JPS62502615A - タンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の生産方法 本発明はタンパク質、特に可溶性天然タンパク質の生産方法に関する。本発明は 特に、そのタンパク質を暗号化する遺伝子を含むベクターで形質転換した宿主細 胞により不溶性タンパク質の形で産出される可溶性天然タンパク質に関し、それ 自体組換ＤＮＡ遺伝子工学を利用したタンパク質生産の分野に関する。

タンパク質はペプチド結合で連結されたアミノ酸鎖として存在する。タンパク質 の通常の生物学的活性型（以下天然型と呼ぶ）においては、鎖は熱力学的に有利 な三次元構造に折りたたまれており、その配座は水素結合、疎水性相互作用。

荷電相互作用などのような比較的弱い原子間力により保持されている。イオウ原 子間の共有結合はペプチド領内の分子内ジスルフィルド架橋のみならす、インス リンのような多量体タンパク質の個々のペプチド鎖の間を結ぶ分子間ジスルフィ ド架橋をも形成している。

現在、組換ＤＮＡ技術の利用などにより異種遺伝物質を発現することのできる宿 主細胞を培養して大量生産の可能な商品価値の高いタンパク質は多数ある。しか し、一部の例とくに宿主細胞が大腸菌である場合においては、タンパク質は不溶 性タンパク質凝集物の形で宿主内で産生されこの形態では天然型のもつ機能活性 を発揮しないため、一般に商品としては役立たない。機能活性の欠如は多数の要 因によると思われるが、形質転換細胞により生産されたタンパク質はその天然型 と異なる配座で生成される可能性がある。これらは天然タンパク質の機能活性は 不要な余分の分子間ジスルフィド結合を分子内ジスルフィド結合のほかにもって いる。このようなタンパク質の三次元構造の変化は不溶化のみならずタンパク質 の生物学的活性の低下または消滅にも通ずる。

このようなタンパク質を天然の生物学的に活性な形にするために、タンパク質凝 集物は変形剤により可溶化される。生じた変性タンパク質と折りたたまれていな い個々のペプチド鎖を含む溶液は次に変性剤を除いたり変性条件を正常に回復し たりすることによりタンパク質を再生させポリペプチド鎖を溶液内で折りたたま せ天然の生物学的活性型に回復する。

公開国際特許出願ＦＤ８３１０４４１８はキモトリプシン前駆体を活性型キモト リプシンの転換可能な形で生産するためのこのような方法を記載している。

しかし、全体または一部が折りたたまれていないタンパク質は通常折りたたみ粂 件下では不溶性なため、折りたたみは非常に希薄でかつ大量の溶液中で行うこと が必要となる。このような希薄溶液を大量に処置することはこの方法の工業化に 際して大巾な経費の上昇をもたらすはすである。

著者は今回折りたたまれているタンパク質を同相吸着材に可逆的に吸着させ、吸 着材に結合している間に吸着材に接している溶媒中の変性剤濃度を時間的に減ら してゆくことにより折りたたみを誘導し、続いて吸着材から溶離させることによ り天然型のタンパク質が生成することを発見した。このことは希薄な大量の溶液 中でのタンパク質の再折りたたみを不要にし、工業化への道を有利にする可溶性 天然タンパク質の生産方法を提供する。本方法はさらに異種のタンパク質または 異種の配座状態を分離する方法を提供する。本方法のその他の利点は以下に記載 してありタンパク質生産技術の熟練者には明解なものと思われる。本方法は組換 ＤＮＡ技術により宿主内で不溶性タンパク質凝集物として生産されるタンパク質 に対して、有利に適用できるものと思われる。

本発明は、変性タンパク質の溶液をタンパク質と可逆的に結合する固相に接触さ せて変性タンパク質を固相と可逆的に結合させ、結合したタンパク質を固相と接 する溶媒中の変性剤濃度を時間的に徐々に減少させることにより再生させ、再生 したタンパク質を固相から天然の型で回収するという、タンパク質を天然型で生 産する方法から成る。

