JPS6251698A - Grf類似体 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はヒトや他の動物の下垂体の機能に影響を及ぼす
ペプチドに関する。特に、本発明は下垂体からの成長ホ
ルモン(以後GHと略す)の放出を促進するペプチドに
関する。
ペプチドに関する。特に、本発明は下垂体からの成長ホ
ルモン(以後GHと略す)の放出を促進するペプチドに
関する。
従来技術
長い間、生理学者達は視床下部で産生される特殊な物質
(下垂体ホルモンの分泌を刺激または抑制する)が下垂
体線部の分泌機能を調節していることを認めてきた。1
982年に、ヒト膵臓(腫瘍)GH放出因子(hpGR
F)がヒトの膵臓腫瘍の抽出物から単離され、精製、同
定、合成および試験が行われて、それは下垂体からのG
Hの放出を促進することが判明した。その時以来、他の
動物やヒト由来の関連する視床下部GH放出因子が同定
および合成されてきた。ヒト視床下部GRF(hGRF
)はhpGRFと同じ式、すなわち:H−Tyr−Al
a−Asp−Al a−11g−Phe−Thr−A
srs−8ar−Tyr−Arg−Lye−Val−L
aw−Gl y−Gln−Las−’;5r−Al a
−Arg−Lys−La1L−Law−Gin−Asp
−It g −M# t−8sr−Arg−Gin−G
in−Gly−Glu−85r−As?5−Gt 5−
GE、x−Ar g−Gl y−AL a−Arg −
Al a −Arg−La1L−NH2を有することが
見出された。
(下垂体ホルモンの分泌を刺激または抑制する)が下垂
体線部の分泌機能を調節していることを認めてきた。1
982年に、ヒト膵臓(腫瘍)GH放出因子(hpGR
F)がヒトの膵臓腫瘍の抽出物から単離され、精製、同
定、合成および試験が行われて、それは下垂体からのG
Hの放出を促進することが判明した。その時以来、他の
動物やヒト由来の関連する視床下部GH放出因子が同定
および合成されてきた。ヒト視床下部GRF(hGRF
)はhpGRFと同じ式、すなわち:H−Tyr−Al
a−Asp−Al a−11g−Phe−Thr−A
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−Arg−Lys−La1L−Law−Gin−Asp
−It g −M# t−8sr−Arg−Gin−G
in−Gly−Glu−85r−As?5−Gt 5−
GE、x−Ar g−Gl y−AL a−Arg −
Al a −Arg−La1L−NH2を有することが
見出された。
発明の概要
ヒトGRFの類似体である合成ポリペプチド(培養した
下垂体細胞からGHを放出させる)が今や合成されて試
験された。これらのペプチドは天然ホルモンの5位と2
6位の間に存在するアミノ酸残基と少なくとも4個のア
ミノ酸が相違している。また、これらのペプチドは1位
にTyr、D−Tyr%Met1Phe1D−Pん6、
Lmu%His およびD−Hisにれらの残基は場合
によりα−炭素原子またはα−アミノ基にメチル置換が
存在してもよい)から選択される残基をもつことができ
る。場合により、ペプチドは2位にD−Alaを、そし
て/筐た3位にD−Attp を有していてもよい。さ
らに好1しくは、ペプチドは27位のMa2O代わりに
La1L、N1gまたはNτGのような置換を有する。
下垂体細胞からGHを放出させる)が今や合成されて試
験された。これらのペプチドは天然ホルモンの5位と2
6位の間に存在するアミノ酸残基と少なくとも4個のア
ミノ酸が相違している。また、これらのペプチドは1位
にTyr、D−Tyr%Met1Phe1D−Pん6、
Lmu%His およびD−Hisにれらの残基は場合
によりα−炭素原子またはα−アミノ基にメチル置換が
存在してもよい)から選択される残基をもつことができ
る。場合により、ペプチドは2位にD−Alaを、そし
て/筐た3位にD−Attp を有していてもよい。さ
らに好1しくは、ペプチドは27位のMa2O代わりに
La1L、N1gまたはNτGのような置換を有する。
本発明による医薬組成物は、薬学的にまたは獣医学的に
受容される液体または固体のキャリアーに分散された、
約29個のアミノ酸残基から成る上記の類似体またはそ
れらのいずれかの無毒性塩を含有する。このような医薬
組成物はヒトおよび動物の臨床医学の分野において使用
され、治療または診断目的のために投与される。
受容される液体または固体のキャリアーに分散された、
約29個のアミノ酸残基から成る上記の類似体またはそ
れらのいずれかの無毒性塩を含有する。このような医薬
組成物はヒトおよび動物の臨床医学の分野において使用
され、治療または診断目的のために投与される。
発明の構成
ペプチドを定義するために用いる命名法はシュレーダー
(Schrodgr )およびリュプケCLsbke)
の“ザ・ペプチドアカデミツクプレス(1965)に明
記されるものであシ、その際慣用的表示に従ってN床端
のアミノ基は左に、そしてC末端のカルボキシル基は右
に表わされる。天然アミノ酸とはGly、Ala、Va
t、 Lgx、 IIs、Sar、 Thr、 Lys
、Arg、Asp、As%、Glx%Gln、 Cyt
t、Mgt、Phe、Tyr、Pro%TrpおよびH
is から成るタンパク質中に見出される普通の自然界
に存在するアミノ酸のうちの1種を意味する。Nlaは
ノルロイシンを意味し、Nvαはノルバリンを意味する
。アミノ酸残基が異性体を有する場合は、特に指定しな
い限り、表示されるアミノ酸の9体を意味する。
(Schrodgr )およびリュプケCLsbke)
の“ザ・ペプチドアカデミツクプレス(1965)に明
記されるものであシ、その際慣用的表示に従ってN床端
のアミノ基は左に、そしてC末端のカルボキシル基は右
に表わされる。天然アミノ酸とはGly、Ala、Va
t、 Lgx、 IIs、Sar、 Thr、 Lys
、Arg、Asp、As%、Glx%Gln、 Cyt
t、Mgt、Phe、Tyr、Pro%TrpおよびH
is から成るタンパク質中に見出される普通の自然界
に存在するアミノ酸のうちの1種を意味する。Nlaは
ノルロイシンを意味し、Nvαはノルバリンを意味する
。アミノ酸残基が異性体を有する場合は、特に指定しな
い限り、表示されるアミノ酸の9体を意味する。
本発明は次のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを提供
する: R1−R2−R3−Ala−R5ff6−4 RB−
Rg−R16R(1−R12−RI3−L g 5−R
I5− G l n−L # % R13−Rlg−R
26−41Lgu−Law−Gin−Glx R26−
R27−R23Arg−Y上記式中R1はTyr、 D
−Tyr%Afg t%Phg、D−Phe。
する: R1−R2−R3−Ala−R5ff6−4 RB−
Rg−R16R(1−R12−RI3−L g 5−R
I5− G l n−L # % R13−Rlg−R
26−41Lgu−Law−Gin−Glx R26−
R27−R23Arg−Y上記式中R1はTyr、 D
−Tyr%Afg t%Phg、D−Phe。
Law、HisまたはD−His(それぞれのアミノ酸
残基はCaMalたはN aAf g置換を有するか、
あるいは未置換である)であジ;R2はAla”tたは
D−Al4であシ;R8はAsplたはD−Aspであ
りeRsはIlgまたはLawで6り; R6はPhg
”iたはTyrであり;R7はEarlたはThτであ
ジ;R6は5eer、Asn、ThruたはGinであ
り;RQはAlasたはSgrであり:R+oはTyr
%PhgまたはLgsであり;Rt+はArg、01−
BまたはLysでるり;R12はArg、0rfLlた
はLgsであり;R13はlie%Lgu、 Phgま
たはVaLであり;R1,はGllまたはAlaであり
;RI8はAlaまたはSgr″″Cあり;RIQはS
et ’EたはAlaであり;R2oはArg%Own
またはLyeで1)’);R21はArg、Ornまた
はLysであす;R26はLaw、Jig、Valまた
はPheであり;R27はN1g、Nυαまたは天然ア
ミノ酸であり;R28はAla、Lax%Asn、 G
ln ”またはSurであり;そしてYはOHMたばN
H2でるる。但しR,、R6、R丁 ・R8%R9・R
Ilh RIlb RI2s 813m R1
5n 818% RIbR2゜、R2,およびR2B
を構成するアミノ酸残基のうち少なくとも4個は、天然
分子のそれぞれの位置に存在するアミノ酸残基と相異な
るものである。
残基はCaMalたはN aAf g置換を有するか、
あるいは未置換である)であジ;R2はAla”tたは
D−Al4であシ;R8はAsplたはD−Aspであ
りeRsはIlgまたはLawで6り; R6はPhg
”iたはTyrであり;R7はEarlたはThτであ
ジ;R6は5eer、Asn、ThruたはGinであ
り;RQはAlasたはSgrであり:R+oはTyr
%PhgまたはLgsであり;Rt+はArg、01−
BまたはLysでるり;R12はArg、0rfLlた
はLgsであり;R13はlie%Lgu、 Phgま
たはVaLであり;R1,はGllまたはAlaであり
;RI8はAlaまたはSgr″″Cあり;RIQはS
et ’EたはAlaであり;R2oはArg%Own
またはLyeで1)’);R21はArg、Ornまた
はLysであす;R26はLaw、Jig、Valまた
はPheであり;R27はN1g、Nυαまたは天然ア
ミノ酸であり;R28はAla、Lax%Asn、 G
ln ”またはSurであり;そしてYはOHMたばN
H2でるる。但しR,、R6、R丁 ・R8%R9・R
Ilh RIlb RI2s 813m R1
5n 818% RIbR2゜、R2,およびR2B
を構成するアミノ酸残基のうち少なくとも4個は、天然
分子のそれぞれの位置に存在するアミノ酸残基と相異な
るものである。
4個またはそれ以上のアミノ酸残基を置き換えることに
よって、たとえアミド化C床端が存在しなくても、増強
された生物学的効力を有する短縮された類似体を作り出
すことができると考えられる。
よって、たとえアミド化C床端が存在しなくても、増強
された生物学的効力を有する短縮された類似体を作り出
すことができると考えられる。
本ペプチドは排他的固相法、部分的固相法、フラグメン
ト縮合または基本的溶液カップリング法のような適当な
方法によって合成することができる。最近開発された組
換えDNA技術は、天然アミノ酸残基のみを含む類似体
の全部または一部を製造する際に使用しうる。例えば、
排他的同和合成法は“固相ペプチド合成C3olid−
Phase P#−ptidg 5ynthesis
)”、スチュワート(Stgwart)およびヤングC
Young )、フリーマン・アンド・カンパニー、サ
ンフランシスコ(1969)に記載されており、ベール
(Vatε)らの米国特許第4105603号(197
8年8月8日付)に例示されている。基本的浴液合成法
は“有機化学的方法(ハウペン−ペイル):ペプチド合
成(Methodan dar Organischg
n Chgmia (Hox−bgn−Wgyl )
: Synthgse van Peptides 〕
”、パンシュ(h:、 Wuns ah )編集、ゲオ
ルグ・テイーム・フエアラーグ、シュトウットガルト、
西ドイツ(1974)に詳述されている。フラグメント
縮合法は米国特許第3972859号(1976年8月
3日)に例示されている。その池の利用可能な合成法は
米国特許第3842067号(1974年10月15日
)および同第3862925号(1975年1月28日
)に例示されている。
ト縮合または基本的溶液カップリング法のような適当な
方法によって合成することができる。最近開発された組
換えDNA技術は、天然アミノ酸残基のみを含む類似体
の全部または一部を製造する際に使用しうる。例えば、
排他的同和合成法は“固相ペプチド合成C3olid−
Phase P#−ptidg 5ynthesis
)”、スチュワート(Stgwart)およびヤングC
Young )、フリーマン・アンド・カンパニー、サ
ンフランシスコ(1969)に記載されており、ベール
(Vatε)らの米国特許第4105603号(197
8年8月8日付)に例示されている。基本的浴液合成法
は“有機化学的方法(ハウペン−ペイル):ペプチド合
成(Methodan dar Organischg
