JPS62502936A - Microsponges and bioreactors - Google Patents
Microsponges and bioreactorsInfo
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- JPS62502936A JPS62502936A JP50208686A JP50208686A JPS62502936A JP S62502936 A JPS62502936 A JP S62502936A JP 50208686 A JP50208686 A JP 50208686A JP 50208686 A JP50208686 A JP 50208686A JP S62502936 A JPS62502936 A JP S62502936A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 ミクロスポンジ 本発明は、ＮＩＢとの契約中あるいは契約下になされた。政府は５ＢＩＲ認可番 号ＣＡ ３７４３０に工υ本発明に対し権利を有する。[Detailed description of the invention] micro sponge This invention was made on or under contract with NIB. Government has 5 BIR approval number No. CA 37430 has rights to this invention.
本発明は生物活性材料を固定化する分野に属し、とりわけ駆動バイオリアクタ一 方式に使用する改良ミクロスポンジに関する。本発明はまた微生物お工び細胞（ 以下、集合的に生物体と呼ぶ）を培養する分野に関し、とりわけ水中浮遊系とし て駆動反応器方式におけるミクロスポンジ上および（または）ミクロスポンジ中 に固定化された生物体の培養に関する。The present invention belongs to the field of immobilizing bioactive materials, in particular to driving bioreactors. This invention relates to an improved micro sponge used in the method. The present invention also provides microbial engineered cells ( Regarding the field of cultivating organisms (hereinafter collectively referred to as living organisms), especially in the field of underwater floating systems. on and/or in the microsponge in a driven reactor system. Relates to the cultivation of organisms immobilized on.
生物体を培養することにより多種多様の化学製品がつくられている。例えば、抗 生物質お工び他の薬剤、アルコール飲料、チーズなどヲ與造するため発酵法が多 数ある。しかし、殆どの発酵法は、連続培養技術の価値が認識されているにも拘 らず、バッチ反応手順を用いて商業的に実施されている。A wide variety of chemical products are produced by culturing living organisms. For example, Many fermentation methods are used to produce biological products, other drugs, alcoholic beverages, cheese, etc. There are several. However, most fermentation methods are limited, despite the recognized value of continuous culture techniques. However, it is carried out commercially using batch reaction procedures.
遺伝子工学および医学の分野における最近の進歩は、生物培養による化学製品の 製造に新時代の到来を告げ次。例えば、公知の抗原、例えば破傷風トキソイドに 特異的な抗体を分泌する哨乳類雑種細胞またはハイプリドーマが開発された。」 よ乞し」１の工うな細菌を遺伝学的に処理して特定のタンパク質、例えばインシ ュリンを産生させる工うになった。しかし、この新技術を最も工く利用するには 、この工うな製品の生産を最高ならしめるように、かかる生物体を高濃度で、か つ最逼発冑条件下に連続して培養するためのバッチ発酵法に勝る技術を開発しな ければならない。Recent advances in the fields of genetic engineering and medicine have enabled the production of chemical products by biological cultivation. Next, heralding the arrival of a new era in manufacturing. For example, known antigens such as tetanus toxoid Sentinel hybrid cells or hybridomas have been developed that secrete specific antibodies. ” Genetically engineer bacteria to produce specific proteins, such as insulin. It became possible to produce urin. However, the best way to utilize this new technology is to In order to maximize the production of this artificial product, such organisms may be used in high concentrations. We need to develop a technology superior to batch fermentation methods for continuous cultivation under conditions of maximum fermentation. Must be.
生物活性材料を固定化する種々な装置は公知である。Various devices for immobilizing bioactive materials are known.
廃水処理および関連発酵法において微生物の固定化に固体支持体が長い間使用さ れて来た。更に最近になって、付着依存型細胞の培養に高細胞密度を得るため、 固体ミクロ担体が用いられる工うになった。例えば、デキストランから加工され ７’Ｃ徽孔性重合体支持体が細胞培養に使用された。この工うな支持体はＰｈａ ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから商品名ｃｙｔｏ（Ｉｅｘ ｅ で商業的に得ることができる。しかし、この工うな固体生物支持体は、激しくか きまぜたタンクおよび流動床といった駆動反応器系には不適当であり、それは細 胞の実質的にすべてが前記支持体の表面に付着し、従って操作中衝撃応力お工び 外傷にさらされるからである。Solid supports have long been used for immobilization of microorganisms in wastewater treatment and related fermentation processes. It came. More recently, in order to obtain high cell densities in the culture of adhesion-dependent cells, Solid microcarriers are now being used. For example, processed from dextran A 7'C porous polymer support was used for cell culture. This support is Pha From rmacia Fine Chemicals, the product name is cyto(Iex e). can be obtained commercially. However, this difficult solid biological support is It is unsuitable for driven reactor systems such as stirred tanks and fluidized beds; Substantially all of the cells adhere to the surface of the support and are therefore susceptible to impact stress during operation. This is because they are exposed to trauma.
多孔質無機ミクロ担体も公知であり、この工うな支持体は細胞がミクロ担体の内 部に居住するので、駆動応用面において細胞に潜在的に保ａａ−与える。都合の 悪いことに、無機ミクロ担体は、あらゆる駆動応用面において十分に機能する工 うに透過性と比重との適切な組み合わせを有する工うにつくることができない。Porous inorganic microcarriers are also known, and these engineered supports allow cells to move inside the microcarriers. Since it resides in the cells, it potentially provides AA-storage to cells in driving applications. convenient Unfortunately, inorganic microcarriers are not fully functional in all drive applications. Sea urchins cannot be made with a suitable combination of permeability and specific gravity.
例えば、ＭＩｉ１８８１ｎｇ等、米国特許第４．１５３．５１０号明細書記載の 多孔性フリットガラスまたは亜青石支持体は一般に、もしそれらの空隙分率が約 ８０チよシ大であるならば水性懸濁系において約１．３未満の比重を示すであろ ５ （Ｍｅｓｓｉｎｇ支持体に対する空隙分率は開示されていないことに注意） 。物質およびエネルギー移動の最高速度に対して高い相対速度を確保するために 一般に高い比重が要求されるあらゆる駆動反応器系に対してこれら支持体が適さ ないのはよく理解できる。For example, MIi1881ng, etc., described in US Pat. No. 4,153,510. Porous fritted glasses or sub-bluestone supports are generally used if their porosity fraction is approximately If it is larger than 80 cm, it will have a specific gravity of less than about 1.3 in an aqueous suspension system. 5 (Note that the void fraction for the Messing support is not disclosed) . To ensure a high relative velocity to the maximum velocity of mass and energy transfer These supports are generally suitable for all driven reactor systems where high specific gravity is required. I can understand that there isn't.
従って、これら支持体は一般に充填床応用面での使用に属して来た。Therefore, these supports have generally been found for use in packed bed applications.
更にまた、これら先行技術のミクロ担体がハイプリドーマといった。付着依存型 生物体の培養に如何に適当であるかは未知である。Furthermore, these prior art microcarriers are referred to as hybridomas. Adhesion dependent type It is unknown how suitable it is for culturing organisms.
本発明の一つの目的は、駆動反応器系で使用するのに適した固定化生物活性材料 を含むミクロスポンジを提供することにある。One object of the present invention is to provide an immobilized bioactive material suitable for use in a driven reactor system. The objective is to provide a micro sponge containing.
本発明のもう一つの目的は、大きさおよび固体支持体への付着の度合が広く変化 することにニジ特徴づけられる多種多様な生物体を固定化するのに適したミクロ スポンジを提供することにある。Another object of the present invention is to provide materials that vary widely in size and degree of attachment to a solid support. A microorganism suitable for immobilizing a wide variety of organisms characterized by The goal is to provide a sponge.
本発明の更に一つの目的は固定化生物体の発育と再生を継続させる駆動反応器系 に適したミクロスポンジを提供することにある。A further object of the present invention is to provide a drive reactor system for continued growth and regeneration of immobilized organisms. Our goal is to provide micro sponges suitable for
また本発明の一つの目的は、固定化生物体の代謝活動を最大ならしめることを助 ける駆動反応器系に適したミクロスポンジを提供することである。It is also an object of the present invention to help maximize the metabolic activity of immobilized organisms. The object of the present invention is to provide a microsponge suitable for a driven reactor system.
本発明の更にもう一つの目的は、生物体を高濃度で連続培養する方法を提供する ことである。Yet another object of the present invention is to provide a method for continuously culturing organisms at high concentrations. That's true.
本発明の更にもう一つの目的は、最大の発育速度または最大代謝活動に合わせな がら高濃度で生物体を培養できる駆動反応器系に適したミクロスポンジを提供す ることである。Yet another object of the invention is to We provide microsponges that are suitable for drive reactor systems that can cultivate organisms at high concentrations. Is Rukoto.
本発明のもう一つの目的は付着依存型および付着非依存型両方の生物体の生体外 培養法を提供することである。Another object of the present invention is the in vitro treatment of both attachment-dependent and attachment-independent organisms. The purpose of the present invention is to provide a culture method.
