JPS62502586A - Hybrid gene cassette vector - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ハイフ゛Ｌｚド゛　云　カセットベクタ一本発玉ｑ立互 本発明は、ハイブリッド遺伝子、特に、１つの遺伝子領域で多形性のハイブリッ ド遺伝子の一部、を構築するのに用いるカセットベクターに関する。[Detailed description of the invention] High ``Lz Do'' cassette vector single ball q standing The present invention relates to hybrid genes, especially hybrids that are polymorphic in one gene region. The present invention relates to a cassette vector used to construct a portion of a gene.

敷旦皿究１急金 ここで述べている発明は、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　 Ｈｅａｌｔｈ。Shikidansara Kyu 1 Urgent Money The invention described here is the invention of the National In5titudes of Health.

Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａ ｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓからの奨励金番号ｌＲ４３Ａ１２１６０ ６−０１とｌＲ４３ＡＩ２１６０４−０１に基づいて行われた。United 5tates Department of Health a Incentive number 1R43A12160 from nd Human Re5sources 6-01 and 1R43AI21604-01.

皇考文献 以下の参考文献は、相当する番号によってここで引用する。imperial literature The following references are cited herein by corresponding number:

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３９、　Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｃｅｌユ（１９８２）　２９： ６７１−６７９゜４２、　Ｚｉｓｓｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｈｅ　Ｂａｃｔ ｅｒｉａ　ｈａ　ｅ　Ｌａｍｂｄａ　ｐ、４５５（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８１）。39, Takahashi, et at, Cel Yu (1982) 29: 671-679゜42, Zissler, et al, The Bact area ha e Lambda p, 455 (Cold Spring H arbor Laboratory 1981).

４３、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、＋　１ｂｉｄ、ｐ、　５０４゜４４、Ｐｏ１ ｉｓｋｙ、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ ４６、Ｃｏｒｙ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　 ＵＳＡ　（１９８０）７７：４９４３−４９４７゜ 発浬坏８１量 ヒトの治療用途に、モノクローナル抗体を用いることに対する関心が高まりつつ ある。元来の、そして今だに最もうまくいく、モノクローナル抗体を産する手順 は、マウス細胞のハイブリドーマによるものであるが、マウスのモノクローナル 抗体はヒトへの予防上あるいは治療上の応用において、特に抗体を幾度も注入し て個人に与えるような場合は、制限されてきているように思われる。というのは 、長期投与は抗体における種特異的決定基に対するヒトの免疫的反応をもたらす 可能性があるからである。43, Maniatis, T, + 1 bid, p, 504° 44, Po1 isky, B,, et al, Proc Natl Acad Sci USA 46, Cory, S, et al, Proc Natl Acad Sci USA (1980) 77:4943-4947゜ 81 quantities of Hakkenjing There is growing interest in using monoclonal antibodies for human therapeutic applications. be. The original and still most successful procedure for producing monoclonal antibodies is caused by mouse cell hybridoma, but mouse monoclonal Antibodies can be used in prophylactic or therapeutic applications in humans, especially when antibodies are injected multiple times. It seems that restrictions are being placed on giving it to individuals. I mean , long-term administration results in human immune responses to species-specific determinants in antibodies This is because there is a possibility.

免疫応答の問題はヒトのモノクローナル抗体を用いることによりある程度解決さ れているが、ヒトのモノクローナル抗体の生産には重大な制限がある。今日まで の技術的な問題は。The problem of immune response can be solved to some extent by using human monoclonal antibodies. However, there are significant limitations to the production of human monoclonal antibodies. until today technical issues.

安定で、高生産のヒトハイブリドーマ細胞系列を産する際に生じていた。別の主 な制限は、ヒトハイブリドーマを形成するのに必要な抗原特異的ヒトリンパ球を 産するためのもの。occurred in producing stable, high-producing human hybridoma cell lines. another master A major limitation is the availability of antigen-specific human lymphocytes needed to form human hybridomas. something to produce.

マイコトキシン、ヘビ毒、毒性化学物質、薬剤などのような多種の抗原に対して ９人間を免疫化するという明らかな倫理学上の問題である。それ故に、現在のハ イブリドーマ法により作られ得るヒトモノクローナル抗体の型は非常に限られて おり９例えば肝炎ウィルスＢ抗原やいくつかの赤血球細胞表面抗原のように、そ れに対して高度に免疫化された個体が見出され得る抗原に限られている。Against a wide variety of antigens such as mycotoxins, snake venom, toxic chemicals, drugs, etc. 9 This is an obvious ethical issue in immunizing humans. Therefore, the current The types of human monoclonal antibodies that can be produced using the hybridoma method are very limited. 9 For example, hepatitis virus B antigen and some red blood cell surface antigens. It is limited to those antigens for which individuals can be found to be highly immunized.