n Chgmia (Hox−bgn−Wgyl )
: Synthgse van Peptides 〕
”、パンシュ(h:、 Wuns ah )編集、ゲオ
ルグ・テイーム・フエアラーグ、シュトウットガルト、
西ドイツ(1974)に詳述されている。フラグメント
縮合法は米国特許第3972859号(1976年8月
3日)に例示されている。その池の利用可能な合成法は
米国特許第3842067号(1974年10月15日
)および同第3862925号(1975年1月28日
)に例示されている。
種々のアミノ酸成分の不安定な側鎖基を適当な保護基(
その基が最終的に除去される壕で、その部位で化学反応
が起こるのを防ぐ)で保護することは、この種の化学合
成において一般的である。
その基が最終的に除去される壕で、その部位で化学反応
が起こるのを防ぐ)で保護することは、この種の化学合
成において一般的である。
また、アミノ酸や断片がカルボキシル基の部位で反応す
る間その物質のα−アミノ基を保護することも一般的で
あり、その後α−アミノ保護基を選択的に除去してその
位置で次の反応を行わせる。
る間その物質のα−アミノ基を保護することも一般的で
あり、その後α−アミノ保護基を選択的に除去してその
位置で次の反応を行わせる。
従って、合成の一段階として、ペプチド鎖中に意図する
配列で位置するアミノ酸残基を含み且つ適当なアミノ酸
残基に側鎖保護基を結合した中間体化合物が生成するこ
とは音速のことである。
配列で位置するアミノ酸残基を含み且つ適当なアミノ酸
残基に側鎖保護基を結合した中間体化合物が生成するこ
とは音速のことである。
次式で表わされる中間体は本発明の範囲に包含されると
考えられる: X’−R,(XiたはX2) R2−RsCX”)−
Ala−Rs−R,CX2) −R7CX’)−R8(
X”Eたはx”)−R0Cx’)−R,。(X2)−R
11(X6またはX7)−R,□(X6またはz7 )
4B−L#w R(5G1nCX5) Lgx−R
HBCX2) −Rlg(X’ ) −R2oCX’
またはX’ ) −R21(X6−またはX7)−La
w−Lgs−Gln(X5) Glu(1”)−R2
6−R27(X8)−R2,CX’またはXS) −A
r g CX6) −X”上記式中、XIは水素原子ま
たはα−アミノ保護基である。Xlに包含されるα−ア
ミノ保護基は、ポリペプチドの逐次合成の分野において
有用であると知られているものである。x′として使用
しうるα−アミン保護基の種類には(1)芳香族ウレタ
ン型保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニ
ル(FMOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)、お
よびp−クロルベンジルオキシカルボニル、p−ニトロ
ベンジルオキシカルボニルlj p−ブロムベンジルオ
キシカルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ルのような置換Z;(2)脂肪族ウレタン型保護基、例
えばt−ブチルオキシカルボニル(BOC)、ジイソプ
ロピルメチルオキシカルボニル、インプロピルオキシカ
ルボニル、エトキシカルボニル、およびアリルオキシカ
ルボニル;おヨヒ(3)シクロアルキルウレタン型保護
基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニル、おヨヒシクロへキシルオキシカ
ルボニル;が含でれる。好適なα−アミノ保護基は、た
とえN(:tMe−置換アミノ酸残基が1位に存在する
ときでも、BOCである。
考えられる: X’−R,(XiたはX2) R2−RsCX”)−
Ala−Rs−R,CX2) −R7CX’)−R8(
X”Eたはx”)−R0Cx’)−R,。(X2)−R
11(X6またはX7)−R,□(X6またはz7 )
4B−L#w R(5G1nCX5) Lgx−R
HBCX2) −Rlg(X’ ) −R2oCX’
またはX’ ) −R21(X6−またはX7)−La
w−Lgs−Gln(X5) Glu(1”)−R2
6−R27(X8)−R2,CX’またはXS) −A
r g CX6) −X”上記式中、XIは水素原子ま
たはα−アミノ保護基である。Xlに包含されるα−ア
ミノ保護基は、ポリペプチドの逐次合成の分野において
有用であると知られているものである。x′として使用
しうるα−アミン保護基の種類には(1)芳香族ウレタ
ン型保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニ
ル(FMOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)、お
よびp−クロルベンジルオキシカルボニル、p−ニトロ
ベンジルオキシカルボニルlj p−ブロムベンジルオ
キシカルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ルのような置換Z;(2)脂肪族ウレタン型保護基、例
えばt−ブチルオキシカルボニル(BOC)、ジイソプ
ロピルメチルオキシカルボニル、インプロピルオキシカ
ルボニル、エトキシカルボニル、およびアリルオキシカ
ルボニル;おヨヒ(3)シクロアルキルウレタン型保護
基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニル、おヨヒシクロへキシルオキシカ
ルボニル;が含でれる。好適なα−アミノ保護基は、た
とえN(:tMe−置換アミノ酸残基が1位に存在する
ときでも、BOCである。
Xは水素原子またはHisのイミダゾール窒素のための
保護基(例えばrom)である。
保護基(例えばrom)である。
X2はTyrのフェノール性ヒドロキシル基のための適
当な保護基であり、例えばテトラヒドロピラニル、t−
ブチル、トリチル、Ext、CBZ。
当な保護基であり、例えばテトラヒドロピラニル、t−
ブチル、トリチル、Ext、CBZ。
4Bτ−CEZおよび2,6−ジクロルベンジル(DC
B)である。−tfcx2は水素原子であってもよく、
この場合はその位置のアミノ酸残基に側鎖保護基が存在
しないことを意味する。
B)である。−tfcx2は水素原子であってもよく、
この場合はその位置のアミノ酸残基に側鎖保護基が存在
しないことを意味する。
X3は水素原子、もしくはAsplたはGhtのカルボ
キシル基のための適当なエステル形成保畿基、例、t
ハヘンジルC0Bzl)、 2.6−ジクロルベンジル
、メチルおよびエチルである。
キシル基のための適当なエステル形成保畿基、例、t
ハヘンジルC0Bzl)、 2.6−ジクロルベンジル
、メチルおよびエチルである。
X4はThr”またはSerのヒドロキシル基のための
適当な保護基であり、例えばアセチル、ベンゾイル、C
−ブチル、トリチル、テトラヒドロピラニル、 Ext
、 2 、6−ジクロルベンジルおよびCBZである。
適当な保護基であり、例えばアセチル、ベンゾイル、C
−ブチル、トリチル、テトラヒドロピラニル、 Ext
、 2 、6−ジクロルベンジルおよびCBZである。
好適な保護基はBzl″T:ある。X4は1だ水素原子
であってもよく、この場合はヒドロキシル基に保護基が
存在しないことを意味する。
であってもよく、この場合はヒドロキシル基に保護基が
存在しないことを意味する。
XSは水素原子、もしくはAsn″!!たはGinの側
鎖アミド基のための適当な保護基である。好ましくはそ
れはキサンチルCXan)である。
鎖アミド基のための適当な保護基である。好ましくはそ
れはキサンチルCXan)である。
X6はArgのグアニジノ基のための適当な保護基、例
えばニトロ、Tag、CBZ、アダマンチルオキシカル
ボニルおよびBOCであり、またX6は水素原子であり
うる。
えばニトロ、Tag、CBZ、アダマンチルオキシカル
ボニルおよびBOCであり、またX6は水素原子であり
うる。
X7は水素原子、もしくはLye”fたはOrnの側鎖
アミ7基のための適当な保護基である。適当な側鎖アミ
ノ保護基の例は2−クロルベンジルオキシカルボニル<
2−C1−Z)、romSt−アミルオキシカルボニル
およびBOCである。
アミ7基のための適当な保護基である。適当な側鎖アミ
ノ保護基の例は2−クロルベンジルオキシカルボニル<
2−C1−Z)、romSt−アミルオキシカルボニル
およびBOCである。
X3は水素原子、もしくは一般的に先に示した適当な側
鎖保護基である。
鎖保護基である。
Ahtは任意に酸素原子で保護しつるが、保護しない方
が好ましい。
が好ましい。
側鎖アミノ保護基の選択は、一般に合成中のα−アミン
保護基の除去の間(C除去されないものを選ぶというこ
とを除いて限定的でない。しかしながら、いくつかのア
ミノ酸例えばHisの場合はカップリング完了後に一般
に保護を必要とせず、従ってα−アミノ保護基と側鎖ア
ミン保護基は同じものでありうる。
保護基の除去の間(C除去されないものを選ぶというこ
とを除いて限定的でない。しかしながら、いくつかのア
ミノ酸例えばHisの場合はカップリング完了後に一般
に保護を必要とせず、従ってα−アミノ保護基と側鎖ア
ミン保護基は同じものでありうる。
XoはC末端カルボキシル基のための適当な保護基であ
るか、あるいは固体m型支持体へ結合するために固相合
成法において用いられる定着結合であるか、あるいはd
#s−X”であり、この場合C末端のArg残基はアミ
ド化される。固体の樹脂支持体を使用する場合、それは
1種の保護基でるると広く考えられ、例えば−〇−CH
2−街脂叉持体、−NH−ベンズヒドリルアミン(BH
A)樹脂支持体または−NHNバーメチルベンズヒドリ
ルアミン(MBHA)樹脂支持体のような当分野で知ら
れた適当なものが選ばれる。C末端が未置換アミドであ
るものを望む場合、樹脂からの切り離しが直接にアミド
を与えるのでBHAIたはMBHA樹脂を使用するのが
好ましい。
るか、あるいは固体m型支持体へ結合するために固相合
成法において用いられる定着結合であるか、あるいはd
#s−X”であり、この場合C末端のArg残基はアミ
ド化される。固体の樹脂支持体を使用する場合、それは
1種の保護基でるると広く考えられ、例えば−〇−CH
2−街脂叉持体、−NH−ベンズヒドリルアミン(BH
A)樹脂支持体または−NHNバーメチルベンズヒドリ
ルアミン(MBHA)樹脂支持体のような当分野で知ら
れた適当なものが選ばれる。C末端が未置換アミドであ
るものを望む場合、樹脂からの切り離しが直接にアミド
を与えるのでBHAIたはMBHA樹脂を使用するのが
好ましい。
中間体の上記式において、X基のうち少なくとも1つは
保護基であるか、あるいはX9が樹脂支持体を含む。従
って、本発明はまた (α)少なくとも1つの保護基を有する式(II)のペ
プチド中間体を製造し、 X’−R,CX”または、Y”)−R2−R,CX3)
−Al6−R,−R6CX”)−R,CX’)−R,C
X”fたはX” ’) −R,(X’ ) −R,、(
X”)−R,、(Z’−iたはX丁)−RltCX”ま
たはXフ)−R13−Law−RlB−G L %(X
” ) −Lax−Rlg(x2) −Rlw(Z’)
−R2aCX’MたはX’) −R2,(X’−1た
はX?)−LlにLaw−GlsCX’)−Glv、C
X3) R26−RnCX”)−R2,(X”!たは
X’)−Arg(X6)−X”(式中X、X1、X2、
X3、X4、X5、X6、X7およびXaはそれぞれ水
素原子または保護基であり、X9は保護基または樹脂支
持体への定着結合もしくはdos−X”である) (b) 式(II)の前記ペプチドから1つまたはそ
れ以上の保護基もしくは定着結合を切断し、そして(+
) Pgr望によシ、得られたペプチドをその無毒性
塩に転化する、 ことから成る目的とするペプチドの製造方法を提供する
。
保護基であるか、あるいはX9が樹脂支持体を含む。従
って、本発明はまた (α)少なくとも1つの保護基を有する式(II)のペ
プチド中間体を製造し、 X’−R,CX”または、Y”)−R2−R,CX3)
−Al6−R,−R6CX”)−R,CX’)−R,C
X”fたはX” ’) −R,(X’ ) −R,、(
X”)−R,、(Z’−iたはX丁)−RltCX”ま
たはXフ)−R13−Law−RlB−G L %(X
” ) −Lax−Rlg(x2) −Rlw(Z’)
−R2aCX’MたはX’) −R2,(X’−1た
はX?)−LlにLaw−GlsCX’)−Glv、C
X3) R26−RnCX”)−R2,(X”!たは
X’)−Arg(X6)−X”(式中X、X1、X2、
X3、X4、X5、X6、X7およびXaはそれぞれ水
素原子または保護基であり、X9は保護基または樹脂支
持体への定着結合もしくはdos−X”である) (b) 式(II)の前記ペプチドから1つまたはそ
れ以上の保護基もしくは定着結合を切断し、そして(+
) Pgr望によシ、得られたペプチドをその無毒性
塩に転化する、 ことから成る目的とするペプチドの製造方法を提供する
。
ペプチド合成において使用する個々の側鎖保護基を選択
する場合、次の一般規則に従う:すなわち(8)保護基
はカップリング条件下でその保護特性を保持して切断さ
れない;(b)保護基は試薬に対して安定であるべきで
あり、合成の各段階でα−アミノ保護基の除去のために
選ばれた反応条件下で、Xanヲ除いて、安定であるの
が好ましい;および(1)側鎖保護基は、意図するアミ
ノ酸配列を含む合成の完了時点に、ペプチド鎖を変性さ
せない反応条件下で除去できなければならない。
する場合、次の一般規則に従う:すなわち(8)保護基
はカップリング条件下でその保護特性を保持して切断さ
れない;(b)保護基は試薬に対して安定であるべきで
あり、合成の各段階でα−アミノ保護基の除去のために
選ばれた反応条件下で、Xanヲ除いて、安定であるの
が好ましい;および(1)側鎖保護基は、意図するアミ
ノ酸配列を含む合成の完了時点に、ペプチド鎖を変性さ
せない反応条件下で除去できなければならない。
本発明化合物は組換え1)HA技法によっても製造する
ことができる。それらの製造において、目的ペプチドを
コードするヌクレオチド配列はこの種の合成のための新
しい常用方法VCより製造される。これらの方法は一般
に目的とするコーディング配列とその相補的配列の両方
のフラグメントをコードするオリゴヌクレオチドの製造
をともなう。
ことができる。それらの製造において、目的ペプチドを
コードするヌクレオチド配列はこの種の合成のための新
しい常用方法VCより製造される。これらの方法は一般
に目的とするコーディング配列とその相補的配列の両方
のフラグメントをコードするオリゴヌクレオチドの製造
をともなう。
オリゴヌクレオチドはコーティング配列の1つのフラグ
メントと相補的配列の2つのフラグメントとの重な!l
l(オーバーラツプ)またはその逆の重なりが生じるよ
うにデザインされる。これらのオリゴヌクレオチドを対
合させて、最終的に目的とする遺伝子配列を得る。
メントと相補的配列の2つのフラグメントとの重な!l
l(オーバーラツプ)またはその逆の重なりが生じるよ
うにデザインされる。これらのオリゴヌクレオチドを対
合させて、最終的に目的とする遺伝子配列を得る。
この遺伝子配列はそれがコードするペプチド産物を発現
しつるクローニングベクターの一定の箇所へ挿入される
。適当なりローニングベクターは遺伝子の発現を調節す
る調節配列を少なくとも一部包含する。
しつるクローニングベクターの一定の箇所へ挿入される
。適当なりローニングベクターは遺伝子の発現を調節す
る調節配列を少なくとも一部包含する。
代表的な発現順4節配列は5つの要素によって説明され
る。これらの要素はそれらが遺伝子系に現われる順序で
次の通りである: (α)プロモーター領域; (6)5’非翻訳領域; (c)タンパク質のコーディング配列;(d)3’非翻
訳領域; (1) 転写終結部位。
る。これらの要素はそれらが遺伝子系に現われる順序で
次の通りである: (α)プロモーター領域; (6)5’非翻訳領域; (c)タンパク質のコーディング配列;(d)3’非翻
訳領域; (1) 転写終結部位。
遺伝子系におけるこれらの要素のそれぞれの機能はよく
理解されている。プロモーター領域はメツセンシャーR
N A (mRNA )生産(転写)の開始を仲介する
。プロモーターは(1)外部からの調節を受けない(構
成的である)か、(2)もし存在する場合には遺伝子機
能を抑制する物質、リプレッサーの制御下にあるか、あ
るいは(3)遺伝子機能を誘起するのに必要な物質、イ
ンデューサーの制御下にあり得る。例えば大腸菌(E、
coti) 由来の外層膜リポタンパク質<tpp)
遺伝子は外部からの調節を受けず、それにより”構成的
である(cons−t□tst ivy ) ’ と
称される。
理解されている。プロモーター領域はメツセンシャーR
N A (mRNA )生産(転写)の開始を仲介する
。プロモーターは(1)外部からの調節を受けない(構
成的である)か、(2)もし存在する場合には遺伝子機
能を抑制する物質、リプレッサーの制御下にあるか、あ
るいは(3)遺伝子機能を誘起するのに必要な物質、イ
ンデューサーの制御下にあり得る。例えば大腸菌(E、
coti) 由来の外層膜リポタンパク質<tpp)
遺伝子は外部からの調節を受けず、それにより”構成的
である(cons−t□tst ivy ) ’ と
称される。
プロモーターのところにまたはその近くに“転写開始部
位″が存在し、その部位でRNAポリメラーゼはm R
N Aの転写を開始する。ひとたび転写が開始されると
、m RN Aが生産される。得られるm RN Aの
構造は上記の遺伝子要素(6)〜(d)のDNA配列に
よって決定される。
位″が存在し、その部位でRNAポリメラーゼはm R
N Aの転写を開始する。ひとたび転写が開始されると
、m RN Aが生産される。得られるm RN Aの
構造は上記の遺伝子要素(6)〜(d)のDNA配列に
よって決定される。
得られろm RN Aはタンパク質産物へ翻訳しうる配
列を保有する。その翻訳可能な配列は5′非翻訳領域か
ら下流で3′非翻訳領域から上流に位置する。翻訳はリ
ポソーム結合部位として知られるm RN Aの5′非
翻訳領域中の配列VCIJボンームが結合することによ
って仲介され、生産物遺伝子配列の第一コトンとして存
在し且つアミノ酸メチオニン(Afst)をコードする
翻訳開始コドン(AUG )から開始される。翻訳は翻
訳領域の終りに存在する1つまたはそれ以上の終止コド
ンで終了する。
列を保有する。その翻訳可能な配列は5′非翻訳領域か
ら下流で3′非翻訳領域から上流に位置する。翻訳はリ
ポソーム結合部位として知られるm RN Aの5′非
翻訳領域中の配列VCIJボンームが結合することによ
って仲介され、生産物遺伝子配列の第一コトンとして存
在し且つアミノ酸メチオニン(Afst)をコードする
翻訳開始コドン(AUG )から開始される。翻訳は翻
訳領域の終りに存在する1つまたはそれ以上の終止コド
ンで終了する。
組換えDNA技法を用いて、発現調節配列すなわち構造
遺伝子に遺伝子工学的に結合されたとき構造遺伝子(外
因性タンパク質を生産する)の発現を制御し且つ調節す
るヌクレオチド配列をクローニングベクター内に挿入す
ることにより、選択された外米性(外因性)タンパク質
の生産に有用なりローニングベクターを作成することが
可能になった。
遺伝子に遺伝子工学的に結合されたとき構造遺伝子(外
因性タンパク質を生産する)の発現を制御し且つ調節す
るヌクレオチド配列をクローニングベクター内に挿入す
ることにより、選択された外米性(外因性)タンパク質
の生産に有用なりローニングベクターを作成することが
可能になった。
上記のことに関連して、1発現調節配列”という用語は
上記の要素(α)、(b)、(−および(e)を含む。
上記の要素(α)、(b)、(−および(e)を含む。
組換えDNA法は本発明化合物を比較的大きな“ハイブ
リッド”分子の一部としてまた直接発現によって発現さ
せるために使用しつる。直接発現法では、クローニング
ベクターは発現生産物がメチオニン残基(不可欠の開始
コドンが存在することによる)によって先行される目的
生産物それ自体であるようにデザインされる。余分のM
e を残基は生産物を臭化シアンで処理するか、または
フェニルインチオシアネートと反応させその後にトリフ
ルオル酢酸のような無水強酸で処理することにより除去
できる。
リッド”分子の一部としてまた直接発現によって発現さ
せるために使用しつる。直接発現法では、クローニング
ベクターは発現生産物がメチオニン残基(不可欠の開始
コドンが存在することによる)によって先行される目的
生産物それ自体であるようにデザインされる。余分のM
e を残基は生産物を臭化シアンで処理するか、または
フェニルインチオシアネートと反応させその後にトリフ
ルオル酢酸のような無水強酸で処理することにより除去
できる。
ハイブリッド分子発現法では、目的生産物をコードする
DNA配列はクローニングベクターの発現調節配列内の
、発現生産物がハイブリッドタンパク質となるような箇
所に挿入される。本明細沓で用いる“ハイブリッドタン
パク質”とは組換えDNA産物が外米性タンパク質と、
その目的タンパク質に結合した発現調節配列によって生
産される天然(内因性)タンパク質(例えばリポタンパ
ク質遺伝子からのりボタンバク質)とから成ることを意
味している。
DNA配列はクローニングベクターの発現調節配列内の
、発現生産物がハイブリッドタンパク質となるような箇
所に挿入される。本明細沓で用いる“ハイブリッドタン
パク質”とは組換えDNA産物が外米性タンパク質と、
その目的タンパク質に結合した発現調節配列によって生
産される天然(内因性)タンパク質(例えばリポタンパ
ク質遺伝子からのりボタンバク質)とから成ることを意
味している。
組換えDNA法によって生産され、適切にデザインされ
たハイブリッドタンパク質は、内因性タンパク質部分と
目的生産物の連結箇所に切断部位を含むだろう。この切
断部位はハイブリッドタンパク質産物を化学的または酵
素的に処理することによって成熟生産物の生成を可能に
する。非常に有用な選択的切断部位は、C末端で化学的
にまたは酵素的に切断しつるアミノ酸もしくはアミノ酸
配列をコニドするDNA配列から成る。
たハイブリッドタンパク質は、内因性タンパク質部分と
目的生産物の連結箇所に切断部位を含むだろう。この切
断部位はハイブリッドタンパク質産物を化学的または酵
素的に処理することによって成熟生産物の生成を可能に
する。非常に有用な選択的切断部位は、C末端で化学的
にまたは酵素的に切断しつるアミノ酸もしくはアミノ酸
配列をコニドするDNA配列から成る。
タンパク質を切断するのに有用な化学薬剤の例H臭化シ
アン、ENPS−スヵトール、ヒドロキシルアミンなど
である。臭化シアンはメチオニン残基のC末端でタンパ
ク質を切断する。従って、選択的切断部位はメチオニン
残基それ自体に存在する。
アン、ENPS−スヵトール、ヒドロキシルアミンなど
である。臭化シアンはメチオニン残基のC末端でタンパ
ク質を切断する。従って、選択的切断部位はメチオニン
残基それ自体に存在する。
ヒドロキシルアミンは成分−Asn−Q (ここでQ
FiGly、LttwまたはAlaである)のC末端で
切断する。
FiGly、LttwまたはAlaである)のC末端で
切断する。
BNPS−スカトールはトリプトファン残基のC末端で
切断する。
切断する。
切断に有用な酵素薬剤の例はトリプシン、パパイン、ペ
プシン、プラスミン、トロンビン、エンテロキナーゼな
どである。各酵素はそれが認識する特定のアミノ酸配列
の箇所でタンパク質を切断する。
プシン、プラスミン、トロンビン、エンテロキナーゼな
どである。各酵素はそれが認識する特定のアミノ酸配列
の箇所でタンパク質を切断する。
好適な酵素はエンテロキナーゼである。従って好適な選
択的切断部位はエンテロキナーゼが認識するもの、すな
わちアミノ酸配列−(Asp)i−Lys−(ここでn
は2〜4の整数である)をコードするDNA配列である
。
択的切断部位はエンテロキナーゼが認識するもの、すな
わちアミノ酸配列−(Asp)i−Lys−(ここでn
は2〜4の整数である)をコードするDNA配列である
。
最も好ましい選択的切断部位は、本発明化合物が有利に
はメチオニンを含まないので、メチオニン残基である。
はメチオニンを含まないので、メチオニン残基である。
目的生産物のN末端に結合されたこの残基は臭化シアン
を用いる既知方法によって容易に切断されて、目的とす
る成熟生産物を生成する。
を用いる既知方法によって容易に切断されて、目的とす
る成熟生産物を生成する。
ある種の真核細胞(例えば酵母や哺乳動物細胞)は比較
的大きな前駆体分子を合成することによって、小さな4
プチドを生産するOとができる。これらの細胞は目的の
ペプチドをその前駆体から明確な切断部位で分離しつる
高度に特異的な酵素を含む。対になった塩基性アミノ酸