本発明のこれらの目的および他の目的は、本明細書本文および請求の範囲の考察 から明白となるであろう。These and other objects of the invention will be realized upon consideration of the present specification and claims. It will be clear from
発明の要約 本発明は、生物活性材料を駆動バイオリアクター系に固定化するための重量を付 与しタミクロスポンジ（なるべくは、コラーゲンミクロスポンジ）に関し、前記 ミクロスポンジは不活性な重量付与性材料を含む多孔質、生物安定性、高度に架 橋されたコラーゲンマトリックスからなシ、前記コラーゲンマトリックスは約１ ミクロンから約１５０ミクロンの範囲内の平均細孔寸法をもつ表面細孔構造に対 して開口を有し、前記マトリックスの細孔はミクロスポンジの約７０から約９８ 容量％ｔ−占め、前記ミクロスポンジはまた約１ｏ。Summary of the invention The present invention provides a weight-bearing system for immobilizing bioactive materials in a driven bioreactor system. Regarding the collagen microsponge (preferably collagen microsponge), the above Microsponges are porous, biostable, highly cross-linked materials containing inert weight-giving materials. If the collagen matrix is a cross-linked collagen matrix, the collagen matrix is about 1 For surface pore structures with average pore sizes ranging from microns to approximately 150 microns. The pores of the matrix are about 70 to about 98 pores of the microsponge. The microsponge also has a volume of about 1o.
ミクロンから約１０００ミクロンの平均粒度と約１．０５以上の比重を有する。It has an average particle size of from microns to about 1000 microns and a specific gravity of about 1.05 or more.
本発明はまた生化学製品の製造のための生物の連続的生体外培養法に関し、水沫 は （イ）（１）型１．Ｉｔお工び■のコラーゲンからなる群から選ばれるコラーゲ ン源を粉砕し、 （ｎ） 前記粉砕コラーゲンを酸性液体媒質と混合し、 （ｉｉｉｌ 前記コラーゲン−液体媒質混合物を凍結乾燥して乾燥スポンジマト リックスにし、そして ｌｖ） 前記スポンジマトリックスのコラーゲンを、（１） カルボジイミＶお よび二官能性スクシンイミジル活性エステルからなる群から選ばれる架橋剤と前 記コラーゲンとを接触させる、 （２）前記乾燥スポンジマトリックスを真空下で高温にさらす、および （３）その組み合わせ、 からなる群から選ばれる処理にょυ架橋する、ことによシつくられる高度に架橋 されたコラーゲンミクロスポンジを用意し、 （ロ）工程（イ）の高度に架橋されたコラーゲンミクロスポンジを前記生物体の 培養で接種し、 （／→ 接種され、高度に架橋されたコラーゲンミクロスポンジと直接接触状態 で栄養培地全供給し、そしてに）栄養培地流出液と共に生化学製品を回収する、 という工程からなる。The present invention also relates to a method for continuous in vitro culturing of organisms for the production of biochemical products. teeth (b) (1) Type 1. Collage selected from the group consisting of It-made collagen. crush the source of (n) mixing the crushed collagen with an acidic liquid medium; (iii) Freeze-dry the collagen-liquid medium mixture to form dried sponge tomatoes. Ricks, and lv) The collagen in the sponge matrix is treated with (1) Carbodiimide V or and a crosslinking agent selected from the group consisting of contact with collagen; (2) exposing the dry sponge matrix to high temperature under vacuum; and (3) The combination, cross-linking, especially highly cross-linked by a treatment selected from the group consisting of Prepare a collagen microsponge, (b) The highly cross-linked collagen microsponge of step (a) is applied to the biological body. inoculated by culture, (/→ Direct contact with inoculated and highly cross-linked collagen microsponge supplying the entire nutrient medium with and a) collecting the biochemical products along with the nutrient medium effluent; It consists of the process of
図面の簡単な記述 第１図は繊維構造を説明する本発明の適当なコラーゲンミクロスポンジマトリッ クスを示す顕微鏡写真である。Brief description of the drawing Figure 1 shows a suitable collagen microsponge matrix of the present invention illustrating the fiber structure. FIG.
第２図は葉状構造を説明する本発明によるもう一つのコラーゲンミクロスポンジ マトリックスの顕微鏡写真である。Figure 2 is another collagen microsponge according to the present invention, illustrating the leaf-like structure. It is a micrograph of a matrix.
詳細な記述 本発明は、駆動バイオリアクター系での使用に適した固定化生物活性材料、とり わけ生物体を含有する重量付与性ミクロスポンジ、なるべくはコラーゲンミクロ スポンジ、ならびに生化学製品製造のための生物体の生体外連続培養法に向けら れる。本明細書本文および請求の範囲を通じて使用した「生物活性材料」という 用語は酵素および他の化学因子、例えばキレート剤、ホルモン、抗体など、およ び生物、即ち微生物および高等生物の細胞を広く包含する。本明細書本文および 請求の範囲を通じて使用した「生物体」という用語は微生物および高等生物の細 胞の両方を広く包含する。detailed description The present invention provides an immobilized bioactive material suitable for use in a driven bioreactor system. Weight-imparting microsponges containing different biological organisms, preferably collagen microsponges. For sponges and in vitro continuous culture of living organisms for the production of biochemical products. It will be done. As used throughout this specification and claims, the term "bioactive material" refers to The term refers to enzymes and other chemical agents, such as chelating agents, hormones, antibodies, etc. It broadly includes cells of microorganisms and higher organisms. The main text of this specification and The term "organism" used throughout the claims refers to microorganisms and higher organisms. It broadly encompasses both cells.
生物体は細菌、真菌、ウィルス、藻類、酵母、動物細胞（組織）、例えば哺乳動 物、昆虫お工び魚および植物細胞といった多様な給源から無制限に誘導できる。Living organisms include bacteria, fungi, viruses, algae, yeast, and animal cells (tissues), such as mammals. It can be derived from unlimited sources from a variety of sources, including plants, insects, fish, and plant cells.
用語「生物体」および「細胞」は本明細書および請求の範囲を通じ交換できる工 うに用いることにする。また本明細書お工び請求の範囲を通じて使用した用語「 生化学製品」はこのような生物体にょシ産生された一次および二次代謝産物だけ でなく、例えば非分泌製品を含む細胞材料１＋１は生物体自身のパイセスも指す 。The terms "organism" and "cell" are used interchangeably throughout this specification and claims. I decided to use sea urchin. In addition, the term " "Biochemical products" are only the primary and secondary metabolites produced by such organisms. For example, 1+1 cellular material containing non-secreted products also refers to the organism's own pyces. .
本発明に係る重量付与ミクロスポンジは、生物体培養に使用するとき特に有利で あるので、一般にこのような具体例に関して記述することにするが、その工うに 限定し工５とするのではない。The weighted microsponge according to the invention is particularly advantageous when used in biological culture. Since there are many cases, I will generally describe this kind of specific example, but I will not explain how to do it. It is not limited to 5.
本発明に係るミクロスポンジは例えば、何ケ月という程度で適当な期間使用中安 定な生物適合性（例えば、無毒性）集合体力）らつ（られる。本発明に係る特に 適当なミクロスポンジは高度に架橋されたコラーゲンから形成される。生物適合 性とは、固定化生物体の望まれる特性に実質的に悪影響を及ぼすことな（（例え ば、ハイプリドーマの場合には、重合体材料、例えばコラーゲンマトリックス材 料はモノクローン抗体の産生を減少させてはならない）、重合体（例えば、コラ ーゲン源） ＩＪソックス材料が生物体の生活力ある培養を支える能力を指す。The microsponge according to the present invention is stable during use for an appropriate period of time, for example, several months. In particular, according to the present invention, Suitable microsponges are formed from highly cross-linked collagen. biocompatible properties that do not substantially adversely affect the desired properties of the immobilized organism (e.g. For example, in the case of hyperdomas, polymeric materials, such as collagen matrix materials, materials (must not reduce the production of monoclonal antibodies), polymers (e.g. (source) Refers to the ability of IJ sock materials to support the viable cultivation of living organisms.
マトリックス材料の安定性あるいは生物安定性とは、関心を寄せている生物体を 培養するための適切な期間にわたり生体外条件下でその強度と完全性を維持する 能力を指す。例えば、モノクローン抗体生産のためのハイブリドーマ培参の場合 、駆動バイオリアクターは６から６ケ月間またはそれ以上連続操作されるだろう ことが予想される。従って、マトリックス材料はこの期間生体安定性でなければ ならない。Stability or biostability of a matrix material refers to the stability of the organism of interest. Maintain its strength and integrity under in vitro conditions for an appropriate period of time to culture Refers to ability. For example, in the case of hybridoma culture for monoclonal antibody production. , the driven bioreactor will be operated continuously for 6 to 6 months or more. It is expected that. Therefore, the matrix material must be biostable for this period. No.