本発明の方法はたとえば不溶性タンパク質凝集物のような非天然型で生産される タンパク質辛てに適用できる。本発明は非天然型のタンパク質をたとえば可溶性 天然型タンパク質のような天然型へ転換するのに利用できる。本発明は特に、タ ンパク質がそれを暗号化する遺伝子を含むベクターにより形質転換された宿主細 胞内で不溶液性タンパク質の形で生産されるような、組換Ｄ　Ｎ　Ａ技術により 生産されるタンパク質に適用できる。形質転換宿主細胞により不溶型で生産され る「組換」タンパク質の例としては、ブタ成長ホルモン、金属タンパク質分解酵 素組織抑制物質（ＴＩＭＰ）、メトプロキモジンのような不溶性キモジン前駆体 、免疫グロブリン、およびＣＡＴカルシトニンのようなＣＡ　Ｔ　ＭＱ合タンパ ク質（これらはみな細菌（たとえば大腸菌）や酵母（たとえばＳ　、　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）宿主細胞内で生産される）などがある。

タンパク質は適当な変性剤溶液中で変性させられる。変性剤溶液は変性タンパク 質を可逆的に結合させるために使う固相に合わせて選択される。変性剤は水溶液 中に含まれる形でよく、たとえば塩酸グアノシンの水溶液などがあるがより望ま しくは８Ｍ尿素など尿素がよい。

固相は変性タンパク質が可逆的に結合するものならば何でもよい。タンパク質は 可逆的共有結合により固相と結合することもある。あるいは固相がタンパク質吸 着剤となることもある。たとえばＱ−セファロースやＳ−セファロース。

ファーマシア・モノＱ　ＦＰＬＣ，ファーマシア・モノ５ＦＬＰＧのような寒天 またはその類似物、ＣＭ−セルロース。

ＤＥＡＥセルロース、フォスフォセルロースのようなセルロース、あるいはアン バーライトなどのイオン変換樹脂などがあり、このうち特にＣＭ−セルロースと ファーマレア・モノＱ　ＦＬＰＣが望ましい。固相がイオン交換樹脂の場合、使 用する変性剤は通常タンパク質の吸着を促進するために低イオン強度のものとす ることは理解されるよう。

固相は、面のような連続固相でもよいができれは粒子の方がよい。より望ましく は同相はその中を変性溶液と溶媒が通過できるような固相粒子を含むカラムの形 にするとよい。

固相に結合したタンパク質の再生は、タンパク質の結合する固相に接する溶媒の 変性剤濃度を時間的に段階的に低下させることにより行われる。より有利な実施 法においては、固相に結合したタンパク質を溶媒勾配、より望ましくはタンパク 質の変性条件を開始とし天然条件を終了とする直線勾配で処理する。たとえば８ Ｍ尿素を開始濃度とし０Ｍ尿素を最終濃度とする尿素勾配が使用される。濃度勾 配の構成は通常直線勾配のような連続様式で少なくとも３０分以上できれば６０ 分以上にわたる長時間かけて変化させる。溶媒勾配は結合タンパク質を含むカラ ム内を通過させるのが望ましい。

固相と接する溶媒は変性剤のほかに共役剤ジスルフィド結合形成および破壊試薬 、塩類などを含むこともある。これらの他の成分の濃度はタンパク質の再生過程 で自由に変えられる。

再生処理が終了した時点でタンパク質は固相から回収される。たとえば再生タン パク質はＮａ　ＣＱなどの塩勾配によりイオン交換樹脂から溶離回収される。

本発明は、本発明に従った方法で生産されるいかなるタンパク質をもその範囲に 含む。

本発明はさらに以下の実施例においてのみ具体的方法で記載されている。これら の実施例に示される結果は、本発明による一般的天然型タンパク質生産の実現性 を実証するものであることは理解されよう。