機能を有する抗体分子は、２つの軽鎖（Ｌ）と２つの重鎮（）Ｉ）から成り、、 　ＨｚＬｚ四量体として軽／重の対を成している。各軽および重鎮は、抗体の抗 原の特異性に関与する可変領域（Ｖ）。A functional antibody molecule consists of two light chains (L) and two heavy chains (I), It forms a light/heavy pair as a HzLz tetramer. Each light and heavy antibody has anti- Variable region (V) involved in original specificity.

および受容体や構造上の機能に寄与している定常領域（Ｃ）を含む。外来（マウ ス）のモノクローナル抗体に対するヒトにおける免疫応答は、抗体の軽および重 鎮の定常領域に対して大きく支配されているので、マウスの可変領域とヒトの定 常領域を持つヒト／マウス　ハイブリッド抗体は、治療用に長期間に渡り投与す る場合、望ましくない免疫応答を刺激するという抗体の能力を大いに中和するで あろうと提案されている。同時に、ハイブリッド抗体はあらゆる所定の抗原に対 して特異性を持たせて構築され得るだろう。というのは、抗体の抗原特異的な可 変領域はマウスで生じた抗体に由来するであろうから。and a constant region (C) that contributes to receptor and structural functions. Outpatient (Mau) The immune response in humans to monoclonal antibodies of Since the mouse variable region and the human constant region are largely controlled by the Human/mouse hybrid antibodies with constant regions can be administered over long periods of time for therapeutic purposes. can largely neutralize the ability of antibodies to stimulate unwanted immune responses. It is proposed that there may be. At the same time, hybrid antibodies can be directed against any given antigen. It could be constructed with specificity. This is because the antigen-specific potential of the antibody The variable regions would be derived from antibodies raised in mice.

異なる抗体クラスに由来する可変および定常領域を持つハイブリッドヒト抗体も 重要な治療上の用途を持つであろう。Hybrid human antibodies with variable and constant regions derived from different antibody classes are also It may have important therapeutic uses.

例えば、寒冷凝集素自己免疫溶血性貧血において、典型的にはＩＢＭ抗体が赤血 球細胞抗原に向けられており、凝集化および破壊が起こる。赤血球細胞に向けら れている可変Ｉ　ｇ　Ｍ　９ｉ域を持ち、そして例えばＩｇＧ定常領域を持つハ イブリッドヒトモノクローナル抗体は、赤血球細胞抗原部位への結合に対し。For example, in cold agglutinin autoimmune hemolytic anemia, IBM antibodies typically It is directed against bulb cell antigens, resulting in aggregation and destruction. directed towards red blood cells For example, a hybrid with a variable IgM9i region that has an IgG constant region. Hybrid human monoclonal antibodies for binding to red blood cell antigen sites.

ＩｇＭ抗体と拮抗できるであろうし、従って、自身で望ましくない溶血反応を産 むこともなく赤血球細胞へのＩｇＭ抗体の接着を阻止している。他には、非相補 的固体抗体を相補的固体抗体に変換して、感染病あるいは悪性の病気との闘いに おけるその効果を高めることができよう。may be able to antagonize IgM antibodies and therefore produce unwanted hemolytic reactions themselves. It seamlessly blocks the adhesion of IgM antibodies to red blood cells. In addition, non-complementary Convert target solid antibodies into complementary solid antibodies to fight infectious or malignant diseases. This could enhance its effectiveness.

機能的なヒト／マウス　ハイブリッド免疫学的遺伝子は。A functional human/mouse hybrid immunological gene.

各型および軽鎖遺伝子における可変および定常領域間のイントロンにおいて、マ ウスの可変部コード領域をヒトの定常領域へとスプライシングすることにより構 築し得るであろうことが、これまでに示されている。両ハイブリッド軽鎖遺伝子 および重鎮遺伝子でともにトランスフェクションしたマウスのミエローマ細胞は ２元のマウスの抗体の特異性に一致した特異性を持つ四量体ハイブリッド抗体を 産することが示されている（参考文献１）。各ハイプリント遺伝子を構築する際 。In the intron between the variable and constant regions of each type and light chain gene, constructed by splicing the mouse variable coding region into the human constant region. It has been shown so far that it can be built. Both hybrid light chain genes and mouse myeloma cells co-transfected with key genes. A tetrameric hybrid antibody with specificity matching that of the original mouse antibody was generated. (Reference 1). When constructing each hyperprinted gene .