天然および合成重合体材料の両方をマトリックス材料として使用できる。適当な 重合体の例には、多糖類、例えばデキストラン、デキストリン、デンプン、セル ロース、アガロース、カラジーナンなど：タンパク質、例えばコラーゲンなど； お工び合成重合体、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリメタ クリレート、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミＰな どが包含される。一般に、材料の生物適合性および生体安定性は日常的な実験を 用いて証明できる。Both natural and synthetic polymeric materials can be used as matrix materials. Appropriate Examples of polymers include polysaccharides such as dextran, dextrin, starch, cellulose, etc. Loose, agarose, carrageenan, etc.: Proteins, such as collagen; Synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, polyacrylate, polymeth Acrylate, polyacrylamide, polyester, polyurethane, polyamide P, etc. which are included. In general, biocompatibility and biostability of materials are determined by routine experimentation. It can be proven using
その生物適合性および強度に基づくと、現在のところコラーゲン中選りぬきの材 料である。コラーゲンはヒトを含めて動物に見出される生物分解性重合体である 。このものは医学分野で多数の用途をもち、大抵の応用面では、種々な架橋剤、 例えばアルデヒド類、例えばグルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒド：エチ ルクロロホルメート；ジメチルアジピミデート：Ｎ。Based on its biocompatibility and strength, collagen is currently the material of choice. It is a fee. Collagen is a biodegradable polymer found in animals, including humans. . It has numerous uses in the medical field, and in most applications, various cross-linking agents, For example, aldehydes such as glutaraldehyde and formaldehyde: dichloroformate; dimethyl adipimidate: N.
Ｎ−メチレンビスアクリルアミｐ；１．２−ジアクリルアミドエチレングリコー ル：シアナミ）８Ｉ；Ｎ、Ｎ’−ジアリル酒石酸ジアミド：臭化シアン；コンカ ナバリンＡ：６−アミノヘキサン酸：１，６−ジアミツヘキサン；スフフンイミ ジル活性エステル；カルボジイミドおよび同様な架橋基をもつ化合物を用いて、 そして（マタは）約５０ ミＩＪ ）ル以上の真空と５０℃から２００’Ｃにわ たる温度における凍結乾燥および強力な脱水といった物理的処理技術を用いて不 溶形に再構成され架橋される。都合の悪いことに、架橋されたコラーゲン中に不 可避的に存在する常用架橋剤、とりわけグルタルアルデヒドの全部ではないにし ても多（のものは、生物学的悪影響を起こし、従って細胞毒である。N-methylenebisacrylamide p; 1,2-diacrylamide ethylene glycol 8I; N,N'-diallyltartaric acid diamide: cyanogen bromide; conca Navarin A: 6-aminohexanoic acid: 1,6-diamithexane; using carbodiimide and similar crosslinking group-containing compounds; (Mata) in a vacuum of about 50 mm or more and from 50°C to 200'C. Physical processing techniques such as freeze-drying at barrel temperatures and intensive dehydration are used to Reconstituted into a melt form and crosslinked. Unfortunately, there are some undesirable elements in the cross-linked collagen. Most if not all of the commonly present cross-linking agents, especially glutaraldehyde, Many of them cause adverse biological effects and are therefore cytotoxic.
最近、生物安定性の向上した新しいコラーゲンをベースとしたマトリックスが発 見された。このコラーゲン材料は従来の架橋剤なしにつくられる。このマ） Ｉ Ｊラックスおける型１． Ｉｆま几はＩのコラーゲンはカルボジイミｒま几はス クシンイミジル活性エステルおよび（または）５０から２００°Ｃにわたる温度 における厳しい脱水条件を用いて架橋される。このような架橋コラーゲンは一般 に約Ｉ Ｘ １ ［３’から５ ［Ｉ Ｘ １ ［１’全越える分子量をもつ。Recently, new collagen-based matrices with improved biostability have been developed. It was seen. This collagen material is made without conventional crosslinking agents. This ma) I Type 1 in J Lux. If the collagen of I is carbodiimirase succinimidyl active ester and/or a temperature ranging from 50 to 200°C is cross-linked using severe dehydration conditions. Such cross-linked collagen is generally It has a molecular weight in excess of about IX1[3' to 5[IX1[1'].
隣り合った架橋間のコラーゲンの分子量は共有結合の形成に工り約１０００から ｉ ｏ ｏ、ｏ ｏ ｏまでを変化する。コラゲナーゼおよび他のプロテイナー ゼによる劣化に対する抵抗性の故に、この架橋コラーゲンはミクロスポンジの多 孔質マトリックスとして特に適することがわかった。事実、固定化生物体、とシ ）わけモノクローン抗体を浸出するハイプリドーマ細胞の連続培養に使用し友と き、このコラーゲン材料からつくられ友ミクロスポンジは幾つがの驚くべき性質 を示した。例えば、本質的に無タンパク培地で培養されたハイプリドーマは、こ のようなコラーゲンマトリックスミクロスポンジ上および（または）スポンジ中 に固定化したとき、このようなマトリックスが存在しない場合ｘＤもモノクロー ン抗体産生においてはるかに効果的である。更にまた、ここに特に言及した架橋 コラーゲン材料からつくられたミクロスポンジは、生きている（生活力のある） 細胞を高濃度で優先的に保持し、生活力のない細胞を排除する工うである。The molecular weight of collagen between adjacent crosslinks varies from about 1000 to 1,000 to form covalent bonds. Changes from i o o to o o o. Collagenase and other proteins This cross-linked collagen is highly resistant to degradation by microsponges. It has been found to be particularly suitable as a porous matrix. In fact, immobilized organisms and ) Used in continuous culture of hybridoma cells to exude monoclonal antibodies The micro-sponge made from this collagen material has some amazing properties. showed that. For example, hybridomas grown in essentially protein-free media are on and/or in collagen matrix microsponges such as xD is also monochrome in the absence of such a matrix when immobilized on much more effective in producing antibodies. Furthermore, the crosslinking specifically mentioned herein Micro sponges made from collagen materials are alive (have vitality) It is a technique that preferentially retains cells at high concentrations and eliminates cells that have no vitality.
特に適当な架橋コラーゲンは、型■、■・お工び■の可溶性コラ−ｒンお工び不 溶性コラーゲンの両方からつくることができる。可溶性コラーゲンは、このよう な型のコラーゲンに富む組織の制限酵素消化および（または）抽出によりつくら れる。不溶性コラーゲンは次の典型的な給源から誘導される：型Ｉのコラーゲン 材料、豚、鶏および魚の皮、牛および鶏の弛、および牛および鶏の骨（胎児組織 を含む）；型■のコラーゲン：牛の関節軟骨組織、鼻中隔、胸骨の軟骨組織；お よび型■のコラーゲン：牛お工びヒトの大動脈および皮膚。例えば、牛の真皮か ら得られる型■コラーゲンを使用できる。型Ｉの臆コラーゲン全用いることが好 ましい。Particularly suitable cross-linked collagens include soluble collagen of types 1, 2, and 3. It can be made from both soluble collagen. Soluble collagen is like this Produced by restriction enzyme digestion and/or extraction of tissues rich in various types of collagen. It will be done. Insoluble collagen is derived from the following typical sources: Type I collagen materials, pig, chicken and fish skins, cow and chicken fluff, and cow and chicken bones (fetal tissue ); type ■ collagen: bovine articular cartilage tissue, nasal septum, and sternum cartilage tissue; Types of collagen: bovine and human aorta and skin. For example, cow dermis Collagen of type ■ obtained from can be used. It is preferable to use all type I collagen. Delicious.
本発明の広い実施において、架橋コラーゲンミクロスポンジの物理的形態′！！ 友は巨視的輪郭に特に制限はない。ミクロスポンジは、ビーズ、フレーク、円板 、繊維、フィルム、被覆物（例えば、拡張された表面支持体上）、およびンート ヲ含め種々な物理的形状で使用できる。例えば、ミクロスポンジはペレット、星 状材、らせん環、クロス パーティション リング、ラシツヒ環、バールサドル 、インタロクスサドル、おおい環、テラーレット環などの工うな公知支持体上の 被覆物として提供できる。ミクロスポンジはシート形、円筒形、または何か他の 未支持構造で提供することもできる。In the broad implementation of the present invention, the physical form of cross-linked collagen microsponges'! ! There is no particular restriction on the macroscopic contour of the friend. Micro sponges include beads, flakes, and disks. , fibers, films, coatings (e.g. on extended surface supports), and It can be used in a variety of physical forms, including: For example, micro sponges are pellets, stars Shaped materials, spiral rings, cross partition rings, Lassitzchi rings, burl saddles , interox saddle, canopy ring, telleret ring, etc. on known supports. Can be provided as a coating. Micro sponges can be sheet-shaped, cylindrical, or some other It can also be provided in an unsupported structure.