残基は最も明確なタンパク質分解プロセッシング部位で
ある。こ(7)itのプロセッシング部位の他の例はア
ミノ酸Glu−AlaまたはAsp−Alaである。大
部分の視床下部〈ブチドおよび若干の下垂体ペプチドは
この方法で生産される。真核生物による小さなペプチド
の生産の他の例は、小さな4プチドの接合フェロモンで
ある酵母のアルファ因子またはα因子である。
的大きな前駆体分子を合成することによって、小さな4
プチドを生産するOとができる。これらの細胞は目的の
ペプチドをその前駆体から明確な切断部位で分離しつる
高度に特異的な酵素を含む。対になった塩基性アミノ酸
残基は最も明確なタンパク質分解プロセッシング部位で
ある。こ(7)itのプロセッシング部位の他の例はア
ミノ酸Glu−AlaまたはAsp−Alaである。大
部分の視床下部〈ブチドおよび若干の下垂体ペプチドは
この方法で生産される。真核生物による小さなペプチド
の生産の他の例は、小さな4プチドの接合フェロモンで
ある酵母のアルファ因子またはα因子である。
合成GRF類似体をコードするDNA配列を、この種の
タンパク質をコードする配列の前駆体部分(しばしばプ
レープロセグメントと呼ばれる)に、それらの通常のタ
ンパク質分解プロセッシング部位の下流でしかもそれに
すぐ隣接して結合することは可能であるだろう。Cのよ
うな発現単位から成るプラスミドを保育する真核細胞の
培養物は、宿主細胞の遺伝子の一般的発現機構を用いて
目的とする前駆体−ペプチド分子を生産することができ
るだろう。さらに、通常の細胞過程は前駆体分子から目
的生産物を正確に切り離すであろう。
タンパク質をコードする配列の前駆体部分(しばしばプ
レープロセグメントと呼ばれる)に、それらの通常のタ
ンパク質分解プロセッシング部位の下流でしかもそれに
すぐ隣接して結合することは可能であるだろう。Cのよ
うな発現単位から成るプラスミドを保育する真核細胞の
培養物は、宿主細胞の遺伝子の一般的発現機構を用いて
目的とする前駆体−ペプチド分子を生産することができ
るだろう。さらに、通常の細胞過程は前駆体分子から目
的生産物を正確に切り離すであろう。
有用なりローニングベクターを作成する場合に、いくつ
かの要素が必要である。必要な要素のうち2つは全ての
有用なりローニングベクターに共通している。第一に、
ベクターは機能的な複製開始点を含むDNAセグメント
(レプリコン)をもたねばならない。プラスミドおよび
ファージDNAは、それらのまさに本性により、宿主細
胞内での複製を容易にするレプリコンを含有している。
かの要素が必要である。必要な要素のうち2つは全ての
有用なりローニングベクターに共通している。第一に、
ベクターは機能的な複製開始点を含むDNAセグメント
(レプリコン)をもたねばならない。プラスミドおよび
ファージDNAは、それらのまさに本性により、宿主細
胞内での複製を容易にするレプリコンを含有している。
第二に、ベクターは形質転換細胞を非形質転換細胞から
選択するのに有用な性質を形質転換可能な宿主細胞に伝
えるDNAセグメントをもたねばならない。広範囲の性
質のどれもが選択目的のために使用し得る。最も普通に
用いられる性質の1つは抗生物質耐性、例えば大腸菌の
形質転換におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシ
リン耐性である。また、栄養要求変異株の、この種の欠
損を治療しつる野性型遺伝子のプラスミドコピーによる
相補性も一般に用いられる。
選択するのに有用な性質を形質転換可能な宿主細胞に伝
えるDNAセグメントをもたねばならない。広範囲の性
質のどれもが選択目的のために使用し得る。最も普通に
用いられる性質の1つは抗生物質耐性、例えば大腸菌の
形質転換におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシ
リン耐性である。また、栄養要求変異株の、この種の欠
損を治療しつる野性型遺伝子のプラスミドコピーによる
相補性も一般に用いられる。
上記の2つの要素は容易に利用しつる認知されたクロー
ニングベクター中におおむね存在する。
ニングベクター中におおむね存在する。
適当なりローニングベクターの例は細菌プラスミド(例
えばpBR322、pMB 9、Co1E1、pCRl
を含めた太腸菌白米のプラスミド);広い宿主域のプラ
スミド(EP4を含む);ファージDNA(例えばλフ
アージDNA)などである。上記の認知されたベクター
のうち全部でないにしても大部分が前記の2つの要素を
すでに保有している。
えばpBR322、pMB 9、Co1E1、pCRl
を含めた太腸菌白米のプラスミド);広い宿主域のプラ
スミド(EP4を含む);ファージDNA(例えばλフ
アージDNA)などである。上記の認知されたベクター
のうち全部でないにしても大部分が前記の2つの要素を
すでに保有している。
第三の要素は発現調節配列である。例えばリポタンパク
質遺伝子、β−ガラクト7ダーゼ遺伝子、トリプトファ
ン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ファージラムダに
白米するものを含めた広範囲のこの種の調節配列が使用
される。
質遺伝子、β−ガラクト7ダーゼ遺伝子、トリプトファ
ン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ファージラムダに
白米するものを含めた広範囲のこの種の調節配列が使用
される。
選択された発現調節配列を挿入することによる適当なり
ローニングベクターの作成VCは、常用方法が使用され
る。クローニングベクター内に種々の部位が存在し、そ
の部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いてベク
ターの切断が行われる。
ローニングベクターの作成VCは、常用方法が使用され
る。クローニングベクター内に種々の部位が存在し、そ
の部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いてベク
ターの切断が行われる。
Cれらの部位のどれも発現調節配列の挿入のために選択
されうる。1つの例として、よく認知され且つ実証され
ているpER322の場合は、いくつかの適当な制限部
位が存在し、これらの部位のどれもが挿入部位として使
用される。PSt1部位はβ−ラクタマーゼ遺伝子の中
に位置する。EC0R1とPvu■は一定のコーティン
グ領域の外側に存在する。これらおよびその他の部位は
当分野で習熟した者により十分認識されている。
されうる。1つの例として、よく認知され且つ実証され
ているpER322の場合は、いくつかの適当な制限部
位が存在し、これらの部位のどれもが挿入部位として使
用される。PSt1部位はβ−ラクタマーゼ遺伝子の中
に位置する。EC0R1とPvu■は一定のコーティン
グ領域の外側に存在する。これらおよびその他の部位は
当分野で習熟した者により十分認識されている。
本発明によって定められたベクターを作成する場合、こ
れらの部位または他の部位のどれかを利用するOとによ
って、発現調節配列またはその不可欠部分を容易に挿入
することができる。
れらの部位または他の部位のどれかを利用するOとによ
って、発現調節配列またはその不可欠部分を容易に挿入
することができる。
第四の要素はもちろん目的生産物をコードするn #
A rrt列である。先に述べたように、このDNA配
列は認知されたホスホトリエステル法または他のよく昶
らnた方法を用いて合成的に作成される。
A rrt列である。先に述べたように、このDNA配
列は認知されたホスホトリエステル法または他のよく昶
らnた方法を用いて合成的に作成される。
適当な勾−ニングベクターは広範囲の宿主微生物、例え
ば大腸菌(Escherichia coli)、 セ
ラチア(5erratia )、シュードモナス(Ps
eudo−monα8)のようなダラム陰性原核生物;
バシラス(Eaci l lus )、ストレプトマイ
セス(Streptornyces)のようなグラム陽
性原核生物;およびサツカロミセス(Saccharo
myces)のような真核生物において使用できる。宿
主微生物がダラム陰性原核生物である場合は、大腸菌に
一12株(例えばRV308)のような大腸菌が好適で
ある。
ば大腸菌(Escherichia coli)、 セ
ラチア(5erratia )、シュードモナス(Ps
eudo−monα8)のようなダラム陰性原核生物;
バシラス(Eaci l lus )、ストレプトマイ
セス(Streptornyces)のようなグラム陽
性原核生物;およびサツカロミセス(Saccharo
myces)のような真核生物において使用できる。宿
主微生物がダラム陰性原核生物である場合は、大腸菌に
一12株(例えばRV308)のような大腸菌が好適で
ある。
よく認知された方法を用いて、適切に作成されたクロー
ニングベクターで適当な宿主微生物を形質転換し、その
微生物内でクローニングベクターを増幅し、そして標準
発酵条件を用いて外因性タンパク質産物を発現させる。
ニングベクターで適当な宿主微生物を形質転換し、その
微生物内でクローニングベクターを増幅し、そして標準
発酵条件を用いて外因性タンパク質産物を発現させる。
その外因性タンパク質産物は得られた発酵培地から慣用
方法で単離しつる。
方法で単離しつる。
Met切断部位を含む前駆体から生産物を分離する一般
方法は、生産物含有細胞の凍結乾燥を含む。
方法は、生産物含有細胞の凍結乾燥を含む。
70%(9/V)蟻酸1リツトルに凍結乾燥した発酵固
体10ダラムを加える。溶解後(約60分後)、その溶
液は臭化シアン10.6ダラムを添加することによりO
,l Mの臭化シアン濃度へ調整する。目的左するアミ
ン末端生産物への定量的4プチド切断は23℃において
約8時間で完了する。蟻暇な真空蒸発により除去し、切
断した発酵固体は凍結乾燥する。その固体を10%(v
/υ)酢酸中に10グラム/リツトルで溶解し、G−5
0超微細セフアデツクスカラム(2,6x 100cm
)のカラム容積の5%に4°C15cm/時間の流速で
装填する。均一精製は0.46X25cInのシーパッ
クス(ZOr b(LZ ) CB カラムでの逆相に
より、アセトニトリル/ 0.1 Mリン酸アンモニウ
ム(pH7,2)の直線状勾配を用いて達成される。目
的生産物は0.01f重炭酸アンモニウム(pH8,5
)中のセファデックスG−25で脱塩し、凍結乾燥する
。
体10ダラムを加える。溶解後(約60分後)、その溶
液は臭化シアン10.6ダラムを添加することによりO
,l Mの臭化シアン濃度へ調整する。目的左するアミ
ン末端生産物への定量的4プチド切断は23℃において
約8時間で完了する。蟻暇な真空蒸発により除去し、切
断した発酵固体は凍結乾燥する。その固体を10%(v
/υ)酢酸中に10グラム/リツトルで溶解し、G−5
0超微細セフアデツクスカラム(2,6x 100cm
)のカラム容積の5%に4°C15cm/時間の流速で
装填する。均一精製は0.46X25cInのシーパッ
クス(ZOr b(LZ ) CB カラムでの逆相に
より、アセトニトリル/ 0.1 Mリン酸アンモニウ
ム(pH7,2)の直線状勾配を用いて達成される。目
的生産物は0.01f重炭酸アンモニウム(pH8,5
)中のセファデックスG−25で脱塩し、凍結乾燥する
。
被ブチドが組換えDNA技法を用いないで製造される場
合、それらは好ましくはメリーフィールド(Merri
field)のJ、Am、Chem、Soc、、85
+ p。
合、それらは好ましくはメリーフィールド(Merri
field)のJ、Am、Chem、Soc、、85
+ p。
2149、(1963)に一般的に記述さnるような固
相合成法を用いて製造される。しかし、先に述べたよう
に当分野で知られた他の同様の化学合成法も使用しつる
。固相合成法は保護したα−アミノ酸を適当な樹脂にカ
ップリングすることによって、ペプチドのC末端から開
始される。このような出発物質はα−アミノ保護アミノ
酸をクロルメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂へ
エステル結合によって結合するか、あるいはEHA樹脂
またはMBHA樹脂ヘアミド結合することによって製造
しつる。ヒドロキシメチル樹脂の製法はボダンスキー(
Bodaosk’/)らのChern、Ind、(o
ンドン)38.1597〜1598(1966)に開示
されている。クロルメチル化樹脂はカリフォルニア州す
ッチモンドのバイオラッド研究所(Bi 。
相合成法を用いて製造される。しかし、先に述べたよう
に当分野で知られた他の同様の化学合成法も使用しつる
。固相合成法は保護したα−アミノ酸を適当な樹脂にカ
ップリングすることによって、ペプチドのC末端から開
始される。このような出発物質はα−アミノ保護アミノ
酸をクロルメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂へ
エステル結合によって結合するか、あるいはEHA樹脂
またはMBHA樹脂ヘアミド結合することによって製造
しつる。ヒドロキシメチル樹脂の製法はボダンスキー(
Bodaosk’/)らのChern、Ind、(o
ンドン)38.1597〜1598(1966)に開示
されている。クロルメチル化樹脂はカリフォルニア州す
ッチモンドのバイオラッド研究所(Bi 。
Rad Labora、tories)およびラブシス
テムズ社(Lab、Systems、Inc、)から市
販されている。この種の樹脂の製法はスチュワート(S
tewart) ラの”固相(ブチド合成(Solid
Phase PeptideSynthesis)”
(1984イリノイ州ロツクフオード、ピアスケミ
カル社)第1章8〜9頁に開示さnている。EHAおよ
びMEHA樹脂叉待体は市販されているが、一般に合成
しようとする目的ポリ−°プチドがそのC末端に未置換
アミド基をもつときにだけ使用される。
テムズ社(Lab、Systems、Inc、)から市
販されている。この種の樹脂の製法はスチュワート(S
tewart) ラの”固相(ブチド合成(Solid
Phase PeptideSynthesis)”
(1984イリノイ州ロツクフオード、ピアスケミ
カル社)第1章8〜9頁に開示さnている。EHAおよ
びMEHA樹脂叉待体は市販されているが、一般に合成
しようとする目的ポリ−°プチドがそのC末端に未置換
アミド基をもつときにだけ使用される。
C床端アミノ酸、すなわちBOCおよびTosで保護さ
れたArg はまずクロルメチル化樹脂もしくはBH
AまたばMEHA 樹脂へ以下で述べるようにカップリ
ングされる。EOC−保護アミノ酸の樹脂支持体へのカ
ップリング後、例えば塩化メチレン中のトリフルオル酢
酸(TFA)またはTFA単独を用いてα−アミノ保護
基を除去する。保護基の除去は約0℃から室温までの温
度で行われる。
れたArg はまずクロルメチル化樹脂もしくはBH
AまたばMEHA 樹脂へ以下で述べるようにカップリ
ングされる。EOC−保護アミノ酸の樹脂支持体へのカ
ップリング後、例えば塩化メチレン中のトリフルオル酢
酸(TFA)またはTFA単独を用いてα−アミノ保護
基を除去する。保護基の除去は約0℃から室温までの温
度で行われる。
他の標準的な切断試薬(例えばジオキサン中のMCI)
、および特定のα−アミノ保護基の除去粂件もシュレー
ダー澄すュプケの“ザ・ペプチド”、1 、p72〜7
5(アカデミツクプレス、 1965 )に示さ1上る
ように使用しうる。
、および特定のα−アミノ保護基の除去粂件もシュレー
ダー澄すュプケの“ザ・ペプチド”、1 、p72〜7
5(アカデミツクプレス、 1965 )に示さ1上る
ように使用しうる。
α−アミン保護基の除去後、残りのα−アミノ−および
側鎖−保護アミノ酸を意図する順序で段階的にカップリ
ングさせて、先に定義した中間体化合物を得る。あるい
は各アミノ酸を別個に反応器へ加える代わりに、若干の
アミノ酸を互いにカップリングさせてから固相反応器へ
添加してもよい。適当なカップリング試薬の選択は当分
野の技術の範囲内である。カンプリング試薬として特に
適しているものはN 、 N’−ジシクロへキシルカル
ボジイミド(DCCI)である。
側鎖−保護アミノ酸を意図する順序で段階的にカップリ
ングさせて、先に定義した中間体化合物を得る。あるい
は各アミノ酸を別個に反応器へ加える代わりに、若干の
アミノ酸を互いにカップリングさせてから固相反応器へ
添加してもよい。適当なカップリング試薬の選択は当分
野の技術の範囲内である。カンプリング試薬として特に
適しているものはN 、 N’−ジシクロへキシルカル
ボジイミド(DCCI)である。
4ブチドの固相合成に用いられる活性化試薬はペプチド
の分野においてよく知られている。適当な活性化試薬の
例はカルボジイミド類、例えばN 、 N’−ジイソプ
ロピルカルボジイミドおよびN−エチル−N’−(3−
ジメチルアミンプロピル)カルボジイミドである。その
他の活性化試薬ならびにペプチドカップリングにおける
それらの使用はシュレーダー澄すュプケの上記文献、第
■章およびカブ−k (Kapoor)のJ、Pんar
、sci、、59 r11〜27(1970)に開示さ
れている。
の分野においてよく知られている。適当な活性化試薬の
例はカルボジイミド類、例えばN 、 N’−ジイソプ
ロピルカルボジイミドおよびN−エチル−N’−(3−
ジメチルアミンプロピル)カルボジイミドである。その
他の活性化試薬ならびにペプチドカップリングにおける
それらの使用はシュレーダー澄すュプケの上記文献、第
■章およびカブ−k (Kapoor)のJ、Pんar
、sci、、59 r11〜27(1970)に開示さ
れている。
それぞれの保護アミノ酸またはアミノ酸配列は大体4倍
以上の過剰量で固相反応器へ導入され、カップリンク反
応はジメチルホルムアミド(DMF ) : CHxC
8t (1’ l )の混合媒体中で、あるいはDMF
またはcg、cI32阜独中で行われる。不完全なカッ
プリングが起こった場合は、α−アミノ保a基を除去す
る前にそのカップリング反応を繰り返し、その後次のア
ミノ酸をカップリングさせる。合成の各段階でのカップ
リング反応の成就は、もしその合成が手動で行われるな
ら、カイザー (E、gaisttr )らのAnal
、Eiochem、 34 r595(1970)に
記載されるようなニンヒドリン反応で監視するのが好ま
しい。カップリング反応は自動的に、例えばペックマン
990自動合成機で、リビエール(Rivier)らの
Eiopo lymers 。
以上の過剰量で固相反応器へ導入され、カップリンク反
応はジメチルホルムアミド(DMF ) : CHxC
8t (1’ l )の混合媒体中で、あるいはDMF
またはcg、cI32阜独中で行われる。不完全なカッ
プリングが起こった場合は、α−アミノ保a基を除去す
る前にそのカップリング反応を繰り返し、その後次のア
ミノ酸をカップリングさせる。合成の各段階でのカップ
リング反応の成就は、もしその合成が手動で行われるな
ら、カイザー (E、gaisttr )らのAnal
、Eiochem、 34 r595(1970)に
記載されるようなニンヒドリン反応で監視するのが好ま
しい。カップリング反応は自動的に、例えばペックマン
990自動合成機で、リビエール(Rivier)らの
Eiopo lymers 。
1978.17.p1927〜1938に報告されるよ
うなプログラムを用いて行うことができる。
うなプログラムを用いて行うことができる。
意図するアミノ酸配列が完了した後、液状フッ化水素の
ような試薬で処理して中間体積ブチドを樹脂支持体から
切り離す。その際液状フッ化水素はペプチドを樹脂から
切り離すばかりでなく、残っている全ての側鎖保護基X
、 X’、X3、X4、X5、X6X7およびX8な
らびにもし使用するlらα−アミノ保護基X1をも切断
してアミド化4ブチドをもたらす。配列中にMetが存
在する場合には、4ブチドを樹脂からHFで切り離す前
にまずトリフルオル酸[(TFA)/エタンジチオール
を用いてEOC保護基を除去し、それにより起こりうる
S−アルキル化を排除することが好ましい。切断のため
にフッ化水素を使用する際には、スカベンジャーとして
アニソールやメチルエチルスルフィドを反応容器に加え
る。
ような試薬で処理して中間体積ブチドを樹脂支持体から
切り離す。その際液状フッ化水素はペプチドを樹脂から
切り離すばかりでなく、残っている全ての側鎖保護基X
、 X’、X3、X4、X5、X6X7およびX8な
らびにもし使用するlらα−アミノ保護基X1をも切断
してアミド化4ブチドをもたらす。配列中にMetが存
在する場合には、4ブチドを樹脂からHFで切り離す前
にまずトリフルオル酸[(TFA)/エタンジチオール
を用いてEOC保護基を除去し、それにより起こりうる
S−アルキル化を排除することが好ましい。切断のため
にフッ化水素を使用する際には、スカベンジャーとして
アニソールやメチルエチルスルフィドを反応容器に加え
る。
実施例!は固相法による好適なアミド化ペプチドの好適
な合成法を示している。様々な長さの対応するペプチド
が単にペプチド鎖の各末端で必要数のアミノ酸を付加す
るかまたは排除することにより、同じ方法で合成し得る
。しかしながら、目下のところ生物学的に活性な類似体
はN末端から残基z7までの明示したアミノ酸配列また
は均等物を含有すると考えられる。
な合成法を示している。様々な長さの対応するペプチド
が単にペプチド鎖の各末端で必要数のアミノ酸を付加す
るかまたは排除することにより、同じ方法で合成し得る
。しかしながら、目下のところ生物学的に活性な類似体
はN末端から残基z7までの明示したアミノ酸配列また
は均等物を含有すると考えられる。
実施例I
次式:
%式%
Lett−Gln−Glu−Leu−Leu−Ala−
Arg−NH2で表わされるペプチド(Ser7山I1
1 、.1 l αQ+I!Id8+28゜Arg””
rLeu13”27) −hGRF(1−29)−M
H2の合成は、ベックマン990−!!ブチド合成機を
使って、置換範囲が約0.35〜0.5ミ!Jモル/g
樹脂のMBHA樹脂上で段階的方法により行った。
Arg−NH2で表わされるペプチド(Ser7山I1
1 、.1 l αQ+I!Id8+28゜Arg””
rLeu13”27) −hGRF(1−29)−M
H2の合成は、ベックマン990−!!ブチド合成機を
使って、置換範囲が約0.35〜0.5ミ!Jモル/g
樹脂のMBHA樹脂上で段階的方法により行った。
BOC−Arg(Tos)の樹脂へのカップリングはベ
ール(Vale)の米国特許第4292313号に記載
される一般方法により、DMF中のKFを用いて撹拌下
約60℃で24時間実施した。この反応は衡脂1.g当
たりArgtJo、 35 ミ’)モルの置換をもたら
した。
ール(Vale)の米国特許第4292313号に記載
される一般方法により、DMF中のKFを用いて撹拌下
約60℃で24時間実施した。この反応は衡脂1.g当
たりArgtJo、 35 ミ’)モルの置換をもたら
した。
保護基を除去して中和した後、ペプチド鎖を樹脂上に一
段ずつ付加していった。保護基の除去、中和および各ア
ミノ酸の付加は一般にリビエール2986〜2992(
1974)に詳述される方法に便って行った。使用する
全ての溶削は不活性ガス(例えばヘリウムや窒素)を散
布するCとによって注意してガス抜きし、酸素を確実に
除いた。
段ずつ付加していった。保護基の除去、中和および各ア
ミノ酸の付加は一般にリビエール2986〜2992(
1974)に詳述される方法に便って行った。使用する
全ての溶削は不活性ガス(例えばヘリウムや窒素)を散
布するCとによって注意してガス抜きし、酸素を確実に
除いた。
保護基の除去は好ましくはスケジュールAに従って行っ
た: スケジュールA 1、60チTFA/2チエタンジチオール 102、
60チTFA/2チエタンジチオール 153、
1PA/L%エタンジチオール 0.54、
CH,C1,中のEt3N(10チ)0.55、 M
g0H015 6、CH2Cl、中のA’ LsN (10チ)0.5
7、MaOHC2回)0.5 8、 CH2Cl2(2回)0.5 カツプリングは好1しくはスケジュールBに記載される
ように行った: スケジュールB 9、 DCCI −10、E
OC−アミノ酸 50〜9011、
Mg0HC2回)0.5 12、 CH,Cl2(2回)05 13、 CH,C12中のActO(3M )
15.014、 CH,C1,0,5 15、Mg0HO,5 16、CH,Ct、 (2回)0.5 簡単に述べれば、樹脂11当たり塩化メチレン中のEO
C−保護アミノ[1〜2ミリモルを使用し、塩化メチレ
ン中の1.0モルDCCI 1当量を加えて2時間実施
した。EOC−Arg(Tos)がカップリングされつ
つあるとき、50%DMFと塩化メチレンの混合物を使
用した。SatおよびThγノヒドロキシル側鎖保護基