寒−ｉ−然一」２ 本実施例はモデルタンパク質の試験に関する。

［材料および方法］ タンパク質：ウマチトクローム９はＢＤＨより入手した。

雌鶏オバルミンはＳ　ｉｇｎａ　（Σ）より入手した。ウシ膵蔵トリプシン抑制 物質（ＢＰＴＩ、Ｒ）−ラジロール）はＢ　ａｙｅｒＡＧから寄貝曽された。

イオン交換樹脂：カルボキシメタル（ＣＭ）セルロース樹脂およびジエチルアミ ノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース樹脂はそれぞれＷｈａｔｎａｎ（ワットマン） のＣＭ５２およびＤＥ５２である。

タンパク質の変性：市販の乾燥天然タンパク質を適当な緩衝液を含む８Ｍ尿素中 に濃度５〜１０ｎｑ／ｍＱとなるように溶かすことによりタンパク質を変性させ た。溶液を１５分間うｏ′Ｃに加温することによりオバルミンを確実に変性させ た。ジスルフィドも還元する場合は、ジチオスレイトールをうＯｒｎＭとなるよ うに添加した。尿素はＢＤＨのＡ　ｒｉＳｔａｒ等級品で、全尿素溶液は使用直 前に調製した。

タンパク質の固相上での再生： 適当な樹脂の小カラム（一般に径１．５ＣＩｌｌ、長さ３ｃ１１）はタンパク質 を強固に吸着させるような適当な緩衝液で平衡化した。はとんどの場合これはＩ Ｍ　ＥＤＴＡ含有１含有１０〜１間０１ 変性タンパク質を装填する直前に、カラムを８Ｍ尿素を含む前記緩衝液数ＩＱで 洗浄した。通常８Ｍ尿素２１１Ｑに変性タンパク質１０〜２０ｍｇ含むものをカ ラムに装填しな。

続いて吸着したタンパク質に折りたたみを起こさせるような緩衝液を通常直線勾 配で流し尿素を徐々に除き他のパラメーターを変化させた。次にタンパク質を適 当な塩勾配で溶離させ、溶出パターンを回置の未変性タンパク質のパターンと比 較した。流出速度は１．０〜３．３１Ω／分の間で変動させた。

溶出液の２８０ｎ　Ｍにおける吸光度を連続的に測定し、２００滴の分画（約１ ３ｎＱ）を収集した．チオールはＥｌｌＩＩｌａｎの方法（　Ａ　ｒｃｈ　、　 Ｂ　１ｏｃｈｅｎ＋．　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ．　８　２巻７０頁（１９５９）によ り、活性ＢＰＴＩはそのトリプシン阻害能力により（Ｋａｓｓｅｌｌ　Ｂ，　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｇｙｍｏ１１９巻　８４４頁（１９７０）活性を測定した。

活性測定は２５°Ｃで行い、その他の全操作は室温にて行った。

（Ｍｙｅｒ　Ｙ、Ｐ、Ｂｉｏｃｈｅｎｌｉｓｔｒｙ　７巻　７６５頁＜１９６８ ）、Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ　Ｅ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ　７巻２８９頁（ １９６８＞、低イオン強度にてＣＭ−セルロースの小カラムに装填したところ樹 脂の上端より１〜２１′ｎｌの位置に結合したことが色により観察された。溶媒 の尿素濃度を８Ｍから０Ｍ尿素に至る直線勾配で徐々に低下させた。

吸着したタンパク質は塩濃度の上昇勾配により定量的に溶離させた。カラム上に 着色タンパク質はみとめられなくなり溶出パターンは未変性のチトクロームｑの パターンと区別不能であった。同様の結果は折りたたまれていないチトクローム ９をカラム上端側３分の１の樹脂内に撹拌して分散させた場合にも得られた。

尿素を勾配により除々に除くのではなく、変性タンパク質の後にカラムに装填す る緩衝液から完全に除去した場合、タンパク質全体の約８０％しか溶離されず、 残りはカラム上端に吸着されたままだった。実験のより詳細な点は、以下の第１ 図の説明文に記載する。

