22 | Sumitomo Chemical Company Limited | Process for breeding a glabrous variety of rice crop and a glabrous plant |
| JPH0638538U (ja) * | 1992-11-07 | 1994-05-24 | 株式会社釣研 | 中通しうき用棒状化学発光体取付け具 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH062054B2 (ja) | 1994-01-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |