JPS6251698A - Ｇｒｆ類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトや他の動物の下垂体の機能に影響を及ぼす
ペプチドに関する。特に、本発明は下垂体からの成長ホ
ルモン（以後ＧＨと略す）の放出を促進するペプチドに
関する。

従来技術 長い間、生理学者達は視床下部で産生される特殊な物質
（下垂体ホルモンの分泌を刺激または抑制する）が下垂
体線部の分泌機能を調節していることを認めてきた。１
９８２年に、ヒト膵臓（腫瘍）ＧＨ放出因子（ｈｐＧＲ
Ｆ）がヒトの膵臓腫瘍の抽出物から単離され、精製、同
定、合成および試験が行われて、それは下垂体からのＧ
Ｈの放出を促進することが判明した。その時以来、他の
動物やヒト由来の関連する視床下部ＧＨ放出因子が同定
および合成されてきた。ヒト視床下部ＧＲＦ（ｈＧＲＦ
）はｈｐＧＲＦと同じ式、すなわち：Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌ
　ａ−Ａｓｐ−Ａｌ　ａ−１１ｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｒｓ−８ａｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｅ−Ｖａｌ−Ｌ
ａｗ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｎ−Ｌａｓ−’；５ｒ−Ａｌ　ａ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌａ１Ｌ−Ｌａｗ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ
−Ｉｔ　ｇ　−Ｍ＃　ｔ−８ｓｒ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−８５ｒ−Ａｓ？５−Ｇｔ　５−
ＧＥ、ｘ−Ａｒ　ｇ−Ｇｌ　ｙ−ＡＬ　ａ−Ａｒｇ　−
Ａｌ　ａ　−Ａｒｇ−Ｌａ１Ｌ−ＮＨ２を有することが
見出された。

発明の概要 ヒトＧＲＦの類似体である合成ポリペプチド（培養した
下垂体細胞からＧＨを放出させる）が今や合成されて試
験された。これらのペプチドは天然ホルモンの５位と２
６位の間に存在するアミノ酸残基と少なくとも４個のア
ミノ酸が相違している。また、これらのペプチドは１位
にＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ％Ｍｅｔ１Ｐｈｅ１Ｄ−Ｐん６、
Ｌｍｕ％Ｈｉｓ　およびＤ−Ｈｉｓにれらの残基は場合
によりα−炭素原子またはα−アミノ基にメチル置換が
存在してもよい）から選択される残基をもつことができ
る。場合により、ペプチドは２位にＤ−Ａｌａを、そし
て／筐た３位にＤ−Ａｔｔｐ　を有していてもよい。さ
らに好１しくは、ペプチドは２７位のＭａ２Ｏ代わりに
Ｌａ１Ｌ、Ｎ１ｇまたはＮτＧのような置換を有する。

本発明による医薬組成物は、薬学的にまたは獣医学的に
受容される液体または固体のキャリアーに分散された、
約２９個のアミノ酸残基から成る上記の類似体またはそ
れらのいずれかの無毒性塩を含有する。このような医薬
組成物はヒトおよび動物の臨床医学の分野において使用
され、治療または診断目的のために投与される。

発明の構成 ペプチドを定義するために用いる命名法はシュレーダー
（Ｓｃｈｒｏｄｇｒ　）およびリュプケＣＬｓｂｋｅ）
の“ザ・ペプチドアカデミツクプレス（１９６５）に明
記されるものであシ、その際慣用的表示に従ってＮ床端
のアミノ基は左に、そしてＣ末端のカルボキシル基は右
に表わされる。天然アミノ酸とはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａ
ｔ、　Ｌｇｘ、　ＩＩｓ、Ｓａｒ、　Ｔｈｒ、　Ｌｙｓ
、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓ％、Ｇｌｘ％Ｇｌｎ、　Ｃｙｔ
ｔ、Ｍｇｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ％ＴｒｐおよびＨ
ｉｓ　から成るタンパク質中に見出される普通の自然界
に存在するアミノ酸のうちの１種を意味する。Ｎｌａは
ノルロイシンを意味し、Ｎｖαはノルバリンを意味する
。アミノ酸残基が異性体を有する場合は、特に指定しな
い限り、表示されるアミノ酸の９体を意味する。

本発明は次のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを提供
する： Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ａｌａ−Ｒ５ｆｆ６−４　　ＲＢ−
Ｒｇ−Ｒ１６Ｒ（１−Ｒ１２−ＲＩ３−Ｌ　ｇ　５−Ｒ
Ｉ５−　Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌ　＃　％　Ｒ１３−Ｒｌｇ−Ｒ
２６−４１Ｌｇｕ−Ｌａｗ−Ｇｉｎ−Ｇｌｘ　Ｒ２６−
Ｒ２７−Ｒ２３Ａｒｇ−Ｙ上記式中Ｒ１はＴｙｒ、　Ｄ
−Ｔｙｒ％Ａｆｇ　ｔ％Ｐｈｇ、Ｄ−Ｐｈｅ。

Ｌａｗ、ＨｉｓまたはＤ−Ｈｉｓ（それぞれのアミノ酸
残基はＣａＭａｌたはＮ　ａＡｆ　ｇ置換を有するか、
あるいは未置換である）であジ；Ｒ２はＡｌａ”ｔたは
Ｄ−Ａｌ４であシ；Ｒ８はＡｓｐｌたはＤ−Ａｓｐであ
りｅＲｓはＩｌｇまたはＬａｗで６り；　Ｒ６はＰｈｇ
”ｉたはＴｙｒであり；Ｒ７はＥａｒｌたはＴｈτであ
ジ；Ｒ６は５ｅｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒｕたはＧｉｎであ
り；ＲＱはＡｌａｓたはＳｇｒであり：Ｒ＋ｏはＴｙｒ
％ＰｈｇまたはＬｇｓであり；Ｒｔ＋はＡｒｇ、０１−
ＢまたはＬｙｓでるり；Ｒ１２はＡｒｇ、０ｒｆＬｌた
はＬｇｓであり；Ｒ１３はｌｉｅ％Ｌｇｕ、　Ｐｈｇま
たはＶａＬであり；Ｒ１，はＧｌｌまたはＡｌａであり
；ＲＩ８はＡｌａまたはＳｇｒ″″Ｃあり；ＲＩＱはＳ
ｅｔ　’ＥたはＡｌａであり；Ｒ２ｏはＡｒｇ％Ｏｗｎ
またはＬｙｅで１）’）；Ｒ２１はＡｒｇ、Ｏｒｎまた
はＬｙｓであす；Ｒ２６はＬａｗ、Ｊｉｇ、Ｖａｌまた
はＰｈｅであり；Ｒ２７はＮ１ｇ、Ｎυαまたは天然ア
ミノ酸であり；Ｒ２８はＡｌａ、Ｌａｘ％Ａｓｎ、　Ｇ
ｌｎ　”またはＳｕｒであり；そしてＹはＯＨＭたばＮ
Ｈ２でるる。但しＲ，、Ｒ６、Ｒ丁　・Ｒ８％Ｒ９・Ｒ
Ｉｌｈ　　ＲＩｌｂ　　ＲＩ２ｓ　　８１３ｍ　　Ｒ１
５ｎ　　８１８％　ＲＩｂＲ２゜、Ｒ２，およびＲ２Ｂ
を構成するアミノ酸残基のうち少なくとも４個は、天然
分子のそれぞれの位置に存在するアミノ酸残基と相異な
るものである。

４個またはそれ以上のアミノ酸残基を置き換えることに
よって、たとえアミド化Ｃ床端が存在しなくても、増強
された生物学的効力を有する短縮された類似体を作り出
すことができると考えられる。

本ペプチドは排他的固相法、部分的固相法、フラグメン
ト縮合または基本的溶液カップリング法のような適当な
方法によって合成することができる。最近開発された組
換えＤＮＡ技術は、天然アミノ酸残基のみを含む類似体
の全部または一部を製造する際に使用しうる。例えば、
排他的同和合成法は“固相ペプチド合成Ｃ３ｏｌｉｄ−
Ｐｈａｓｅ　Ｐ＃−ｐｔｉｄｇ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　
）”、スチュワート（Ｓｔｇｗａｒｔ）およびヤングＣ
Ｙｏｕｎｇ　）、フリーマン・アンド・カンパニー、サ
ンフランシスコ（１９６９）に記載されており、ベール
（Ｖａｔε）らの米国特許第４１０５６０３号（１９７
８年８月８日付）に例示されている。基本的浴液合成法
は“有機化学的方法（ハウペン−ペイル）：ペプチド合
成（Ｍｅｔｈｏｄａｎ　ｄａｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｇ
ｎ　Ｃｈｇｍｉａ　（Ｈｏｘ−ｂｇｎ−Ｗｇｙｌ　）　
：　Ｓｙｎｔｈｇｓｅ　ｖａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　〕
”、パンシュ（ｈ：、　Ｗｕｎｓ　ａｈ　）編集、ゲオ
ルグ・テイーム・フエアラーグ、シュトウットガルト、
西ドイツ（１９７４）に詳述されている。フラグメント
縮合法は米国特許第３９７２８５９号（１９７６年８月
３日）に例示されている。その池の利用可能な合成法は
米国特許第３８４２０６７号（１９７４年１０月１５日
）および同第３８６２９２５号（１９７５年１月２８日
）に例示されている。

種々のアミノ酸成分の不安定な側鎖基を適当な保護基（
その基が最終的に除去される壕で、その部位で化学反応
が起こるのを防ぐ）で保護することは、この種の化学合
成において一般的である。

また、アミノ酸や断片がカルボキシル基の部位で反応す
る間その物質のα−アミノ基を保護することも一般的で
あり、その後α−アミノ保護基を選択的に除去してその
位置で次の反応を行わせる。

従って、合成の一段階として、ペプチド鎖中に意図する
配列で位置するアミノ酸残基を含み且つ適当なアミノ酸
残基に側鎖保護基を結合した中間体化合物が生成するこ
とは音速のことである。

次式で表わされる中間体は本発明の範囲に包含されると
考えられる： Ｘ’−Ｒ，（ＸｉたはＸ２）　　Ｒ２−ＲｓＣＸ”）−
Ａｌａ−Ｒｓ−Ｒ，ＣＸ２）　−Ｒ７ＣＸ’）−Ｒ８（
Ｘ”Ｅたはｘ”）−Ｒ０Ｃｘ’）−Ｒ，。（Ｘ２）−Ｒ
１１（Ｘ６またはＸ７）−Ｒ，□（Ｘ６またはｚ７　）
４Ｂ−Ｌ＃ｗ　　Ｒ（５Ｇ１ｎＣＸ５）　　Ｌｇｘ−Ｒ
ＨＢＣＸ２）　−Ｒｌｇ（Ｘ’　）　−Ｒ２ｏＣＸ’　
またはＸ’　）　−Ｒ２１（Ｘ６−またはＸ７）−Ｌａ
ｗ−Ｌｇｓ−Ｇｌｎ（Ｘ５）　　Ｇｌｕ（１”）−Ｒ２
６−Ｒ２７（Ｘ８）−Ｒ２，ＣＸ’またはＸＳ）　−Ａ
ｒ　ｇ　ＣＸ６）　−Ｘ”上記式中、ＸＩは水素原子ま
たはα−アミノ保護基である。Ｘｌに包含されるα−ア
ミノ保護基は、ポリペプチドの逐次合成の分野において
有用であると知られているものである。ｘ′として使用
しうるα−アミン保護基の種類には（１）芳香族ウレタ
ン型保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニ
ル（ＦＭＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、お
よびｐ−クロルベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニルｌｊ　ｐ−ブロムベンジルオ
キシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
ルのような置換Ｚ；（２）脂肪族ウレタン型保護基、例
えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプ
ロピルメチルオキシカルボニル、インプロピルオキシカ
ルボニル、エトキシカルボニル、およびアリルオキシカ
ルボニル；おヨヒ（３）シクロアルキルウレタン型保護
基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニル、おヨヒシクロへキシルオキシカ
ルボニル；が含でれる。好適なα−アミノ保護基は、た
とえＮ（：ｔＭｅ−置換アミノ酸残基が１位に存在する
ときでも、ＢＯＣである。

Ｘは水素原子またはＨｉｓのイミダゾール窒素のための
保護基（例えばｒｏｍ）である。

Ｘ２はＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基のための適
当な保護基であり、例えばテトラヒドロピラニル、ｔ−
ブチル、トリチル、Ｅｘｔ、ＣＢＺ。

４Ｂτ−ＣＥＺおよび２，６−ジクロルベンジル（ＤＣ
Ｂ）である。−ｔｆｃｘ２は水素原子であってもよく、
この場合はその位置のアミノ酸残基に側鎖保護基が存在
しないことを意味する。

Ｘ３は水素原子、もしくはＡｓｐｌたはＧｈｔのカルボ
キシル基のための適当なエステル形成保畿基、例、ｔ　
ハヘンジルＣ０Ｂｚｌ）、　２．６−ジクロルベンジル
、メチルおよびエチルである。

Ｘ４はＴｈｒ”またはＳｅｒのヒドロキシル基のための
適当な保護基であり、例えばアセチル、ベンゾイル、Ｃ
−ブチル、トリチル、テトラヒドロピラニル、　Ｅｘｔ
、　２　、６−ジクロルベンジルおよびＣＢＺである。

好適な保護基はＢｚｌ″Ｔ：ある。Ｘ４は１だ水素原子
であってもよく、この場合はヒドロキシル基に保護基が
存在しないことを意味する。

ＸＳは水素原子、もしくはＡｓｎ″！！たはＧｉｎの側
鎖アミド基のための適当な保護基である。好ましくはそ
れはキサンチルＣＸａｎ）である。

Ｘ６はＡｒｇのグアニジノ基のための適当な保護基、例
えばニトロ、Ｔａｇ、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカル
ボニルおよびＢＯＣであり、またＸ６は水素原子であり
うる。

Ｘ７は水素原子、もしくはＬｙｅ”ｆたはＯｒｎの側鎖
アミ７基のための適当な保護基である。適当な側鎖アミ
ノ保護基の例は２−クロルベンジルオキシカルボニル＜
２−Ｃ１−Ｚ）、ｒｏｍＳｔ−アミルオキシカルボニル
およびＢＯＣである。

Ｘ３は水素原子、もしくは一般的に先に示した適当な側
鎖保護基である。

Ａｈｔは任意に酸素原子で保護しつるが、保護しない方
が好ましい。

側鎖アミノ保護基の選択は、一般に合成中のα−アミン
保護基の除去の間（Ｃ除去されないものを選ぶというこ
とを除いて限定的でない。しかしながら、いくつかのア
ミノ酸例えばＨｉｓの場合はカップリング完了後に一般
に保護を必要とせず、従ってα−アミノ保護基と側鎖ア
ミン保護基は同じものでありうる。

ＸｏはＣ末端カルボキシル基のための適当な保護基であ
るか、あるいは固体ｍ型支持体へ結合するために固相合
成法において用いられる定着結合であるか、あるいはｄ
＃ｓ−Ｘ”であり、この場合Ｃ末端のＡｒｇ残基はアミ
ド化される。固体の樹脂支持体を使用する場合、それは
１種の保護基でるると広く考えられ、例えば−〇−ＣＨ
２−街脂叉持体、−ＮＨ−ベンズヒドリルアミン（ＢＨ
Ａ）樹脂支持体または−ＮＨＮバーメチルベンズヒドリ
ルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂支持体のような当分野で知ら
れた適当なものが選ばれる。Ｃ末端が未置換アミドであ
るものを望む場合、樹脂からの切り離しが直接にアミド
を与えるのでＢＨＡＩたはＭＢＨＡ樹脂を使用するのが
好ましい。

中間体の上記式において、Ｘ基のうち少なくとも１つは
保護基であるか、あるいはＸ９が樹脂支持体を含む。従
って、本発明はまた （α）少なくとも１つの保護基を有する式（ＩＩ）のペ
プチド中間体を製造し、 Ｘ’−Ｒ，ＣＸ”または、Ｙ”）−Ｒ２−Ｒ，ＣＸ３）
−Ａｌ６−Ｒ，−Ｒ６ＣＸ”）−Ｒ，ＣＸ’）−Ｒ，Ｃ
Ｘ”ｆたはＸ”　’）　−Ｒ，（Ｘ’　）　−Ｒ，、（
Ｘ”）−Ｒ，、（Ｚ’−ｉたはＸ丁）−ＲｌｔＣＸ”ま
たはＸフ）−Ｒ１３−Ｌａｗ−ＲｌＢ−Ｇ　Ｌ　％（Ｘ
”　）　−Ｌａｘ−Ｒｌｇ（ｘ２）　−Ｒｌｗ（Ｚ’）
　−Ｒ２ａＣＸ’ＭたはＸ’）　−Ｒ２，（Ｘ’−１た
はＸ？）−ＬｌにＬａｗ−ＧｌｓＣＸ’）−Ｇｌｖ、Ｃ
Ｘ３）　　Ｒ２６−ＲｎＣＸ”）−Ｒ２，（Ｘ”！たは
Ｘ’）−Ａｒｇ（Ｘ６）−Ｘ”（式中Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸａはそれぞれ水
素原子または保護基であり、Ｘ９は保護基または樹脂支
持体への定着結合もしくはｄｏｓ−Ｘ”である） （ｂ）　　式（ＩＩ）の前記ペプチドから１つまたはそ
れ以上の保護基もしくは定着結合を切断し、そして（＋
）　　Ｐｇｒ望によシ、得られたペプチドをその無毒性
塩に転化する、 ことから成る目的とするペプチドの製造方法を提供する
。

ペプチド合成において使用する個々の側鎖保護基を選択
する場合、次の一般規則に従う：すなわち（８）保護基
はカップリング条件下でその保護特性を保持して切断さ
れない；（ｂ）保護基は試薬に対して安定であるべきで
あり、合成の各段階でα−アミノ保護基の除去のために
選ばれた反応条件下で、Ｘａｎヲ除いて、安定であるの
が好ましい；および（１）側鎖保護基は、意図するアミ
ノ酸配列を含む合成の完了時点に、ペプチド鎖を変性さ
せない反応条件下で除去できなければならない。

本発明化合物は組換え１）ＨＡ技法によっても製造する
ことができる。それらの製造において、目的ペプチドを
コードするヌクレオチド配列はこの種の合成のための新
しい常用方法ＶＣより製造される。これらの方法は一般
に目的とするコーディング配列とその相補的配列の両方
のフラグメントをコードするオリゴヌクレオチドの製造
をともなう。

オリゴヌクレオチドはコーティング配列の１つのフラグ
メントと相補的配列の２つのフラグメントとの重な！ｌ
ｌ（オーバーラツプ）またはその逆の重なりが生じるよ
うにデザインされる。これらのオリゴヌクレオチドを対
合させて、最終的に目的とする遺伝子配列を得る。

この遺伝子配列はそれがコードするペプチド産物を発現
しつるクローニングベクターの一定の箇所へ挿入される
。適当なりローニングベクターは遺伝子の発現を調節す
る調節配列を少なくとも一部包含する。

代表的な発現順４節配列は５つの要素によって説明され
る。これらの要素はそれらが遺伝子系に現われる順序で
次の通りである： （α）プロモーター領域； （６）５’非翻訳領域； （ｃ）タンパク質のコーディング配列；（ｄ）３’非翻
訳領域； （１）　　転写終結部位。

遺伝子系におけるこれらの要素のそれぞれの機能はよく
理解されている。プロモーター領域はメツセンシャーＲ
Ｎ　Ａ　（ｍＲＮＡ　）生産（転写）の開始を仲介する
。プロモーターは（１）外部からの調節を受けない（構
成的である）か、（２）もし存在する場合には遺伝子機
能を抑制する物質、リプレッサーの制御下にあるか、あ
るいは（３）遺伝子機能を誘起するのに必要な物質、イ
ンデューサーの制御下にあり得る。例えば大腸菌（Ｅ、
ｃｏｔｉ）　　由来の外層膜リポタンパク質＜ｔｐｐ）
遺伝子は外部からの調節を受けず、それにより”構成的
である（ｃｏｎｓ−ｔ□ｔｓｔ　ｉｖｙ　）　’　　と
称される。

プロモーターのところにまたはその近くに“転写開始部
位″が存在し、その部位でＲＮＡポリメラーゼはｍ　Ｒ
Ｎ　Ａの転写を開始する。ひとたび転写が開始されると
、ｍ　ＲＮ　Ａが生産される。得られるｍ　ＲＮ　Ａの
構造は上記の遺伝子要素（６）〜（ｄ）のＤＮＡ配列に
よって決定される。

得られろｍ　ＲＮ　Ａはタンパク質産物へ翻訳しうる配
列を保有する。その翻訳可能な配列は５′非翻訳領域か
ら下流で３′非翻訳領域から上流に位置する。翻訳はリ
ポソーム結合部位として知られるｍ　ＲＮ　Ａの５′非
翻訳領域中の配列ＶＣＩＪボンームが結合することによ
って仲介され、生産物遺伝子配列の第一コトンとして存
在し且つアミノ酸メチオニン（Ａｆｓｔ）をコードする
翻訳開始コドン（ＡＵＧ　）から開始される。翻訳は翻
訳領域の終りに存在する１つまたはそれ以上の終止コド
ンで終了する。

組換えＤＮＡ技法を用いて、発現調節配列すなわち構造
遺伝子に遺伝子工学的に結合されたとき構造遺伝子（外
因性タンパク質を生産する）の発現を制御し且つ調節す
るヌクレオチド配列をクローニングベクター内に挿入す
ることにより、選択された外米性（外因性）タンパク質
の生産に有用なりローニングベクターを作成することが
可能になった。

上記のことに関連して、１発現調節配列”という用語は
上記の要素（α）、（ｂ）、（−および（ｅ）を含む。

組換えＤＮＡ法は本発明化合物を比較的大きな“ハイブ
リッド”分子の一部としてまた直接発現によって発現さ
せるために使用しつる。直接発現法では、クローニング
ベクターは発現生産物がメチオニン残基（不可欠の開始
コドンが存在することによる）によって先行される目的
生産物それ自体であるようにデザインされる。余分のＭ
ｅ　を残基は生産物を臭化シアンで処理するか、または
フェニルインチオシアネートと反応させその後にトリフ
ルオル酢酸のような無水強酸で処理することにより除去
できる。

ハイブリッド分子発現法では、目的生産物をコードする
ＤＮＡ配列はクローニングベクターの発現調節配列内の
、発現生産物がハイブリッドタンパク質となるような箇
所に挿入される。本明細沓で用いる“ハイブリッドタン
パク質”とは組換えＤＮＡ産物が外米性タンパク質と、
その目的タンパク質に結合した発現調節配列によって生
産される天然（内因性）タンパク質（例えばリポタンパ
ク質遺伝子からのりボタンバク質）とから成ることを意
味している。

組換えＤＮＡ法によって生産され、適切にデザインされ
たハイブリッドタンパク質は、内因性タンパク質部分と
目的生産物の連結箇所に切断部位を含むだろう。この切
断部位はハイブリッドタンパク質産物を化学的または酵
素的に処理することによって成熟生産物の生成を可能に
する。非常に有用な選択的切断部位は、Ｃ末端で化学的
にまたは酵素的に切断しつるアミノ酸もしくはアミノ酸
配列をコニドするＤＮＡ配列から成る。

タンパク質を切断するのに有用な化学薬剤の例Ｈ臭化シ
アン、ＥＮＰＳ−スヵトール、ヒドロキシルアミンなど
である。臭化シアンはメチオニン残基のＣ末端でタンパ
ク質を切断する。従って、選択的切断部位はメチオニン
残基それ自体に存在する。

ヒドロキシルアミンは成分−Ａｓｎ−Ｑ　　（ここでＱ
ＦｉＧｌｙ、ＬｔｔｗまたはＡｌａである）のＣ末端で
切断する。

ＢＮＰＳ−スカトールはトリプトファン残基のＣ末端で
切断する。

切断に有用な酵素薬剤の例はトリプシン、パパイン、ペ
プシン、プラスミン、トロンビン、エンテロキナーゼな
どである。各酵素はそれが認識する特定のアミノ酸配列
の箇所でタンパク質を切断する。

好適な酵素はエンテロキナーゼである。従って好適な選
択的切断部位はエンテロキナーゼが認識するもの、すな
わちアミノ酸配列−（Ａｓｐ）ｉ−Ｌｙｓ−（ここでｎ
は２〜４の整数である）をコードするＤＮＡ配列である
。

最も好ましい選択的切断部位は、本発明化合物が有利に
はメチオニンを含まないので、メチオニン残基である。

目的生産物のＮ末端に結合されたこの残基は臭化シアン
を用いる既知方法によって容易に切断されて、目的とす
る成熟生産物を生成する。

ある種の真核細胞（例えば酵母や哺乳動物細胞）は比較
的大きな前駆体分子を合成することによって、小さな４
プチドを生産するＯとができる。これらの細胞は目的の
ペプチドをその前駆体から明確な切断部位で分離しつる
高度に特異的な酵素を含む。対になった塩基性アミノ酸
残基は最も明確なタンパク質分解プロセッシング部位で
ある。こ（７）ｉｔのプロセッシング部位の他の例はア
ミノ酸Ｇｌｕ−ＡｌａまたはＡｓｐ−Ａｌａである。大
部分の視床下部〈ブチドおよび若干の下垂体ペプチドは
この方法で生産される。真核生物による小さなペプチド
の生産の他の例は、小さな４プチドの接合フェロモンで
ある酵母のアルファ因子またはα因子である。

合成ＧＲＦ類似体をコードするＤＮＡ配列を、この種の
タンパク質をコードする配列の前駆体部分（しばしばプ
レープロセグメントと呼ばれる）に、それらの通常のタ
ンパク質分解プロセッシング部位の下流でしかもそれに
すぐ隣接して結合することは可能であるだろう。Ｃのよ
うな発現単位から成るプラスミドを保育する真核細胞の
培養物は、宿主細胞の遺伝子の一般的発現機構を用いて
目的とする前駆体−ペプチド分子を生産することができ
るだろう。さらに、通常の細胞過程は前駆体分子から目
的生産物を正確に切り離すであろう。

有用なりローニングベクターを作成する場合に、いくつ
かの要素が必要である。必要な要素のうち２つは全ての
有用なりローニングベクターに共通している。第一に、
ベクターは機能的な複製開始点を含むＤＮＡセグメント
（レプリコン）をもたねばならない。プラスミドおよび
ファージＤＮＡは、それらのまさに本性により、宿主細
胞内での複製を容易にするレプリコンを含有している。

第二に、ベクターは形質転換細胞を非形質転換細胞から
選択するのに有用な性質を形質転換可能な宿主細胞に伝
えるＤＮＡセグメントをもたねばならない。広範囲の性
質のどれもが選択目的のために使用し得る。最も普通に
用いられる性質の１つは抗生物質耐性、例えば大腸菌の
形質転換におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシ
リン耐性である。また、栄養要求変異株の、この種の欠
損を治療しつる野性型遺伝子のプラスミドコピーによる
相補性も一般に用いられる。

上記の２つの要素は容易に利用しつる認知されたクロー
ニングベクター中におおむね存在する。

適当なりローニングベクターの例は細菌プラスミド（例
えばｐＢＲ３２２、ｐＭＢ　９、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＣＲｌ
を含めた太腸菌白米のプラスミド）；広い宿主域のプラ
スミド（ＥＰ４を含む）；ファージＤＮＡ（例えばλフ
アージＤＮＡ）などである。上記の認知されたベクター
のうち全部でないにしても大部分が前記の２つの要素を
すでに保有している。

第三の要素は発現調節配列である。例えばリポタンパク
質遺伝子、β−ガラクト７ダーゼ遺伝子、トリプトファ
ン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ファージラムダに
白米するものを含めた広範囲のこの種の調節配列が使用
される。

選択された発現調節配列を挿入することによる適当なり
ローニングベクターの作成ＶＣは、常用方法が使用され
る。クローニングベクター内に種々の部位が存在し、そ
の部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いてベク
ターの切断が行われる。

Ｃれらの部位のどれも発現調節配列の挿入のために選択
されうる。１つの例として、よく認知され且つ実証され
ているｐＥＲ３２２の場合は、いくつかの適当な制限部
位が存在し、これらの部位のどれもが挿入部位として使
用される。ＰＳｔ１部位はβ−ラクタマーゼ遺伝子の中
に位置する。ＥＣ０Ｒ１とＰｖｕ■は一定のコーティン
グ領域の外側に存在する。これらおよびその他の部位は
当分野で習熟した者により十分認識されている。

本発明によって定められたベクターを作成する場合、こ
れらの部位または他の部位のどれかを利用するＯとによ
って、発現調節配列またはその不可欠部分を容易に挿入
することができる。

第四の要素はもちろん目的生産物をコードするｎ　＃　
Ａ　ｒｒｔ列である。先に述べたように、このＤＮＡ配
列は認知されたホスホトリエステル法または他のよく昶
らｎた方法を用いて合成的に作成される。

適当な勾−ニングベクターは広範囲の宿主微生物、例え
ば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、　セ
ラチア（５ｅｒｒａｔｉａ　）、シュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏ−ｍｏｎα８）のようなダラム陰性原核生物；
バシラス（Ｅａｃｉ　ｌ　ｌｕｓ　）、ストレプトマイ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｒｎｙｃｅｓ）のようなグラム陽
性原核生物；およびサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）のような真核生物において使用できる。宿
主微生物がダラム陰性原核生物である場合は、大腸菌に
一１２株（例えばＲＶ３０８）のような大腸菌が好適で
ある。

よく認知された方法を用いて、適切に作成されたクロー
ニングベクターで適当な宿主微生物を形質転換し、その
微生物内でクローニングベクターを増幅し、そして標準
発酵条件を用いて外因性タンパク質産物を発現させる。

その外因性タンパク質産物は得られた発酵培地から慣用
方法で単離しつる。

Ｍｅｔ切断部位を含む前駆体から生産物を分離する一般
方法は、生産物含有細胞の凍結乾燥を含む。

７０％（９／Ｖ）蟻酸１リツトルに凍結乾燥した発酵固
体１０ダラムを加える。溶解後（約６０分後）、その溶
液は臭化シアン１０．６ダラムを添加することによりＯ
，ｌ　Ｍの臭化シアン濃度へ調整する。目的左するアミ
ン末端生産物への定量的４プチド切断は２３℃において
約８時間で完了する。蟻暇な真空蒸発により除去し、切
断した発酵固体は凍結乾燥する。その固体を１０％（ｖ
／υ）酢酸中に１０グラム／リツトルで溶解し、Ｇ−５
０超微細セフアデツクスカラム（２，６ｘ　１００ｃｍ
）のカラム容積の５％に４°Ｃ１５ｃｍ／時間の流速で
装填する。均一精製は０．４６Ｘ２５ｃＩｎのシーパッ
クス（ＺＯｒ　ｂ（ＬＺ　）　ＣＢ　カラムでの逆相に
より、アセトニトリル／　０．１　Ｍリン酸アンモニウ
ム（ｐＨ７，２）の直線状勾配を用いて達成される。目
的生産物は０．０１ｆ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８，５
）中のセファデックスＧ−２５で脱塩し、凍結乾燥する
。

被ブチドが組換えＤＮＡ技法を用いないで製造される場
合、それらは好ましくはメリーフィールド（Ｍｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ）のＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８５　
＋　ｐ。

２１４９、（１９６３）に一般的に記述さｎるような固
相合成法を用いて製造される。しかし、先に述べたよう
に当分野で知られた他の同様の化学合成法も使用しつる
。固相合成法は保護したα−アミノ酸を適当な樹脂にカ
ップリングすることによって、ペプチドのＣ末端から開
始される。このような出発物質はα−アミノ保護アミノ
酸をクロルメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂へ
エステル結合によって結合するか、あるいはＥＨＡ樹脂
またはＭＢＨＡ樹脂ヘアミド結合することによって製造
しつる。ヒドロキシメチル樹脂の製法はボダンスキー（
Ｂｏｄａｏｓｋ’／）らのＣｈｅｒｎ、Ｉｎｄ、（ｏ　
ンドン）３８．１５９７〜１５９８（１９６６）に開示
されている。クロルメチル化樹脂はカリフォルニア州す
ッチモンドのバイオラッド研究所（Ｂｉ　。

Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａ、ｔｏｒｉｅｓ）およびラブシス
テムズ社（Ｌａｂ、Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）から市
販されている。この種の樹脂の製法はスチュワート（Ｓ
ｔｅｗａｒｔ）　ラの”固相（ブチド合成（Ｓｏｌｉｄ
　Ｐｈａｓｅ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）”
　　（１９８４イリノイ州ロツクフオード、ピアスケミ
カル社）第１章８〜９頁に開示さｎている。ＥＨＡおよ
びＭＥＨＡ樹脂叉待体は市販されているが、一般に合成
しようとする目的ポリ−°プチドがそのＣ末端に未置換
アミド基をもつときにだけ使用される。

Ｃ床端アミノ酸、すなわちＢＯＣおよびＴｏｓで保護さ
れたＡｒｇ　　はまずクロルメチル化樹脂もしくはＢＨ
ＡまたばＭＥＨＡ　樹脂へ以下で述べるようにカップリ
ングされる。ＥＯＣ−保護アミノ酸の樹脂支持体へのカ
ップリング後、例えば塩化メチレン中のトリフルオル酢
酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡ単独を用いてα−アミノ保護
基を除去する。保護基の除去は約０℃から室温までの温
度で行われる。

他の標準的な切断試薬（例えばジオキサン中のＭＣＩ）
、および特定のα−アミノ保護基の除去粂件もシュレー
ダー澄すュプケの“ザ・ペプチド”、１　、ｐ７２〜７
５（アカデミツクプレス、　１９６５　）に示さ１上る
ように使用しうる。

α−アミン保護基の除去後、残りのα−アミノ−および
側鎖−保護アミノ酸を意図する順序で段階的にカップリ
ングさせて、先に定義した中間体化合物を得る。あるい
は各アミノ酸を別個に反応器へ加える代わりに、若干の
アミノ酸を互いにカップリングさせてから固相反応器へ
添加してもよい。適当なカップリング試薬の選択は当分
野の技術の範囲内である。カンプリング試薬として特に
適しているものはＮ　、　Ｎ’−ジシクロへキシルカル
ボジイミド（ＤＣＣＩ）である。

４ブチドの固相合成に用いられる活性化試薬はペプチド
の分野においてよく知られている。適当な活性化試薬の
例はカルボジイミド類、例えばＮ　、　Ｎ’−ジイソプ
ロピルカルボジイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（３−
ジメチルアミンプロピル）カルボジイミドである。その
他の活性化試薬ならびにペプチドカップリングにおける
それらの使用はシュレーダー澄すュプケの上記文献、第
■章およびカブ−ｋ　（Ｋａｐｏｏｒ）のＪ、Ｐんａｒ
、ｓｃｉ、、５９　ｒ１１〜２７（１９７０）に開示さ
れている。

それぞれの保護アミノ酸またはアミノ酸配列は大体４倍
以上の過剰量で固相反応器へ導入され、カップリンク反
応はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）　：　ＣＨｘＣ
８ｔ　（１’　ｌ　）の混合媒体中で、あるいはＤＭＦ
またはｃｇ、ｃＩ３２阜独中で行われる。不完全なカッ
プリングが起こった場合は、α−アミノ保ａ基を除去す
る前にそのカップリング反応を繰り返し、その後次のア
ミノ酸をカップリングさせる。合成の各段階でのカップ
リング反応の成就は、もしその合成が手動で行われるな
ら、カイザー　（Ｅ、ｇａｉｓｔｔｒ　）らのＡｎａｌ
、Ｅｉｏｃｈｅｍ、　　３４　ｒ５９５（１９７０）に
記載されるようなニンヒドリン反応で監視するのが好ま
しい。カップリング反応は自動的に、例えばペックマン
９９０自動合成機で、リビエール（Ｒｉｖｉｅｒ）らの
Ｅｉｏｐｏ　ｌｙｍｅｒｓ　。

１９７８．１７．ｐ１９２７〜１９３８に報告されるよ
うなプログラムを用いて行うことができる。

意図するアミノ酸配列が完了した後、液状フッ化水素の
ような試薬で処理して中間体積ブチドを樹脂支持体から
切り離す。その際液状フッ化水素はペプチドを樹脂から
切り離すばかりでなく、残っている全ての側鎖保護基Ｘ
　、　Ｘ’、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６Ｘ７およびＸ８な
らびにもし使用するｌらα−アミノ保護基Ｘ１をも切断
してアミド化４ブチドをもたらす。配列中にＭｅｔが存
在する場合には、４ブチドを樹脂からＨＦで切り離す前
にまずトリフルオル酸［（ＴＦＡ）／エタンジチオール
を用いてＥＯＣ保護基を除去し、それにより起こりうる
Ｓ−アルキル化を排除することが好ましい。切断のため
にフッ化水素を使用する際には、スカベンジャーとして
アニソールやメチルエチルスルフィドを反応容器に加え
る。

実施例！は固相法による好適なアミド化ペプチドの好適
な合成法を示している。様々な長さの対応するペプチド
が単にペプチド鎖の各末端で必要数のアミノ酸を付加す
るかまたは排除することにより、同じ方法で合成し得る
。しかしながら、目下のところ生物学的に活性な類似体
はＮ末端から残基ｚ７までの明示したアミノ酸配列また
は均等物を含有すると考えられる。

実施例Ｉ 次式： ％式％ Ｌｅｔｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−ＮＨ２で表わされるペプチド（Ｓｅｒ７山Ｉ１
１　、．１　ｌ　αＱ＋Ｉ！Ｉｄ８＋２８゜Ａｒｇ””
　ｒＬｅｕ１３”２７）　−ｈＧＲＦ（１−２９）−Ｍ
Ｈ２の合成は、ベックマン９９０−！！ブチド合成機を
使って、置換範囲が約０．３５〜０．５ミ！Ｊモル／ｇ
樹脂のＭＢＨＡ樹脂上で段階的方法により行った。

ＢＯＣ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）の樹脂へのカップリングはベ
ール（Ｖａｌｅ）の米国特許第４２９２３１３号に記載
される一般方法により、ＤＭＦ中のＫＦを用いて撹拌下
約６０℃で２４時間実施した。この反応は衡脂１．ｇ当
たりＡｒｇｔＪｏ、　３５　ミ’）モルの置換をもたら
した。

保護基を除去して中和した後、ペプチド鎖を樹脂上に一
段ずつ付加していった。保護基の除去、中和および各ア
ミノ酸の付加は一般にリビエール２９８６〜２９９２（
１９７４）に詳述される方法に便って行った。使用する
全ての溶削は不活性ガス（例えばヘリウムや窒素）を散
布するＣとによって注意してガス抜きし、酸素を確実に
除いた。

保護基の除去は好ましくはスケジュールＡに従って行っ
た： スケジュールＡ １、６０チＴＦＡ／２チエタンジチオール　　１０２、
６０チＴＦＡ／２チエタンジチオール　　　１５３、　
１ＰＡ／Ｌ％エタンジチオール　　　　０．５４、　　
ＣＨ，Ｃ１，中のＥｔ３Ｎ（１０チ）０．５５、　　Ｍ
ｇ０Ｈ０１５ ６、ＣＨ２Ｃｌ、中のＡ’　ＬｓＮ　（１０チ）０．５
７、ＭａＯＨＣ２回）０．５ ８、　　ＣＨ２Ｃｌ２（２回）０．５ カツプリングは好１しくはスケジュールＢに記載される
ように行った： スケジュールＢ ９、　　ＤＣＣＩ　　　　　　　　　　　　−１０、Ｅ
ＯＣ−アミノ酸　　　　　　　　　５０〜９０１１、　
　Ｍｇ０ＨＣ２回）０．５ １２、　　ＣＨ，Ｃｌ２（２回）０５ １３、　　ＣＨ，Ｃ１２中のＡｃｔＯ（３Ｍ　）　　　
　　１５．０１４、　　ＣＨ，Ｃ１，０，５ １５、Ｍｇ０ＨＯ，５ １６、ＣＨ，Ｃｔ、　（２回）０．５ 簡単に述べれば、樹脂１１当たり塩化メチレン中のＥＯ
Ｃ−保護アミノ［１〜２ミリモルを使用し、塩化メチレ
ン中の１．０モルＤＣＣＩ　１当量を加えて２時間実施
した。ＥＯＣ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）がカップリングされつ
つあるとき、５０％ＤＭＦと塩化メチレンの混合物を使
用した。ＳａｔおよびＴｈγノヒドロキシル側鎖保護基
としてＢｚＬエーテルを使用した。ＡｓｎやＧｌｎのア
ミド基は、有利であるようにＤＣＣカップリングを使用
する場合、Ｘａｎテ保Ｊ　Ｌ７’ｃ。ｐ−ニトロフェニ
ルエステルＣ０Ｎｐ）ハＡｓｎ、’；’Ｇｉｎのカルボ
キシル末端を活性化するために使用し、例えばＥＯＣ−
Ａｓｓ（ＯＮｐ）はＤＭＦと塩化メチレンの５０チ混合
物中のＨＯＢｔ１当量を用いて一晩カツブリングさせる
ことができ、この場合はＤＣＣを加えなかった。２−ク
ロル−ベンジルオキシカルボニルＣ２Ｃ１−Ｚ）はＬ１
／８側鎖の保護基として使用した。ｒｏｍはＡｒｇのグ
アニジノ基およびＨｉｓのイミダゾール窒素を保護する
ために使用でき、ＧｌｕまたはＡｓｐの側鎖カルボキシ
ル基はＯＢπｔで保護した。Ｔｙｒのフェノール性ヒド
ロキシル基は２．６−ジクロルベンジルＣＤＣＥ）で保
護した。合成の終りに、次の組成の中間体が得られた： ＥＯＣ−ＴｙｒＣＸ）−ＡＬａ−ＡｓｐＣＸ３）　Ａｌ
ａ−１１ｇ−Ｐｈａ−８ａｒＣＸ’）−８ａｒ（Ｘ’）
−Ａｌａ−ＴｙｒＣＸ２）−ＡｒｇＣＸ”）−ＡｒｇＣ
Ｘ’）−ＬａＳ−Ｌａｓ−Ａｌａ−ＧｌｎＣＸ５）　−
Ｌａｗ　−ＡＬ　０Ｌ−８ａｒ（Ｘ’）−ＡｒｇＣＸ’
）　−Ａｒｇ（Ｘ６）−Ｌｔｒｕ−Ｌａｗ−Ｇｌ　ｎＣ
Ｘ”　）　−Ｇｌ　ｘ（Ｘ３）−Ｌａｗ−Ｌｇｓ−Ａｌ
　ａ−ＡｒｇＣＸ６）−Ｘ”　（ここでＸはＴｏｓ、Ｘ
２はＤＣＥ、Ｘ３は０Ｂｚｔ、Ｘ’はＢｚＬ、Ｘ”はＸ
ａｎ、　Ｘ”はＴｏｓ、そしてＸ９は−ＮＨ−樹脂支持
体である）Ｘａｎはα−アミノ保護基を除去するために
用いたＴＦＡ処理によって部分的にまたは完全に除去で
きた。

保護ペプチド−樹脂を切り離して保護基を除去するため
に、ペプチド−樹脂１１当たりアニソール１．５ｄ、メ
チルエチルスルフィド０．５ｍｌおよびフッ化水素ＣＨ
Ｆ　）　１５　ｍｌを用いて一２０℃で３０分および０
℃で３０分処理した。高真空下でＨＦを除去した後、樹
脂−ペプチド残留物を乾燥ジエチルエーテルおよびクロ
ロホルムで交互に洗い、次いでペプチドをガス抜きした
２Ｎ水性酢酸で抽出し、濾過によｔ）樹脂から分離した
。

その後、得られたペプチドを０〜５％酢酸に溶解し、セ
ファデックスＧ−５０微細ゲル濾過を含めた精製工程に
付した。

さらにペプチドはリビエールらのペプチド：構造および
生物学的機能、ｐ１２５〜１２８（１９７９）およびマ
ーキー（Ｍａｒｋｔ　）らのに示されるような調製用筐
たは半調製用ＨＰＬ　Ｃで精製した。カートリッジを備
えたウォーターズ・アソシエーツ・プレグＬ　Ｃ−５Ｕ
　ＯＣＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｐｒｏｐ　
ＬＣ５００）はバイダックＣＶｙｄａｃ　）　３００　
Ａからの１５〜２０μのＣＩ８シリカを装填した。リビ
エールのＪ、　Ｌｉｑ、　Ｃｈｒｏｍ−ａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ　　１．３４３〜３６７（１９７８）に記載される
ように、低圧エルデツクスＣ１１ｌｄｅｓｅ）　勾配製
造機を使って、ＴＥＡＰ中のＣ１１３ＣＮの勾配をつく
った。クロマトグラフ画分は注意してＨＰＬＣで監視し
、実質的純度を示す画分のみを集めた。

それぞれ別個に純度を調べた精製画分の脱塩は０．１％
ＴＦＡ甲のＣＨ，ＣＮの勾配を用いて行った。

その後センターカッ）　（ｃｇｎｔｔｒｒ　ｃｕｔ　）
を凍結乾燥して目的とするペプチド（純度９８％以上で
ありうる）を得た。

実施例■ 次式： ％式％ で表わされる、同じ配列をもつが遊離酸の形のペプチド
（Ｅａｒ？−シ”、ＡＬａ９・＋５＋ＩＬＺａ　、　Ａ
ｒ１７　＋２ＪＩ。

Ｌａｗ１３１２す７〕ｈＧＲＦ　（１２９）−ＯＨは、
ペックマン９９０ペプチド合成機を使って、置換範囲が
約０．３５〜０．５ミリモル／２樹脂のクロルメチル化
樹脂上で段階的方法により合成した。ＢＯＣ−ＡｒｇＣ
Ｔｏａ）　　の樹脂へのカップリングはモナハンＣＭｏ
５ａｈａｓ）らのＢｉｏｐｏｌｙｍｇｒｓ、１２、ｐ２
５１３〜２５１９（１９７３）に記載される一般方法に
より、溶剤として塩化メチレンを使用し、塩化メチレン
中２ＭＤＣＣ１１当量を加えて攪拌下２時間実施した。

樹脂からの切ｖ％ＦＩｔＬ、保護基の除去および精製を
含めた合成の残りの部分は実施例■のように行った。

本ペプチドはＴＬＣおよびＨＰＬＣを用いて実質的に純
粋であることが判明した。

実施例■ 実施例バで合成した同じペプチドを組換えＤＮＡ技法に
より製造した。

カージャン（ＫｕｒｊａｆＬ）　　およびノへ−スコヴ
イツツＣＨｇｒｓｋｏｗｉｔｔ　）のＣｅ１１．．３　
（］：　９３３〜９４３（１９８２年１０月）に記載さ
れるようなアルファ因子構造遺伝子をコードする１、７
Ｋｂ　ＥＣｏＲ１フラグメントを、アルファ因子構造遺
伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と同じ向きになるよ
うにｐＢＲ３２２にサブクローニングした。このプラス
ミドをＢａｔ　ｒで消化して再び閉環した。得られたプ
ラスミドはアルファ因子プロモーター、プレープローペ
プチドコーディング配列および１３個のアミノ酸から成
る成熟アルファ因子ペプチドの−ｔＳを含んでいた。こ
のプラスミドはこのベクターの唯一のＰυ％Ｉ［部位へ
ＢａｍＨＩ　　リンカ−を挿入することによりさらに修
飾して、ＧＲＦ類似体コーディング配列の挿入部位をつ
くった。

実施例■に記載のＧＲＦ類似体のために次のヌクレオチ
ド配列（センス鎖）： ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＧＣＴ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＣＣ
ＴＣＣＧＣＣＴＡＴ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＣＴＴ　ＣＴＴ
　ＧＣＴ　ＣＡＧＣＴＴ　　ＧＣＣＴＣＣＡＧＡ　　Ａ
ＧＡ　　ＣＴＣＣ１’ＣＣＡＡＧＡＡ　　ＣＴＴ　　Ｃ
ＴＴ　　ＧＣＴ　　ＡＧＧ　　ＴＡＧが選択され、その
３′宋端はＴＡＧターミネータ−コードを含んでいた。

このＤＮＡ配列はそのアンチセンス鎖と共に最新の技術
を用いて合成した。

この配列を発現ベクターと適合させるために、アルファ
因子ペプチドの一部とプロセッシング部位をコードする
仄の配列：　ＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＡ−ＡＡＧ
ＧをＧＲＦ類似体のセンス鎖の５′床端に付加シタ。ア
ンチセンス鎖はこのオリゴおよびＧＲＦ類似体の両方と
正確に相補的なりＮＡ鎖から成るが、それは５′末端に
ＢａｍＨ７突出部分を含んでいた。

上記のようにして作成したベクターをその後ＢαｍＨＩ
およびＢｃＬｔＩで切断し、合成遺伝子を挿入して次の
特性を有するベクターをつくった。それはアルファ因子
プロモーター、プレープロー配列、および１つのアルフ
ァ因子ペプチドコーディング配列を含んでいた。このペ
プチドコーディング配列の後にＩ、ｙｓ−Ａｒｇの配列
が続き、この配列はＧＲＦ類似体をアルファ因子ペプチ
ドからタンパク質分解酵素で切断する際に役立った。膨
訳終止を含むＧＲＦ類似体はこのＬｙｓ−Ａｒｇ配列の
後に位置していた。

ＧＲＦ類似体発現単位はＢａｍＨＩおよびＢｇｔｌで消
化することによりこのベクターから正確に切り取った。

このフラグメントを電気芯ｊ、＠（ｇｌａｃ−１ｒｏ　
５ｌＳｔｉｏｎ）により６チアクリルアミドゲルから単
離し、フェノール抽出してエタノール沈殿させた。この
フラグメント約２０　ｎｆは適当な酵母シャトルベクタ
ー（好１しくは酵母−特異的配列が挿入されたｐＥＲ３
２２に基づくもの、例えば１９８５年６月２０付のチル
（Ｔｈｉｌｌ）　　らの米国特許出願第７４７１５２号
に詳述される発現ベクターＴＥＰ２０９：上記特許の明
細書を参考としてここに引用する）の脱リン酸化Ｅａｍ
ＨＩ消化物６ｎｙに標準条件下で連結した。次いで、そ
れを用いて大腸菌株Ａ／Ｃ’１０６１をアンピシリン耐
性へと形質転換した。形質転換細胞は微琶溶解産物（ｍ
ｉｎｉ　１ｙｓａｔａ　）のＸｂａ（消化により分析し
た。

正しい方向性を有するもの（すなわちその遺伝子の３′
末端が転写ターミネータ−に隣接するもの）は既知分子
量の標品と対比して特徴的制限フラグメントを同定する
ことにより選択した。得られた酵母発現ベクターは酵母
内での選択のための野性型Ｔｒｐｌ遺伝子と、内因性酵
母プラスミド２μサークル由来の複製開始点を保有して
いた。それを使ってトリプトファン要求性サツカロミセ
ス（５ａｅｃｈａｒｏｎｔｙｃａｓ　）菌株（例えばＧ
Ｇｌｏｏ−１４Ｄ。

ＡＴＣＣ＃２０７６２　）を原栄養株へと形質転換した
。

さらに、それは先に述べたアルファ因子プロモーター、
プレープロー領域、アルファ因子ペプチド、プロセッシ
ング部位、ＧＲＦ類似体およびアルファ因子転写ターミ
ネータ−を含む発現カセットを保有していた。

陽性の形質転換細胞は標準技法を用いて発生させ、それ
をバッチ培養または連続培養によりトリプトファン欠損
合成培地で増殖させた。免疫反応性ＧＲＦ類似体はＲＩ
Ａによって増殖培地中で検出した。分析はＣ末端に遊離
酸を有する２９個のアミノ酸から成るペプチドが生産さ
れたことを示した。

実施例■および■に一般的（Ｃ示した方法を用いて、次
のｈＧＲＦ類似体の同相合成を行った：ｌ：　Ｈｉｓ’
　、　５ｅｒ７＋”＋”　、　Ａｌａ””””、　Ａｒ
ｇ”’　。

Ｌａｗ””７〕−ｈＧＲＦ　（１２９）　　＃Ｈ２：（
Ｈｉ　ｓ　’　、　Ｓ　ｇ　ｒ”’　、　Ａｔ　ａ”＋
５’♂＋２８　、　Ａ　ｒ　ｙ　１２＋　２１　、　Ｌ
　ｅ　ｗ　１３！２６Ａｌａ”〕−ｈＧＲＦｃ１−２９
）−Ａ＃７ｚ　：［Ｈｔ　ｓ’　　、　　Ｓ　ｓｒ”’
、　Ａ　ｌ　　ａ””””　　、　Ａｒ　Ｎ１２，２’
　　、　　Ｌｍ−Ｎ１３””）〕−ｈＧＲＦｃ１−２９
）−Ｎｌ１２； ［Ｓｇｒフー’、Ｇｌｓδ　　７　（ａ９，１５．１８
．２８　、．４　、．１２．２１゜Ｌｅ　１Ｌ１３Ｔ２
へ”］　−ｈＧＲＦ　（１−２９）　　＃Ｈ２；［ｐ）
、　、ｌ　、　（、、、、＋５．＋３．２６．２？　、
　Ｂ　、　、７．ａ、ＩＣＩ　、　Ａ　１ａ１５．＋８
，２δ。

Ａｒｇ””〕−ｈＧＲＦ　（１２９）−Ａ’Ｈｚ　：（
Ｓ　ｅ　　ｒ？＋♂−９，２１１、’、４　　ｌ　　α
Ｑ、＋５−８　、Ｐｈ　　ｇＩｏ　、Ａｒ　ｇ’２Ｉ”
　　。