本発明方法の広い実施において、ミクロスポンジの大きさに特に制限はない。例 えば、充填床または固定床用（例えば、プラグ フロー リアクター）に対して ミクロスポンジはこのような応用面に典型的な寸法で提供できる。駆動反応器系 で高濃度の生物体を培養するのに適合させ、そして栄養物の固定化生物体への移 動およびミクロスポンジからの望む生成物の移動を許す庭め、本発明に係る重量 付与ミクロスポンジ、なるべくはコラーゲンは幾つかの機能上の要件を満さねば ならない。ミクロスポンジは典型的にはビーズの形状にあシ、約１００ミクロン から１０００ミクロン、なるべくは約２００ミクロンから５００ミクロンの範囲 内の粒度をも几ねばならない。もっと大きい粒度においては、固定化生物活性材 料とそれと接触した液体媒質との間の反応による望む製品の製造に対し、多孔質 構造の内部容積全体が有効に利用されず、従ってこのようなミクロスポンジを用 いる駆動反応器の体積生産性音感くする。より小さい粒度はミクロスポンジの製 造および駆動反応器の操作において実際的な問題全提出する。In the wide implementation of the method of the invention, there are no particular restrictions on the size of the microsponges. example For example, for packed or fixed bed applications (e.g. plug flow reactors) Microsponges can be provided in dimensions typical of such applications. Drive reactor system suitable for culturing high concentrations of organisms in The weight according to the invention allows for the transfer of the desired product from the microsponge and the microsponge. The applied microsponge, preferably collagen, must meet several functional requirements. No. Microsponges typically have reeds in the shape of beads, approximately 100 microns in diameter. to 1000 microns, preferably approximately 200 microns to 500 microns. The internal particle size must also be checked. For larger particle sizes, immobilized bioactive materials For the production of the desired product by reaction between the material and the liquid medium in contact with it, porous The entire internal volume of the structure is not utilized effectively and therefore it is difficult to use such microsponges. The volumetric productivity of the driven reactor is improved. Smaller particle size is made of micro sponge All practical problems in the construction and operation of drive reactors are presented.
ミクロスポンジの透過性はもう一つの重要な問題である。ミクロスポンジの透過 性はその多孔性あるいは空隙分率とその細孔構造の相互関係にニジ決まる。空隙 分率は材料の間質容積対材料にニジ占められる全体積の比として定義され、しば しば百分率として表わされる。高生物濃度での操作を許すためには、ミクロスポ ンジは約７０係から９８係の空隙分率金もたねばならない。なるべく、コラーゲ ンミクロスポンジの空隙分率は８５チよυ大であるのがよく、約９０Ｌ０大きい のが最も望ましい。The permeability of microsponges is another important issue. Transmission of micro sponge Its properties are determined by the interrelationship between its porosity or void fraction and its pore structure. void Fraction is defined as the ratio of the interstitial volume of the material to the total volume occupied by the material, and is often Often expressed as a percentage. To allow operation at high biological concentrations, microspores must be The resin should have a void fraction of about 70 to 98 parts. Collage if possible The void fraction of micro-sponge is preferably 85 mm, which is about 90 L0 large. is the most desirable.
ミクロスポンジは一！九表面細孔構造に対し開口を有しなければならない。これ は過度のせん断力なしに細胞入口、細胞保持、その後の細胞発育、および過剰な 細胞集団の排出を可能にする。例えば、望む製品が生物体により分泌されない場 合（例えば、インシュリンのような非浸出ｒ ＤＮＡ製品を有する遺伝学的に処 理された二づ囮Ｌ）、その生物体は固定化集落が***により膨張するにつれてミ クロスポンジから脱出できなければならない。もしこの過程をミクロスポンジ構 造全破裂させることなく連続式で進めようとするならば、開口細孔構造が絶対必 要である。望む生物製品は培養収穫液に伴なわれた成分として回収される。Micro sponge is the best! It must have an opening to the nine surface pore structure. this prevents cell entrance, cell retention, subsequent cell development, and excessive shear forces without excessive shear forces. Allowing evacuation of the cell population. For example, if the desired product is not secreted by the organism, (e.g. genetically treated products with non-leachable rDNA products such as insulin) As the immobilized colony expands due to fission, the organism grows You must be able to escape from the black sponge. If this process were to be carried out using a micro-sponge structure, If we want to proceed in a continuous manner without completely rupturing the structure, an open pore structure is absolutely necessary. It is essential. The desired biological product is recovered as a component of the culture harvest fluid.
ミクロスポンジは最小の微生物に対し、またウィルスに対し約１ミクロン、大き い哺乳動物細胞および植物細胞に対し約１５０ミクロンまでの範囲内の平均寸法 をもつ細孔を含むべきである。一般に、ミクロスポンジの細孔は、固定化生物活 性材料の最小主要寸法と少なくとも同じ位大きく、そして最大主要寸法の約５倍 未満でなければならない。なるべくは、マトリックスの細孔寸法は、生物体また は細胞の平均直径の１．５から３倍程度であるのがよい。もし不明ならば、ある 生物体の最小および最大主要寸法は公知の技術を用いて決定できる。出願者等は 、粒度および細孔寸法のここに挙げた組み合わせが、構成成分、例えば栄養物の 固定化生物体への十分な物質移動、ならびに構成成分、例えば固定化生物体から の望む代謝産物の十分な物質移動全確保することを見出した。Microsponges are effective against the smallest microorganisms and viruses, approximately 1 micron in size. Average size in the range of up to about 150 microns for small mammalian and plant cells should contain pores with Generally, the pores of microsponges are at least as large as the smallest major dimension of the material and about five times the largest major dimension. Must be less than Preferably, the pore size of the matrix is is preferably about 1.5 to 3 times the average diameter of the cells. If unknown, there is The minimum and maximum major dimensions of an organism can be determined using known techniques. Applicants etc. , particle size and pore size are suitable for constituents, e.g. nutrients. Sufficient mass transfer to the immobilized organism as well as components e.g. It has been found that sufficient mass transfer of all desired metabolites can be ensured.
駆動反応器系で使用するためには、ミクロスポンジ（例えば、コラーゲン）もま た重量全付与しなければならない。本発明にマトリックス材料として使用する重 合体材料（例えば、架橋コラ−ｒン）は一般に約１．０以下の比重をもつ。駆動 反応器での適当な操作に対しては、約１．０５以上、なるべくは約１．６以上、 そして最も好ましくは約１．６から２．０の比重が望まれる。Microsponges (e.g. collagen) can also be used in driven reactor systems. The full weight must be given. Heavy metals used as matrix materials in the present invention The coalescent material (eg, crosslinked colaene) generally has a specific gravity of about 1.0 or less. drive For proper operation in the reactor, it is about 1.05 or more, preferably about 1.6 or more, And most preferably a specific gravity of about 1.6 to 2.0 is desired.
ミクロスポンジ中にある種の重量付与性添加物を導入することに二って、その空 隙分率を望ましくない程減少させることなく適切な比重をもつコラーゲンミクロ スポンジを得ることが可能であることが意外にもわがった。重量付与性添加物は 反応器環境で実質的に不活性でなければならず、そして固定化生物体に対して無 毒性でなければならず、あるいは添加物を無毒性にするよう適当に処理しなけれ ばならない。また、重量付与性添加物は固定化生物体の生産性に悪影響を及ぼし てはならない。一般に、約４以上、そしてなるべくは約７以上の比重を有する金 属およびそれらの合金および酸化物、およびセラミックスといつ几材料が使用さ れる。本発明の広い実施に使用するのに適した重量付与性添加物の例は、クロム 、タングステン、モリブデ例えばモネル、３１６ステンレス、♂タリウム（クロ ムおよびモリブデンを含むコバルト合金）、チタン６ＡＩ−４Ｖ（アルミニウム お工びバナジウムを含むチタン合金）、お工びハイネス ステライト合金２５（ クロム、ニッケル、タングステンおよびマンガンを含むコバルト合金）である。The introduction of certain weight-giving additives into the microsponge also helps Collagen micro with appropriate specific gravity without undesirably reducing porosity I surprisingly discovered that it is possible to obtain sponges. Weight-imparting additives Must be substantially inert in the reactor environment and non-toxic to immobilized organisms. Must be toxic, or must be properly treated to render the additive non-toxic. Must be. Additionally, weight-imparting additives have a negative impact on the productivity of immobilized organisms. must not. Generally, gold has a specific gravity of about 4 or more, and preferably about 7 or more. metals and their alloys and oxides, and when ceramics and materials are used. It will be done. Examples of weight-imparting additives suitable for use in the broad practice of this invention include chromium , tungsten, molybde such as Monel, 316 stainless steel, thallium (chrome) titanium 6AI-4V (cobalt alloy containing aluminum and molybdenum), titanium 6AI-4V (aluminum Titanium alloy containing vanadium), Titanium alloy containing vanadium), Stellite alloy 25 ( cobalt alloys containing chromium, nickel, tungsten and manganese).
しかし、これら材料の多くはある種の生物体と適合しないことがあり、ある応用 に対する毒性を査定する几め日常的実験が必要となるであろう。例えば、チタン はＩ・イブリドーマについて選び抜かれた重量付与性材料であるが、それは大抵 の他の金属は細胞毒だからである。However, many of these materials may be incompatible with some organisms and may Careful routine experiments to assess toxicity will be required. For example, titanium is the weight-giving material of choice for I. ibridoma, but it is mostly This is because other metals are cytotoxic.