第１図二〇Ｍ−セルロースに吸着させたウマチトクロームｑの再生。全体を通じ ての緩衝液はＯ，ＩＭ）リスＨＣＱ　、ＰＨ８，７，１ｍＭ　ＥＤＴＡである。

緩衝液１．０ｍｌに溶かしたチトクロームＣＩＯ，Ｏ■（天然または８Ｍ尿素に よる変性物が存在）を同−緩衝液で平衡化したＣＭ−セルロースカラムに装填し な。変性タンパク質に続いて尿素を緩衝液中８ＭからＯＭ濃度に至る２　０００ １＋１直線勾配で流した。両タンパク質はＮａ　ＣＱのＯＭから１．０Ｍに至る ２００ｍ１直線勾配で溶離させた。掲載した溶出パターンは２８０ｎｍの吸光度 で示されている。

ｂ、オバルミン 変性オバルミンは変性剤を除くとその大半が沈澱することはよく知られている。

（Ｓ　１ＴＯｐｓＯｎ等、　Ｊ、　ＡＩ′ｔｔｅｒ　。

Ｃｈｅｌ　、　Ｓａｃ、　７５巻５１３９頁（１９５Ｂ）＞、タンパク質は通常 、２個のアミノ酸残基の部分的リン酸化とプロテアーゼ分解により不均一であり 、主成分の２残基リン酸化分子種は可逆的に変化することがわかっている。

（Ａ　ｈｎ＋ａｄとＳ　ａｌａｈｎｄｄｉｎ　、Ｂ　１ｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ 　１５巻５１６８頁（１９７６））、市販の不均一オバルミンがＤＥＡＥセルロ ースに吸着している間にチトクロームｑに適用したのと同様の方法で再生した場 合、約５０％の明らかに再生した分子が得られた（第２図）。実験のより詳細な 点は以下の第２図の説明文に記載する。

第２図：ＤＥＡＥセルロースに吸着させた雌鶏オバルミンの再生。全体を通じて 緩衝液は２０　ｍ　Ｍ　ｌ−リスＨＣＱ　。

ＰＨ８，７とした。緩衝液２．Ｏｍｌ中にオバルミン２０■を溶かしく天然物ま たは８Ｍ尿素による変性物が存在）、同−緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロー スカラムに装填した。変性タンパク質に続き尿素の８ＭからＯＭに至る２００ｍ １直線勾配をかけた。両タンパク質はＮａ　ＣＱ　ＯＭから０．５Ｍに至る２　 ００　ｍｌ直線勾配で溶出させた。

Ｃ，ウシ膵臓トリプシン抑制物質 一部のタンパク質は安定な折りたたみ配座をとるためにジスルフィド結合を形成 する必要があり、このことは折りたたみ過程の操作および解明を進めるのに役立 つ。この点に関し最も特徴的なタンパク質は３個のジスルフィド結合をもつＢＰ ＴＩである。８Ｍ尿素と５０ｍＭジチオスレイトールで還元したＢＰＴＩをＣＭ −セルロースカラムに装填した。続いて各々負、中性、正に帯電したチオールお よびジスルフィド型のグルタチオン、メルカプトエタノール。

シスタミンの各濃度によってチオール／ジスルフィド酸化還元電位を様々に変え ながら、尿素濃度を直線勾配で除々に低下させた。その後タンパク質は塩勾配に より溶離させた（第３図）。

