JPS62122586A - Matrix used in cell culture - Google Patents
Matrix used in cell cultureInfo
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- JPS62122586A JPS62122586A JP61142455A JP14245586A JPS62122586A JP S62122586 A JPS62122586 A JP S62122586A JP 61142455 A JP61142455 A JP 61142455A JP 14245586 A JP14245586 A JP 14245586A JP S62122586 A JPS62122586 A JP S62122586A
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- C12N2533/50—Proteins
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は各橋生活細胞の試験管内培養および生長に、特
に有効に生長し、栄養物乞代謝し、繁殖し、そして生物
学的活性物質を生産するために固体表面に付着すること
を必要とする（無菌液体栄養培地の他に）ｌ″ｉ乳類組
繊細胞の試験管内生育に対する方法および装置に関する
。この）ような組繊細胞は［付着依存性（ａｎｃｈｏｒ
ａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ） Ｊ細胞と呼ばれる。こ
Ｃｔ）ような細胞が付着する適当な表面の供給はこれら
の試験管内培養に対する必須要件である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention relates to the in vitro culture and growth of living cells, particularly to effectively grow, metabolize nutrients, reproduce, and produce biologically active substances. It relates to a method and apparatus for the in vitro growth of l''i mammalian tissue cells (in addition to sterile liquid nutrient media) that require attachment to solid surfaces. (anchor
age dependent) called J cells. The provision of a suitable surface for attachment of cells such as Ct) is an essential requirement for these in vitro cultures.
従って組繊細胞培養は固体連続表面上で行なわれる。実
験室規模でこれらはペトリ皿、平らな側面の瓶又はロー
ラー瓶形である。大規模培養に適用できる最近の改良は
微小ビーズのような各重大きさの球および小さな長方形
流路が横断したセラミックブロックの開発であった。こ
れらのすべての装置では細胞は固体の利用できる表面上
に付着し、増殖する。細胞は適当な表面組成および電気
的表面荷電を有する表面にのみ付着する。この目的に対
し成功することがわかった材料はガラス、セラミック、
ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、デキストラン、コラー
ゲンおよび成る他の材料である。しばしばこれらの材料
の細胞付着表面は９５チ硫酸により、又は好ましくはコ
ロナ又は酸素プラズマ放電により処理され細胞の竹屑を
改良する。Therefore, tissue cell culture is performed on a solid continuous surface. On a laboratory scale these are in the form of Petri dishes, flat-sided bottles or roller bottles. A recent improvement applicable to large-scale culture was the development of ceramic blocks traversed by spheres of significant size and small rectangular channels, such as microbeads. In all these devices, cells attach and grow on any available solid surface. Cells will only attach to surfaces that have the appropriate surface composition and electrical surface charge. Materials that have proven successful for this purpose include glass, ceramics,
It is made of polyvinyl chloride, polystyrene, dextran, collagen and other materials. Often the cell attachment surfaces of these materials are treated with 95 thiosulfuric acid or preferably with a corona or oxygen plasma discharge to improve the cell debris.
（Ｋｒｕｓｅ ＆ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｔｉ５
ｓｕｅ ｑｕｌｔｕｒｅ−Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅ
ｓｓ １９８３ ）に記載のような培養条件下で、これ
らの表面と接触する細胞は表面にそれら自体が付着し隣
接し合流する単層に表面を被覆するまで繁殖する。合流
し終ると細胞の生長は停止する。細胞の連続層が達成さ
れる場会細胞生長停止の現象は「接触抑止」と呼ばれ、
二次元表面上における非がん細胞生長の特徴である。(Kruse & Patterson Ti5
sue culture-Methodsand A
applications, academic pre
Under culture conditions such as those described in J.D. SS 1983), cells in contact with these surfaces attach themselves to the surface and proliferate until they coat the surface in an adjacent, confluent monolayer. Once confluence is complete, cell growth stops. The phenomenon of cell growth arrest when a continuous layer of cells is achieved is called "contact arrest";
This is a characteristic of non-cancerous cell growth on a two-dimensional surface.
現在、試験管内組織培養に対し使用される生長表面は成
る重大な欠点に苦しむ：
ａ）これらは供給栄養培地の単位容積につき限定された
面積を供する。従って栄養培地の単位容積について生長
できる細胞数は試験管内組織の細胞の容積密度より６オ
ーダーの大きさだけ少ない。Currently, the growth surfaces used for in vitro tissue culture suffer from the following serious drawbacks: a) They provide a limited area per unit volume of feeding nutrient medium. Therefore, the number of cells that can grow per unit volume of nutrient medium is six orders of magnitude less than the cell volume density of in vitro tissue.
ｂ）これは細胞生長を開始するために高濃度の接種細胞
な要する。代表的には細胞は合流したときに達する最終
数の２０〜６０％である濃度および数で新しい培養表面
に導入される。通例、合流したときに達する数０１０％
未満で接種することはできない。b) It requires a high concentration of inoculated cells to initiate cell growth. Typically cells are introduced to a new culture surface at a concentration and number that is 20-60% of the final number reached at confluence. Usually, the number reached when merging is 010%
It is not possible to vaccinate with less than
Ｃ）非−がん細胞の細胞生長は単層に限定される。C) Cell growth of non-cancer cells is restricted to a monolayer.
ｄ）細胞は単層飽和、血清の高又は低濃度、培地の消耗
、および特に培養培地の撹拌又は灌流により生ずる粘稠
剪断力を言む条件下で付着表面から引き離されがちであ
る。細胞生長および生合成は細胞脱離により停止する。d) Cells tend to become detached from adhesion surfaces under conditions of monolayer saturation, high or low concentrations of serum, medium depletion, and especially viscous shear forces caused by agitation or perfusion of the culture medium. Cell growth and biosynthesis cease due to cell detachment.
非がん細胞は二次元表面に生長するが、通常の細ｍ ｈ
ｓ デル、特にコラーゲンのデルにも生長することは古
くから知られていた。このようなデルの１つは商品とし
て入手できる（商品名「ｒルフォームＪ 、［ＪｐｊＯ
ｈｎ、 ［ａｌｍａｚｏす。しかしデルは貧弱な寸法安
定性を有し、これらの内部構造のために合理的密度まで
細胞を生長させるには適さず、特に培地灌流によるシス
テムに対しては適さない。Non-cancerous cells grow on two-dimensional surfaces, but normal thin m h
It has been known for a long time that it also grows in S dels, especially in collagen dels. One such model is available as a commercial product (product name ``Rleform J'', [JPJO
hn, [almazosu. However, dels have poor dimensional stability and their internal structure makes them unsuitable for growing cells to reasonable densities, especially for systems with medium perfusion.
従ってこれらは細胞の大規模培養に対し使用を見出せな
かった。これらの使用は細胞形態学の実験室的研究、又
は最初の培養の［ヒストチビック（ｈｙｅ ｔｏｔｙｐ
ｉｃ ）Ｊ生長の研究（例えば、Ｄｏｕｇｌｅｓ ヘエ
ｎ ｖｌｔｒｏ、 １６．３０６〜３１２．１９８０）
に゛ 限定される。Therefore, they have not found use for large-scale culture of cells. Their use is for laboratory studies of cell morphology, or for initial culture [hye totype
ic) J growth studies (e.g., Doubles Haen Vltro, 16.306-312.1980)
limited to.
本発明に関連があることは成る種の細胞および特にがん
性哨乳類細胞およびハイプリドーマのような細胞の改変
形は培養培地に懸濁して自由に生長し、又はカラギーナ
ン、アガロース、コラーゲン、ゼラチンおよび同様の澱
粉又はタン白又は重合性物質のような多孔性デル化材料
の小ビーズに不動化することができる事実である。細胞
は栄養培地に懸濁される小ビーズ又は粒子形にピルを注
型する前にこれらのデルに混合することができる。Cells of the species that are relevant to the present invention, and in particular modified forms of cells such as cancerous sentinel cells and hybridomas, can be grown freely in suspension in a culture medium, or in carrageenan, agarose, collagen, etc. It is a fact that gelatin and similar starches or proteins or polymeric substances can be immobilized into small beads of porous dellated materials. Cells can be mixed into these pellets prior to casting the pill into bead or particle form that is suspended in a nutrient medium.
（Ｋａｒｋａｒｅ、Ｓ、Ｂ、、 Ｐｈ１１１１ｐｓ、
Ｐ、Ｇ、、 Ｂｕｒｋｅ、 Ｄ、Ｈ，。(Karkare, S.B., Ph1111ps,
P.G., Burke, D.H.
およびＤｅａｎ Ｊｒ、、 ’Ｂ、Ｃ，［ｏｏｎｔｉｎ
ｕｏｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ ＭＯｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ工ｍｍｏｂｉｌｉ
ｚｅｄＨｙｌ）ｒｉｄｏｍａ ０ｕｌｔｕｒｅＪ Ａ、
Ｃ，Ｓ、 Ａｎｎｕａｌ ＭｅｅｔｌｎｇＰｈｉｌａ
、 ｐａ、 Ａｕｇｓ ２７．１９８４．７＋３ｒａＸ
０Ｏｒｐ。and Dean Jr., 'B, C, [oontin
uous Production of Monoclo
nal Antibodies by Engineering Mmobili
zedHyl)ridoma0ultureJA,
C, S, Annual MeetlngPhila
, pa, Augs 27.1984.7+3raX
0 Orp.
Ｈａｎｏｖｅｒ、 Ｎ、Ｈ，から入手できる）。Hanover, N.H.).
別法では、細胞はＬｉｍら、Ｍｉ ｃｒｏｅｎｃａｐｓ
ｕｌａｔｉ ｏｎｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅ１ｌｓ ａ
ｎｄ Ｔｉ５ｓｕｅｓ； Ｊ、Ｐｈａｒｍ、 Ｓｃｉ、
。Alternatively, cells can be used as described in Lim et al., Microencaps
ulati on of Living Ce1ls a
nd Ti5sues; J, Pharm, Sci.
.
Ｌ旦、４：３５１〜３５４、Ａｐｒｉｌ １９８１ ：
・Ｎｉ１ｓｓｏｎ、、コｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａ
ｎｉｍａｌ Ｑｅｌｌｓ ｆｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｌｅｓ
ａｎｄｏｔｈｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ’１ｓｊｌ
Ｊａｔｕｒｅ ３ Ｑ ２．６２９〜６５ＣＪ、１９７
３の記載のように微小カプセルに不動化することができ
る。Ldan, 4:351-354, April 1981:
・Ni1sson, Contrapment of A
normal Qells for Production
of Monoclonal Antibodles
andother Biochemica'1sjl
Jature 3 Q 2.629~65CJ, 197
It can be immobilized into microcapsules as described in 3.