重量付与性添加物は、微粉砕粉末としてミクロスポンジ中に隈な（導入分散させ ることができ、その大抵の粒子は１０から４０ミクロン程度の粒度をもつ。しか し、重量付与性添加物の表面積を最小にするｍめ、それを中空でない芯としてミ クロスポンジに使用することが望ましい。望まれる比重？もつミクロスポンジ全 書るために十分な重量付与性材料を添加する。平均細孔寸法２０から４０ミクロ ンそして空隙分率的９９φを有するコラーゲンの厚さ５０ミクロンの層で被覆さ れた約７．０の比重ヲモつ直径５０ミクロンの重量付与性添加物の芯は、約１． ７の比重と全空隙分率約８５係を有するミクロスポンジを生ずる。このようなミ クロスポンジは好気的駆動反応器系に使用するのに特に適する。The weight-imparting additive is introduced and dispersed in the microsponge as a finely ground powder. Most particles have a particle size on the order of 10 to 40 microns. deer In order to minimize the surface area of the weight-imparting additive, it is mixed as a solid core. It is recommended to use it for black sponge. Desired specific gravity? All micro sponges Add enough weight-giving material to write. Average pore size 20 to 40 microns and coated with a 50 micron thick layer of collagen with a void fraction of 99φ. The core of the weight-imparting additive has a specific gravity of about 7.0 and a diameter of about 50 microns. This results in a microsponge having a specific gravity of 7 and a total void fraction of about 85. Mi like this Closponge is particularly suitable for use in aerobically driven reactor systems.
最後に、駆動応用面に対してコラーゲンミクロスポンジは摩滅に対し適当な抵抗 を示さねばならない。−回分の仕込量のミクロスポンジは、なるべ（は３から６ ケ月またはそれ以上の程度の有効寿命を有するべきである。一般的には、ミクロ スポンジは３ケ月の操作後で約１０％以下の体積損失を示すべきである。Finally, for drive applications, collagen microsponges offer adequate resistance to abrasion. must be shown. - The amount of micro sponge prepared per batch is 3 to 6 It should have a useful life of several months or more. Generally, micro The sponge should exhibit no more than about 10% volume loss after three months of operation.
通常、生物体は固体支持体に対するそれらの付着の度合に広い変動を示す。例え ば、ある種の生物体は有機および無機材料の両方を含めて、多種多様の支持体に 容易にくっつく、あるいは付着するが、一方他のものは生物学的起源の支持体に のみ付着するであろう（付着依存型生物）。他の生物体はどの支持体材料に対し ても直接付着を殆ど示さない（付着非依存型生物体）。本発明に係るミクロスポ ンジは、それが重合体（有機）材料からつくられていることとその透過性（多孔 性お工び細孔構造）の故に実質的にあらゆる型の生物体の固定化に適しているに 違いない。Typically, living organisms exhibit wide variation in their degree of attachment to solid supports. example For example, some organisms can accommodate a wide variety of supports, including both organic and inorganic materials. easily stick or attach, while others attach to supports of biological origin. (adhesion-dependent organisms). For which support material are other organisms However, they show almost no direct attachment (adhesion-independent organisms). Microspores according to the present invention The reason for this is that it is made from a polymeric (organic) material and its permeability (porosity). Due to its unique pore structure, it is suitable for the immobilization of virtually any type of organism. Must.
事実、下に一層詳細に述べるように、固定化生物体の付着傾向に最もよく順応す るようにミクロスポンジの微細構造あるいは輪郭を仕立てることさえ可能である 。例えば、金網構造をもつミクロスポンジ（第１図）は付着非依存型生物体に関 して使用できるが、一方案状構造？示すミクロスポンジ（第２図）は付着依存型 の生物体について使用できる。In fact, as will be discussed in more detail below, those that best adapt to the adhesion tendencies of immobilized organisms It is even possible to tailor the microstructure or contours of microsponges to . For example, microsponges with a wire mesh structure (Figure 1) are associated with non-adhesion-dependent organisms. Can it be used as a draft structure? The microsponge shown (Figure 2) is an adhesion-dependent type. Can be used for living organisms.
吸着および化学的カップリングといった技術を含めて、このような生物体をミク ロスポンジ上に固定化するため先行技術により使用された適当な手順はいずれも 本発明に使用できる。例えば、ある生物体の場合に、特定生物体で接種し文発酵 液中でコラーゲンミクロスポンジ金混合するだけで済むであろう。短時間後に、 生物体はミクロスポンジに住みつき、その細孔中に捕捉されるようになる。フィ ブロブラストおよびハイプリドーマのような若干の生物体の場合には、ミクロス ポンシヲ接種に先立ちフィブロネクチン、ポリリジンぉ工び抗−ハイプリドーマ 抗体といった付着増進材料で被覆することが望ましいかもしれない。他の技術、 例えばミクロスポンジの表面に正味の電荷を適用することも固定化を促進するの に使用できる。techniques such as adsorption and chemical coupling can be used to mix these organisms. Any suitable procedure used by the prior art for immobilization on Rosponge Can be used in the present invention. For example, in the case of a certain organism, inoculating it with a specific organism and fermenting it It would be sufficient to simply mix the collagen microsponge gold in the liquid. After a short time, Organisms colonize microsponges and become trapped within their pores. Fi In the case of some organisms such as bloblasts and hyperdomas, micros Fibronectin, polylysine and antihyperdoma were administered prior to Ponshio vaccination. It may be desirable to coat with an adhesion promoting material such as an antibody. other technologies, For example, applying a net charge to the surface of the microsponge may also promote immobilization. Can be used for
本発明の広い実施において、固定化生物活性材料を、固定化生物体の培養のため の発育支持培地といった液体試薬流と直接接触させるために使用する手順には特 に制限がなく、かきまぜタンク反応器、固定床反応器、流動床反応器、および移 動床反応器などといつ文公知の装置を含めて先行技術に利用できる多数の装置の いずれも使用できることは当業者に工り認識されるであろう。一般に、生物体を 培養するときは、ミクロスポンジを適当な反応器に入れ、その中で栄養発酵液お よび生物体の接種材と混合する。ミクロスポンジは完全に浸没させるべきである 。ミクロスポンジを、生物体が発育しミクロスポンジの多孔質マトリックスを集 落化するようにインキュベーションする。新しい栄養発酵液全発育に必要な他の 物質、例えば好気性生物体の場合には酸素、と共に反応器に連続的に供給し、生 化学製品を含む収穫液を回収する。生化学製品は固定化生物体の一次または二次 代謝産物、固定化生物体に工υ生じた、例えば非分泌生成物、固定化酵素で触媒 された反応生成物などを含む過剰のバイオマスからなシうる。In the broad practice of the invention, the immobilized bioactive material is used for culturing immobilized organisms. Procedures used for direct contact with liquid reagent streams, such as growth support media, are There are no restrictions on stirred tank reactors, fixed bed reactors, fluidized bed reactors, and transfer A large number of devices are available in the prior art, including moving bed reactors and other devices known in the art. Those skilled in the art will recognize that either can be used. In general, living organisms When culturing, place the microsponge in a suitable reactor and add the nutrient fermentation liquid and and biological inoculum. Microsponge should be completely immersed . Microsponges are formed by organisms that grow and collect the microsponge's porous matrix. Incubate so that it dries down. New nutrients fermentation liquid other necessary for full growth The reactor is continuously fed with a substance, e.g. oxygen in the case of aerobic organisms, to Collect harvest liquor containing chemicals. Biochemical products are primary or secondary immobilized organisms. Metabolites, produced by immobilized organisms, e.g. non-secreted products, catalyzed by immobilized enzymes. Excess biomass containing recycled reaction products, etc., can be removed.
本発明ミクロスポンジの一つの特別な利点は、それを流動床反応器の工うな混合 あるいは駆動系で使用できる点である。本明細書中で用いた「駆動反応器」とい う用語は、ミクロスポンジと流体媒質との間の相対的運動が一部はミクロスポン ジ自身に対して運動を与えることによって与えられる反応器系全指す。このよう な反応器系は実質的に物質移動お工びエネルヤー移動を高める。特に適当な駆動 反応器系は同時出願米国特許願第７０６，８７２号明細書（１９８５年２月２８ 日にＲｏｂｅｒｔ Ｃ，Ｄｅａｎ、 Ｊｒ、 、 Ｐｅｔ、ｅｒ Ｖ、 Ｇｒｅ ｌａお工び５ｕｂｈａｓｈ Ｂ、 Ｋａｒｋａｒｅの名前で出願）に記載されて いる。One special advantage of the microsponge of the present invention is that it can be mixed easily in a fluidized bed reactor. Alternatively, it can be used in drive systems. As used herein, "driven reactor" The term ``microsponge'' refers to the relative movement between the microsponge and the fluid medium that Refers to the entire reactor system given by the motion exerted on itself. like this The reactor system substantially enhances mass transfer and energy transfer. Particularly suitable drive The reactor system is described in co-filed U.S. Patent Application No. 706,872 (February 28, 1985). Robert C, Dean, Jr, Pet, er V, Gre 5ubhash B, filed in the name of Karkare) There is.
