JPS61265022A - イネプロトプラストからの植物体の再生方法 - Google Patents
イネプロトプラストからの植物体の再生方法Info
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- JPS61265022A JPS61265022A JP60106887A JP10688785A JPS61265022A JP S61265022 A JPS61265022 A JP S61265022A JP 60106887 A JP60106887 A JP 60106887A JP 10688785 A JP10688785 A JP 10688785A JP S61265022 A JPS61265022 A JP S61265022A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
この発明はイネのプロトプラストからのカルスを経た植
物体の再生に関する技術である。
物体の再生に関する技術である。
この発明は植物細胞についての遺伝子組み換え、細胞融
合などのバイオテクノロジーを応用した新品種の開発に
利用される。
合などのバイオテクノロジーを応用した新品種の開発に
利用される。
(従来の技術)
プロトプラストからの植物体再生の技術は、タバコ等の
多くの双子葉植物では完成しているが、主要穀物である
、イネ、コムギ、トウモロコシ等の属するイネ科植物で
は、僅かに牧草やトウモロコシでの例が見られるものの
特にイネについては断片的な例が見られるに過ぎない。
多くの双子葉植物では完成しているが、主要穀物である
、イネ、コムギ、トウモロコシ等の属するイネ科植物で
は、僅かに牧草やトウモロコシでの例が見られるものの
特にイネについては断片的な例が見られるに過ぎない。
従来報告された、イネプロトプラストの培養例において
は、硝酸還元酵素を欠く、細胞より得られたプロトプラ
ストが***してカルスを形成したこと(Wakasaら
(1984) J、Ptant Physiol。
は、硝酸還元酵素を欠く、細胞より得られたプロトプラ
ストが***してカルスを形成したこと(Wakasaら
(1984) J、Ptant Physiol。
月7 : 223−231 ) 、花粉由来のカルスか
らのプロトプラストからカルスを形成し、芽を形成した
こと(大野ら(1985)育種学雑誌35(別1):5
4−55)が報告されている。後者の例では芽は生長せ
ず、完全な植物体を得るに至っていない。
らのプロトプラストからカルスを形成し、芽を形成した
こと(大野ら(1985)育種学雑誌35(別1):5
4−55)が報告されている。後者の例では芽は生長せ
ず、完全な植物体を得るに至っていない。
一方でイネの培養細胞から植物体を再生させることはす
でに多くの研究者から報告されているところではあるが
(Nishiら(1968)Nature 219 。
でに多くの研究者から報告されているところではあるが
(Nishiら(1968)Nature 219 。
50B−509> 、そのような植物体に再生しやすい
細胞材料はプロトプラスト化しにくく、また培養も困難
であった。
細胞材料はプロトプラスト化しにくく、また培養も困難
であった。
プロトプラストの培養法については溶解した寒天培地に
流し込む方法や、液体培地に懸濁する方法、フィーダー
セルを使用して培養する方法等いろいろ工夫がこらされ
てきている。しかしこれら従来技術は、すべてのプロト
プラストに広く一般的に応用できるものは少なく、適当
と思われる条件にプロトプラストとその培地を置いても
必ずしも望み通りにプロトプラストが***し、増殖して
、カルスを形成するとは限らず、プロトプラストの***
停止又は死滅を来してしまうことがあった。
流し込む方法や、液体培地に懸濁する方法、フィーダー
セルを使用して培養する方法等いろいろ工夫がこらされ
てきている。しかしこれら従来技術は、すべてのプロト