本発明もここに記載のように付着弁−依存性細胞および
生長および収穫が上記のように不動化のいくつかの形態
により促進できる他の細胞の培養に関する。The present invention also relates to the culture of adherent valve-dependent cells as described herein and other cells whose growth and harvest can be promoted by some form of immobilization as described above.
本発明によれば、
高−表面−面積基質の有効面積は平面に投影されたその
面積の１０〜約１００倍であるその高−表面−面積基質
を供される試験管内細胞培養に使用するマトリックスで
あって、４０〜約９５％の多孔率および１０μ〜１００
μのオーダーの孔隙の大きさ、又は約１０μ〜１００μ
の孔隙の大きさを有する開放孔発泡構造を有する生理学
的に許容しうる繊維の網状組織を含み、マトリックスの
全体の高さは５０μ〜約５００μのオーダーのものであ
る：
三次元構造は円形、扁平、非円形、又は中空繊維又は０
．５μｍ〜５０μｍのオーダーの直径又は巾を有するこ
れらの繊維の組み合せの不織布の１つであるマトリック
ス；
構造は２μｍ〜２０μｍ巾の、縮らすことができるリサ
ン形成繊維から成り、巾対厚さの比は２：１又はそれよ
り高いマトリックス；高特定表面積、又は投影表面積単
位当りの表面積又は周囲の培地の単位容積当りの高表面
積を意味する高表面密度を有する付着依存性細胞付着に
対するマトリックス：
平板培養で達成できるものより少なくとも１オーダーの
大きさだけ大きく培地の単位容積当りの生長細胞密度を
増加させる表面；
平らなシートとして配置することができる高特定表面細
胞付着マ） ＩＪラックス
らせん形シートとして、又は波形シートとして配置でき
るマトリックス；
撹拌培養タンク反応器内に懸濁細胞担体として配置でき
るマトリックス；
細胞数の測定に容易に試料を採取できるマ） ＩＪワッ
クス
顕微鏡検査に対し容易に試料でありうるマ） ＩＪワッ
クス
衝撃および粘稠剪断力から細胞を保護するマトリックス
；
この表面から細胞の分離を抑止するマトリックス；
低接種密度で細胞生長を開始し、従って細胞密度および
数を１０倍以上に増７ＪＯさせ、こうして出発に必要な
カルチャーの数を低減して細胞および細胞生成物の高生
産を達成するマ） ＩＪラックス細胞な複数層に、三次
元マトリックスに生長すせるマトリックス；
細胞を三次元の非平面形に生長させるマトリックス；
栄養物、ホルモン、生長要素および血清成分のような物
質を急速に内部に拡散し、代謝廃棄物および細胞生成物
を外部に拡散できるマトリックス；付Ｎ依存性又は付着
非依存性細胞を生長させるマトリックス、このマトリッ
クスは高内部表面積および個個の細胞容積の１〜２０倍
である孔隙な有する高内部容積を供し、この孔隙はマト
リックスを通して、内部に、およびマトリックスから急
速拡散を供するようにマトリックスの外部表面の１００
μｍ内にある：
付着依存性でない、懸濁培養ＶＣ訃けるこれらの細胞の
収穫を容易にする細胞捕集に対するマトリックス；
高速で移動し、高剪断力下にある流体栄養物に曝露され
る間、高密度の付着非依存性細胞を保護し、生長させる
マトリックス；
このマトリックスから製造された粒子は最少量の撹拌で
培養培地に懸濁できるように中位に近め浮揚性な有する
細胞を捕集し又は付着させるマトリックス；
細胞培養容器の圧を上下させることによりマトリックス
を栄養液中に上下に移動できるように、細胞培養容器に
賦課した圧力により調整される変動浮揚性を有する、細
胞を付着させ、又は捕集するマトリックス；
血清を保存し、過大な培地にＭ胞生成物の稀釈を抑止す
る一方、高諷度および大容量のカルチャーに組織プラス
ミノーダンアクチベーターな生産する方法およびこのよ
うな方法を行なう要素、が供される。According to the invention, a matrix for use in in vitro cell culture is provided with a high-surface-area substrate whose effective area is from 10 to about 100 times its area projected onto a plane. and a porosity of 40 to about 95% and a porosity of 10μ to 100%
Pore size on the order of μ, or about 10μ to 100μ
The three-dimensional structure is circular; Flat, non-circular, or hollow fiber or 0
．． A matrix that is one of the non-woven fabrics of a combination of these fibers having a diameter or width on the order of 5 μm to 50 μm; Matrix with a ratio of 2:1 or higher; matrix for adhesion-dependent cell attachment with high specific surface area, or high surface density meaning high surface area per unit of projected surface area or per unit volume of surrounding medium: plate A surface that increases the growing cell density per unit volume of medium by at least one order of magnitude greater than that achievable in culture; a high specific surface cell attachment matrix that can be arranged as a flat sheet (IJ Lux as a helical sheet) matrices that can be placed as suspended cell carriers in stirred culture tank reactors; matrices that can be easily sampled for cell number determination; matrices that can be easily sampled for IJ wax microscopy; Ma) A matrix that protects cells from IJ wax impact and viscous shear forces; A matrix that inhibits detachment of cells from this surface; Initiates cell growth at low seeding densities, thus increasing cell density and number by more than 10 times 7JO A matrix in which cells are grown in multiple layers into a three-dimensional matrix; thus reducing the number of starting cultures and achieving high production of cells and cell products; A matrix that allows growth in a planar form; a matrix that allows substances such as nutrients, hormones, growth factors, and serum components to diffuse rapidly into the interior and metabolic wastes and cellular products to the outside; A matrix in which dependent cells grow, this matrix provides a high internal surface area and a high internal volume with pores that are 1-20 times the individual cell volume, and the pores allow rapid diffusion through, into, and out of the matrix. 100 of the external surface of the matrix to provide
Within μm: non-adhesion-dependent, suspension-cultured VC matrix for cell collection that facilitates the harvest of these cells; while exposed to fluid nutrients moving at high speeds and under high shear forces. , a matrix that protects and grows high-density, attachment-independent cells; particles made from this matrix capture cells with near-medial buoyancy so that they can be suspended in the culture medium with minimal agitation. Matrix to aggregate or adhere to; cells to which adhere, having variable buoyancy adjusted by the pressure applied to the cell culture vessel such that the matrix can be moved up and down into the nutrient solution by raising or lowering the pressure in the cell culture vessel. matrices to induce or capture; methods of producing tissue plasminodan activators in high fidelity and large volume cultures while preserving serum and preventing dilution of M follicle products in excessive media; Elements for performing a method are provided.
これらおよび他の目的は以下の詳細な開示から明らかと
なろう。These and other objects will become apparent from the detailed disclosure below.
本発明によれば培養細胞の付着に対し利用できる付着表
面を実質的に増加させる生長マトリックスが供される二
増加は発明の構成が支持されるペースの投影により計算
して１０〜６０倍の係数はどである。１０〜６０倍のこ
のような増加は単位層についてであり、スペーサーなど
により分離される複数層が使用される場合、１０〜３０
倍の係数はこれらの各構造について適用する。マトリッ
クスがシート形、好ましくは不織繊維シート、又を工開
放一孔発泡構造ボリマーシートで使用される揚会、好ま
しいシートの厚さは約５０〜２５０μｍであり、細胞が
入り栄養物が入り、そしてシートから廃棄生成物が除去
されるために適度の多孔率が供され、この孔は１０〜１
００μｍの有効直径を有する。これらのシートは各種火
さの繊維から製造することができ、好ましい繊維の太さ
又は繊維の直径範囲は０．５〜２０μｍであり、さらに
好ましくは１０〜１５μｍ直径の範囲にある。According to the invention, a growth matrix is provided which substantially increases the attachment surface available for the attachment of cultured cells; the increase is by a factor of 10 to 60, calculated by pace projection, in which the configuration of the invention is supported. It's heart. Such an increase of 10-60 times is for a unit layer, and if multiple layers are used separated by spacers etc.
A multiplication factor applies for each of these structures. When the matrix is used in sheet form, preferably a non-woven fibrous sheet, or an open-pore foam structure polymer sheet, the preferred sheet thickness is about 50-250 μm, containing cells and nutrients; A moderate porosity is provided for the removal of waste products from the sheet, the pores being between 10 and 1
It has an effective diameter of 00 μm. These sheets can be made from fibers of various sizes, with a preferred fiber thickness or fiber diameter range of 0.5 to 20 μm, more preferably 10 to 15 μm diameter.
複数のこれらのシートは相互に重ねて使用することがで
きる。このような場合適当な間隔要素は復元される。１
５０μｍ〜約１藺の多孔性スペーサーは一投に満足でき
る結果を与える。A plurality of these sheets can be used on top of each other. In such cases the appropriate spacing elements are restored. 1
Porous spacers of 50 μm to about 1 mm give satisfactory results in a single cast.
本発明の構成は次元安定性および物理的強度を供される
多孔性支持シート又はスクリーンにより支持され、又は
一層良く結合することができる。The construction of the present invention can be supported or better bound by a porous support sheet or screen that provides dimensional stability and physical strength.
このようなマトリックスシートは切断し、打ち抜き、細
断して約０．２Ｂ２〜約１０」２のオーダーの投影面積
を有し同じオーダーの厚さく約５０〜２５０μｍ）を有
する粒子を供する。この粒子は特ｖｃ流動カルチャーの
サスペンションに有用である。Such matrix sheets are cut, punched, and chopped to provide particles having a projected area on the order of about 0.2B2 to about 10"2 and a thickness on the same order of magnitude (about 50 to 250 micrometers). The particles are particularly useful in suspension of vc fluid cultures.
本発明は細胞の生長に対し保画された微小−環境を供し
、細胞の収穫を容易にする開放カプセルに付着非依存性
細胞を捕集し、生長させる装置又はマトリックスに関す
る。The present invention relates to a device or matrix for trapping and growing attachment-independent cells in an open capsule that provides a protected micro-environment for cell growth and facilitates cell harvest.
大量の付着非依存性細胞を生産するために細胞は通例個
個の細胞が適当に栄養物に浴することを保証するために
撹拌し、そして代謝廃棄物が細胞から運び出される、栄
養液体培地中に懸濁して生長する。細胞の成るフラクシ
ョンは羽根車による衝撃により又は高剪断力により破壊
される。通例の懸濁培養からの収穫細胞は遠心分離又は
微小多孔性フィルターのような特別の補足ｖｃｉ１を必
要とする。栄養液１ｃ１６）Ｌ′５についての細胞濃度
は比較的低い。To produce large numbers of attachment-independent cells, cells are typically placed in a nutrient liquid medium, with agitation to ensure that individual cells are properly exposed to nutrients, and metabolic wastes are transported away from the cells. Grows in suspension. The fraction of cells is destroyed by impeller impact or by high shear forces. Harvesting cells from conventional suspension cultures requires special supplements such as centrifugation or microporous filters. The cell concentration for nutrient solution 1c16) L'5 is relatively low.