２８０ｎｍにおけ吸光度によりタンパク質とジスルフィド試薬の両方を検知した 。チオールとＢＰＴＩ）−リプシン抑制物（負活性）を測定した。これらの操作 によりチオールのジスルフィド試薬との（還元試薬を生成する）反応性と、天然 型類似の配座をもつ溶出タンパク質の割合を測定した。チオールおよびジスルフ ィド型のメルカプトエタノール、Ｒ３Ｈ，Ｒ３５Ｒの濃度をそれぞれ一定、増加 、減少させつつ、尿素を直線勾配により緩衝液から除くと、少なくとも９０％の ＢＰＴＩをカラムから溶離できた。ジスルフィド試薬はタンパク質のジスルフィ ドを生成するために、またチオール試薬はタンパク質のジスルフィド再配置を補 助するために添加した。

生成物のＲ３Ｈ／Ｒ３５Ｒ勾配の型に対する依存性はみちれなかった（第３ｂ、 ３ｃ図）、シかし尿素濃度の減少勾配は必要であり、尿素を急激に除去するとご く一部のＢＰＴＩＬか回収されず大半は不活性型となった（第３ｄ図〉、タンパ ク質の樹脂への吸着があまり強くないと推定される高イオン強度緩衝液を用いる と非常に高収量の正しく折りたたまれたＢＰＴＩが得られた（第４図）。

実験のより詳細な点は第３図と第４図の説明文に記載する。

第３図二〇Ｍ−セルロースに吸着させた還元ＢＰＴＩの再生。各場合において、 ８Ｍ尿素含有綬緩衝２　ｍｌにＢＰＴＩ　２０■を溶かしたものを吸着させた。

Ａは対照で、ＢＰＴＩは還元せずに８Ｍ尿素に溶かしただけであり、ＢＰＴＩは 折りたたまれたままでジスルフィドは無傷である。Ｂ、Ｃ，Ｄはう０ｍＭジチオ スレイトールで還元したＢＰＴＩを使用しており、ジチオスレイトールはカラム に結合しない吸光物質である。Ａ、Ｂ、Ｃではタンパク質の後に緩衝液中の尿素 濃度が８ＭからＯＭに至るまでの２００　ｍｌ直線勾配を流した。Ｄでは後続の 緩衝液は尿素を全く含まず勾配をかけなかった。Ａ、Ｂ、Ｄの勾配緩衝液には１ 、Ｏｍ　Ｍヒドロキシエチルジスルフィド（ＲＳＳＲ）が一様に存在するが、Ｃ では８Ｍ尿素溶液のみに１．０ｍＭ存在しその後は除々に濃度が減少する。メル カプトエタノール（ＲＳＨ）はＢとＤでは一様に０．１ｍＭ存在するが、Ｃでは ０Ｍ尿素溶液のみに０．１ｍＭ存在しその後は除々に濃度が増加する。タンパク 質は緩衝液のＮａ　ＣＱ濃度ＯＭから０．６Ｍに至る２００Φ（直線勾配で溶離 した。

ＡとＢではこれらの溶液は１．ＯｍＭ　Ｒ５５Ｒと０．１ｍＭ　ＲＳＨを含むが 、Ｄでは１ｍＭ　Ｒ５５Ｒのみを含む。

全体を通じての緩衝液は１０　ｍ　Ｍ　）リスＨＣＱ、（ＰＨ８，７）１ｍＭ　 ＥＤＴＡとした。実線は２８０ｎｍの吸光度であり、Ｒ３５Ｒとタンパク質の両 方の指標である。

第４図：０．ＩＭ）リスＨＣＱ　、ＰＨ８，７，１ｍＭＥＤＴＡを全体を通じて の緩衝液に使用することによる正しく再生したＢＰＴＩの収量の増加。条件はト リス濃度が１０倍高い点を除き第３Ｃ図と同じである０、ｔた尿素勾配を通じて Ｒ５５Ｒは一様に１．０ｍＭ存在するのに対し、ＲＳＨ濃度はＯＭから１．０ｍ Ｍへ直線的に上昇させた。

カラムから溶離しないようタンパク質は再度８Ｍ尿素と５０　ｍ　Ｍジチオスレ イトールによる処理およびこれに続く再生、ジスルフィド形成過程をくり返すこ とにより回収できる。