高度に架橋されたコラーゲンミクロスポンジをつくるには、適当なコラーゲン源 を先ず小さい「繊維」寸法に粉砕する。一般に、コラーゲンは約２００ミクロン 程度の最大寸法をもつ粒子（繊維）を得るように、例えばＷｉｌｅｙ ミルを用 いて粉砕される。なるべくは、コラーゲン源材料を１から５０ミクロン程度の直 径とせいぜい約２００ミクロンの長さに有する繊維を生ずるように粉砕（即ち、 乾式摩砕）する。コラーゲン源材料の適当な粉砕は望まれる構造のミクロスポン ジを得るために重要である。To create highly cross-linked collagen microsponges, a suitable collagen source is required. is first ground into small "fiber" sizes. Collagen is generally about 200 microns. For example, using a Wiley mill to obtain particles (fibers) with maximum dimensions of and crushed. Preferably, the collagen source material should be placed directly in the range of 1 to 50 microns. Grinding (i.e., dry milling). Appropriate grinding of the collagen source material produces microspons with the desired structure. It is important to obtain
粉砕コラ−ｒンを次にコラーゲンをベースとする溶液または分散液につくる、即 ち可溶性コラーゲンを溶媒に溶かす、あるいは不溶性コラーゲンを適当な溶媒、 特に酸類、例えば希塩酸、希酢酸などとの混合によシ溶媒に分散させる。本発明 においては、酢酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸などを含めて有機酸が特に適当で ある。幾つかの長鑓脂肪酸も使用できる。標準の混合装置を用いてコラーケゞン を液体（溶媒）中に混ぜ込む。The ground collagen is then made into a collagen-based solution or dispersion, immediately First, dissolve soluble collagen in a solvent, or dissolve insoluble collagen in a suitable solvent. In particular, it is dispersed in a solvent by mixing with an acid such as dilute hydrochloric acid or dilute acetic acid. present invention Organic acids are particularly suitable, including acetic acid, lactic acid, propionic acid, butyric acid, etc. be. Some long chain fatty acids can also be used. Collagen using standard mixing equipment mix into a liquid (solvent).
なるべ（は、コラーゲン分散液の場合には、コラーゲンの微小繊維をつくるよう に、例えばＷａ ｒ ｉ ｎ ｇプレンダーを使用する高レベルのかきまぜに工 っで混合を達成するのが工い。コラーゲンと溶媒との混合物は、典型的にはコラ ーゲン０．５チから約１．５重量％’を含有する。混合物はなるべく約２．０か ら約４．０の範囲内のＰＨを示すことが好ましい。コラーゲンの変性を避けるた め混合物の温度を十分に下げる（例えば、約４°Ｃ）限シ１．０から２．０の範 囲のＰＨも使用できる。Narube (in the case of a collagen dispersion, it is used to create collagen microfibers) For example, a high-level stirring process using a Warrinig blender can be used. The trick is to achieve mixing. The mixture of collagen and solvent is typically 0.5% to about 1.5% by weight. The mixture should preferably be about 2.0 Preferably, the pH is within the range of about 4.0. To avoid collagen denaturation Lower the temperature of the mixture sufficiently (e.g., about 4°C) to a range of 1.0 to 2.0. The surrounding PH can also be used.
次に、重量付与性添加物をコラーゲン−液体混合物と配合し、この複合混合物全 小さい液滴に形づくり、約００Ｃ以下、なるべくは約−６０℃以下の温度で凍結 させることにより迅速に凝固させて望みの寸法の粒子をつくる。小さい粒子を製 造する公知の技術はどれも本発明の実施に使用できる。適当な技術には、就中、 加圧または空気せん断噴霧、乳化技術、Ｒａｌｅｉｇｈ液体噴射不安定技術を用 いる小滴形成、押出し技術、重力または遠心力を用いる小滴形成、静電気小滴形 成、および慣性力を用いる小滴形成法が含まれる。例えば、適当に寸法をもたせ た粒子を慣性力を用いて調製して振動針のオリフィスのところで小さい液滴を形 成させる。この小滴を液体窒素の低温浴中に落下させることにより凍結させるこ とができる。明らかに他の小滴凍結用冷却浴、例えば冷却エタノールも使用でき る。また、冷凍にニジ形づくられたもつと大きい寸法の粒子を摩砕などといった 破壊技術にニジ望む粒度に小さくすることも多分できるであろう。種々な核種方 法論といった更に追加の技術を用いて重量付与性添加物の固体芯を含むミクロス ポンジを形づくることもできる。Next, the weight-imparting additive is combined with the collagen-liquid mixture, and the entire complex mixture is Shape into small droplets and freeze at a temperature below about 00C, preferably below about -60℃ This allows rapid solidification to form particles of the desired size. produce small particles Any known technique for manufacturing can be used in the practice of the present invention. Suitable techniques include, among others: Using pressurized or air shear atomization, emulsification technology, Raleigh liquid jet instability technology droplet formation using extrusion techniques, droplet formation using gravity or centrifugal force, electrostatic droplet formation droplet formation methods using inertial forces. For example, with appropriate dimensions particles are prepared using inertial force to form small droplets at the orifice of the vibrating needle. make it happen This droplet can be frozen by dropping it into a cold bath of liquid nitrogen. I can do it. Obviously other cooling baths for freezing droplets can also be used, e.g. chilled ethanol. Ru. In addition, it is possible to grind large particles of giblets that have been formed into rainbow shapes during freezing. It would probably be possible to reduce the particle size to the desired size depending on the destructive technology. Various nuclides microspheres containing a solid core of weight-imparting additives using additional techniques such as You can also form a ponzi.
この場合には、コラーゲンマトリックスの殻が重量付与芯材を包囲することにな るであろう。当業者は前記の型の小粒子の形成に適した他の技術全認識するであ ろうし、本発明は特定技術のいずれにも限定されないものとする。In this case, the shell of the collagen matrix will surround the weighting core material. There will be. Those skilled in the art will be aware of all other techniques suitable for forming small particles of the type described above. However, the invention is not limited to any particular technology.
コラーゲンミクロスポンジの細孔寸法と構造は種々な因子にニジ影響金受ける。The pore size and structure of collagen microsponges are influenced by various factors.
例えば、コラーゲン濃度の変化は細孔寸法に影響するようであシ、コラーゲン濃 度が高いと、！ニジ小さい細孔寸法を生ずる傾向がある。For example, changes in collagen concentration appear to affect pore size; If the degree is high! It tends to produce smaller pore sizes.
混合物の出および混合物調製に用いる特定の酸も、生ずるミクロスポンジの細孔 寸法と構造に影響する。例えば、あまシにも低い−はミクロスポンジの細孔寸法 を有意に制限する傾向があシ、一方高い−は元の溶液または分散液からはつきシ したコラーゲン相金分離させ、それに工す多孔質構造の形成を妨げ、そして微粉 砕重量付与性添加物を用いるときそれが分散した相中に留まる傾向をもつ。凍結 速度もミクロスポンジの構造に影響するようであシ、そしてその構造はまたコラ ーゲンの型の変化に伴ない変動するであろう。The specific acids used in blend extraction and blend preparation also affect the pores of the resulting microsponge. Affects dimensions and structure. For example, the pore size of a micro sponge is extremely low. tends to significantly limit the The collagen phase is separated from the gold, which prevents the formation of a porous structure, and makes it into a fine powder. When using a crush weight additive it tends to remain in the dispersed phase. frozen Speed also seems to affect the structure of the microsponges, and the structure is also correlated. It will fluctuate as the type of gene changes.
その後、凍結複合物上１なるべくは約５０ ミＩＪ ）ル以上の真空でまた約２ ２℃から一１００°Ｃの範囲の温度で操作した通常の装置を使用して真空凍結乾 燥する。The frozen composite is then vacuumed for 1 hour, preferably at least about 50 milliliters (IJ), and again for about 2 hours. Vacuum freeze-drying using conventional equipment operated at temperatures ranging from 2°C to -100°C. dry
凍結と乾燥の組み合わせを凍結乾燥と呼ぶ。The combination of freezing and drying is called freeze-drying.
凍結乾燥されたコラーゲンマドＩＪツクス複合物は次にコラーゲンを架橋するよ う処理される。コラーゲンは、なるべくはカルボジイミドまたはＮ−ヒドロキシ スクシンイミド−誘導活性エステル（スクシンイミジル活性エステル）からなる 群から選ばれる化学架橋剤を用いるか、または高温での強力な脱水により、また はこれら処理の組み合わせにニジ架橋できる。この工うにしてつくられたコラー ゲンマトリックスの強度と生物安定性は、との工うな処理によって導入された架 橋の度合によシ影響される。これら架橋法は、コラゲナーゼおよび他の酵素によ る劣化に対して驚く程抵抗性のあるコラーゲンマトリックスを与え、それによっ てこれらの材料は生物培養に特に適するようになる。The freeze-dried Collagen Mado IJ Tsux composite then cross-links the collagen. will be processed. Collagen is preferably a carbodiimide or N-hydroxy Consists of succinimide-derived active ester (succinimidyl active ester) by using chemical crosslinking agents selected from the group or by intensive dehydration at high temperatures; can be crosslinked by a combination of these treatments. Collar made using this method GenMatrix's strength and biostability depend on the framework introduced by the Affected by the degree of bridge. These cross-linking methods involve collagenase and other enzymes. provides a collagen matrix that is surprisingly resistant to degradation, thereby This makes these materials particularly suitable for biological culture.