これらの細胞の収穫を単純化しこれらの密度を増加させ
る１方法はＬｉｍおよび１ＪｉｌＢＢｏｎの上記引用研
究に記載のように透過性微小カプセルに細胞をカプセル
化することを富む。これらの微小カプセルはこれらが捕
集する細胞より大きく、濃密である。従ってこれらは栄
養培地から沈澱又は濾過゛ により容易に分離される。One method to simplify the harvest of these cells and increase their density involves encapsulating the cells in permeable microcapsules as described in the above-cited work of Lim and JilBBon. These microcapsules are larger and denser than the cells they capture. They are therefore easily separated from the nutrient medium by precipitation or filtration.
微小カプセルはある不利な面を有するニ
ーこれらは製造するために高価を要し微妙である、
一高密度生長で、カプセルの中心の細胞はしばしば死滅
する、
一カプセルは早期に破裂し内容細胞を失なう、−新しい
接種毎に新しいカプセル化手順な必要とする。Microcapsules have certain disadvantages; they are expensive and delicate to manufacture; - with dense growth, the cells in the center of the capsule often die; and - the capsule ruptures prematurely, destroying the content cells. - each new inoculum requires a new encapsulation procedure.
本発明は試験管内培養中細胞付着および／又は捕集に対
し改良された表面および形態学を供する材料形の供給に
関し、この改良された表面および形態学は一般に使用さ
れる付着表面の欠点に打ち勝ち、および付着表面な必要
としない他の細胞の改良培養に対し新しい可能性を供す
る。The present invention relates to the provision of a material form that provides an improved surface and morphology for cell attachment and/or collection during in vitro culture, the improved surface and morphology overcoming the disadvantages of commonly used attachment surfaces. , and offers new possibilities for improved culture of other cells that do not require an attachment surface.
繊維の成る形および組成および成る高多孔性膜は細胞お
よび特に付着依存性細胞に対し、特にこの繊維が平らな
高多孔性の不織シート、又はマットに配列されフィルタ
ー又はティッシュペーパーのような、又は薄め多孔性フ
ェルトの外観を有する場合、非常に有効な支持体を供す
ることがわかった。この不織シートは紡糸−接着、熱接
着、圧搾ローラーかけ、縫合などの技術を富む不織繊維
、紙、又はフェルトの製造に対する広範な周知技術のい
ずれかにより製造することができる。シートは好ましく
は繊維表面に細胞の付着な促進するために非特定的に使
用されるグルー又は付着被覆なさむべきではない。The shape and composition of the fibers and the highly porous membranes they consist of are particularly useful for cells and especially attachment-dependent cells, especially when the fibers are arranged in flat highly porous non-woven sheets, or mats, such as filters or tissue paper. It has been found that the appearance of a thin porous felt provides a very effective support. The nonwoven sheet can be made by any of a wide variety of well-known techniques for making nonwoven fibers, paper, or felt, including techniques such as spin-bonding, heat bonding, press rolling, and stitching. The sheet should preferably be free of glue or adhesive coatings used nonspecifically to promote cell attachment to the fiber surface.
不織繊維シートの形成に使用される繊維は連続性フィラ
メント、ステーゾルフィラメント、中空フィラメント、
パルプ、又はフロック形、又はこれらの形の組み合せで
よい。好ましくはシートに非常に不整の、無作為一様、
もつれた仕方で配置され、繊維の軸は開放の、多次元配
列を形成するＯシートの多孔率は４０〜９５俤の範囲で
あるべきで、好ましい多孔率は６０〜８０％である。好
ましい孔の大きさは１０〜約１００μｍである。The fibers used to form nonwoven fiber sheets can be continuous filaments, stator filaments, hollow filaments,
It may be in pulp or floc form, or a combination of these forms. A highly irregular, random, uniform sheet, preferably
The porosity of the O-sheets arranged in a tangled manner, with the fiber axes open, forming a multidimensional array, should be in the range of 40 to 95 degrees, with a preferred porosity of 60 to 80%. Preferred pore sizes are from 10 to about 100 μm.
何個の繊維は１フイラメントにつき０．０５〜５？ニー
ル（ｄｐｆ） （１）ヂニ−＃（９０００ｍの繊維のＩ
重量）を有すべきで好ましい重量は１．０〜１．５ｄｐ
ｆである。繊維の断面は円形又は非円形で、好ましい断
面はリボンのもので、さらにその軸に沿って課された縮
れを有するものである。繊維の巾を１０．５〜５０μｍ
の範囲であるが、好ましい巾は１０〜１５μｍである。How many fibers are 0.05 to 5 per filament? Neil (dpf) (1) Genie # (9000m fiber I
The preferred weight is 1.0 to 1.5 dp.
It is f. The cross-section of the fibers may be circular or non-circular, the preferred cross-section being that of a ribbon, with an imposed crimp along its axis. The width of the fiber is 10.5 to 50 μm.
However, the preferred width is 10 to 15 μm.
中空フィラメントが不織シートに組みこまれる場合、１
個又は複数の内腔を有してもよく、これらのデニールは
一般に中空でない断面の繊維より大きく１フイラメント
につき５０デニールの大きさの範囲である。When hollow filaments are incorporated into nonwoven sheets, 1
They may have one or more lumens, and their denier generally ranges in size from 50 denier per filament, which is greater than for solid cross-section fibers.
この適用に適する高多孔率膜はスポンジ様構造および多
孔率、および不織繊維マットと同じ孔の寸法、丁なわち
４０〜９５チ多孔率および孔の大きさ１０〜８０μｍｆ
ｔ有しなければならない。孔は開放され、高度のねじれ
を有しなければならない。ポリマーマトリックスは連続
性であるべきで、細胞付着を促進する任意の組成を有す
ることができる。多孔性膜生長に適するポリマーの例は
セルロース、酢酸セルロース、ポリエチレン、ポリエス
テル、ポリフルオロクロロエチレン、ボｌＪ［化ビニル
、ポリスチレン、ポリスルホン、ガラス繊維などである
。High porosity membranes suitable for this application have a sponge-like structure and porosity and pore size the same as non-woven fiber mats, i.e. 40-95μm porosity and pore size 10-80 μmf.
Must have t. The pores must be open and have a high degree of twist. The polymer matrix should be continuous and can have any composition that promotes cell attachment. Examples of polymers suitable for porous membrane growth are cellulose, cellulose acetate, polyethylene, polyester, polyfluorochloroethylene, vinylide, polystyrene, polysulfone, glass fibers, and the like.
不織繊維シート又は多孔性膜の厚さは重要なパラメータ
である。適当な培養条件下で、これらのシート上に接種
された多数の細胞はシートの上部表面上よりかえってシ
ートの厚さ内で生長する。The thickness of the nonwoven fibrous sheet or porous membrane is an important parameter. Under appropriate culture conditions, large numbers of cells seeded onto these sheets will grow within the thickness of the sheet rather than on the top surface of the sheet.
細胞は通例の組織培養瓶、フラスコ、ぺ） ＩＪ皿およ
び微小担体ビーズにおけるような二次元におけるよりか
えって三次元のシートの繊維の中に増殖する。細胞は１
個より多い繊維に付着しく図１）、こうして細胞生長は
繊維マトリックスの内部容積で行なわれる。細胞は複数
層の組織様構造を形成しその厚さは不織繊維シートのも
のである。細胞集合体の内部におよび内部から栄養物お
よび生成物の適当な拡散な保証するために、そしてこの
濃密構造の内部の細胞の壊死な抑止するために、シート
は約２５〜２５０μｍの厚さでなければならない。好ま
しい厚さは１００〜１５０μｍである。Cells grow in fibers in sheets in three dimensions rather than in two dimensions, such as in conventional tissue culture bottles, flasks, IJ dishes, and microcarrier beads. cell is 1
Cell growth occurs in the internal volume of the fibrous matrix (Fig. 1). The cells form a multilayered tissue-like structure whose thickness is that of a nonwoven fibrous sheet. In order to ensure proper diffusion of nutrients and products into and from the cell aggregate and to prevent cell necrosis within this dense structure, the sheet is approximately 25-250 μm thick. There must be. The preferred thickness is 100-150 μm.
理想的シートの厚さは培養される特別種の組織で生体内
に存在する毛細管の間隔にほぼ等しい。The ideal sheet thickness is approximately equal to the spacing of capillaries present in vivo in the particular type of tissue being cultured.
不織多孔性生長マ） ＩＪラックスートは単独で使用す
るか又はこれらはシートがそれらの形を保有するのを助
け、又は密集充填配列で使用される場合、シートの沈澱
による相互の濃密接触を抑止するために、硬い支持体材
料に熱接着することができる。特に有用な形状は粗い（
１ａｍ又はそれ以上のメツシュ）ポリプロぎレンスクリ
ーンに生長マトリックスシートを熱積層化することであ
る（図２）。これは又、懸濁培養に使用される場合、中
位に浮揚できるようにマトリックスの正味密度を調整で
きる。Non-woven porous growth matrices) IJ rack soots can be used alone or they help the sheets retain their shape, or when used in a close-packed arrangement, prevent the sheets from settling into close contact with each other. For deterrence, it can be thermally bonded to a rigid support material. A particularly useful shape is the rough (
1 am or larger mesh) by thermal lamination of the growth matrix sheet to a polypropylene screen (Figure 2). This also allows the net density of the matrix to be adjusted to be moderately buoyant when used in suspension culture.
生長マトリックスシートおよび支持体およびセパレータ
ーシートはこれらのシートの積み重ねのすべての部分に
均一に液体培地を分配する要素および各マトリックスシ
ートの平面に平行に培地の流れを促進する要素を供する
ことができる。これらの要素は図４ａの２０および２１
で示されるように不可欠のじゃま板又は水路孔でよい。The growth matrix sheets and the support and separator sheets can be provided with elements to distribute the liquid medium evenly to all parts of the stack of these sheets and to promote the flow of the medium parallel to the plane of each matrix sheet. These elements are 20 and 21 in Figure 4a.
It may be an essential baffle plate or channel hole as shown in .