多種多様な固相支持体が利用できる０本実施例ではその入手し易さとタンパク質 のクロマトグラフィーのおける多用により親水性イオン交換樹脂を用いたが、こ の他にも適当なりロマトグラフィー支持体は多数ある。タンパク質の樹脂への静 電的結合は折りたたみの大きな妨げにはならないと推定される。というのはいく つかのタンパク質のイオン化した基を修飾してもその折りたたみと安定性は実質 的に変化しないからである０球状タンパク質は一般に全てのイオン基がその表面 に存在する。非極性支持体は球状タンパク質の折りたたみに重要な疎水的相互作 用を阻害するものと推定されるが、膜タンパク質に対しては理想的と考えられる 。

使用する溶媒はタンパク質の固相支持体への吸着と折りたたみ条件の変化の両方 に適したものとする必要がある。

変性剤濃度以外のパラメーターにより、温度、ＰＨ，イオン強度、ジスルフィド 形成または破壊およびリガンド濃度などの折りたたみ条件を変えることができる 。特異的共役物質を溶媒に添加することによっても折りたたみ条件を変えること ができる。

イオン交換樹脂に吸着させた変性タンパク質はＢＰＴＩのチオール基の反応性で 示されるように少なくとも小さな試薬に対しても敏感である。ジスルフィド結合 形成は翻訳後修飾の１種であり、したがってグリコジル化、γ−カルボキシル化 、ヒドロキシル化などもまた可能である。このことから吸着させたタンパク質を 必要な試薬および酸素と接近させることが必要となる。

固相支持体に吸着させたタンパク質の凝集を最小にする方法は、固相支持体への タンパク質の結合に１ないし数個の共有結合性でかつ可逆的な結合を用いること である。

本実験に用いた細胞はプロキモジンを暗号化する遺伝子を含むプラスミドＰＣＴ ７０をもつ大腸菌ＨＢ　１０１細胞である０本プラスミドとその誘導体の詳細な 英国特許第２１００７３７Ｂ号に記載されている。

湿重量Ｌｏｇの細胞（ＨＢ　１０１／ＰＣＴ７０　）を５０ｍＭ）リスＨＣＱ　 、ＰＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＣＱ　３０＋ｚ＋１中に懸濁 し、フレンチプレスに１２５０Ｐ、Ｓ、Ｉ　（重量ボンド／平方インチ）で１回 通温させることにより溶菌させた。溶菌物を４℃で５分間、１２００ｘｇで遠心 分離しな、沈澱物をＨ２Ｏ”３０ｍ１に懸濁し再び前記同様に遠心分離した。洗 浄した沈澱物を２０ｍ　Ｍ　トリスＨＣＱ、ＰＨ９，０，１ｍＭ　ＭＥＤＴＡ　 ８Ｍ尿素中に懸渇し３０℃で３０分間保温した。

１００１１１１Ｘ　１００ｏｕｎのファーアマシア・モノＱ　ＦＰＬＣカラムを ２０ｍＭ　エタノールアミン　ＰＨ９，８Ｍ尿素にて平衡化した。プロキモジン 尿素懸濁液２００μ党をカラムに装填し流速を０．５ｍｌ／分とした。２０ｍＭ 　エタノールアミン中尿素濃度８ＭからＯＭに至る直線減少勾配を流速０．５ｍ ｌ／分にて６０分間にわなりカラムに流した。１ｒｎｌずつの分画を集めた０次 にカラムを２０ｍＭ　エタノールアミンＰ　Ｈ９、０、１０ｍｌで洗浄し、２０ ｍＭ　エタノールアミンＰＨ９，０中　Ｎａ　ＣＱ濃度ＯＭからＩＭに至る直線 勾配で流速０．５ｍｌ／分にて６０分間にわたり展開した。１ｍｌずつの分画を 集めた。第５図は吸光度２８０ｎｍで測定した本カラムの溶出パターンである。