としてBzLエーテルを使用した。AsnやGlnのア
ミド基は、有利であるようにDCCカップリングを使用
する場合、Xanテ保J L7’c。p−ニトロフェニ
ルエステルC0Np)ハAsn、’;’Ginのカルボ
キシル末端を活性化するために使用し、例えばEOC−
Ass(ONp)はDMFと塩化メチレンの50チ混合
物中のHOBt1当量を用いて一晩カツブリングさせる
ことができ、この場合はDCCを加えなかった。2−ク
ロル−ベンジルオキシカルボニルC2C1−Z)はL1
/8側鎖の保護基として使用した。romはArgのグ
アニジノ基およびHisのイミダゾール窒素を保護する
ために使用でき、GluまたはAspの側鎖カルボキシ
ル基はOBπtで保護した。Tyrのフェノール性ヒド
ロキシル基は2.6−ジクロルベンジルCDCE)で保
護した。合成の終りに、次の組成の中間体が得られた: EOC−TyrCX)−ALa−AspCX3) Al
a−11g−Pha−8arCX’)−8ar(X’)
−Ala−TyrCX2)−ArgCX”)−ArgC
X’)−LaS−Las−Ala−GlnCX5) −
Law −AL 0L−8ar(X’)−ArgCX’
) −Arg(X6)−Ltru−Law−Gl nC
X” ) −Gl x(X3)−Law−Lgs−Al
a−ArgCX6)−X” (ここでXはTos、X
2はDCE、X3は0Bzt、X’はBzL、X”はX
an、 X”はTos、そしてX9は−NH−樹脂支持
体である)Xanはα−アミノ保護基を除去するために
用いたTFA処理によって部分的にまたは完全に除去で
きた。
た: スケジュールA 1、60チTFA/2チエタンジチオール 102、
60チTFA/2チエタンジチオール 153、
1PA/L%エタンジチオール 0.54、
CH,C1,中のEt3N(10チ)0.55、 M
g0H015 6、CH2Cl、中のA’ LsN (10チ)0.5
7、MaOHC2回)0.5 8、 CH2Cl2(2回)0.5 カツプリングは好1しくはスケジュールBに記載される
ように行った: スケジュールB 9、 DCCI −10、E
OC−アミノ酸 50〜9011、
Mg0HC2回)0.5 12、 CH,Cl2(2回)05 13、 CH,C12中のActO(3M )
15.014、 CH,C1,0,5 15、Mg0HO,5 16、CH,Ct、 (2回)0.5 簡単に述べれば、樹脂11当たり塩化メチレン中のEO
C−保護アミノ[1〜2ミリモルを使用し、塩化メチレ
ン中の1.0モルDCCI 1当量を加えて2時間実施
した。EOC−Arg(Tos)がカップリングされつ
つあるとき、50%DMFと塩化メチレンの混合物を使
用した。SatおよびThγノヒドロキシル側鎖保護基
としてBzLエーテルを使用した。AsnやGlnのア
ミド基は、有利であるようにDCCカップリングを使用
する場合、Xanテ保J L7’c。p−ニトロフェニ
ルエステルC0Np)ハAsn、’;’Ginのカルボ
キシル末端を活性化するために使用し、例えばEOC−
Ass(ONp)はDMFと塩化メチレンの50チ混合
物中のHOBt1当量を用いて一晩カツブリングさせる
ことができ、この場合はDCCを加えなかった。2−ク
ロル−ベンジルオキシカルボニルC2C1−Z)はL1
/8側鎖の保護基として使用した。romはArgのグ
アニジノ基およびHisのイミダゾール窒素を保護する
ために使用でき、GluまたはAspの側鎖カルボキシ
ル基はOBπtで保護した。Tyrのフェノール性ヒド
ロキシル基は2.6−ジクロルベンジルCDCE)で保
護した。合成の終りに、次の組成の中間体が得られた: EOC−TyrCX)−ALa−AspCX3) Al
a−11g−Pha−8arCX’)−8ar(X’)
−Ala−TyrCX2)−ArgCX”)−ArgC
X’)−LaS−Las−Ala−GlnCX5) −
Law −AL 0L−8ar(X’)−ArgCX’
) −Arg(X6)−Ltru−Law−Gl nC
X” ) −Gl x(X3)−Law−Lgs−Al
a−ArgCX6)−X” (ここでXはTos、X
2はDCE、X3は0Bzt、X’はBzL、X”はX
an、 X”はTos、そしてX9は−NH−樹脂支持
体である)Xanはα−アミノ保護基を除去するために
用いたTFA処理によって部分的にまたは完全に除去で
きた。
保護ペプチド−樹脂を切り離して保護基を除去するため
に、ペプチド−樹脂11当たりアニソール1.5d、メ
チルエチルスルフィド0.5mlおよびフッ化水素CH
F ) 15 mlを用いて一20℃で30分および0
℃で30分処理した。高真空下でHFを除去した後、樹
脂−ペプチド残留物を乾燥ジエチルエーテルおよびクロ
ロホルムで交互に洗い、次いでペプチドをガス抜きした
2N水性酢酸で抽出し、濾過によt)樹脂から分離した
。
に、ペプチド−樹脂11当たりアニソール1.5d、メ
チルエチルスルフィド0.5mlおよびフッ化水素CH
F ) 15 mlを用いて一20℃で30分および0
℃で30分処理した。高真空下でHFを除去した後、樹
脂−ペプチド残留物を乾燥ジエチルエーテルおよびクロ
ロホルムで交互に洗い、次いでペプチドをガス抜きした
2N水性酢酸で抽出し、濾過によt)樹脂から分離した
。
その後、得られたペプチドを0〜5%酢酸に溶解し、セ
ファデックスG−50微細ゲル濾過を含めた精製工程に
付した。
ファデックスG−50微細ゲル濾過を含めた精製工程に
付した。
さらにペプチドはリビエールらのペプチド:構造および
生物学的機能、p125〜128(1979)およびマ
ーキー(Markt )らのに示されるような調製用筐
たは半調製用HPL Cで精製した。カートリッジを備
えたウォーターズ・アソシエーツ・プレグL C−5U
OCWatersAssociates prop
LC500)はバイダックCVydac ) 300
Aからの15〜20μのCI8シリカを装填した。リビ
エールのJ、 Liq、 Chrom−atograp
hy 1.343〜367(1978)に記載される
ように、低圧エルデツクスC11ldese) 勾配製
造機を使って、TEAP中のC113CNの勾配をつく
った。クロマトグラフ画分は注意してHPLCで監視し
、実質的純度を示す画分のみを集めた。
生物学的機能、p125〜128(1979)およびマ
ーキー(Markt )らのに示されるような調製用筐
たは半調製用HPL Cで精製した。カートリッジを備
えたウォーターズ・アソシエーツ・プレグL C−5U
OCWatersAssociates prop
LC500)はバイダックCVydac ) 300
Aからの15〜20μのCI8シリカを装填した。リビ
エールのJ、 Liq、 Chrom−atograp
hy 1.343〜367(1978)に記載される
ように、低圧エルデツクスC11ldese) 勾配製
造機を使って、TEAP中のC113CNの勾配をつく
った。クロマトグラフ画分は注意してHPLCで監視し
、実質的純度を示す画分のみを集めた。
それぞれ別個に純度を調べた精製画分の脱塩は0.1%
TFA甲のCH,CNの勾配を用いて行った。
TFA甲のCH,CNの勾配を用いて行った。
その後センターカッ) (cgnttrr cut )
を凍結乾燥して目的とするペプチド(純度98%以上で
ありうる)を得た。
を凍結乾燥して目的とするペプチド(純度98%以上で
ありうる)を得た。
実施例■
次式:
%式%
で表わされる、同じ配列をもつが遊離酸の形のペプチド
(Ear?−シ”、ALa9・+5+ILZa 、 A
r17 +2JI。
(Ear?−シ”、ALa9・+5+ILZa 、 A
r17 +2JI。
Law1312す7〕hGRF (129)−OHは、
ペックマン990ペプチド合成機を使って、置換範囲が
約0.35〜0.5ミリモル/2樹脂のクロルメチル化
樹脂上で段階的方法により合成した。BOC−ArgC
Toa) の樹脂へのカップリングはモナハンCMo
5ahas)らのBiopolymgrs、12、p2
513〜2519(1973)に記載される一般方法に
より、溶剤として塩化メチレンを使用し、塩化メチレン
中2MDCC11当量を加えて攪拌下2時間実施した。
ペックマン990ペプチド合成機を使って、置換範囲が
約0.35〜0.5ミリモル/2樹脂のクロルメチル化
樹脂上で段階的方法により合成した。BOC−ArgC
Toa) の樹脂へのカップリングはモナハンCMo
5ahas)らのBiopolymgrs、12、p2
513〜2519(1973)に記載される一般方法に
より、溶剤として塩化メチレンを使用し、塩化メチレン
中2MDCC11当量を加えて攪拌下2時間実施した。
樹脂からの切v%FItL、保護基の除去および精製を
含めた合成の残りの部分は実施例■のように行った。
含めた合成の残りの部分は実施例■のように行った。
本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純
粋であることが判明した。
粋であることが判明した。
実施例■
実施例バで合成した同じペプチドを組換えDNA技法に
より製造した。
より製造した。
カージャン(KurjafL) およびノへ−スコヴ
イツツCHgrskowitt )のCe11..3
(]: 933〜943(1982年10月)に記載さ
れるようなアルファ因子構造遺伝子をコードする1、7
Kb ECoR1フラグメントを、アルファ因子構造遺
伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と同じ向きになるよ
うにpBR322にサブクローニングした。このプラス
ミドをBat rで消化して再び閉環した。得られたプ
ラスミドはアルファ因子プロモーター、プレープローペ
プチドコーディング配列および13個のアミノ酸から成
る成熟アルファ因子ペプチドの−tSを含んでいた。こ
のプラスミドはこのベクターの唯一のPυ%I[部位へ
BamHI リンカ−を挿入することによりさらに修
飾して、GRF類似体コーディング配列の挿入部位をつ
くった。
イツツCHgrskowitt )のCe11..3
(]: 933〜943(1982年10月)に記載さ
れるようなアルファ因子構造遺伝子をコードする1、7
Kb ECoR1フラグメントを、アルファ因子構造遺
伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と同じ向きになるよ
うにpBR322にサブクローニングした。このプラス
ミドをBat rで消化して再び閉環した。得られたプ
ラスミドはアルファ因子プロモーター、プレープローペ
プチドコーディング配列および13個のアミノ酸から成
る成熟アルファ因子ペプチドの−tSを含んでいた。こ
のプラスミドはこのベクターの唯一のPυ%I[部位へ
BamHI リンカ−を挿入することによりさらに修
飾して、GRF類似体コーディング配列の挿入部位をつ
くった。
実施例■に記載のGRF類似体のために次のヌクレオチ
ド配列(センス鎖): TAT GCT GACGCT ATT TTCTCC
TCCGCCTAT AGA AGA CTT CTT
GCT CAGCTT GCCTCCAGA A
GA CTCC1’CCAAGAA CTT C
TT GCT AGG TAGが選択され、その
3′宋端はTAGターミネータ−コードを含んでいた。
ド配列(センス鎖): TAT GCT GACGCT ATT TTCTCC
TCCGCCTAT AGA AGA CTT CTT
GCT CAGCTT GCCTCCAGA A
GA CTCC1’CCAAGAA CTT C
TT GCT AGG TAGが選択され、その
3′宋端はTAGターミネータ−コードを含んでいた。
このDNA配列はそのアンチセンス鎖と共に最新の技術
を用いて合成した。
を用いて合成した。
この配列を発現ベクターと適合させるために、アルファ
因子ペプチドの一部とプロセッシング部位をコードする
仄の配列: CCAACCAATGTACAA−AAG
GをGRF類似体のセンス鎖の5′床端に付加シタ。ア
ンチセンス鎖はこのオリゴおよびGRF類似体の両方と
正確に相補的なりNA鎖から成るが、それは5′末端に
BamH7突出部分を含んでいた。
因子ペプチドの一部とプロセッシング部位をコードする
仄の配列: CCAACCAATGTACAA−AAG
GをGRF類似体のセンス鎖の5′床端に付加シタ。ア
ンチセンス鎖はこのオリゴおよびGRF類似体の両方と
正確に相補的なりNA鎖から成るが、それは5′末端に
BamH7突出部分を含んでいた。