生長マトリック哀シートは多くの仕方で使用できる：
−ベトリ皿の底部又はローラー瓶の内部表面の内張つと
して、１オーダーより大きめオーダーの大きさだけ生長
表面面積を増大させる、−ローラー瓶の内側のらせんシ
ートとして（図３）、
ｍ−６および図７におけるように透過性又は微小多孔性
ポリマーの平らにした管１３の外部およびその間に積層
化したシート１１として、各交互の平らにした管は導管
として働き、１つは液体培養培地に対し１４、他は酸素
、空気、Ｃ０２および水蒸気のようなガスに対し１５、
全体の集成装置は図６に示されるようにらせ、んに巻か
れ、又は積層の間に差しこんだ積み重ね（図８９に配置
され、そして栄養培地を満たし１７、培養に対し細胞な
接種した密閉無菌容器１６１図７に浸漬される。ガスお
よび栄養培地は多孔性又は不織繊維マトリックスシート
１１上に生長する細胞が酸素又は栄養物が決して枯渇せ
ず、その中で廃棄物が停溜により蓄積しないおだやかに
うねる流体中に浴するように脈打ちの様式で平らにした
透過性管を通してボンゾ輸送される。一般に集成装置の
被覆１９を通して流れる４つの連結図６．７．１８はガ
スの導入および排出、および栄養培地な平らにした管１
３に導入および排出するために働く。Growth matrix growth sheets can be used in a number of ways: - as a lining on the bottom of a bird dish or on the inside surface of a roller bottle to increase the growth surface area by an order of magnitude greater; - on the inside of a roller bottle; each alternating flattened tube as a helical sheet (FIG. 3), as a sheet 11 laminated outside and between flattened tubes 13 of permeable or microporous polymer as in m-6 and FIG. act as conduits, one for the liquid culture medium 14, the other for gases such as oxygen, air, CO2 and water vapor 15,
The entire assembly is arranged in a helical, rolled or stacked stack (Fig. 89) as shown in Fig. 6 and filled with nutrient medium and inoculated with cells for culture. A closed sterile container 161 is immersed in the gas and nutrient medium in which the cells growing on the porous or non-woven fibrous matrix sheet 11 are never depleted of oxygen or nutrients and in which waste products are trapped due to retention. Bonzo is transported through flattened permeable tubes in a pulsating manner to bathe in a gently undulating fluid that does not accumulate. Drainage and nutrient medium flattened tube 1
3. Works to introduce and expel.
ＰＯ２１０、Ｐｌ″１１１およびグルコース濃度１２σ
〕ような培養パラメータを監視するプローブは平らにし
たらせん抜管の外部の生長培地１７に配置され、栄養物
１４の流れ割合および組成およびがス１５のｃｏ２およ
び酸素含量を調整するために使用される。ボリプａビレ
ンスクリーン又は同様のスペーサー１２は各平らにした
管の内Ｎおよび管の間に配置され、らせん又は積み重ね
の各層間の最少分離距離を保持する。細胞生長マ） Ｉ
Ｊラックス１および外部又は浸漬生長培地１７への出入
は、浸漬培地を灌流し又は除去するために、又は生成物
の収集に、又は培地の交換に、又は細胞試料の採取に使
用できる入口２０を通してなされる。PO210, Pl″111 and glucose concentration 12σ
] Probes monitoring culture parameters such as 17 are placed in the growth medium 17 outside the flattened spiral extubation and are used to adjust the flow rate and composition of the nutrients 14 and the CO2 and oxygen content of the gas 15. . A voliper screen or similar spacer 12 is placed within each flattened tube and between the tubes to maintain a minimum separation distance between each layer of the helix or stack. Cell Growth Ma) I
Access to the J-lux 1 and the external or immersion growth medium 17 is through an inlet 20 that can be used for perfusing or removing the immersion medium, or for product collection, or for medium exchange, or for taking cell samples. It will be done.
一連続的に培地を灌流するカラムの充填材料として（図
４）、
一修正デキストランビーズのような材料に代る懸濁培養
の微小担体として（［Ｍｌ ｃ ｒｏ ｃａｒｒｉ ｏ
ｒ０＋３１’ｌ○ｕｌｔｕｒｅｊ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。One as a packing material for columns that are continuously perfused with medium (Fig. 4); One as a microcarrier for suspension cultures in place of materials such as modified dextran beads ([Micro carri o
r0+31'l○ulturej Pharmacia
Chemicals.
σｐｐｓａ１ａ、 ｓｗｅｄｅｎ、 １９８１参照）。σppsa1a, Sweden, 1981).
微小担体として又はカラム充填材として使用される場合
、生長マトリックスはポリプロｔレンスクリーン（上記
、図２）に対し積層するのが有利でありこれは矢に小円
盤、正方形、環状十字形、又は波形および折り重ね形に
切断し、充填又は懸濁材料に所望の動水力学的特徴を与
える。When used as a microcarrier or column packing material, the growth matrix is advantageously laminated to a polypropylene screen (above, FIG. 2), which can be shaped like an arrow, a small disc, a square, a toroidal cross, or a corrugated shape. and cut into folded shapes to impart the desired hydrodynamic characteristics to the filled or suspended material.
別法では懸濁培養で微小担体として使用される生長マト
リックスは繊維の密度および相対的割合が中位に近い浮
揚性を与える繊維の混合物から成る繊維の不織シートか
ら切断することができる。Alternatively, the growth matrix used as a microcarrier in suspension culture can be cut from a nonwoven sheet of fibers consisting of a mixture of fibers in which the density and relative proportions of fibers provide near-moderate buoyancy.
例として、２」の直径な有する環状微小円盤は２０重重
量のポリエチレンテレフタレート繊維および８０チのポ
リゾロぎレン繊維の無作為方向性混合物から成る不織シ
ートから打ち抜かれる。ポリエチレンテレフタレート繊
維は１．３３の比重を有し、ポリデクピレン繊維は０．
９２の比重を有するので、複合不織布は１．００２の密
度を有する。By way of example, annular microdiscs having a diameter of 2" are stamped from a nonwoven sheet consisting of a randomly oriented mixture of 20 gw polyethylene terephthalate fibers and 80 g polyzologylene fibers. Polyethylene terephthalate fibers have a specific gravity of 1.33 and polydexpyrene fibers have a specific gravity of 0.33.
Having a specific gravity of 92, the composite nonwoven fabric has a density of 1.002.
従ってこのシートから打ち抜かれた微小円盤は中空でな
いポリエチレンテレフタレート繊維のみから成る円盤な
ＷＡｇＩＪ保持するのに必要であるよりもはるかに低速
で撹拌する場合液体培地に懸濁させたまま保持される。Microdiscs punched from this sheet therefore remain suspended in the liquid medium when agitated at much lower speeds than is necessary to maintain discotic WAgIJ consisting solely of solid polyethylene terephthalate fibers.
中位に近い浮揚性の微小円盤は内腔に満たしたガスを■
する中空フィラメントポリマー繊維なフィラメントポリ
マー繊維につき中空でない低デニールと適当な割合で合
せることにより製造された（図２ａ、２ｂ）。捕集した
ガス泡を含む微小担体の利点はこれらの浮揚性を調整で
きることである。捕集ガスの容積は懸濁培養上の外部圧
が減少又は増加するとき、増〃口又は減少するりで、微
小円盤は撹拌機を使用しなくても週期的に栄養液中に浮
き、および沈むよ５に製造される。これは非常に温和な
洗滌作用を生じ、特に生長細胞の表面に栄養物を運び、
代謝廃棄物を除去することに対し、撹拌する場合、付着
表面から追い出されるようになりやすい細胞タイプでは
特に有効である。The medium-sized buoyant micro-disc allows the gas filling the inner cavity to
Hollow filament polymer fibers were prepared by combining suitable proportions of solid low denier filament polymer fibers (FIGS. 2a, 2b). An advantage of microcarriers containing trapped gas bubbles is that their buoyancy can be adjusted. The volume of captured gas increases or decreases when the external pressure on the suspension culture decreases or increases, and the microdiscs float in the nutrient solution periodically without the use of a stirrer, and It will be manufactured in 5. This produces a very mild cleansing action, especially transporting nutrients to the surface of growing cells,
For removing metabolic waste products, agitation is particularly effective for cell types that tend to be dislodged from attached surfaces.
撹拌機の要求を排除し、単純化し、大きな培養容器のコ
ストを低減する。Eliminates the requirement for agitators, simplifying and reducing the cost of large culture vessels.
本発明の主要な利点は微小担体組繊細胞「ＷＡ濁培養」
に対し多孔性マトリックス細胞付着表面を適用すること
である（微小担体懸濁組織細胞培養の手順は「Ｍｉｃｒ
ｏｃａｒｒｉｅｒ Ｃｅ１ｌ Ｑｕｌｔｕｒ８ Ｊ。The main advantage of the present invention is microcarrier tissue cell "WA turbid culture"
(The procedure for microcarrier suspension tissue cell culture is described in “Micr
ocarrier Ce1l Qultur8 J.
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、
σｐｐｓａｌａ、 Ｓｗｅｄｅｎ。Pharmacia Fine Chemicals,
σppsala, Sweden.
１９８１ ；および［Ｌａｒｇｅ ５ｏａ１８ ｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆＴｉｓｓｕｅ ０ｅ１１．ｓ Ｊ
、 ５ＱｉｅｎｔｉｆｉＱ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ
ａＬ 。1981; and [Large 5oa18 pro
duction ofTissue 0e11. s J
, 5QientifiQ American J
aL.
１９８３の論文に記載される）。懸濁培養の適用に対し
ては多孔性シートは小片に切断され、それぞれは約１〜
１００１００ａ投影表面を有し、好ましい投影面積は約
１〜２０騙２である。この小片の形状は多数の形状なと
ることができるが、円盤又は環状形が好ましめ。多孔性
マトリックス細胞付着シート材料は多孔性マ） ＩＪソ
ックス料を強化し、父上記浮揚性を増加するために、１
ｕ又はより微細メツシュを有するポリプロピレンスクリ
ーンのような材料に熱接着することができる。円盤の周
囲端の繊維は熱接着されるか又は相互に部分融着される
ように加熱ダイを使用してこれらの円盤を打ち抜くこと
は特に有利である。(described in a 1983 paper). For suspension culture applications, the porous sheet is cut into small pieces, each about 1 to
The preferred projected area is approximately 1-20 mm. The shape of this piece can take many shapes, but a disk or ring shape is preferred. The porous matrix cell adhesion sheet material is made of porous matrix (1) to strengthen the IJ sock material and increase buoyancy above the matrix.
It can be thermally bonded to materials such as polypropylene screens with a finer or finer mesh. It is particularly advantageous to punch these discs using a heated die so that the fibers at the peripheral edges of the discs are thermally bonded or partially fused to each other.