Ｌａｗ１３＋”＋２７〕−ｈＧＲＦ（１−２９）　−＝
＃Ｈ２：（：　Ｈｓ　ｓ’　＋　Ｓ　ａ　ｒ””９ｒ　
Ａ　ｌ　ａ”１５”””　＋　０ｒｎ１２＋Ａｒｇ””
　。

Ｌａｗ１３”、Ｖａｌ”〕−ｈＧＲＦｃ１−２９）ＯＨ
；〔Ｌ　、、５．＋３．２６．３　、、）＋＋９．Ａｌ
ａ’−δ、２ａ、Ａ？、ｇ１２，２Ｉ　。

Ｎ１ｇ２７）　　ＡＧＲＦ（１２９）　　＃Ｈ２：（Ｈ
ｉｓ’、Ｓｅ　　ｒ”’、Ｔｈｒ８　、Ａｌａ””””
”、Ａｒｇ”＋Ｌａｗ”””〕−ｈＧＲＦｃ１−２９）
　　ＮＮ２：（Ｈｉｓ’、５ｅｒ）・♂、０１、．４　
ｌ　、Ｑ、＋５．２８、．４．．１２．２１　　、Ｚ、
、、Ｗ１２７　〕−ｈＧＲＦｃ　１−２９　）−ＮＨ，
；〔Ｈｉｓ　宜　、　ｓ　、　７）＋８＋　１９　、　
　Ａ　１　．０１１８Ｊ８　、　．１．　　、＋２．２
１　　、　１　　（、＋３　。

Ｌ　ｇ　ｘ”７）　　ｈ　Ｇ’ＲＦ　（１２９）　−Ｎ
４　；〔Ｈｉ　　ｓ’　　、Ｔｙｒ６　、　　ｓｇ　　
ｒ）、♂・”　Ｔ　Ａ　ｌ　　ａ”””８．Ａ　ｒ　ｇ
”　。

ＰＡｇ１３．Ｌｇｕ”］−ｈＧＲＦ（１−２９）−Ｏｆ
ｆ：〔Ｄ−Ａｓ　ｐ２　、Ｓ　ｇ　ｒ７山＋９　、　Ａ
７　ａ　Ｑ　＋　＋　！’　！　＋８．２ｓ　、　Ａ　
ｒ　ｙ　１２１２１゜ＬａｗＩ３１２ｓ、Ｎｌ　ｇ”］
−ｈＧＥＦｃ　１−２９　）−＃７／２；〔Ｄ−Ｐｈ　
　＃’　　、Ｓ　ｇ　　ｒ丁＋＆　　、、４　（，９＋
１５Ｊ８、．４　、、ＩＬ！＋　　。

Ｌａｗ””、Ｎｖａ２７〕−ｈＧＲＦＣｌ−２９）−Ｎ
Ｎ２：［：Ｄ−Ｈｉ　　ｓ’　　、Ｄ−Ａｓ　　ｐ３　
、Ｓ　ｓ　　ｒ丁＊　Ｉｌｌ　、Ａ　！　　、１１１１
５＋ＩＩＪ８　。

ＡｒｇＩ２＋ＬｍＪ””＋Ｎ１５２７．Ｏｒｎ”〕−ｈ
ＧＲＦ（１−２９）−ＮＮ２； 〔ＮａＭｇ−Ｄ−Ｔｙｒ’　、５ａｒ７山”　、　Ａ　
ｌ　ａ”１８””　、　Ｏｒｎ”　。

Ａｒ、１２・”、ＬａｗＩ３”、１１ｇ２７〕−ｈＧＲ
Ｆｃｌ−２９）−ＮＨ，： （Ｐｈｇ’　　＋Ｔｙｒ’　、５ｓ１−５＋　＋　９　
、　Ａ　（ａ＋５　＋　１８１２８　、　Ａｒ　ｙ　１
２　＋　２１゜Ｌ　ｅ　Ｎ２６”　］　　ｈ　Ｇ　ＲＦ
　（１２９）　　Ｎ　Ｎ２：［：Ｈｉ　　、ｓ’　　、
　　Ｓ　ｅ　　ｒ””　　、　　Ａ　ｌ　　ａ”１５”
８．　　Ａｒ　　ｇ”　　、　　Ｌｇｕ＝””）　。

０ｒｎ２０”］−ｈＧＲＦ（・１　２９）−＃Ｈ２：［
Ｓｇｒ）、８１１ＣＩ、Ａｌ、９１１５１１８，２１１
．Ｊ、、、ＩＯ＋１３．．４ｒ、１２．２＋。

Ｐ　ｈ　ｅ”　、　Ｇ　ｌ　Ｎ２７）　　ｈＧＲＦ　（
１２９）−ＮＮ２；［ＣｃＬＭｅ　−Ｔ１１ｒ’　、５
ｔｔｒ””１ｏ＋Ａｌａ”１５””２δ、　Ａｒ　ｇ”
、２’　＋Ｌ　ｅ　１Ｌ１３”’　、　Ｏｒ　ｎ２°、
Ａｓｐ２７〕−ｈＧＲｈ’ｃ１−２９）−ＮＮ２； （Ｌ　＃　　ｓ　＋＋　１３　、　　ｓ　ｇ　　ｒ　７
１　ａ、　宜’　、　　Ａ　Ｌ　　ａ”δ＋２８　　、
　　Ａ　ｒ　　ａ　１２Ｔ　Ｑ１　　。

ＩＩ　ｇ””）−ｈＧＲＦｃｌ−２９）　　ＯＨ；［Ｎ
ｃＬＭｇ−Ｍａｔ’　　、Ｓｇｒ）、ＩＱ　、　　ＴＡ
　　ｒＢ　　、Ａ　ｌ　　ｃＬＱ＋＋５，１８４８　。

Ｌｙｓ”、Ａｒｇ１２”、ＬａｗＩ３””〕−ｈＧＲＦ
ｃ１−２９）−ＮＮ２； （，５＋、Ｔ７，８．Ａｌ、９１１５．１８．．４．．
１２．２１．ｚ、、、１３．２６１２７゜Ａｓｔｔ”〕
−ｈＧＲＦＣ１−２９）　−ＮＮ２；〔ＮａＭｇ　−Ｈ
ｉ　ｓ’　、　Ｓ　ｇ　ｒ”ｒ”、　Ｐｈ　ｅｌｏ、　
Ａｌ　ａ””８９２’。

Ｏｒｎ””、Ｌｅｘ””、Ｌｙｓ２０．Ｇｌｎ”：１−
ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＮ２； （ＣａＭｇ　　−Ｈｓ　　ｓ’　　、　　Ｓ　　ｇ　　
ｒ）”９　、ＧＬ　　？Ｌδ　、Ａ１　　ｃＬｇｌ１５
１１８＋２８　　。

Ｏｒｎ”、Ａｒｇ１２”、Ｌｅｘ”＋２６．Ｔｒｐ２７
）−ｈＧＲＦ（１−２９’）−ＯＨ： 〔Ｈｉ　　ｓ’　　、　　Ｓ　ｇ　　ｒ””　ＩＱ　、
　　Ａ　ｌ　　ａ””鵞’　”　ｒ　　Ａ　ｒ　　９１
２　＋　　Ｌ　ａ　Ｊ””　■ Ｌｙｓ２０．Ｔｙｒ２７〕−ｈＧＲＦＯｌ　　２９）−
ＮＮ２゜これらの類似体はＴＬＣおよびＨＰＬＣを用い
て実質的に純粋であると判明した。

発明の効果 これらの合成ペプチドは、合成ｈＧＲＦＣ１−４０）−
ＯＨと比較して、ＧＨの分泌に関して少なくとも同程度
の、往々にしてより優れた効力を示すことが見出された
。

成長ホルモンの放出をうながす実施例Ｉの合成ペプチド
の有効性を試験するために、標品として合成ｈＧＲＦｃ
１−４０）−ＯＨを用いて等モル濃度の種々の他の合成
類似体および断片と並行比較することによりｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ検定を行った。試験の４日前に摘出したラット下
垂体細胞を含む培養物を使用した。比較試験のために成
長ホルモンの分泌が最適でるると考えられる培養物を、
ベール（Ｖａｌｇ）らのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｔｏｇｙｒ
　９１．５６２〜５７２　（１９７２）　　ＹＣ記載さ
れ、またペールらのｈ：ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｒ
　１１２．１５５３〜１５５５（１９８３）にさらに詳
しく記載される一般方法により使用した。試験すべき物
質とのインキュベーションは４時間行い、培地アリコー
トを取り出して、それらの免疫反応性ＧＨＣｉｒ　ＧＨ
）の含有量をよく知られたラジオイムノアッセイで測定
するだめに処理した。等モル濃度を使用するこの比較試
験の結果は、実施例１および１１のペプチドがｈＧＲＦ
ｃｌ−４０’ｌ−ＯＨ標品と同等の効力を有することを
示した。

この種の合成んｐＧＲＦ類似体は医師がＧＨ産生を高め
ることを望むヒトへ適用するのに有用であり、天然ｈｐ
ＧＲＦよりも優れているだろう。これらの類似体の同相
合成は、ｈｐＧＲＦ類似体ペプチドの長さがより短いた
めに、天然分子の合成よりも簡単である。さらに類似体
に見出せる比較的整然とした構造はより安定なペプチド
をもたらし、それにより精製が容易となる。この種の類
似体によるＧＨ分泌の刺激は、内因性Ｇ　Ｒｋ’の産生
低下に起因する完全または相対的ＧＨ欠乏症を有する患
者を対象としている。さらに、増大したＧＨ分泌および
それに伴う成長増加は正常のＧＨレベルを有するヒトま
たは動物にも現われるであろう。