上記のようにして作成したベクターをその後BαmHI
およびBcLtIで切断し、合成遺伝子を挿入して次の
特性を有するベクターをつくった。それはアルファ因子
プロモーター、プレープロー配列、および1つのアルフ
ァ因子ペプチドコーディング配列を含んでいた。このペ
プチドコーディング配列の後にI、ys−Argの配列
が続き、この配列はGRF類似体をアルファ因子ペプチ
ドからタンパク質分解酵素で切断する際に役立った。膨
訳終止を含むGRF類似体はこのLys−Arg配列の
後に位置していた。
およびBcLtIで切断し、合成遺伝子を挿入して次の
特性を有するベクターをつくった。それはアルファ因子
プロモーター、プレープロー配列、および1つのアルフ
ァ因子ペプチドコーディング配列を含んでいた。このペ
プチドコーディング配列の後にI、ys−Argの配列
が続き、この配列はGRF類似体をアルファ因子ペプチ
ドからタンパク質分解酵素で切断する際に役立った。膨
訳終止を含むGRF類似体はこのLys−Arg配列の
後に位置していた。
GRF類似体発現単位はBamHIおよびBgtlで消
化することによりこのベクターから正確に切り取った。
化することによりこのベクターから正確に切り取った。
このフラグメントを電気芯j、@(glac−1ro
5lStion)により6チアクリルアミドゲルから単
離し、フェノール抽出してエタノール沈殿させた。この
フラグメント約20 nfは適当な酵母シャトルベクタ
ー(好1しくは酵母−特異的配列が挿入されたpER3
22に基づくもの、例えば1985年6月20付のチル
(Thill) らの米国特許出願第747152号
に詳述される発現ベクターTEP209:上記特許の明
細書を参考としてここに引用する)の脱リン酸化Eam
HI消化物6nyに標準条件下で連結した。次いで、そ
れを用いて大腸菌株A/C’1061をアンピシリン耐
性へと形質転換した。形質転換細胞は微琶溶解産物(m
ini 1ysata )のXba(消化により分析し
た。
5lStion)により6チアクリルアミドゲルから単
離し、フェノール抽出してエタノール沈殿させた。この
フラグメント約20 nfは適当な酵母シャトルベクタ
ー(好1しくは酵母−特異的配列が挿入されたpER3
22に基づくもの、例えば1985年6月20付のチル
(Thill) らの米国特許出願第747152号
に詳述される発現ベクターTEP209:上記特許の明
細書を参考としてここに引用する)の脱リン酸化Eam
HI消化物6nyに標準条件下で連結した。次いで、そ
れを用いて大腸菌株A/C’1061をアンピシリン耐
性へと形質転換した。形質転換細胞は微琶溶解産物(m
ini 1ysata )のXba(消化により分析し
た。
正しい方向性を有するもの(すなわちその遺伝子の3′
末端が転写ターミネータ−に隣接するもの)は既知分子
量の標品と対比して特徴的制限フラグメントを同定する
ことにより選択した。得られた酵母発現ベクターは酵母
内での選択のための野性型Trpl遺伝子と、内因性酵
母プラスミド2μサークル由来の複製開始点を保有して
いた。それを使ってトリプトファン要求性サツカロミセ
ス(5aecharontycas )菌株(例えばG
Gloo−14D。
末端が転写ターミネータ−に隣接するもの)は既知分子
量の標品と対比して特徴的制限フラグメントを同定する
ことにより選択した。得られた酵母発現ベクターは酵母
内での選択のための野性型Trpl遺伝子と、内因性酵
母プラスミド2μサークル由来の複製開始点を保有して
いた。それを使ってトリプトファン要求性サツカロミセ
ス(5aecharontycas )菌株(例えばG
Gloo−14D。
ATCC#20762 )を原栄養株へと形質転換した
。
。
さらに、それは先に述べたアルファ因子プロモーター、
プレープロー領域、アルファ因子ペプチド、プロセッシ
ング部位、GRF類似体およびアルファ因子転写ターミ
ネータ−を含む発現カセットを保有していた。
プレープロー領域、アルファ因子ペプチド、プロセッシ
ング部位、GRF類似体およびアルファ因子転写ターミ
ネータ−を含む発現カセットを保有していた。
陽性の形質転換細胞は標準技法を用いて発生させ、それ
をバッチ培養または連続培養によりトリプトファン欠損
合成培地で増殖させた。免疫反応性GRF類似体はRI
Aによって増殖培地中で検出した。分析はC末端に遊離
酸を有する29個のアミノ酸から成るペプチドが生産さ
れたことを示した。
をバッチ培養または連続培養によりトリプトファン欠損
合成培地で増殖させた。免疫反応性GRF類似体はRI
Aによって増殖培地中で検出した。分析はC末端に遊離
酸を有する29個のアミノ酸から成るペプチドが生産さ
れたことを示した。
実施例■および■に一般的(C示した方法を用いて、次
のhGRF類似体の同相合成を行った:l: His’
、 5er7+”+” 、 Ala””””、 Ar
g”’ 。
のhGRF類似体の同相合成を行った:l: His’
、 5er7+”+” 、 Ala””””、 Ar
g”’ 。
Law””7〕−hGRF (129) #H2:(
Hi s ’ 、 S g r”’ 、 At a”+
5’♂+28 、 A r y 12+ 21 、 L
e w 13!26Ala”〕−hGRFc1−29
)−A#7z :[Ht s’ 、 S sr”’
、 A l a”””” 、 Ar N12,2’
、 Lm−N13””)〕−hGRFc1−29
)−Nl12; [Sgrフー’、Glsδ 7 (a9,15.18
.28 、.4 、.12.21゜Le 1L13T2
へ”] −hGRF (1−29) #H2;[p)
、 、l 、 (、、、、+5.+3.26.2? 、
B 、 、7.a、ICI 、 A 1a15.+8
,2δ。
Hi s ’ 、 S g r”’ 、 At a”+
5’♂+28 、 A r y 12+ 21 、 L
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、 A l a”””” 、 Ar N12,2’
、 Lm−N13””)〕−hGRFc1−29
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、 、l 、 (、、、、+5.+3.26.2? 、
B 、 、7.a、ICI 、 A 1a15.+8
,2δ。
Arg””〕−hGRF (129)−A’Hz :(
S e r?+♂−9,211、’、4 l α
Q、+5−8 、Ph gIo 、Ar g’2I”
。
S e r?+♂−9,211、’、4 l α
Q、+5−8 、Ph gIo 、Ar g’2I”
。
Law13+”+27〕−hGRF(1−29) −=
#H2:(: Hs s’ + S a r””9r
A l a”15””” + 0rn12+Arg””
。
#H2:(: Hs s’ + S a r””9r
A l a”15””” + 0rn12+Arg””
。
Law13”、Val”〕−hGRFc1−29)OH
;〔L 、、5.+3.26.3 、、)++9.Al
a’−δ、2a、A?、g12,2I 。
;〔L 、、5.+3.26.3 、、)++9.Al
a’−δ、2a、A?、g12,2I 。
N1g27) AGRF(129) #H2:(H
is’、Se r”’、Thr8 、Ala””””
”、Arg”+Law”””〕−hGRFc1−29)
NN2:(His’、5er)・♂、01、.4
l 、Q、+5.28、.4..12.21 、Z、
、、W127 〕−hGRFc 1−29 )−NH,
;〔His 宜 、 s 、 7)+8+ 19 、
A 1 .0118J8 、 .1. 、+2.2
1 、 1 (、+3 。
is’、Se r”’、Thr8 、Ala””””
”、Arg”+Law”””〕−hGRFc1−29)
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l 、Q、+5.28、.4..12.21 、Z、
、、W127 〕−hGRFc 1−29 )−NH,
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A 1 .0118J8 、 .1. 、+2.2
1 、 1 (、+3 。
L g x”7) h G’RF (129) −N
4 ;〔Hi s’ 、Tyr6 、 sg
r)、♂・” T A l a”””8.A r g
” 。
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r)、♂・” T A l a”””8.A r g
” 。
PAg13.Lgu”]−hGRF(1−29)−Of
f:〔D−As p2 、S g r7山+9 、 A
7 a Q + + !’ ! +8.2s 、 A
r y 12121゜LawI312s、Nl g”]
−hGEFc 1−29 )−#7/2;〔D−Ph
#’ 、S g r丁+& 、、4 (,9+
15J8、.4 、、IL!+ 。
f:〔D−As p2 、S g r7山+9 、 A
7 a Q + + !’ ! +8.2s 、 A
r y 12121゜LawI312s、Nl g”]
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#’ 、S g r丁+& 、、4 (,9+
15J8、.4 、、IL!+ 。
Law””、Nva27〕−hGRFCl−29)−N
N2:[:D−Hi s’ 、D−As p3
、S s r丁* Ill 、A ! 、1111
5+IIJ8 。
N2:[:D−Hi s’ 、D−As p3
、S s r丁* Ill 、A ! 、1111
5+IIJ8 。
ArgI2+LmJ””+N1527.Orn”〕−h
GRF(1−29)−NN2; 〔NaMg−D−Tyr’ 、5ar7山” 、 A
l a”18”” 、 Orn” 。
GRF(1−29)−NN2; 〔NaMg−D−Tyr’ 、5ar7山” 、 A
l a”18”” 、 Orn” 。
Ar、12・”、LawI3”、11g27〕−hGR
Fcl−29)−NH,: (Phg’ +Tyr’ 、5s1−5+ + 9
、 A (a+5 + 18128 、 Ar y 1
2 + 21゜L e N26” ] h G RF
(129) N N2:[:Hi 、s’ 、
S e r”” 、 A l a”15”
8. Ar g” 、 Lgu=””) 。
Fcl−29)−NH,: (Phg’ +Tyr’ 、5s1−5+ + 9
、 A (a+5 + 18128 、 Ar y 1
2 + 21゜L e N26” ] h G RF
(129) N N2:[:Hi 、s’ 、
S e r”” 、 A l a”15”
8. Ar g” 、 Lgu=””) 。
0rn20”]−hGRF(・1 29)−#H2:[
Sgr)、811CI、Al、9115118,211
.J、、、IO+13..4r、12.2+。
Sgr)、811CI、Al、9115118,211
.J、、、IO+13..4r、12.2+。
P h e” 、 G l N27) hGRF (
129)−NN2;[CcLMe −T11r’ 、5
ttr””1o+Ala”15””2δ、 Ar g”
、2’ +L e 1L13”’ 、 Or n2°、
Asp27〕−hGRh’c1−29)−NN2; (L # s ++ 13 、 s g r 7
1 a、 宜’ 、 A L a”δ+28 、
A r a 12T Q1 。
129)−NN2;[CcLMe −T11r’ 、5
ttr””1o+Ala”15””2δ、 Ar g”
、2’ +L e 1L13”’ 、 Or n2°、
Asp27〕−hGRh’c1−29)−NN2; (L # s ++ 13 、 s g r 7
1 a、 宜’ 、 A L a”δ+28 、
A r a 12T Q1 。
II g””)−hGRFcl−29) OH;[N
cLMg−Mat’ 、Sgr)、IQ 、 TA
rB 、A l cLQ++5,1848 。
cLMg−Mat’ 、Sgr)、IQ 、 TA
rB 、A l cLQ++5,1848 。
Lys”、Arg12”、LawI3””〕−hGRF
c1−29)−NN2; (,5+、T7,8.Al、9115.18..4..
12.21.z、、、13.26127゜Astt”〕
−hGRFC1−29) −NN2;〔NaMg −H
i s’ 、 S g r”r”、 Ph elo、
Al a””892’。
c1−29)−NN2; (,5+、T7,8.Al、9115.18..4..