このような多孔性マ） Ｉ３ックス微微小体は好結果の
細胞生長を開始するために実質的に一層低い濃度の接種
材料（培養の出発時に導入される細胞〕を必要とするこ
とは理論的根拠で発見し試験により立証した。例えば微
小担体の代表的懸濁培養（修正デキストランビーズ）で
は、接種材料は培養の終期に収穫される細胞数の３１］
９６に含む（Ｆｌｌｅｉｓｃｓｃｈａｋｅｒｍ １１７
頁、Ｐｈ、 Ｄ、 Ｔｈｅｓｉｓ。It is theoretical that such porous matrices require substantially lower concentrations of inoculum (cells introduced at the start of the culture) to initiate successful cell growth. For example, in a typical suspension culture on microcarriers (modified dextran beads), the inoculum is approximately 31% of the number of cells harvested at the end of the culture.
96 (Flleiscshakerm 117
Page, Ph.D., Thesis.
Ｊｕｎｅ １９８２、Ｍ、工、Ｔ、 ｐｅｐｔ、 ｏｆ
Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ′ｇｏｏａ ５Ｏ１ａｎ
ｃｅ）。修正デキストラン微小ビーズのものに等しい総
付着表面を有するポリエステル繊維多孔性マトリックス
微小担体が使用される場合、接種細胞含量は収穫される
最終細胞数の約５％未満のみを必要とすることがわかっ
た。接種材料の大きさのこの減少は組繊細胞および細胞
生成物の大規模生産に漠大な利益であり、１つの培養か
らの生産は約６〜１０の率だけ増加しそして感染および
再接種問題は減少する。June 1982, M, Eng, T, pept, of
Nutrition and'gooa 5O1an
ce). It was found that when polyester fiber porous matrix microcarriers with a total attachment surface equal to that of modified dextran microbeads are used, the inoculated cell content only requires about 5% of the final cell number to be harvested. . This reduction in inoculum size is of vast benefit to large scale production of tissue cells and cell products, increasing production from one culture by a factor of approximately 6-10 and reducing infection and reinoculation problems. decreases.
低濃度細胞接種による繊維又は多孔性マトリックス微小
担体の有効性は明らかで＆＠Ｌなりが、重要な発見であ
る。このすぐれた有効性に対する説明は次の通りである
二
微小担体懸濁培養では何個の微小担体粒子上で行なわれ
る会流細胞生長に対し、最少数の接種細胞は機外担体粒
子と衝朶し、粒子に固着しなければならない。この鍾少
数の細胞は成る程度まで細胞タイプに依存するが、代表
的数は１微小担体粒子につき７細胞である（Ｆｌｅｉｓ
ｃｓｃｈａｋｅｒ、 Ｊ、。The effectiveness of fibrous or porous matrix microcarriers with low concentration cell seeding is clearly an important discovery. The explanation for this excellent effectiveness is as follows: in two-microcarrier suspension culture, the minimum number of inoculated cells is in a collision with the external carrier particles, compared to the perfusion cell growth that takes place on several microcarrier particles. and must adhere to the particles. This number of cells depends to some extent on the cell type, but a typical number is 7 cells per microcarrier particle (Fleis et al.
cshaker, J.
１７１頁、ｐｈ、 Ｄ、 Ｔｈｅｓｉｓ’、Ｔｕｎｅ
１９８２、Ｍ、 １． Ｔ。171 pages, ph, D, Thesis', Tune
1982, M, 1. T.
Ｄｅｐｔ、、 ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆ
ｏｏｄ ５ｃｉｅｎｃｅ） 。微小担体粒子と接種細胞
間の衝突は純粋に無作為工程であるので、任意数１の細
胞と衝突を経験する微小担体粒子のフラクションｆ１は
ボアノン分布（方程式Ｉ）により評価することができる
：ｆ□＝λ１／（θ’（ｉ）） （Ｉ）式中
、１＝微微小体粒子と衝突する接種細胞数λ＝＝均接種
細胞数／微小担体粒子、又は１−当りの接種細胞／１−
当りの微小
担体粒子
ｒｎＪ回の衝突が合流生長な開始するために必要である
場合、合流生長を経験する微小担体のフラクションＰは
１マイナスｎより少ない衝突を有する微小担体のフラク
ションになる。Dept, of Nutrition and F
ood 5science). Since collisions between microcarrier particles and inoculated cells are a purely random process, the fraction f of microcarrier particles that experience collisions with any number 1 of cells can be estimated by the Boannon distribution (Equation I): f □=λ1/(θ'(i)) (I) In the formula, 1=number of inoculated cells that collide with microscopic particles λ==average number of inoculated cells/microcarrier particles, or inoculated cells per 1-1 −
If rnJ collisions per microcarrier particle are required to initiate confluence growth, then the fraction P of microcarriers that undergo confluence growth will be the fraction of microcarriers that have fewer than 1 minus n collisions.
Ｐ＝ １− Ｘ” （ｆ□） （Ｉ［）ｎ
＝ ７および１０５細胞／−が１−につき３ Ｘ Ｉ
Ｑ’の微小担体ぎ−ズ粒子の通常濃度で接種される場
合、方程式Ｉのλは６．３細胞／微小担体粒子に等しめ
。方程式（Ｉ）から０〜６回の衝突を経験する粒子のフ
ラクションは：
ｆｏ ” ０１ ｆｌ ＝−１２１ｆ２ ” 、２０
＊ ｆｓ”−２２ａで４＝−１８−ｆ５”−１２ａ ｆ
６ ＝０．７であることがわかる。P= 1-X” (f□) (I[)n
= 7 and 105 cells/- per 1-3 X I
When seeded with a normal concentration of Q' microcarrier particles, λ in Equation I equals 6.3 cells/microcarrier particle. From equation (I), the fraction of particles that experience 0 to 6 collisions is: fo ” 01 fl = −121f2 ”, 20
* fs”-22a = 4=-18-f5”-12a f
It can be seen that 6 = 0.7.
従って方程式（１６））は：
Ｐ＝１−（ｆ（、＋ｆｌ＋ｆ２＋ｆ３＋ｆ、＋ｆ５＋ｆ
、 ）；０．０５となる。２０のうちの唯１個の粒子が
７回又はそれ以上の衝突を有し、合流細胞生長を経験す
ることを意味する。従ってこの培養は失敗するであろう
。これらの稀釈細胞濃度および条件で通例の微小担体カ
ルチャーな接種しようと試みる場合このようなことは実
際に一般的経験である
（ＩＰｌｅｉａｃｓｃｈａｋｅｒ １ｂｉｄ、 １１７
頁）。Therefore, equation (16)) is: P=1−(f(,+fl+f2+f3+f,+f5+f
, ); 0.05. Only one particle out of 20 has 7 or more collisions, meaning that it undergoes confluent cell growth. This culture will therefore fail. This is indeed a common experience when attempting to inoculate customary microcarrier cultures at these diluted cell concentrations and conditions (IPleiacshaker 1bid, 117).
page).
この統計的推論は多孔性又は繊維マトリックス微小担体
の著しい優位性を説明する。代表的にはこのような担体
は１０μｍ直径のポリエステル繊維から成る１５０μｍ
厚さの不織シートから打ち抜すた２、Ｏｕ直径の微小円
盤である。シートは１ｇのシート材料につき３０００ｃ
ｒｒＬ”より多い細胞付着面積を供する。１−の培養溶
液当りこれらの５０微小円盤の濃度は１−当り３ Ｘ
１０’ ｔ７）通例の微小担体ビーズと同じ細胞付着面
積を構成する。This statistical inference explains the significant advantages of porous or fibrous matrix microcarriers. Typically such carriers are 150 μm made of 10 μm diameter polyester fibers.
A microdisk with a diameter of 2.0 mm was punched from a nonwoven sheet with a thickness of 2 mm. 3000c per 1g of sheet material
The concentration of these 50 microdiscs per 1 - of culture solution is 3 x per 1 - of the culture solution.
10' t7) Constitutes the same cell attachment area as conventional microcarrier beads.
１０５細胞／ｍｔ接種材料濃度で、接種細胞の平均数／
微小円盤、λ、は１０５１５０．又は２０００細胞／微
小円盤（６，６細胞／微小ビーズと対照的に）である。At an inoculum concentration of 105 cells/mt, the average number of inoculated cells/
The microdisk, λ, is 105150. or 2000 cells/microdisc (as opposed to 6,6 cells/microbead).
微小円盤とこれら２０００細胞との衝突頻度はデキスト
ラン微小担体ビーズとその３．３細胞のものより高い大
きさである。事実、方程式（Ｉ）にλ＝２０００を挿入
すると１００より少ない細胞衝突を有する円盤粒子を工
きわめて稀であることがわかる。従って同じ接種材料濃
度および表面付着面積で１００より多い衝突を経験する
微小円盤の確率はＰがほぼ１に等しいときに方程式Ｈに
より与えられる。従ってすべての微小円盤担体は細胞に
より砲撃され、ごれらの生長表面は稀釈接種材料に曝露
されると飽和に達する。実験的に１チの接種は合流生長
の生成に成功した。The collision frequency of the microdiscs and these 2000 cells is of a higher magnitude than that of the dextran microcarrier beads and their 3.3 cells. In fact, inserting λ=2000 into equation (I) shows that it is extremely rare to engineer a disk particle with fewer than 100 cell collisions. Therefore, the probability of a microdisk experiencing more than 100 collisions with the same inoculum concentration and surface adhesion area is given by equation H when P is approximately equal to 1. All microdisk carriers are therefore bombarded with cells and their growth surfaces reach saturation when exposed to diluted inoculum. Experimentally, inoculation of 1 t was successful in producing confluent growth.
この効果は微小ビーズ又は非多孔性担体では再現できな
い。何故ならば微少ビーズ数の減少は細胞付着に対し利
用できる表面を減少させるからである。従って微小ビー
ズ懸濁培養は多量の接種材料に限定される。This effect cannot be reproduced with microbeads or non-porous carriers. This is because reducing the number of microbeads reduces the surface available for cell attachment. Microbead suspension culture is therefore limited to large amounts of inoculum.
例
１、 細胞培養マトリックスに使用する材料は最初にプ
ラズマトーチからの放電を通し、メタノールで洗滌した
。材料は紫外線下で滅菌し仄Ｖｃ１００μｇ／−ポリー
Ｄ−リジン浴液中に浸漬し、無菌水でｊ丁いだ。細胞培
養は６７°Ｃ１空気中の５％ｃｏ２雰囲気下に行なった
。Example 1 The material used for the cell culture matrix was first passed through an electric discharge from a plasma torch and washed with methanol. The material was sterilized under UV light, immersed in a 100 μg/-poly D-lysine bath, and rinsed with sterile water. Cell culture was carried out at 67° C. in 5% CO2 atmosphere.