寸だ、投与は身体の脂肪含量を変化させ、その他のＧＨ
依存性の代謝、免疫および発生過程を変更させるであろ
う。例えば、これらの類似体は火傷を負ったような情況
下にあるヒトの同化過程を刺激する手段として有用であ
りうる。他の例として、これらの類似体は鶏、七面鳥、
豚、ヤギ、牛および羊のような商業用温血動物ＶＣ，ま
たは魚や他の冷血動物（例えばウミガメおよびウナギ）
および両生類の養殖に、有効量の本ペプチドを与えるこ
とにより成長をはやめ且つタンパク質対脂肪の比を高め
るために使用しつる。

ヒトに投与する場合、これらの合成ペプチドは少なくと
も約９３チ、好１しくは少なくとも９８係の純度をもつ
べきである。本明細書において純度とは意図するペプチ
ドが存在する全てのペプチドおよびペプチド断片の表示
重量％ｆ占めることを意味する。この種の合成ペプチド
を商業用または龍の動物に成長促進および脂肪含量低下
の目的で投与する場合は、約５チ程度の低い純度、ある
いは０．０１％の純度でさえも許容しつるかも知れない
。

これらの合成ペプチドでたはその無毒性塩は、医薬組成
物をつくるため１ｃ薬学的または獣医学的に受答される
キャリアーと混合されて、ヒトを含めた動物へ静脈内、
皮下、筋肉内、経皮的（例えば鼻腔内）、または経口的
にさへ投与することができる。投与は治療しようとする
受容者がこのような治療上の処置を必要とする場合にＧ
Ｈの放出を刺激すべく医師シてより行われる。必要な投
与量は治療しようとするそれぞれの症状、その症状の程
度、および治療の持続期間により変化するであろう。

この種のペプチドは無毒性塩、せりえば酸付加塩または
亜鉛や鉄などとの金属錯体（本明細８Ｖｃおいては金属
錯体も塩として考える）の形でしばしば投与される。酸
付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、
マレイン酸塩、げ１・酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、
コノ・り酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸
塩などである。活性成分を錠剤の形で経口的に投与する
場合、錠剤はトラガカント、トウモロコシ澱粉またはゼ
ラチンのような結合剤；アルギン咳のような崩壊剤；お
よびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含みつ
る。液体での投与が望１れる場合は甘味料および／また
は風味料を使用することができ、また等張塩水や燐酸緩
衝液での静脈内投与を行うこともできる。

本ペプチドは医師の指導のもとてヒトに投与されるべき
であり、医薬組成物は通常薬学的に受答される慣用の固
体または液体キャリアーと共にペプチドを含むだろう。

一般に、非経口投与量は受答者の体重１ｋｇ当たクペプ
チド約１０　Ｏｎ７〜約５０μ７であるだろう。

本発明はその好適な実施態様（特に実施例Ｉと■は本発
明者が認める最もよい方法である）について説明してき
たが、当分野で通常の知識を有する者に明らかないろい
ろな変更および修飾が特許請求の範囲に記載する本発明
の範囲から逸脱することなくなされうろことを理解すべ
きである。例えば、ペプチド鎖の修飾、とりわけペプチ
ドのＣ末端から始４る１個以上のアミノ酸残基の欠失は
今１でに知られた実験慣習に従って行われ、それによジ
ペプチドの生物学的効力の１さに本質的部分を保持する
ペプチドがつくり出され、この種のペプチドも本発明の
範囲内に含壕れると考えられる。さらに、Ｃ末端での付
加も行われ、かつ／′！たペプチド化学の分野で知られ
るよって自然界に存在する残基の代わりにほぼ均等の残
基を用いて、タンパク質の加水分解に対して増強された
抵抗性を有し、１だ実施例■に記載のペプチドのような
本発明の範囲を逸脱しない請求されたポリペプチドの効
力の少なくとも本質的部分を有する他の類似体を製造す
ることができる。同様に、Ｃ末端のカルボキシル基にお
ける既知の置換（例えば低級アルキルアミド）もまた均
等の分子・２もたらす。

本発明の特徴は先の特許請求の範囲に説明されるもので
ある。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列を有する合成ペプチド。 【アミノ酸配列があります】 （式中Ｒ＿１はＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
   Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＤ−Ｈｉｓであり、
   各アミノ酸残基はＣ＾αＭｅまたはＮ＾αＭｅ置換を有
   するかまたは未置換である；Ｒ＿２はＡｌａまたはＤ−
   Ａｌａであり；Ｒ＿３はＡｓｐまたはＤ−Ａｓｐであり
   ；Ｒ＿５はＩｌｅまたはＬｅｕであり；Ｒ＿６はＰｈｅ
   またはＴｙｒであり；Ｒ＿７はＳｅｒまたはＴｈｒであ
   り；Ｒ＿８はＳｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＧｌｎであ
   り；Ｒ＿９はＡｌａまたはＳｅｒであり；Ｒ＿１＿０は
   Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＬｅｕであり；Ｒ＿１＿１はＡｒ
   ｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり；Ｒ＿１＿２はＡｒｇ、
   ＯｒｎまたはＬｙｓであり；Ｒ＿１＿３はＩｌｅ、Ｌｅ
   ｕ、ＰｈｅまたはＶａｌであり；Ｒ＿１＿５はＧｌｙま
   たはＡｌａであり；Ｒ＿１＿８はＡｌａまたはＳｅｒで
   あり；Ｒ＿１＿９はＳｅｒまたはＡｌａであり；Ｒ＿２
   ＿０はＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり；Ｒ＿２＿１
   はＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓであり；Ｒ＿２＿６はＬ
   ｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＰｈｅであり；Ｒ＿２＿７
   はＮｌｅ、Ｎｖａまたは天然アミノ酸であり；Ｒ＿２＿
   ８はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＳｅｒであ
   り；そしてＹはＯＨまたはＮＨ＿２である；但しＲ＿５
   、Ｒ＿６、Ｒ＿７、Ｒ＿８、Ｒ＿９、Ｒ＿１＿０、Ｒ＿
   １＿１、Ｒ＿１＿２、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿５、Ｒ＿１
   ＿８、Ｒ＿１＿９、Ｒ＿２＿０、Ｒ＿２＿１およびＲ＿
   ２＿６を構成するアミノ酸残基のうち少なくとも４個は
   、天然ｈＧＲＦのそれぞれの位置に存在するアミノ酸残
   基と相異なるものである）
2. （２）Ｒ＿７がＳｅｒである特許請求の範囲第１項記載
   のペプチド。
3. （３）Ｒ＿９がＡｌａである特許請求の範囲第１項記載
   のペプチド。
4. （４）Ｒ＿１＿２がＡｒｇである特許請求の範囲第１項
   記載のペプチド。
5. （５）Ｒ＿１＿８がＡｌａである特許請求の範囲第１項
   記載のペプチド。
6. （６）Ｒ＿１＿３、Ｒ＿２＿６およびＲ＿２＿７がＬ＿
   ｅ＿ｕであり、Ｒ＿２＿８がＡｌａであり、ＹがＯＨで
   ある特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
7. （７）Ｒ＿１＿３がＬｅｕであり、Ｒ＿２＿６がＬｅｕ
   であり、Ｒ＿２＿７がＬｅｕであり、Ｒ＿２＿８がＡｌ
   ａであり、ＹがＮＨ＿２である特許請求の範囲第１項記
   載のペプチド。
8. （８）Ｒ＿２＿７がＩｌｅである特許請求の範囲第１項
   記載のペプチド。
9. （９）Ｒ＿１がＴｙｒであり、Ｒ＿２がＡｌａであり、
   Ｒ＿３がＡｓｐである特許請求の範囲第１項記載のペプ
   チド。
10. （１０）Ｒ＿１＿９がＳｅｒである特許請求の範囲第１
    項記載のペプチド。
11. （１１）Ｒ＿７がＴｈｒであり、Ｒ＿８がＧｌｎである
    特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
12. （１２）Ｒ＿１＿２がＯｒｎである特許請求の範囲第１
    項記載のペプチド。
13. （１３）Ｒ＿２＿１がＡｒｇである特許請求の範囲第１
    項記載のペプチド。
14. （１４）Ｒ＿３がＬｅｕであり、Ｒ＿５がＰｈｅであり
    、Ｒ＿１＿０がＴｙｒであり、Ｒ＿１＿１がＡｒｇであ
    り、Ｒ＿２＿０がＡｒｇであり、Ｒ＿２＿７がＬｅｕで
    ある特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
15. （１５）Ｒ＿１＿３がＬｅｕであり、Ｒ＿１＿５がＡｌ
    ａであり、Ｒ＿２＿６がＶａｌであり、Ｒ＿２＿７がＬ
    ｅｕであり、Ｒ＿２＿８がＡｌａである特許請求の範囲
    第１項記載のペプチド。
16. （１６）Ｒ＿１がＨｉｓであり、Ｒ＿２がＡｌａであり
    、Ｒ＿３がＡｓｐである特許請求の範囲第１項記載のペ
    プチド。
17. （１７）次式： 【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
18. （１８）次式： 【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
19. （１９）有効量の特許請求の範囲第１項記載のペプチド
    またはその無毒性塩、およびそのための薬学的または獣
    医学的に受容される液体もしくは固体のキャリアーを含
    有する動物の成長ホルモン（ＧＨ）放出を刺激するため
    の医薬組成物。