プラストに広く一般的に応用できるものは少なく、適当
と思われる条件にプロトプラストとその培地を置いても
必ずしも望み通りにプロトプラストが***し、増殖して
、カルスを形成するとは限らず、プロトプラストの***
停止又は死滅を来してしまうことがあった。
(発明が解決しようとする問題点)
本発明はプロトプラスト化が困難な、高い分化 能を保
有した細胞を、一定条件で培養することにより、分化能
を低下させることなく、プロトプラスト分離を容易なら
しめ、その得られたプロトプラストを特殊な条件下で培
養する事によって、分化能を低下させることなく、***
増殖せしめ、植物体に、再分化させるものである。
有した細胞を、一定条件で培養することにより、分化能
を低下させることなく、プロトプラスト分離を容易なら
しめ、その得られたプロトプラストを特殊な条件下で培
養する事によって、分化能を低下させることなく、***
増殖せしめ、植物体に、再分化させるものである。
(問題点を解決する為の手段)
1ず第一段階として、分化能の高いカルスを誘導しその
カルスを継代培養する必要がある。この手段として、イ
ネの種子、胚(未熟胚を含む)、幼根より、イーストエ
キストラクト、モルトエキストラクトカゼイン加水分解
物をo、o i〜1係もしくは、ポテトエクストラクト
を5〜20%含有し、植物ホルモンである、2.4−D
0.1〜10.07119/lとベンジルアデニン
(BA)もしくはカイネチンO〜5.0 m9/ tの
範囲で含有するMS (Murash i −ge &
Skoog(196,2) Physiol、Pla
nt、15.473−479 )、B5 (Gambo
rgら(196B) Exp、Ge1lRes、50.
151−158)、〜6 (Chuら(1975) 5
cie−ntia 5cinica 18.659−6
65)、葦たはR2(Oh−iraら(1973) P
lant Ce1l Physiol、14゜1113
−1121)の培地でカルスを誘導し誘導と同一条件で
4週間に一度継代培養を行なう、このようにして得られ
たカルスから直接プロトプラストを分離するのは困難な
為に、とのカルスを液体培地で培養するにあたり、留意
する点はなるべく微細な細胞の塊りで培養が行なえかつ
分化能を低下させない条件を確立するという事である。
カルスを継代培養する必要がある。この手段として、イ
ネの種子、胚(未熟胚を含む)、幼根より、イーストエ
キストラクト、モルトエキストラクトカゼイン加水分解
物をo、o i〜1係もしくは、ポテトエクストラクト
を5〜20%含有し、植物ホルモンである、2.4−D
0.1〜10.07119/lとベンジルアデニン
(BA)もしくはカイネチンO〜5.0 m9/ tの
範囲で含有するMS (Murash i −ge &
Skoog(196,2) Physiol、Pla
nt、15.473−479 )、B5 (Gambo
rgら(196B) Exp、Ge1lRes、50.
151−158)、〜6 (Chuら(1975) 5
cie−ntia 5cinica 18.659−6
65)、葦たはR2(Oh−iraら(1973) P
lant Ce1l Physiol、14゜1113
−1121)の培地でカルスを誘導し誘導と同一条件で
4週間に一度継代培養を行なう、このようにして得られ
たカルスから直接プロトプラストを分離するのは困難な
為に、とのカルスを液体培地で培養するにあたり、留意
する点はなるべく微細な細胞の塊りで培養が行なえかつ
分化能を低下させない条件を確立するという事である。
これらの問題点を解決する方法とし、R2、〜6又はM
eの各培地にイーストエキストラクト、モルトエキスト
ラクト、カゼイン加水分解物のいずれかを01〜1.0
%又はポテトエキストラクトを5〜2゜多含有し、かツ
2.4−Dを01〜10m9/lおよびBAもしくはカ
イネチンを0〜5Tn9/l含有する液体培地で、当液