２、 ポリエステル（０，１５騙公称の厚さ、１５μｍ
繊維）又はポリプロピレン（０，１５１１の公称の厚さ
、１２μｍ繊維）の不織シートを３０ｕ直径の環に切断
し、３０Ｌｌぺ） ＩＪ皿の底部においた。同じ大きさ
の組織培養皿は対照として使用した。ヒトの二倍体繊維
芽細胞（肺） （１，５Ｘ １０’細胞］を２．５−の
ＤＭＥＭ （Ｄｕ１ｂθＣＯ修正ＦＸａｇｌｅ培地）＋
１０％血清を含む各プレートに接種し、カルチャーの進
行は顕微鏡で試験した。細胞は複数層の組織様構造な形
成することを観察した（図１）。2. Polyester (0.15mm nominal thickness, 15μm
A nonwoven sheet of polypropylene (nominal thickness of 0.1511 mm, 12 μm fibers) was cut into rings of 30 μm diameter and placed at the bottom of a 30 μm IJ dish. A tissue culture dish of the same size was used as a control. Human diploid fibroblasts (lung) (1,5X 10' cells) in 2.5-DMEM (Du1bθCO modified FXagle medium) +
Each plate containing 10% serum was inoculated and culture progress was examined microscopically. We observed that the cells formed a multilayered tissue-like structure (Figure 1).
培養は細胞が合同した塊つとして現れるまで継続した。Culture was continued until the cells appeared as a congruent mass.
そこで各プレートの細胞数をＤＮＡ１ｉ’に測定するこ
とによりはかった。′結果（表工）は正規の培養皿の等
しい投影面積上よりも７〜１０倍多め細胞がポリマーマ
トリックスに得られたことを示す。Therefore, the number of cells on each plate was determined by measuring DNA1i'. 'The results show that 7-10 times more cells were obtained on the polymer matrix than on an equal projected area of a regular culture dish.
表■
顕微鏡で観襲した
ポリプロピレン ４ Ｘ １０５７０％ポリエス
テル ６Ｘ１０’ ６０％ヌン
クＴ、０．皿 ａｘ １０’ １００
％６、不織布シートは２１Ｘ３４ｃＩＬ長方形に切断し
、これはローラー瓶の８５０ｃＩＬ′！の内側に内張つ
として固着した。未被覆ローラー瓶は対照として使用し
た。布で内張すした瓶はそれぞれ＋１１０．３ Ｘ １
０’、＋２＋ Ｉ Ｘ １０７および１３） １．５
Ｘ １０’細胞を接種した。Table ■ Polypropylene observed under a microscope 4 X 105 70% polyester 6 X 10' 60% Nunc T, 0. Plate ax 10' 100
%6, the non-woven sheet was cut into a 21X34 cIL rectangle, which was 850 cIL' for a roller bottle! It stuck to the inside of the lining. Uncoated roller bottles were used as controls. Each bottle lined with cloth is +110.3 x 1
0', +2+ I X 107 and 13) 1.5
X10' cells were seeded.
未被覆瓶はそれぞれｉ、５ｘｉｏフ細胞を接種した。Each uncoated bottle was inoculated with i, 5xio cells.
次にすべての瓶は培地を半分満たし、培養は回転Ｂ１１
１８０ Ｒｏｌｌｅｒ 装置上で０．５層回転／分で行
なった。培地は２日の間隔で新しい培地と置換した。Next, all bottles are half filled with medium and the culture is rotated B11.
It was carried out on a 180 Roller apparatus at 0.5 layer revolutions/min. The medium was replaced with fresh medium at 2 day intervals.
未被覆瓶は３日後に顕微鏡試験により判定されたように
合流に達し５．７Ｘ１０’細胞の細胞数を含有した。内
張り瓶は追加の５日間培養した。ＤＮＡ測定は接種量に
関係なく６〜５×１０８細胞が各布内張り瓶で得られた
ことな示した。The uncoated vials reached confluence and contained a cell number of 5.7 x 10' cells as determined by microscopic examination after 3 days. Lined bottles were incubated for an additional 5 days. DNA measurements showed that 6-5 x 108 cells were obtained in each cloth lined bottle regardless of the inoculum.
４、長さ２００ｃｍおよび巾２１ｃｒＩＬの不織布シー
トをポリエチレンスクリーン（１１１１１開口、０．６
ｕ厚さ）に積層した。積層品はらせんに巻き、ローラー
瓶内に内部表面に対して配置し、７層の深さに内張すし
てらせんを形成させた。ローラー瓶はそれぞれ１．５
Ｘ １０７細胞を接種し、培地を半分満たした。培養の
進行は週期的に内張りの１片を成り出すことによって追
求し、生長培地は週期的に置換して（グルコースと乳酸
の分析に基づいて）栄養物の消耗を回避した。細胞は平
均１．２日の２倍の時間で増殖し１２日後に１瓶当り約
４ Ｘ １０９細胞に達した。4. A nonwoven fabric sheet with a length of 200 cm and a width of 21 cr IL is attached to a polyethylene screen (11111 opening, 0.6
(thickness). The laminate was wound into a spiral, placed against the interior surface in a roller bottle, and lined to a depth of 7 layers to form a spiral. Roller bottles each cost 1.5
X 107 cells were seeded and the medium was half filled. Culture progress was followed by weekly production of a piece of lining, and the growth medium was replaced weekly (based on glucose and lactate analysis) to avoid nutrient depletion. Cells doubled in average time to 1.2 days and reached approximately 4 x 109 cells per vial after 12 days.
５、反応容器を通す流れの不織布上の細胞培養は図５に
描写した実験室規模の集成装置で試験した。5. Cell culture on nonwoven fabrics flowing through reaction vessels was tested in the laboratory scale setup depicted in FIG.
ポリプロピレン又はポリエステル支持体マトリックスは
次の形で反応室（図５．）に導入した。The polypropylene or polyester support matrix was introduced into the reaction chamber (Figure 5) in the following manner.
１）不織布およびポリプロピレンスクリーンの積層物の
積み重ねの環。３驕直径の円形孔を各環にあけ（１又は
５孔／１環）培地を流せるようにする（図４〕。1) Stacked ring of non-woven and polypropylene screen laminates. A circular hole with a diameter of 3 mm is drilled in each ring (1 or 5 holes/ring) to allow the medium to flow (Figure 4).
＋＋） 長方形の積層物を竪固ならせんに巻き、反応
室（図４）にきちんと固定した。++) The rectangular laminate was rolled into a rigid spiral and securely fixed in the reaction chamber (Figure 4).
細胞はマ） ＩＪラックス被覆する十分な生長培地を有
する反応容器に接種した。反応容器を密閉し貯蔵器は培
地を満たした。４時間の静置インキュベーション後、培
地の循環を開始した。ポンプ速度は初めの培地滞留時間
２５分を得るように調整し、細胞が増殖するにつれてポ
ンプ速度は増加し、滞留時間は約１分に減少した。反応
容器は１片の支持体を成り出す〜ことにより週期的に試
料を採取し、ＤＮＡを測定した。培養８日後に反応室の
細胞密度は積み重ねた環で２ ｘ １０’細胞／−およ
びらせんでほとんど７ Ｘ １０’細胞／−に達した。Cells were seeded into reaction vessels with sufficient growth medium to coat the IJ lux. The reaction vessel was sealed and the reservoir filled with medium. After 4 hours of static incubation, circulation of the medium was started. The pump speed was adjusted to obtain an initial medium residence time of 25 minutes, and as the cells grew the pump speed increased and the residence time decreased to approximately 1 minute. The reaction vessel formed a piece of support, and samples were taken weekly to measure DNA. After 8 days of culture, the cell density in the reaction chamber reached 2 x 10' cells/- in stacked rings and almost 7 x 10' cells/- in spirals.
６、 レーヨン（１８μｍ厚さ、０．５〜２−長さ）、
ナイロン（１５μｍ、０．５〜１．５日ｍ）およびアク
リル（１０〜２０μ×０．２〜１ ｒｍ ）の繊維ぐず
を例１のように処理した。各’／ＩＱ、Ｓ’を５０ｍｘ
ペトリ皿の底部に層にし、細胞な接種し、３−のＤＭＥ
Ｍ十１０チ血清を被覆した。繊維層に付着した細胞数は
２４時間後に測定した。付着効率はアクリル繊維上に１
５〜２０％、レーヨン上に６５％およびナイロン繊維上
にほとんど６０％であった。正規の組織培養皿による対
照は７０チ付着効率を得た。6. Rayon (18μm thickness, 0.5~2-length),
Nylon (15 μm, 0.5-1.5 days m) and acrylic (10-20 μm x 0.2-1 rm) fiber waste were treated as in Example 1. Each '/IQ, S' 50mx
Layer the cells on the bottom of a Petri dish and seed with 3-DME.
It was coated with M110 serum. The number of cells attached to the fiber layer was measured after 24 hours. The adhesion efficiency is 1 on acrylic fiber.
5-20%, 65% on rayon and almost 60% on nylon fibers. Controls with regular tissue culture dishes yielded a 70-chi attachment efficiency.
２ 不織布シート（４００ｃｒＩＬ”）は小正方形（約
３Ｘ３ｍ）に切断し、Ｔｅｃｈｎｅ ２００−培養容器
に１００−の培地を入れた。瓶にそれぞれＩ Ｘ １０
’、５ｘｉＯ’および１．５ Ｘ １０’細胞を接種し
た。撹拌は３０ ｒｐｍであった。最初の４時間に対し
ては撹拌機は６０分動かし、５分休止した。その後撹拌
は連続した。接種後第３日に７０−の培地を新しい培地
と置換しその後３５−ｆｆ毎日置換した。細胞数は毎日
ＤＮＡＩａｌｌ定により行なった。接種後、２４時間に
測定した細胞付着は接種密度に関係なく平均６７％（５
６〜８１係］にあった。試験は接種後４日間継続し、細
胞が２倍になる時間は平均約６２時間であった。最終細
胞数は各瓶の細胞が約１０倍に増加し、増加割合は低濃
度の接種材料に感受性のないこと？示した。2. The non-woven fabric sheet (400crIL") was cut into small squares (approximately 3x3m) and 100ml of culture medium was placed in a Techne 200-culture container.
', 5xiO' and 1.5 X 10' cells were seeded. Stirring was at 30 rpm. For the first 4 hours, the stirrer was run for 60 minutes and paused for 5 minutes. Stirring was then continued. On the third day after inoculation, the 70-ff medium was replaced with fresh medium and then 35-ff daily. Cell counts were determined daily by DNA Ill determination. After inoculation, cell adhesion measured 24 hours after inoculation was 67% (55%) on average regardless of inoculation density.
Sections 6-81]. The study continued for 4 days after inoculation, with an average cell doubling time of approximately 62 hours. The final cell count is approximately a 10-fold increase in cells in each bottle, and the rate of increase indicates that they are not sensitive to low concentrations of inoculum. Indicated.