第６図と第７図の説明文に記載したようにしてカラムがら集めた分画を、Ｌ　ａ ｅｎｕｉ　Ｉ　ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２２７巻６８９〜６８５頁（１０７０ ））に従ってＳＤＳ　Ｉｍａｇｅ　１２．５％アクリルアミドゲルに１５０Ｖに て４時間がけることにより分析した０本ゲルをクマシーブルーにて染色し、７． ５％酢酸にて脱色した後、銀染色した（Ｍｅｒｒｉｌ等、　５ｃｉｅｎｃｅ２１ １巻１４３７頁（１９８１））。

ａ纜 実　施　例　３ 金属プロテアーゼ組繊抑制物質（ＴＩＭＰ）本実験に用いた。ｔｆ［ａはＴＩＭ Ｐを暗号化する遺伝子を含むプラスミドＰＭＧ４６１をもつ大腸菌Ｅ１０３Ｓ細 胞である。

プラスミドＰＭＧ４６１の誘導は今回共に請求した英国特許出願第８６００１９ ９号（１９８６年１月６日提出）に記載されている。

実験はプラスミドＰＣＴ７０をもつ大腸菌ＨＢＩＯＩの代りにプラスミドＰＭＧ ４６１をもつ大腸菌Ｅ１０３Ｓを用いて、実質的に実施例２の記載に従って行っ た。

第８図に２８０ｎｍの吸光度により測定したファマシア・モノＱ　ＦＰＬＣカラ ムの溶出パターンを示す。

第６図と第７図の説明文に記載のようにしてカラムから集めた分画は実施例２の 記載に従って分析した。

火−」Ｌ−皿一」。

ブタ成長ホルモン 本実験に用いた細胞はプラスミドＰ　Ｍ　Ｇ　９３５をもつ大腸菌Ｅ１０３５Ｓ である。ブタ成長ホルモンを暗号化する遺伝子は公開欧州特許出願ＥＰ１０４９ ２０Ａ　（Ｂｉｏｇｅｎ　）とＥＰ　１１１３８９Ａ　（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ　） 　ノ記載に従って誘導できる。

プラスミドＰＭＧ９３うはＰＭＧ１９６の誘導体でブタ成長ホルモンを暗号化す る遺伝子をもつ、ＰＭＧ１９６はＰＴｒｐプロモーターとＴ７終終了呼をもつ二 元起始発現ベクターである。Ｐ　Ｍ　Ｇ　１．９６を作成するため、ＰＭＧ１５ 由来のＣｏｌ　Ｅｌ起始点をもつＸｈｏＩ−ＢａｒＨＩ　ＤＮＡ断片をＰＭＧ４ １１から分離したＥｃｏ　ＲＩ　ＢａｍＨＩ　ＤＮＡＦｉ片（Ｙ　ａｒｒａｎ　 ｔｏｎ等、Ｇｅｎｅ　２８巻　２９３〜３００頁（１９８４））と、その唯一の Ｂ　ａｍＨ１部位に挿入された５ａｌＩ　Ｈｉｎｄ　１１１　ＤＮＡ連結体をも つＰＣＱ　Ｖ２（Ｑｕｅｅｎ、　Ｊ、Ｍｏ　Ｑ　、　ａｎｄ　５ｐｐｌ　ｉｅｄ 　、　Ｇｅｎｅ　Ｉ。