化学的処理に使用できるカルポジイミＰの例はシアナミドおよび１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノゾロ２ル）−カルボジイミド境酸塩である。適当な二官 能性スクシンイミジル活性エステルには、二官能性Ｎ−ヒドロキシスククンイミ ド、３．３’−ジチオ（スルホスクシンイミジル）プロピオネートおよびぎス（ スルホスクシンイミジル）スベレートが含まれる。この工うなイヒ学架橋剤を用 いる場合、乾燥コラーゲンマトリックス材料を架橋剤溶液中におよそ室温で約２ から９６時間の時間にわたり浸漬する。架橋剤溶液は約０．１から約１５チ（重 量／容量）の架橋剤上官みうる。Examples of carposiimine P that can be used for chemical treatment are cyanamide and 1-ethyl-3 -(3-dimethylaminozolo2yl)-carbodiimide salt. appropriate second official Functional succinimidyl active esters include difunctional N-hydroxysuccinimidyl active esters. do, 3,3'-dithio(sulfosuccinimidyl)propionate and Gis( Contains sulfosuccinimidyl) suberate. Using this engineering cross-linking agent, If the dry collagen matrix material is in a crosslinker solution at about room temperature, Soak for a period of 96 hours. The crosslinker solution should be about 0.1 to about 15 (amount/volume) of the crosslinking agent.
別法として架橋剤をコラーゲン源の元の溶液あるいは分散液に加えてもよい。Alternatively, the crosslinking agent may be added to the original solution or dispersion of the collagen source.
強力な脱水を用いてコラーゲンマトリックスを架橋するには、ミクロスポンジを 約５０ミリトル以上の真空に、約２から約９６時間にわたシ約５０°Ｃから約２ ００℃、例えば約１００ から１１０℃の範囲の温度でさらす。To crosslink the collagen matrix using intensive dehydration, use a microsponge. In a vacuum of about 50 mTorr or more, for about 2 to about 96 hours, from about 50°C to about 2 00°C, for example in the range of about 100 to 110°C.
上記のように、これら二つの処理は組み合わせて使用でき、そして強力な脱水処 理とそれに続く化学処理を用いてコラーゲンマトリックスを架橋することが好ま しい。しかし、一般に、化学処理が脱水処理に先行する場合には、架橋剤を後に 続く真空脱水処理を容易にするため、マトリックス粒子の調製と凍結乾燥に先立 ち、元のコラーゲン溶液または分散液へ架橋剤を直接添加すべきである。また、 前に１及したように、コラーゲンマトリックスの強度と生体安定性はこのような 処理によシ導入された架橋の度合にｘ９影響される。As mentioned above, these two treatments can be used in combination and It is preferred to crosslink the collagen matrix using a chemical process followed by a chemical process. Yes. However, in general, if the chemical treatment precedes the dehydration treatment, the crosslinking agent is Prior to matrix particle preparation and freeze-drying to facilitate subsequent vacuum dehydration. In other words, the crosslinking agent should be added directly to the original collagen solution or dispersion. Also, As mentioned previously, the strength and biostability of the collagen matrix depend on this It is influenced x9 by the degree of crosslinking introduced by the treatment.
これらの架橋法はコラゲナーゼお工び他の酵素的劣化に対して驚く程抵抗性のあ るコラーゲンマトリックスを与え、それによってこれら材料は生物体培養に特に 適するようになる。化学処理を用いるときはいつでもコラーゲンマトリックスを 、過剰な架橋剤全除去するために、先の使用に先立ち十分工く洗浄すべきである 。These crosslinking methods are surprisingly resistant to collagenase and other enzymatic degradation. provide a collagen matrix that makes these materials particularly suitable for biological culture. become suitable. Collagen matrix whenever chemical treatments are used , should be thoroughly washed prior to further use to remove all excess cross-linking agent. .
高度に架橋されたコラーゲンを製造するための手順に関するこれ以上の情報は、 Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｈ，５ｔｌｖｅｒ。Further information on procedures for producing highly cross-linked collagen can be found at Frederick H, 5tlver.
Ｒｌｃｈａｒｄ Ａ、 Ｂｅｒｇ、 Ｄａｖｉｄ Ｅ、 Ｂｉｒｋ、 Ｋｅｖｉ ｎ ＷｅａｄｏｃｋおよびＣｏｎｒａｄ Ｗｈｙｎｅの名で１９８４年３月１７ 日に出願され、「生物分解性マトリックスならびに同製造到と題した米国特許願 第５９３，７３３号明細書から得ることができ、そしてこの開示は参考としてこ こに取り入れである。Rlchard A, Berg, David E, Birk, Kevi March 17, 1984 under the names of Weadock and Conrad Whyne United States Patent Application entitled ``Biodegradable Matrix and its Manufacturer'' filed on No. 593,733, the disclosure of which is incorporated herein by reference. This is how it was introduced.
架橋されたコラーゲンマトリックスを超純水中で十分よく洗浄後、ミクロスポン ジを次に通常の滅菌技術を用いて滅菌することができる。コラーゲンミクロスポ ンジの一つの特別な利点は、これらを生物体固定化工程と切離して製造でき、結 果としてこれらを接種前に適切に滅菌あるいは貯蔵できる。ミクロスポンジはガ ンマ−線照射を用いて滅菌するのがよい。ミクロスポンジの重要な特徴が傷つけ られない限シ、別法としてエチレンオキシＹも使用でき、これは当業者にとって 公知の追加減菌手順かもしれない。エチレンオキ７ドを用いてミクロスポンジを 滅菌する場合に、明らかに生物体培養のためにミクロスポンジを後で使用する前 に、この滅菌剤のすべての痕跡を除去するため粒子を十分よく通気しがければな らない。コラーゲンを架橋するために用いた高温で長時間の強力な脱水処理は、 ミクロスポンジを申し分なく滅菌できるので、追加処理を除くことができること も発見された。After thoroughly washing the cross-linked collagen matrix in ultrapure water, microspons The tube can then be sterilized using conventional sterilization techniques. collagen microspo One particular advantage of these is that they can be manufactured separately from the biological immobilization process, resulting in As a result, they can be properly sterilized or stored before inoculation. The micro sponge is Sterilization is preferably performed using laser radiation. Important features of micro sponges are scratch-resistant Alternatively, ethyleneoxy Y can also be used, unless otherwise known, and will be understood by those skilled in the art. There may be additional sterilization procedures known in the art. Micro sponge using ethylene oxide When sterilizing, clearly before using the microsponge for biological culture. The particles must be aerated well to remove all traces of this sterilant. No. The intense dehydration treatment at high temperatures and for a long time used to crosslink collagen. The microsponge can be sterilized satisfactorily, thus eliminating the need for additional processing. was also discovered.
滅菌されたミクロスポンジは究極の消費者へ配達するため無菌的に包装するのが よい。使用者は単にミクロスポンジを前以て滅菌した反応器に入れ、適当な栄養 物と接種材を加え、そして操作を開始するだけである。特に適当な具体例におい ては、この包装は実際には栄養物流の供給、収穫液の取出し、そして必要に応じ 付随的な操作、例えば熱交換、酸素供給およびプロセス制御のための必要な接続 部を有する使い捨て反応容器からなる。流動床反応に対しては、その容器は適当 に設計された分布板を含むことになろう。このようなプレパック使い捨て反応容 器は約０．１１から１０１の容量金有しうる。この場合反応器使用者はポンプ類 、弁、配管類、熱およびガス交換器、および各種計測器およびプローブからなる プロセス装置に括め、そして操作を開始するだけである。滅菌済のすぐ使用に供 せるミクロスポンジでプレパックされた使い捨て反応器を提供することは、とり わけ一つの培養から他の培養へと変える場合に生物培養の手順の開始を有意に単 純化する。Sterilized micro sponges must be packaged aseptically for delivery to the ultimate consumer. good. Users simply place the microsponge into a pre-sterilized reactor and add appropriate nutrients. Simply add the material and inoculum and begin operation. Especially in suitable specific examples. In practice, this packaging is used to supply the nutrient distribution, extract the harvest liquid, and as needed. Necessary connections for ancillary operations, e.g. heat exchange, oxygen supply and process control consists of a disposable reaction vessel with a For fluidized bed reactions, the container is suitable It would include a distribution plate designed to. Pre-packed disposable reaction containers such as The vessel may have a capacity of about 0.11 to 101. In this case, the reactor user must use the pumps. , consisting of valves, piping, heat and gas exchangers, and various instruments and probes. Simply attach it to your process equipment and begin operation. Sterile, ready-to-use Providing disposable reactors pre-packed with microsponge that Significantly simplifies the initiation of biological culture procedures when changing from one culture to another. Purify.
完全には理解されていないが、プロセスパラメーターの変化は、高度に架橋され たコラーデンマ） ＩＪラックス構造あるいは輪郭における重大な変化につなが る。Although not fully understood, changes in process parameters may result in highly cross-linked lead to significant changes in the IJ lux structure or contour. Ru.