体培地1に対しo、oom〜0.03の重量の細胞を添
加し1週問おきに継代培養を行う。
eの各培地にイーストエキストラクト、モルトエキスト
ラクト、カゼイン加水分解物のいずれかを01〜1.0
%又はポテトエキストラクトを5〜2゜多含有し、かツ
2.4−Dを01〜10m9/lおよびBAもしくはカ
イネチンを0〜5Tn9/l含有する液体培地で、当液
体培地1に対しo、oom〜0.03の重量の細胞を添
加し1週問おきに継代培養を行う。
このようにして培養された細胞は直径1〜6闘の微少な
塊りで、かつ分化培地に置床した場合分化する能力を示
した。これらの細胞からプロトプラストを遊離させた。
塊りで、かつ分化培地に置床した場合分化する能力を示
した。これらの細胞からプロトプラストを遊離させた。
プロトプラストを遊離させる酵素液の処方を種々検討し
たところ、最も効率良くプロトプラストを遊離させ、か
つプロトプラストの生存率も高いものとして次の酵素液
の処方を得り。すなわち、酵素液としてセルラーゼオノ
ズカRS 4.0%、マセロザイムR−101,0%、
塩化カルシウム05%、デキストラン硫酸カリウム塩0
5%および浸透圧調節剤としてマニトール0.4Mを含
むものを用い、pHは55に調整された。
たところ、最も効率良くプロトプラストを遊離させ、か
つプロトプラストの生存率も高いものとして次の酵素液
の処方を得り。すなわち、酵素液としてセルラーゼオノ
ズカRS 4.0%、マセロザイムR−101,0%、
塩化カルシウム05%、デキストラン硫酸カリウム塩0
5%および浸透圧調節剤としてマニトール0.4Mを含
むものを用い、pHは55に調整された。
この酵素液中で細胞は4ないし8時間振とぅ培養され多
量のプロトプラストを分離する。プロトプラストを含む
酵素液はナイロン篩でろ過し、未消化の細胞塊を除き、
ろ液は507で5分間遠心しプロトプラストを沈澱させ
た。この分離されたプロトプラストを培養するにあたり
従来から行われている培養法を種々試みたがうまくゆか
ず、プロトプラストの安定した***を得る手段として以
下の手段を用いる事°によりこの問題の解決に成功した
。プロトプラストを培養する容器を50〜200ミクロ
ンの厚みの所定の浸透圧調節剤を含有する寒天培地でコ
ーティングした後、プロトプラストを含有する培養液を
添加し培養する。これによって培養液の厚さは200〜
600ミクロンの厚さとなり、プロトプラストは好気的
条件におかれる。
量のプロトプラストを分離する。プロトプラストを含む
酵素液はナイロン篩でろ過し、未消化の細胞塊を除き、
ろ液は507で5分間遠心しプロトプラストを沈澱させ
た。この分離されたプロトプラストを培養するにあたり
従来から行われている培養法を種々試みたがうまくゆか
ず、プロトプラストの安定した***を得る手段として以
下の手段を用いる事°によりこの問題の解決に成功した
。プロトプラストを培養する容器を50〜200ミクロ
ンの厚みの所定の浸透圧調節剤を含有する寒天培地でコ
ーティングした後、プロトプラストを含有する培養液を
添加し培養する。これによって培養液の厚さは200〜
600ミクロンの厚さとなり、プロトプラストは好気的
条件におかれる。
寒天のコーティングを行わない場合は、培養液はその表
面張力のために球状となり空気との接触面積は減少し、
プロトプラストは比較的嫌気的条件で培養されることに
なる。この違いがプロトプラストの培養に大きな影響を
与えていることが明らかとなった。プロトプラスト培養
のもう一つの問題はどのような培地を使用するかである
が、我々はpHを529、下に調製したコンディション
培地を使用し、浸透圧調節剤としてイネに従来使用さレ
テいるマニトール、マニトールとシュークロースの混合
物の代わりにシュークロース単独を使用することにより
、プロトプラストの***頻度の向上をはかる事に成功し
た。この培養液は経時的に浸透圧調節剤を含まない培地
で希釈され、ある一定の大きさに成長したカルスは分化