２巻１〜１０頁（１９８３＞　）由来のλＤＲとｃ　ｌ８５９をもツＥｃｏＲ１ −５ａｌＩ　ＤＮＡＵｒ片に連結した。生じたプラスミドをＥｃｏＲＩとＰｓｔ Ｉで開裂させ、ＰＳＣＩＯＩ起始点をもつＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ！ｆｔ片をＰＳＣＩＯ Ｉ起始点をもつＰＭＧ１６８由来のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ　ＤＮＡ断片で置換し た。本プラスミドがＰＭＧ１’７１である。ＰＭＧ１７１をＢａｎ＋ＨＩとＰｓ ｔＩで開裂させ、小ＤＮＡ断片をＰＬＴ５４由来のＢ　ａｌｌＨＩ　−Ｐｓｔｌ 断片で置換した（　Ｅ　ｍｔａｇｅ等、ＰＭＡＳ　ＵＳＡ８０巻（１９８Ｂ）３ ６７１〜３６７５頁）０本所片はＰＴｒｐとＴ７終終了呼をもち、生じたプラス ミドはＰ　Ｍ　Ｇ１９６である（Ｗｒｉｇｈｔ　等、印刷中）、ＰＧＨの遺伝子 をＥｃｏＲＩとＣＩａＩで部分的な開裂したベクターに挿入することによりＰＭ Ｇ１９６内に構築し、連結して形質転換した後、アンピシリン抵抗性形質転換細 胞を３０’Ｃ″′Ｃ−選別した。これらの形質転換細胞から分離したプラスミド がＰＭ０９３５でありＰＴｒ　ｐからＰＧＨを発現する。

実験はプラスミドＰＣＴ７０をもつ大腸菌ＨＢ　１０１の代りにプラスミドＰＭ ０９３５をもつ大腸菌Ｅ１０３Ｓを用いて、実施例２の記載に従って行った。

第９図は２８　Ｏｎｌ′Ｄにて測定したファーマシア・モノＱＦＬＰＣの溶出パ ターンを示す。

第６図の説明文の記載に従ってカムラから集めた分画は実施例２の記載に従って 分析した。

ＦＩＧ、　３ Ｍ２３　４　５　６７８　９４０１１　＋２＋３＋４１５＋６１７１８１９ＭＦ ＩＧ、　６　ｇｔａ Ｍ２　３　４　５　６　７８９１０　＋１１２＋３１７．ｌ’１６１７　Ｔ８１ ９Ｍ国際調査報告 、ｈＪＩ　Ｎ三ＸＴＯτ：、ｘ：　ＩＮＴＥＦＬＮＡＴＺＯＮＡ、Ｌ　Ｓ三Ａ− Ｒ（ＨＲ三ＰＯＲτ　ＯＮ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．変性タンパク質溶液を固相と接触させ変性タンパク質を固相と可逆的に結合 させ、結合したタンパク質を固相と接する溶媒中の変性剤濃度を時間的に徐々に 減少させることにより再生させることを特徴とし、再生タンパク質を固相から天 然の型で回収する、天然型タンパク質生産方法。
2. ２．組成がタンパク質に対する変性条件にある起始点の溶媒からタンパク質に対 する天然条件にある終末点の溶媒まで変化する溶媒勾配により固相を処理する， 請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．溶媒勾配が直線勾配である請求の範囲第２項記載の天然型タンパク質生産方 法。
4. ４．変性剤が尿素である請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．溶媒勾配が開始濃度８Ｍ尿素から最終濃度ＯＭ尿素まで６０分間かけて変化 する尿素勾配である，請求の範囲第３項記載の方法。
6. ６．タンパク質が組換ＤＮＡ技術により生産されるタンパク質であり、そのタン パク質を暗号化する遺伝子をもつベクターで形質転換した宿主細胞により不溶性 タンパク質の形で生産される，請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．固相と接する溶媒が変性剤，共役物質，ジスルフィド形成および破壊試薬， 塩類の中から選ばれた１つ以上の成分を含む，請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．固相と接する溶媒が尿素とジチオスレイトールを含む，請求の範囲第７頁記 載の方法。
9. ９．固相吸着剤がイオン交換樹脂である，請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．固相吸着剤がセルロースである，請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．固相吸着剤が寒天またはその類似物質である，請求の範囲第１項記載の方 法。
12. １２．再生タンパク質を塩溶液での溶出によりイオン交換カラムから回収する， 請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．請求の範囲第１項記載の方法により生産される全てのタンパク質。