８、２Ｕ直径の微小円盤はフィラメントポリエステル繊
維につき１．５装置およびフィラメント中空ポリプロピ
レン繊維につき１５装置から成る不織繊維シートから、
二重凸面の又シュレンズ一様外観を円盤に与える図２ａ
に示した仕方で円盤の端を熱接着する加熱ダイを使用し
て打ち抜論た。次に円盤は例１におけるように処理し１
００−の培地に５０粒子／−の濃度でＴｅｃｈｎｅ ２
００ ｍｌ撹拌培養瓶に入れた。工ＭＲ−９０ヒトの肺
線維芽細胞を１０５細胞／−の濃度で接種した。撹拌は
間欠的で、次に例７におけるように連続した。培地は例
７におけるように置換した。８日後細胞な計数し４ Ｘ
１０６細胞／−の濃度な有することがわかった。２．
５％の最終羨度の接種は可能であることを立証した。8.2U diameter microdiscs were made from a nonwoven fiber sheet consisting of 1.5 devices per filament polyester fiber and 15 devices per filament hollow polypropylene fiber.
Figure 2a gives the disc a double convex or Schlenz uniform appearance.
The die was punched out using a heated die that thermally bonded the edges of the disc in the manner shown in Figure 2. The disk is then processed as in Example 1 and 1
Techne 2 at a concentration of 50 particles/- in a medium of 00-
00 ml in a stirred culture bottle. Engineering MR-90 human lung fibroblasts were inoculated at a concentration of 105 cells/-. Stirring was intermittent and then continuous as in Example 7. The medium was replaced as in Example 7. After 8 days, count the cells 4X
It was found to have a concentration of 106 cells/-. 2.
It has been proven that vaccination with a final envy level of 5% is possible.
９．２個の平らにした１インチ巾のセルロース透析管１
３から成るらせん積層構造、表面処理不織ポリエステル
布地１１（１０μｍ繊維直径）の小片、およびポリプロ
ピレンスペーサースクリーン１２ （０，６μｍ直径モ
ノフィラメント、１ｕＬ開口）の４小片を図６に示す形
に集成し、ここで各平らにした管１３はそれ自身内にス
ペーサースクリーン１２の小片を有し不織繊維生長マト
リックス１１の小片およびスペーサースクリーン１２に
よりその平らな外部表面上で結分した。全体の集底装ｒ
ＩＬは無菌容器１６に入れ１図７に示すように生長培地
１７に浸漬した。9. 2 flattened 1 inch wide cellulose dialysis tubes 1
3, a small piece of surface-treated nonwoven polyester fabric 11 (10 μm fiber diameter), and 4 small pieces of polypropylene spacer screen 12 (0.6 μm diameter monofilament, 1 uL aperture) were assembled in the shape shown in FIG. Here each flattened tube 13 had a piece of spacer screen 12 within itself bound by a piece of nonwoven fiber growth matrix 11 and spacer screen 12 on its flat exterior surface. Overall collection r
The IL was placed in a sterile container 16 and immersed in a growth medium 17 as shown in FIG.
透析管は各各５０ｃｒＩＬの長さであった。血清な言ま
ぬ栄養培地は１秒につき約１ｃｒＩＬの線状流速で１個
の平らにした管を通してポンプ輸送した。空気および５
＄００２の無菌混合物は他の平らにした透過性らせん管
を通してポンプ輸送した。適当な要素によりガス管から
の排出流は、ガスを運ぶらせん管を週期的に膨張および
縮少するように、らせんが浸漬する生長培地なおだやか
に可逆的に週期的に置換させるように２分間隔で制限し
た。The dialysis tubing was each 50 crIL long. Nutrient medium, including serum, was pumped through one flattened tube at a linear flow rate of approximately 1 crIL per second. air and 5
The $002 sterile mixture was pumped through another flattened permeable helical tube. By means of suitable elements, the exhaust flow from the gas pipe is controlled for 2 minutes so as to periodically expand and contract the gas-carrying helical tube, and to periodically displace the growth medium in which the helix is immersed, in a gentle and reversible manner. limited by interval.
繊維生長マ） ＩＪラックススペーサーおよヒＷ Ｏ）
積層らせん集成装置は１０チ血清な言む１００−のＤ
ＭＫＭ生長培地に浸漬した。バイブ＋３ ｙ−マは１．
５ ｘ １０’細胞／−の密度で生長培地を含む血清に
接種した。９日後に浸漬培地の細胞の濃度は１０７＃ｌ
胞／−以上に生長した。循環培地は血清を含有しなかっ
た。浸漬生長培地は血清な含有し、２４時間毎に１回血
清を置換する割合で灌流した。Fiber growth machine) IJ Lux spacer and WO)
The laminated helix assembly is 100 times the D of 100.
immersed in MKM growth medium. Vibrator +3 Y-ma is 1.
Cells were seeded in serum containing growth medium at a density of 5 x 10' cells/-. After 9 days, the concentration of cells in the soaking medium is 107#l
The cells grew to more than /-. Circulating medium contained no serum. The immersion growth medium contained serum and was perfused at a rate of one serum replacement every 24 hours.
９日後に、十分な生長に達した揚会浸漬生長培地は血清
？含有しない生産浸漬培地に変更した。灌流割合は浸漬
培地からモノクローン抗体を除去して継続した。モノク
ローン抗体の濃度は６週間安定のまま残り、その時点で
継続することはできたが中止した。After 9 days, the Yang Kai immersion growth medium that reached sufficient growth is serum? The production immersion medium was changed to one that does not contain The perfusion rate was continued by removing the monoclonal antibody from the immersion medium. The monoclonal antibody concentration remained stable for 6 weeks, at which point it was possible to continue but discontinued.
生長培地、栄養培地およびガス流路を分離したらせん集
成装置ｔは、それぞれが別別に灌流することができ、塊
り一移行拡散性接触は流路の中で維持された。血清は保
存され、抗体力価は最適レベルに保持された。A helical assembly that separated the growth medium, nutrient medium, and gas channels allowed each to be perfused separately, while mass-transfer diffusive contact was maintained within the channels. Serum was stored and antibody titers were maintained at optimal levels.
尚、図１はポリエステルシート上に生長する線維芽細胞
を示す。ポリエステルシートを切断して３０ｍペトリ皿
に適合する円盤を作り適用する。Note that FIG. 1 shows fibroblasts growing on a polyester sheet. A polyester sheet is cut to form a disc that fits into a 30 m Petri dish and applied.
細胞を接種し、（Ａ）ｉｔ、ａ日、（Ｂ）は１２日増殖
させる。Cells are inoculated and grown for (A) it, a day and (B) 12 days.
次に細胞な固定し、顕微鏡観察に対しギムず染色する。Cells are then fixed and stained with Gimm's staining for microscopic observation.
図２Ａは各種ポリマーの無作為方向性フィラメントから
成る二重凸面の懸濁培養繊維微小円盤を示す。これらポ
リマーのあるものは熱接着でき、そしであるものは中空
で、空気又はガス泡を捕集する開放端で、その大きさお
よび浮揚性は懸濁培養容器の外部圧により決定される。Figure 2A shows a doubly convex suspended cultured fiber microdisc consisting of randomly oriented filaments of various polymers. Some of these polymers can be thermally bonded, and others are hollow with open ends that trap air or gas bubbles, the size and buoyancy of which is determined by the external pressure of the suspension culture vessel.
熱接着端は７１０熱ダイ又はパンチにより打ち抜くこと
により形成される。The thermally bonded edges are formed by punching with a 710 thermal die or punch.
図６は生長マトリックスと平らにした栄養培地および水
を運ぶ透過性管のらせん集成装置である。FIG. 6 is a helical assembly of permeable tubes carrying the growth matrix, flattened nutrient medium and water.
細胞生長＆″ｓ、平らにした管の外側の積層マ） １６
）ラックス行なわＩＬる。Cell growth &''s, layered matrix on the outside of the flattened tube) 16
) Lux do ILru.
図７は図６におけるような積層らせん集成装置である。FIG. 7 is a stacked helical arrangement as in FIG.
第１Ａ図および１Ｂはポリエステルシート上に生長した
線維芽細胞を示す。
第２図しまポリプロピレンスクリーン２に積層シたマト
リックスシート１を示す。
第２Ａ図は二重凸面の懸濁培養に使用する繊維微小円盤
を示す。
第２Ｂ図は内腔にガス泡な有する中空繊維を示す。
第３図はローラー瓶内のマトリックスのらせんシートな
示す。図中１はマトリックスシートおよび２はポリプロ
ピレンスクリ−ｙ２’に示ｊ。
第４Ａ図および第４Ｂ図はカラムに充填したマトリック
スシートを示し、＄４Ａ図では環状、第４Ｂ図ではらせ
んを示す。図中１マトリツクスシート訃よび２はポリプ
ロピレンスクリーン？示ス。
第５図は培地灌流による実験室規模の反応容器を示す。
第６図は生長マトリックスおよび平らにした透過性管の
らせん集成装置な示す。
第７図は積層らせん集成装置を示す。
第７ａ図は第一６図および第７図における積層らせん集
成装置の断面な示す。
第８図は生長マトリックスシート、間にハサム平らにし
た透過性管およびセパレータスクリーンのａＮ７ｊ積み
重ねを示す。Figures 1A and 1B show fibroblasts grown on polyester sheets. FIG. 2 shows a matrix sheet 1 laminated on a striped polypropylene screen 2. Figure 2A shows fibrous microdiscs used in double convex suspension culture. Figure 2B shows a hollow fiber with gas bubbles in the lumen. FIG. 3 shows a spiral sheet of matrix within a roller bottle. In the figure, 1 is a matrix sheet and 2 is a polypropylene screen. Figures 4A and 4B show matrix sheets packed into columns, with Figure 4A showing a ring shape and Figure 4B a spiral shape. In the figure, 1 is a matrix sheet and 2 is a polypropylene screen? Show. FIG. 5 shows a laboratory scale reaction vessel with medium perfusion. FIG. 6 shows a helical assembly of growth matrix and flattened permeable tubes. FIG. 7 shows a stacked helical arrangement. FIG. 7a shows a cross-section of the stacked helical arrangement in FIGS. 16 and 7. FIG. FIG. 8 shows an aN7j stack of growth matrix sheets, flattened permeable tubes in between, and separator screens.