前記技術を用いてつくられたコラーゲンマトリックスの顕微鏡写真である第１図 および第２図はこれらの異なる構造を説明している。第１図お工び第２図の顕微 鏡写真は走査電子顕微鏡を用いて得た。第１図は実質的に金網構造を有するコラ ーゲンマトリックスを示す。Figure 1 is a micrograph of a collagen matrix produced using the above technique. and FIG. 2 illustrate these different structures. Fig. 1. Microscope shown in Fig. 2. Mirror photographs were obtained using a scanning electron microscope. Figure 1 shows a structure that essentially has a wire mesh structure. This shows the gene matrix.
この構造において繊維網状組織の直径は典型的には約１ミクロン程度である。こ の構造はハイシリドーマの工うな付着非依存型生物に対して特に望ましい。この マトリックスにおいては、かかる生物はマトリックス構造中にまた構造上に捕捉 される工うになる。第２図は葉状型マ） ＩＪツクス構造金示す。この構造の葉 は典型的には約１ミクロン程度の厚さをもつ。この構造はフィブロプラスト細胞 の工うな付着依存型細胞に対して特に適当である。現在では、ビーズ製造工程に おける小滴の冷却（凍結）速度がコラーゲンミクロスポンジの形態学に影響する と考えられる。In this structure, the diameter of the fiber network is typically on the order of about 1 micron. child The structure is particularly desirable for attachment-independent organisms such as hypersilidomas. this In matrices, such organisms become entrapped in and on the matrix structure. The work that will be done will be done. Figure 2 shows the IJTx structure. Leaves of this structure typically has a thickness on the order of about 1 micron. This structure is a fibroplast cell It is particularly suitable for attachment-dependent cells. Currently, the bead manufacturing process The rate of cooling (freezing) of droplets in the pores influences the morphology of collagen microsponges. it is conceivable that.
のであって発明の範囲に制限を加えるものではない。However, it is not intended to limit the scope of the invention.
例 １ 本例は高度に架橋されたコラーゲンマトリックス材料のミクロスポンジの製造全 記述する。Example 1 This example describes the entire manufacturing process of a highly cross-linked collagen matrix material microsponge. Describe.
部分的に精製しｆｃ腕コラーゲン全、ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得られる Ｗｉｌｅｙミルを使用して長さ約２００ミクロン未満、直径約５から５０ミクロ ンを有する繊維を得た。次に一定量の粉砕コラーゲン材料を酢酸溶液とＷａｒｉ ｎｇプレンダーを用いて混合して２約３．０、コラーゲン約１．０係（重量）ｔ −有するコラーデンベース分散液を調製した。次にこのコラーゲンをペースとす る分散液へ、不活性な重みつけ材料であるチタンを約５から約１８０ミクロンの 範囲内の粒径をもつ微粉として加えた。Partially purified whole FC arm collagen, obtained from VWR5 scientific Less than about 200 microns in length and about 5 to 50 microns in diameter using a Wiley mill A fiber having a 100% carbon content was obtained. Next, a certain amount of crushed collagen material is mixed with acetic acid solution and Wari Mix using a ng blender to obtain approximately 3.0 t of collagen and approximately 1.0 t of collagen (weight) - A colladen-based dispersion was prepared. Next, use this collagen as a pace. The inert weighting material, titanium, is added to the dispersion in a thickness of about 5 to about 180 microns. It was added as a fine powder with a particle size within a range.
次に複合混合物を先ず複合混合物の小滴をつくることにニジ固体粒子に成形した 。小滴は、約９０８Ｚの周波数で振動させた内径約１．３ミＩＪメートルの振動 中空針を通して複合混合物上流すことによシつくつ友。The composite mixture was then shaped into solid particles to first create droplets of the composite mixture. . The droplets were vibrated with an inner diameter of approximately 1.3 mm IJ meters vibrated at a frequency of approximately 908Z. The compound mixture can be passed through a hollow needle.
小滴は液体窒素の冷却浴中に落下し、迅速に凍結した。The droplets fell into a cooling bath of liquid nitrogen and quickly froze.
次にこの複合混合物の凍結小滴全約１０ミリトルの真空で約４８時間Ｖｉｒｔｉ ｓ Ｆｒｅａｚｅｍｏｂｉｌｅ ＬｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒＭｏａｅ１６ ’ｒ用 いて真空乾燥した。The frozen droplets of this complex mixture were then incubated in a vacuum of about 10 mTorr for about 48 hours. s Freezemobile Lyophilizer Moae16’r and vacuum dried.
この凍結乾燥後、乾燥ミクロスポンジを■田５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃの乾燥オープ ンを使用して温度約１００°Ｃにおいて約１０ ミＩＪ ）ルの真空下に約７２ 時間強力な脱水（脱水熱処理）に付した。次にミクロスポンジを化学架橋剤とし てのシアナミドの１．０ ％ （重量）溶液で約５．５０ＰＨで約２０°Ｃにお いて約２４時間処理した。After this freeze-drying, the dried microsponge is dried in a scientific dryer. At a temperature of about 100°C and under a vacuum of about 10 mil (IJ) using a It was subjected to intensive dehydration (dehydration heat treatment) for hours. Next, microsponge is used as a chemical crosslinking agent. A 1.0% (by weight) solution of cyanamide at about 5.50 PH and about 20°C. and treated for about 24 hours.
高度に架橋されたミクロスポンジ上次に超純水を使用して約２４時間中分工く況 浄し、乾燥し、次にガンマ−線照射により滅菌した。このミクロスポンジは約２ ００から８００ミクロンの範囲内の粒度、約７７係程度の空隙分率、約２０ミク ロン程度の細孔寸法、および約１．１程度の比重を有した。このミクロスポンジ は金網微細構造を有した。The highly cross-linked micro sponge is then separated using ultrapure water for about 24 hours. It was cleaned, dried and then sterilized by gamma irradiation. This micro sponge is about 2 Particle size in the range of 00 to 800 microns, void fraction of about 77 microns, about 20 microns It had a pore size on the order of 1.2 mm and a specific gravity on the order of 1.1. This micro sponge had a wire mesh microstructure.
例 ２ 例１のミクロスポンジを用いてハイシリドーマ細胞の発育を支えることができ友 。特に、約ｓｏｏｍｌのミクロスポンジｔ ６００ ｍＡの反応容器に含めるこ とができた。ミクロスポンジをノ・イブリドーマ細胞で接種し、適当な栄養培地 を用いて培養することができた。反応器の内容を激しくかきまぜながら、反応器 を約２５〜４０％の固体濃度で操作することができた。１０チの胎児子牛血清を 含む栄養培地、例えばＤｅｌ’ｂｅｃｋ。Example 2 The microsponge of Example 1 can be used to support the growth of hyperciridoma cells. . In particular, approximately 600 mA of microsponge can be included in the reaction vessel. I was able to do it. Microsponges were inoculated with N. hybridoma cells and placed in appropriate nutrient medium. was able to be cultured using While vigorously stirring the contents of the reactor, could be operated at solids concentrations of about 25-40%. 10cm fetal calf serum A nutrient medium containing, for example Del'beck.
ＭＯｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地を連続式に反応器に供給し、モノクローン抗 体を含む生成物流を実質的に等価な流速で回収できた。Modified Eagle medium is continuously supplied to the reactor, and monoclonal anti- The product stream containing the bodies could be recovered at substantially equivalent flow rates.
本発明の真の主旨と範囲から離れることなく数多くの改変をなしうろことは当業 者にとって明白であろう。It will be apparent to those skilled in the art that numerous modifications may be made without departing from the true spirit and scope of the invention. It will be obvious to anyone.
本発明の主旨と範囲は請求の範囲によってのみ制限されるものとする。It is intended that the spirit and scope of the invention be limited only by the scope of the claims.
ＦＩｏ、 １ ＦＩＧ、 ２゜ 国際調査報告FIo, 1 FIG, 2゜ international search report
Claims (1)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71988085A | 1985-04-04 | 1985-04-04 | |
| US719881 | 1985-04-04 | ||
| US719880 | 1985-04-04 | ||
| US732736 | 1985-05-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62502936A true JPS62502936A (en) | 1987-11-26 |
| JPH0577390B2 JPH0577390B2 (en) | 1993-10-26 |
Family
ID=24891750
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50208686A Granted JPS62502936A (en) | 1985-04-04 | 1986-03-26 | Microsponges and bioreactors |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62502936A (en) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62122586A (en) * | 1985-06-18 | 1987-06-03 | イエダ リサ−チ アンド デベロツプメント コンパニ− リミテツド | Matrix used in cell culture |
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| US10240122B2 (en) | 2014-02-14 | 2019-03-26 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Active-ester-group-containing composition for producing fibers, and cell culture scaffold material using fibers produced from active-ester-group-containing composition |
-
1986
- 1986-03-26 JP JP50208686A patent/JPS62502936A/en active Granted
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| US9896563B2 (en) | 2005-08-10 | 2018-02-20 | Toray Industries, Inc. | Process for producing spongelike structure |
| WO2007020713A1 (en) | 2005-08-18 | 2007-02-22 | Koken Co., Ltd. | Cell culture support embeddable in vivo |
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| US10240122B2 (en) | 2014-02-14 | 2019-03-26 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Active-ester-group-containing composition for producing fibers, and cell culture scaffold material using fibers produced from active-ester-group-containing composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0577390B2 (en) | 1993-10-26 |
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