培地に移される前に一度増殖培地に移す。イネのカルス
培養のとき、一般的にカルスを継代するにつれそのカル
スの分化能は極端に低下することが知られており、小さ
なカルスを一定の大きさのカルスに増殖させる間にもそ
の分化能の低下はその後の分化にとって大きな問題とな
る。分化能力を低下させない培地の選定がM要な因子と
なり、我々はイーストエキストラクト、モルトエキスト
ラクト、カゼイン加水分解物のいずれかを01〜10%
、又はポテトエキストラクトを5〜20係含有し、かつ
2,4−D O,1〜10m9/l、 BA又はカ
イネチンO〜5 mti / 7の範囲で含有するN6
、B5もしくはF2の培地でカルスを増殖させる事によ
り問題の解決をはかった。最後にこのカルスから植物体
を分化させるにあたり、イーストエキストラクト、モル
トエキストラクト、カゼイン加水分解物のいずれかを0
1〜10%、又はポテトエキストラクトを5〜20チ含
有し、かつBA又はカイネチンをO〜10■/を含有す
るMS培地を採用する事によりその目的を達成できた。
面張力のために球状となり空気との接触面積は減少し、
プロトプラストは比較的嫌気的条件で培養されることに
なる。この違いがプロトプラストの培養に大きな影響を
与えていることが明らかとなった。プロトプラスト培養
のもう一つの問題はどのような培地を使用するかである
が、我々はpHを529、下に調製したコンディション
培地を使用し、浸透圧調節剤としてイネに従来使用さレ
テいるマニトール、マニトールとシュークロースの混合
物の代わりにシュークロース単独を使用することにより
、プロトプラストの***頻度の向上をはかる事に成功し
た。この培養液は経時的に浸透圧調節剤を含まない培地
で希釈され、ある一定の大きさに成長したカルスは分化
培地に移される前に一度増殖培地に移す。イネのカルス
培養のとき、一般的にカルスを継代するにつれそのカル
スの分化能は極端に低下することが知られており、小さ
なカルスを一定の大きさのカルスに増殖させる間にもそ
の分化能の低下はその後の分化にとって大きな問題とな
る。分化能力を低下させない培地の選定がM要な因子と
なり、我々はイーストエキストラクト、モルトエキスト
ラクト、カゼイン加水分解物のいずれかを01〜10%
、又はポテトエキストラクトを5〜20係含有し、かつ
2,4−D O,1〜10m9/l、 BA又はカ
イネチンO〜5 mti / 7の範囲で含有するN6
、B5もしくはF2の培地でカルスを増殖させる事によ
り問題の解決をはかった。最後にこのカルスから植物体
を分化させるにあたり、イーストエキストラクト、モル
トエキストラクト、カゼイン加水分解物のいずれかを0
1〜10%、又はポテトエキストラクトを5〜20チ含
有し、かつBA又はカイネチンをO〜10■/を含有す
るMS培地を採用する事によりその目的を達成できた。
以下にその実施例を示す。
実施例
1−1.植物体を再生しゃすいカルスの誘導およびその
継代培養 イネ(品種二日本晴)の種子を70%アルコールに1分
間、次亜塩素酸ナトリウム液(塩素濃度5%)l/11
m15分間浸し、滅菌類溜水で6回洗った後、寒天培地
上に植えこんだ。培地はN6の基本培地と、2.4−D
2 ppm、 BA Lppm、カゼイン加水
分解物06係からなっている。26℃3週間培養すると
胚盤からカルスが形成した。このカルスは同一培養条件
下で4週問おきに継代培養した。
継代培養 イネ(品種二日本晴)の種子を70%アルコールに1分
間、次亜塩素酸ナトリウム液(塩素濃度5%)l/11
m15分間浸し、滅菌類溜水で6回洗った後、寒天培地
上に植えこんだ。培地はN6の基本培地と、2.4−D
2 ppm、 BA Lppm、カゼイン加水
分解物06係からなっている。26℃3週間培養すると
胚盤からカルスが形成した。このカルスは同一培養条件
下で4週問おきに継代培養した。
70係アルコールで1分間滅菌後、滅菌水で洗った後、
未熟な肝をとり出し、寒天培地に植えこんだ。培地は、