12.21.z、、、13.26127゜Astt”〕
−hGRFC1−29) −NN2;〔NaMg −H
i s’ 、 S g r”r”、 Ph elo、
Al a””892’。
Orn””、Lex””、Lys20.Gln”:1−
hGRF(1−29)−NN2; (CaMg −Hs s’ 、 S g
r)”9 、GL ?Lδ 、A1 cLgl15
118+28 。
hGRF(1−29)−NN2; (CaMg −Hs s’ 、 S g
r)”9 、GL ?Lδ 、A1 cLgl15
118+28 。
Orn”、Arg12”、Lex”+26.Trp27
)−hGRF(1−29’)−OH: 〔Hi s’ 、 S g r”” IQ 、
A l a””鵞’ ” r A r 91
2 + L a J”” ■ Lys20.Tyr27〕−hGRFOl 29)−
NN2゜これらの類似体はTLCおよびHPLCを用い
て実質的に純粋であると判明した。
)−hGRF(1−29’)−OH: 〔Hi s’ 、 S g r”” IQ 、
A l a””鵞’ ” r A r 91
2 + L a J”” ■ Lys20.Tyr27〕−hGRFOl 29)−
NN2゜これらの類似体はTLCおよびHPLCを用い
て実質的に純粋であると判明した。
発明の効果
これらの合成ペプチドは、合成hGRFC1−40)−
OHと比較して、GHの分泌に関して少なくとも同程度
の、往々にしてより優れた効力を示すことが見出された
。
OHと比較して、GHの分泌に関して少なくとも同程度
の、往々にしてより優れた効力を示すことが見出された
。
成長ホルモンの放出をうながす実施例Iの合成ペプチド
の有効性を試験するために、標品として合成hGRFc
1−40)−OHを用いて等モル濃度の種々の他の合成
類似体および断片と並行比較することによりin vi
tro検定を行った。試験の4日前に摘出したラット下
垂体細胞を含む培養物を使用した。比較試験のために成
長ホルモンの分泌が最適でるると考えられる培養物を、
ベール(Valg)らのEndocrinotogyr
91.562〜572 (1972) YC記載さ
れ、またペールらのh:ndocrinology r
112.1553〜1555(1983)にさらに詳
しく記載される一般方法により使用した。試験すべき物
質とのインキュベーションは4時間行い、培地アリコー
トを取り出して、それらの免疫反応性GHCir GH
)の含有量をよく知られたラジオイムノアッセイで測定
するだめに処理した。等モル濃度を使用するこの比較試
験の結果は、実施例1および11のペプチドがhGRF
cl−40’l−OH標品と同等の効力を有することを
示した。
の有効性を試験するために、標品として合成hGRFc
1−40)−OHを用いて等モル濃度の種々の他の合成
類似体および断片と並行比較することによりin vi
tro検定を行った。試験の4日前に摘出したラット下
垂体細胞を含む培養物を使用した。比較試験のために成
長ホルモンの分泌が最適でるると考えられる培養物を、
ベール(Valg)らのEndocrinotogyr
91.562〜572 (1972) YC記載さ
れ、またペールらのh:ndocrinology r
112.1553〜1555(1983)にさらに詳
しく記載される一般方法により使用した。試験すべき物
質とのインキュベーションは4時間行い、培地アリコー
トを取り出して、それらの免疫反応性GHCir GH
)の含有量をよく知られたラジオイムノアッセイで測定
するだめに処理した。等モル濃度を使用するこの比較試
験の結果は、実施例1および11のペプチドがhGRF
cl−40’l−OH標品と同等の効力を有することを
示した。
この種の合成んpGRF類似体は医師がGH産生を高め
ることを望むヒトへ適用するのに有用であり、天然hp
GRFよりも優れているだろう。これらの類似体の同相
合成は、hpGRF類似体ペプチドの長さがより短いた
めに、天然分子の合成よりも簡単である。さらに類似体
に見出せる比較的整然とした構造はより安定なペプチド
をもたらし、それにより精製が容易となる。この種の類
似体によるGH分泌の刺激は、内因性G Rk’の産生
低下に起因する完全または相対的GH欠乏症を有する患
者を対象としている。さらに、増大したGH分泌および
それに伴う成長増加は正常のGHレベルを有するヒトま
たは動物にも現われるであろう。
ることを望むヒトへ適用するのに有用であり、天然hp
GRFよりも優れているだろう。これらの類似体の同相
合成は、hpGRF類似体ペプチドの長さがより短いた
めに、天然分子の合成よりも簡単である。さらに類似体
に見出せる比較的整然とした構造はより安定なペプチド
をもたらし、それにより精製が容易となる。この種の類
似体によるGH分泌の刺激は、内因性G Rk’の産生
低下に起因する完全または相対的GH欠乏症を有する患
者を対象としている。さらに、増大したGH分泌および
それに伴う成長増加は正常のGHレベルを有するヒトま
たは動物にも現われるであろう。
寸だ、投与は身体の脂肪含量を変化させ、その他のGH
依存性の代謝、免疫および発生過程を変更させるであろ
う。例えば、これらの類似体は火傷を負ったような情況
下にあるヒトの同化過程を刺激する手段として有用であ
りうる。他の例として、これらの類似体は鶏、七面鳥、
豚、ヤギ、牛および羊のような商業用温血動物VC,ま
たは魚や他の冷血動物(例えばウミガメおよびウナギ)
および両生類の養殖に、有効量の本ペプチドを与えるこ
とにより成長をはやめ且つタンパク質対脂肪の比を高め
るために使用しつる。
依存性の代謝、免疫および発生過程を変更させるであろ
う。例えば、これらの類似体は火傷を負ったような情況
下にあるヒトの同化過程を刺激する手段として有用であ
りうる。他の例として、これらの類似体は鶏、七面鳥、
豚、ヤギ、牛および羊のような商業用温血動物VC,ま
たは魚や他の冷血動物(例えばウミガメおよびウナギ)
および両生類の養殖に、有効量の本ペプチドを与えるこ
とにより成長をはやめ且つタンパク質対脂肪の比を高め
るために使用しつる。
ヒトに投与する場合、これらの合成ペプチドは少なくと
も約93チ、好1しくは少なくとも98係の純度をもつ
べきである。本明細書において純度とは意図するペプチ
ドが存在する全てのペプチドおよびペプチド断片の表示
重量%f占めることを意味する。この種の合成ペプチド
を商業用または龍の動物に成長促進および脂肪含量低下
の目的で投与する場合は、約5チ程度の低い純度、ある
いは0.01%の純度でさえも許容しつるかも知れない
。
も約93チ、好1しくは少なくとも98係の純度をもつ
べきである。本明細書において純度とは意図するペプチ
ドが存在する全てのペプチドおよびペプチド断片の表示
重量%f占めることを意味する。この種の合成ペプチド
を商業用または龍の動物に成長促進および脂肪含量低下
の目的で投与する場合は、約5チ程度の低い純度、ある
いは0.01%の純度でさえも許容しつるかも知れない
。
これらの合成ペプチドでたはその無毒性塩は、医薬組成
物をつくるため1c薬学的または獣医学的に受答される
キャリアーと混合されて、ヒトを含めた動物へ静脈内、
皮下、筋肉内、経皮的(例えば鼻腔内)、または経口的
にさへ投与することができる。投与は治療しようとする
受容者がこのような治療上の処置を必要とする場合にG
Hの放出を刺激すべく医師シてより行われる。必要な投
与量は治療しようとするそれぞれの症状、その症状の程
度、および治療の持続期間により変化するであろう。
物をつくるため1c薬学的または獣医学的に受答される
キャリアーと混合されて、ヒトを含めた動物へ静脈内、
皮下、筋肉内、経皮的(例えば鼻腔内)、または経口的
にさへ投与することができる。投与は治療しようとする
受容者がこのような治療上の処置を必要とする場合にG
Hの放出を刺激すべく医師シてより行われる。必要な投
与量は治療しようとするそれぞれの症状、その症状の程
度、および治療の持続期間により変化するであろう。
この種のペプチドは無毒性塩、せりえば酸付加塩または
亜鉛や鉄などとの金属錯体(本明細8Vcおいては金属
錯体も塩として考える)の形でしばしば投与される。酸
付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、
マレイン酸塩、げ1・酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、
コノ・り酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸
塩などである。活性成分を錠剤の形で経口的に投与する
場合、錠剤はトラガカント、トウモロコシ澱粉またはゼ
ラチンのような結合剤;アルギン咳のような崩壊剤;お
よびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含みつ
る。液体での投与が望1れる場合は甘味料および/また
は風味料を使用することができ、また等張塩水や燐酸緩
衝液での静脈内投与を行うこともできる。
亜鉛や鉄などとの金属錯体(本明細8Vcおいては金属
錯体も塩として考える)の形でしばしば投与される。酸
付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、
マレイン酸塩、げ1・酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、
コノ・り酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸
塩などである。活性成分を錠剤の形で経口的に投与する
場合、錠剤はトラガカント、トウモロコシ澱粉またはゼ
ラチンのような結合剤;アルギン咳のような崩壊剤;お
よびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含みつ
る。液体での投与が望1れる場合は甘味料および/また
は風味料を使用することができ、また等張塩水や燐酸緩
衝液での静脈内投与を行うこともできる。
本ペプチドは医師の指導のもとてヒトに投与されるべき
であり、医薬組成物は通常薬学的に受答される慣用の固
体または液体キャリアーと共にペプチドを含むだろう。
であり、医薬組成物は通常薬学的に受答される慣用の固
体または液体キャリアーと共にペプチドを含むだろう。
一般に、非経口投与量は受答者の体重1kg当たクペプ
チド約10 On7〜約50μ7であるだろう。
チド約10 On7〜約50μ7であるだろう。
本発明はその好適な実施態様(特に実施例Iと■は本発
明者が認める最もよい方法である)について説明してき
たが、当分野で通常の知識を有する者に明らかないろい
ろな変更および修飾が特許請求の範囲に記載する本発明
の範囲から逸脱することなくなされうろことを理解すべ
きである。例えば、ペプチド鎖の修飾、とりわけペプチ
ドのC末端から始4る1個以上のアミノ酸残基の欠失は
今1でに知られた実験慣習に従って行われ、それによジ
ペプチドの生物学的効力の1さに本質的部分を保持する
ペプチドがつくり出され、この種のペプチドも本発明の
範囲内に含壕れると考えられる。さらに、C末端での付
加も行われ、かつ/′!たペプチド化学の分野で知られ
るよって自然界に存在する残基の代わりにほぼ均等の残
基を用いて、タンパク質の加水分解に対して増強された
抵抗性を有し、1だ実施例■に記載のペプチドのような
本発明の範囲を逸脱しない請求されたポリペプチドの効
力の少なくとも本質的部分を有する他の類似体を製造す
ることができる。同様に、C末端のカルボキシル基にお
ける既知の置換(例えば低級アルキルアミド)もまた均
等の分子・2もたらす。
明者が認める最もよい方法である)について説明してき
たが、当分野で通常の知識を有する者に明らかないろい
ろな変更および修飾が特許請求の範囲に記載する本発明
の範囲から逸脱することなくなされうろことを理解すべ
きである。例えば、ペプチド鎖の修飾、とりわけペプチ
ドのC末端から始4る1個以上のアミノ酸残基の欠失は
今1でに知られた実験慣習に従って行われ、それによジ
ペプチドの生物学的効力の1さに本質的部分を保持する
ペプチドがつくり出され、この種のペプチドも本発明の
範囲内に含壕れると考えられる。さらに、C末端での付
加も行われ、かつ/′!たペプチド化学の分野で知られ
るよって自然界に存在する残基の代わりにほぼ均等の残
基を用いて、タンパク質の加水分解に対して増強された
抵抗性を有し、1だ実施例■に記載のペプチドのような
本発明の範囲を逸脱しない請求されたポリペプチドの効
力の少なくとも本質的部分を有する他の類似体を製造す
ることができる。同様に、C末端のカルボキシル基にお
ける既知の置換(例えば低級アルキルアミド)もまた均
等の分子・2もたらす。
本発明の特徴は先の特許請求の範囲に説明されるもので
ある。
ある。
Claims (19)
- (1)次のアミノ酸配列を有する合成ペプチド。 【アミノ酸配列があります】 (式中R_1はTyr、D−Tyr、Met、Phe、
D−Phe、Leu、HisまたはD−Hisであり、
各アミノ酸残基はC^αMeまたはN^αMe置換を有
するかまたは未置換である;R_2はAlaまたはD−
Alaであり;R_3はAspまたはD−Aspであり
;R_5はIleまたはLeuであり;R_6はPhe
またはTyrであり;R_7はSerまたはThrであ
り;R_8はSer、Asn、ThrまたはGlnであ
り;R_9はAlaまたはSerであり;R_1_0は
Tyr、PheまたはLeuであり;R_1_1はAr
g、OrnまたはLysであり;R_1_2はArg、
OrnまたはLysであり;R_1_3はIle、Le
u、PheまたはValであり;R_1_5はGlyま
たはAlaであり;R_1_8はAlaまたはSerで
あり;R_1_9はSerまたはAlaであり;R_2
_0はArg、OrnまたはLysであり;R_2_1
はArg、OrnまたはLysであり;R_2_6はL
eu、Ile、ValまたはPheであり;R_2_7
はNle、Nvaまたは天然アミノ酸であり;R_2_
8はAla、Leu、Asn、GlnまたはSerであ
り;そしてYはOHまたはNH_2である;但しR_5
、R_6、R_7、R_8、R_9、R_1_0、R_
1_1、R_1_2、R_1_3、R_1_5、R_1
_8、R_1_9、R_2_0、R_2_1およびR_
2_6を構成するアミノ酸残基のうち少なくとも4個は
、天然hGRFのそれぞれの位置に存在するアミノ酸残
基と相異なるものである) - (2)R_7がSerである特許請求の範囲第1項記載
のペプチド。 - (3)R_9がAlaである特許請求の範囲第1項記載
のペプチド。 - (4)R_1_2がArgである特許請求の範囲第1項
記載のペプチド。 - (5)R_1_8がAlaである特許請求の範囲第1項
記載のペプチド。 - (6)R_1_3、R_2_6およびR_2_7がL_
e_uであり、R_2_8がAlaであり、YがOHで
ある特許請求の範囲第1項記載のペプチド。 - (7)R_1_3がLeuであり、R_2_6がLeu
であり、R_2_7がLeuであり、R_2_8がAl
aであり、YがNH_2である特許請求の範囲第1項記
載のペプチド。 - (8)R_2_7がIleである特許請求の範囲第1項
記載のペプチド。 - (9)R_1がTyrであり、R_2がAlaであり、
R_3がAspである特許請求の範囲第1項記載のペプ
チド。 - (10)R_1_9がSerである特許請求の範囲第1
項記載のペプチド。 - (11)R_7がThrであり、R_8がGlnである
特許請求の範囲第1項記載のペプチド。 - (12)R_1_2がOrnである特許請求の範囲第1
項記載のペプチド。 - (13)R_2_1がArgである特許請求の範囲第1
項記載のペプチド。 - (14)R_3がLeuであり、R_5がPheであり
、R_1_0がTyrであり、R_1_1がArgであ
り、R_2_0がArgであり、R_2_7がLeuで
ある特許請求の範囲第1項記載のペプチド。 - (15)R_1_3がLeuであり、R_1_5がAl
aであり、R_2_6がValであり、R_2_7がL
euであり、R_2_8がAlaである特許請求の範囲
第1項記載のペプチド。 - (16)R_1がHisであり、R_2がAlaであり
、R_3がAspである特許請求の範囲第1項記載のペ
プチド。 - (17)次式: 【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第1項記載のペプチド。
- (18)次式: 【アミノ酸配列があります】 で表わされる特許請求の範囲第1項記載のペプチド。
- (19)有効量の特許請求の範囲第1項記載のペプチド
またはその無毒性塩、およびそのための薬学的または獣
医学的に受容される液体もしくは固体のキャリアーを含
有する動物の成長ホルモン(GH)放出を刺激するため
の医薬組成物。
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