Claims (28)
たその面積の１０〜約１００倍であるその高−表面−面
積基質を供される試験管内細胞培養に使用するマトリッ
クスであって、４０〜約９５％の多孔率および１０〜１
００μのオーダーの孔隙の大きさ、又は約１０〜１００
μの孔隙の大きさを有する開放化発泡構造を有する生理
学的に許容しうる繊維の網目組織から成りマトリックス
の全体の高さは５０〜約５００μのオーダーのものであ
ることを特徴とする、上記マトリックス。(1) A matrix for use in in vitro cell culture provided with a high-surface-area substrate whose effective area is 10 to about 100 times its area projected onto a plane; , 40 to about 95% porosity and 10 to 1
Pore size on the order of 00μ, or about 10-100μ
characterized in that it consists of a network of physiologically acceptable fibers having an open foam structure with a pore size of μ, and the overall height of the matrix is of the order of 50 to about 500 μ. matrix.
又は０．５〜５０μｍのオーダーの直径又は巾を有する
これらの繊維の組み合せからの不織布の１つである、特
許請求の範囲第１項記載のマトリックス。(2) The three-dimensional structure is one of circular, flat, non-circular, or hollow fibers or a combination of these fibers with a diameter or width on the order of 0.5 to 50 μm. Matrix according to item 1.
形成繊維から成り巾対厚さの比は２：１又はそれより高
い、特許請求の範囲第２項記載のマトリックス。3. The matrix of claim 2, wherein the structure consists of 2-20 micrometer ribbon-forming fibers that can be crimped and has a width to thickness ratio of 2:1 or higher.
孔率を有する開放孔発泡ポリマー構造を有する、特許請
求の範囲第１項記載のマトリックス。4. The matrix of claim 1 having an open-pore foamed polymer structure with pores of about 10-100 microns and a porosity of 60-95%.
求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載のマト
リックス。(5) The matrix according to any one of claims 1 to 4, which is adhered to or laminated on a porous support sheet.
ーク形および全体の高さは５０〜約２５０μｍである、
特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載
のマトリックス。(6) particle or flake shape with a projected surface area of 1 to about 10 mm^2 and an overall height of 50 to about 250 μm;
A matrix according to any one of claims 1 to 5.
高周波で）処理することにより細胞付着を増加するため
に修正し又はこの表面は適当な物質により被覆すること
により修正する、特許請求の範囲第１項から第６項のい
ずれか１項に記載のマトリックス。(7) The surface is modified to increase cell attachment by treatment with a corona discharge, cold gas plasma (at low pressure and high frequency) or the surface is modified by coating with a suitable substance. The matrix according to any one of items 1 to 6.
カップリング剤、誘導剤との反応により、又は細胞表面
抗原に対する抗体により修正する、特許請求の範囲第１
項から第６項のいずれか１項に記載のマトリックス−シ
ート。(8) The surface of the matrix is modified to enhance cell attachment by reaction with a chemical coupling agent, inducing agent, or by an antibody against a cell surface antigen.
The matrix sheet according to any one of items 6 to 6.
許請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項に記載の
マトリックス−シート。(9) A matrix-sheet according to any one of claims 1 to 7, wherein the surface is provided with a net positive or net negative charge.
被覆する、特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか
１項に記載のマトリックス。(10) The matrix according to any one of claims 1 to 7, wherein the surface of the matrix component is coated with poly-D-lysine.
ルキレン、ＰＶＣ、ポリスチレン、コラーゲン繊維、ガ
ラス繊維、天然繊維、又はインサート金属である、特許
請求の範囲第１項から第８項のいずれか１項に記載のマ
トリックス。(11) According to any one of claims 1 to 8, the fibrous material or foam material is polyester, polyalkylene, PVC, polystyrene, collagen fiber, glass fiber, natural fiber, or insert metal. Matrix described.
、特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれか１項に
記載のマトリックス−シート。(12) A matrix sheet according to any one of claims 1 to 11, which is pleated, folded, or spirally wound.
の範囲第１項から第９項のいずれか１項に特許請求した
高さ約２６０μまでのマトリックス、セパレータシート
およびさらにこのようなマトリックスシートなどの順序
を含み、所望数のマトリックスシートおよびセパレータ
シートを交互に積み重ね形で供することを特徴とする、
上記システム。(13) An in vitro cell culture system comprising a matrix up to a height of about 260μ as claimed in any one of claims 1 to 9, a separator sheet, and further such matrix sheets, etc. characterized in that the desired number of matrix sheets and separator sheets are provided in alternating stacks,
The above system.
の表面に挿入し、又は付着させる、特許請求の範囲第１
３項記載の試験管内細胞培養システム。(14) Inserted into or attached to the surface of a Petri dish, roller bottle, flask or other container, claim 1
The in vitro cell culture system according to item 3.
囲第６項記載の円盤を液体栄養培地に懸濁させることを
含む、特許請求の範囲第１３項記載の試験管内懸濁細胞
培養システム。(15) The in vitro suspension cell culture system according to claim 13, which comprises suspending matrix particles, flakes or disks according to claim 6 in a liquid nutrient medium.
た粒子の層およびこの層を通る流体の均質な流れを促進
する適当なセパレータ又はじゃま板を含有するカラムを
含む、特許請求の範囲第１６項記載の試験管内培養シス
テム。(16) A column containing a layer of loosely packed particles consisting of pieces of matrix sheet and suitable separators or baffles to promote homogeneous flow of the fluid through the layer. In vitro culture system.
１項に規定したマトリックスに、又は特許請求の範囲第
１３項から第１６項のいずれか１項に規定した堆積シス
テムにこの細胞を培養し、栄養物の供給および廃棄生成
物の除去に対し要素が供されることを含む試験管内細胞
培養方法。(17) The cells are deposited in a matrix as defined in any one of claims 1 to 12 or in a deposition system as defined in any one of claims 13 to 16. An in vitro cell culture method comprising culturing cells and providing elements for the provision of nutrients and the removal of waste products.
を有するポリマー繊維の組み合せから成り、この組み合
せはマトリックスが懸濁する液体栄養培地中で実質的に
中立の浮揚性を有する、特許請求の範囲第６項記載のマ
トリックス。(18) comprising a combination of polymeric fibers having a density higher and lower than that of water, respectively, the combination having substantially neutral buoyancy in the liquid nutrient medium in which the matrix is suspended; Matrix according to item 6.
０４の有効比重を有するポリプロピレン繊維およびポリ
エチレンテレフタレート繊維から成る、特許請求の範囲
第１８項記載のマトリックス。(19) The combination of polymer fibers is about 1.001 to 1.
19. The matrix of claim 18, comprising polypropylene fibers and polyethylene terephthalate fibers having an effective specific gravity of 0.04.
ロピレン繊維および約２０〜５０重量％のポリエチレン
テレフタレート繊維から成る、特許請求の範囲第１８項
記載のマトリックス。20. The matrix of claim 18, wherein the fiber combination consists of about 50-80% by weight polypropylene fibers and about 20-50% by weight polyethylene terephthalate fibers.
の組み合せから成り、この組み合せはこのマトリックス
が懸濁する液体培地中で実質的に中位である浮揚性を有
する、特許請求の範囲第６項記載のマトリックス。(21) comprising a combination of fibers with solid and hollow cross sections, the combination having substantially moderate buoyancy in the liquid medium in which the matrix is suspended; Matrix described.
密封端又は閉塞内腔を有し、この内腔では空気又はガス
が捕集され、液体培地におけるその浮揚性は「もぐり人
形」の仕方でこの培地に適用された外部圧の関数である
、特許請求の範囲第２１項記載のマトリックス。(22) All or some of the hollow fibers have at least one sealed end or closed lumen in which air or gas is trapped and whose buoyancy in a liquid medium is similar to that of a "speakeasy". 22. The matrix of claim 21, wherein the matrix is a function of external pressure applied to the medium at .
外部圧を反復上下することにより液体培地中を反復浮揚
および沈下する、液体培地に懸濁した特許請求の範囲第
２２項記載のマトリックス粒子を特徴とする、試験管内
懸濁液システム。(23) The matrix particles are suspended in a liquid medium and are characterized by the matrix particles according to claim 22, which float and sink repeatedly in the liquid medium by repeatedly raising and lowering the external pressure applied to the liquid medium. An in vitro suspension system.
個又はそれ以上の閉鎖内腔を有する、中空繊維から成る
特許請求の範囲第６項記載のマトリックス。(24) has an effective specific gravity of about 1.001 to 1.04, and 1
7. A matrix according to claim 6 consisting of hollow fibers having one or more closed lumens.
あって、上記マトリックスシートの層から成り、この中
に細胞は捕集され又は付着し、マトリックスシート層間
に栄養培地を誘導する平らにした透過性又は微小多孔性
導管が介在し、他の透過性微小多孔性の平らにした導管
は空気および他のガスに対する流路として働き、この介
在層構造は細胞および新しいおよび消費した液体および
ガスを導入および回収する適当な無菌的囲いに含まれる
栄養培地に浸漬される堆積又はらせんに配列され、温度
、ｐＨ、グルコース濃度および培養システムの他のパラ
メータを監視する要素を供され、すべての細胞生長は平
らにした、透過性、中間層の管状流路の外側の液体培地
で、大部分は上記マトリックスシートの介在層で行なわ
れることを特徴とする、上記システム。(25) An in vitro high-density culture or growth system of cells, comprising a layer of the above-described matrix sheet, into which the cells are collected or attached, and a flattened permeable medium that directs a nutrient medium between the matrix sheet layers. This intervening layer structure allows the introduction of cells and new and spent liquids and gases, while other permeable microporous flattened conduits serve as channels for air and other gases. The collection and collection are arranged in piles or spirals immersed in a nutrient medium contained in a suitable sterile enclosure and provided with elements to monitor temperature, pH, glucose concentration and other parameters of the culture system, and all cell growth is monitored. System as described above, characterized in that the liquid medium outside the tubular channels of a flattened, permeable, intermediate layer is carried out mostly in the intervening layer of the matrix sheet.
ステル、ポリスルホン、ポリハロゲン化エチレンおよび
他のハロカーボンのような透過性又は微小多孔性ポリマ
ーフィルムから成る、特許請求の範囲第２５項記載のシ
ステム。26. The system of claim 25, wherein the flattened intervening tubular conduit is comprised of a permeable or microporous polymeric film such as cellulose, polyester, polysulfone, polyhalogenated ethylene, and other halocarbons.
流体培地は灌流する、特許請求の範囲第２５項記載のシ
ステム。27. The system of claim 25, wherein the cell culture fluid medium outside the flattened permeable intervening conduit is perfused.
胞培養流体培地は１個又はそれより多い平らにした管状
導管内の流体容積を週期的に増減することによりおだや
かに撹拌する、特許請求の範囲第２６項記載のシステム
。(28) The cell culture fluid medium outside the flattened permeable intervening polymer tube is gently agitated by periodically increasing or decreasing the fluid volume within the one or more flattened tubular conduits. The system according to item 26.
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