2.4−D 2f)pmsイーストエクストラクト03
係およびMETの培地成分からなっている。
未熟な肝をとり出し、寒天培地に植えこんだ。培地は、
2.4−D 2f)pmsイーストエクストラクト03
係およびMETの培地成分からなっている。
26℃で3週間培養するとカルスが形成した。このカル
スは同一培養条件下で4週問おきに継代培養された。
スは同一培養条件下で4週問おきに継代培養された。
1−■、植物体を再生しゃすいカルスの誘導およびその
継代培養 滅菌したイネ種子(品種コシヒカリ)を寒天のみを含む
培地上に植えこんだ。1週間後、生長した幼根を切り取
り、新な寒天培地上に植えこんだ、この培地は、2.4
−D 2ppmおよびB5の培地成分からなっている。
継代培養 滅菌したイネ種子(品種コシヒカリ)を寒天のみを含む
培地上に植えこんだ。1週間後、生長した幼根を切り取
り、新な寒天培地上に植えこんだ、この培地は、2.4
−D 2ppmおよびB5の培地成分からなっている。
カルスの形成には、26℃で、6週間必要であった。誘
導されたカルスは同−条件下で継代培養された。
導されたカルスは同−条件下で継代培養された。
2、誘導されたカルスの液体培養
1−1.■および■の条件の寒天培地で継代培養された
カルスは第1表からなる液体培地中で継代培養した。細
胞は100mJフラスコ中の30m/の液体培地中で、
1分間当り70回の割合で回転する回転培養器上で培養
した。植え継ぎは1週間に1度おこなった。
カルスは第1表からなる液体培地中で継代培養した。細
胞は100mJフラスコ中の30m/の液体培地中で、
1分間当り70回の割合で回転する回転培養器上で培養
した。植え継ぎは1週間に1度おこなった。
第1表、液体培地の処方
液体培地中で培養された、継代培養後7日目の細胞を材
料とした。プロトプラストを単離するための酵素液は、
セルラーゼオノズ力RS 4. o %、マセロザイム
10%、塩化カルシウム05チ、デキストラン硫酸カリ
ウム塩05チ、マニトール0.4Mからなり、pHを5
5に合せた。
料とした。プロトプラストを単離するための酵素液は、
セルラーゼオノズ力RS 4. o %、マセロザイム
10%、塩化カルシウム05チ、デキストラン硫酸カリ
ウム塩05チ、マニトール0.4Mからなり、pHを5
5に合せた。
この酵素液中で27℃で6時間振とうし、プロトプラス
トを得た。プロトプラストを含む酵素液はナイロン篩で
口過し、未消化の細胞塊を除き、通過した液体を507
5分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた。沈澱した
プロトプラストを0.4Mブドウ糖溶液で6回洗い、培
養に供した。
トを得た。プロトプラストを含む酵素液はナイロン篩で
口過し、未消化の細胞塊を除き、通過した液体を507
5分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた。沈澱した
プロトプラストを0.4Mブドウ糖溶液で6回洗い、培
養に供した。
5、プロトプラストの培養培地の調整(コンディション
培地)この実験例で液体培養されている継代培養後、4
ないし71目の細胞懸濁液を口過し培養液を得、この培
養口液10m1に2.4−D 100 ppm液を50
μt1 およびしよ糖を加えた後pHを4.5になる
ように0.1N H’ctで調整した。この培地に新
しく作製された同一組成の培地、すなわちR2培地で液
体培養されている場合、R2培地を前記の4に対して1
の量添加する。この際、新しく作製され1ま た培地には0.4 Mのしよ糖が含有されている。
培地)この実験例で液体培養されている継代培養後、4
ないし71目の細胞懸濁液を口過し培養液を得、この培
養口液10m1に2.4−D 100 ppm液を50
μt1 およびしよ糖を加えた後pHを4.5になる
ように0.1N H’ctで調整した。この培地に新
しく作製された同一組成の培地、すなわちR2培地で液
体培養されている場合、R2培地を前記の4に対して1
の量添加する。この際、新しく作製され1ま た培地には0.4 Mのしよ糖が含有されている。
6ブロトプラストの培養
寒天で底面を薄くコーティングされた直径65mmのプ
ラスティック製シャーレに200μtの培地を入れ、さ
らに30μLのプロトプラスト懸濁液を加え均一に広げ
た。シャーレはシールした後、暗所27℃で培養した。
ラスティック製シャーレに200μtの培地を入れ、さ
らに30μLのプロトプラスト懸濁液を加え均一に広げ
た。シャーレはシールした後、暗所27℃で培養した。
約1週間で最初の***が観察され、約1カ月で大きさ約
100μmの小細胞塊を形成した。(第2表)この時点
でシャーレに200μtの同一組成でショ糖濃度を3%
に減じた培地を加えた。さらに2週間後に同様の操作を
行った。
100μmの小細胞塊を形成した。(第2表)この時点
でシャーレに200μtの同一組成でショ糖濃度を3%
に減じた培地を加えた。さらに2週間後に同様の操作を
行った。
培養開始後約2カ月で、直径1關程度の小カルスに葦で
成長した。
成長した。
第2表、培養1週間後の1シャーレ当りの小細胞塊≠C
H:カゼイン加水分解物 YE:イーストエキストラクト ME:モルトエキストラクト PE:ポテトエキストラクト 7カルスの増殖 プロトプラスト培養容器中で形成したカルスをカルス増
殖培地に移し、カルスを増殖させた。
H:カゼイン加水分解物 YE:イーストエキストラクト ME:モルトエキストラクト PE:ポテトエキストラクト 7カルスの増殖 プロトプラスト培養容器中で形成したカルスをカルス増
殖培地に移し、カルスを増殖させた。
用いた増殖培地およびカルスの増殖速度は第6表に示し
た。
た。
第5表 使用した増殖培地とその増殖速度土二あまり成
長しない 8、植物体の再分化 カルス増殖用培地上で増殖したカルスを、第4表の培地
で植物体の再生を誘導した。
長しない 8、植物体の再分化 カルス増殖用培地上で増殖したカルスを、第4表の培地
で植物体の再生を誘導した。
移殖後約1週間で緑色のスポットの形成がみられ、約1
カ月で小植物体へと分化した。この小植物体を寒天培地
を含む大型試験管(4Qmmφ×30C1lJへ移殖し
たところ、中型の健全な植物体へと成長した。
カ月で小植物体へと分化した。この小植物体を寒天培地
を含む大型試験管(4Qmmφ×30C1lJへ移殖し
たところ、中型の健全な植物体へと成長した。
第4表 植物体再生培地及び植物体再生XCH:カゼイ
ン加水分解物 YE:イーストエキストラクト ME:モルトエキストラクト PE:ポテトエキストラクト ウ 第6表の培地番号参照 ※ ◎:比較的良く再生 ○:再再生みられた ×:再生がみられなかった
ン加水分解物 YE:イーストエキストラクト ME:モルトエキストラクト PE:ポテトエキストラクト ウ 第6表の培地番号参照 ※ ◎:比較的良く再生 ○:再再生みられた ×:再生がみられなかった
Claims (1)
- イネ種子の胚、胚盤又は幼根から誘導したカルスを液体
培養し、その懸濁細胞からプロトプラストを単離し、培
養し、再び形成させたカルスを分化培地上に移植するこ
とによりイネ植物体を再生させる方法
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60106887A JPS61265022A (ja) | 1985-05-21 | 1985-05-21 | イネプロトプラストからの植物体の再生方法 |
CA000509543A CA1288713C (en) | 1985-05-21 | 1986-05-20 | Method of regenerating rice plant from protoplasts |
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