共に継がれるべきマウスとヒトの両遺伝子の単離クローンを。Isolated clones of both mouse and human genes that should be inherited together.

旦　ビトロの制限エンドヌクレアーゼや連結操作により切断して継ぎ、中間のイ ントロン領域で異なる起源の可変および定常コード領域を連結した。各抗体額用 の六イブリフト遺伝子を産するのに必要なりローン化遺伝子の単離および−（７ ビトロ操作段階は、各々が異なる選択された抗原特異性を持つハイブリッド抗体 の大きな集まりを生じさせることを労力を要するものとすることは認識されよう 。例えば、各メンバーが異なる抗原特異性を持つような場合、所定の免疫学上の クラスのマウス可変部／ヒト定常部遺伝子の一部を構築するためには、その一群 の各メンバーの両軽および重鎮のクローン化可変領域遺伝子を単離し、クローン 化した遺伝子の可変部コード領域をクローン化したヒトの免疫グロブリン鎖遺伝 子の連関した定常領域へ継ぎ、そして望ましいハイブリッド遺伝子の構築を持つ 形質転換体を選択することが必要であろう。Once cut and spliced using an in vitro restriction endonuclease or ligation procedure, the intermediate The variable and constant coding regions of different origins were joined in the intron region. For each antibody forehead Isolation of the cloned gene and -(7 The in vitro engineering step produces hybrid antibodies, each with a different selected antigen specificity. It will be recognized that it is labor intensive to bring about large gatherings of . For example, if each member has a different antigenic specificity, a given immunological To construct a portion of a class of mouse variable region/human constant region genes, a group of Isolate and clone both light and heavy cloned variable region genes of each member of Human immunoglobulin chain genetics by cloning the variable coding region of the transformed gene inherit the associated constant regions of the offspring and have the desired hybrid gene construction. It may be necessary to select for transformants.

重要な医療上の用途を持つことが期待されるであろうハイブリッド免疫学的構造 の別の型は、ハイブリッド移植抗原を含む。移植と免疫応答の抗原は、移植拒絶 を含む免疫システムや、もっと一般的には細胞毒性Ｔ細胞による細胞結合抗原の 認識という、多数の面において重要である。ヒトの移植抗原はヒトの主要組織適 合性複合体（ＭＢＣ）のクラス■とクラス■の遺伝子にコードされており、また ヒトの白血球抗原（ＨＬＡ）としてもみなされており、ヒトの染色体６の２セン チモルガン領域に含まれている（参考文献２および３）。各遺伝子は。Hybrid immunological structures that may be expected to have important medical applications Another type of include hybrid graft antigens. Antigens in transplants and immune responses contribute to transplant rejection of cell-bound antigens by the immune system, including the immune system, and more generally by cytotoxic T cells. It is important in many aspects: recognition. Human transplantation antigens are suitable for major human tissues. It is encoded by the genes of class ■ and class ■ of the conjugative complex (MBC), and It is also considered a human leukocyte antigen (HLA) and is located on the 2nd center of human chromosome 6. It is included in the thymorgan region (References 2 and 3). Each gene is.

種々の長さの非コード（イントロン）領域により各々隔てられている一連のコー ド領域（エキソン）により成っている。A series of codes, each separated by non-coding (intron) regions of varying length. It consists of two code regions (exons).

クラスＩ遺伝子の最初の３つのエキソンとクラス■遺伝子の最初の２つのエキソ ンは高度に多形性で、集団中の個人間で見られる移植抗原性における変化に主と して関係している（参考文献２および３）。クラス■とクラスＨの遺伝子におけ る残りのコード領域は、鎖間の相互作用、膜通過、および抗原の他の構造上ある いは効果的な機能に関連している。The first three exons of class I genes and the first two exons of class ■ genes. The tumor is highly polymorphic and is primarily due to variation in transplant antigenicity between individuals within a population. (References 2 and 3). In class ■ and class H genes The remaining coding region is responsible for interchain interactions, membrane crossing, and other structural aspects of the antigen. or related to effective functioning.

ＨＬＡ複合体内からの個々にクラス！遺伝子およびクラス■遺伝子の特異産物に 起因する全ての多形性を認識し得るモノクローナル抗体を産出できることは、病 気の傾向の診断、移植一致、そしてもしかすれば様々な病気段階の免疫治療にお いて、非常に価値あるものであろう。マウスを免疫化してモノクローナル抗体を 得ようという努力は、非常に限られた数しか成功していない。□というのは、マ ウスは、集団中の個人間で変化する多形性決定基よりむしろ、いくつかのヒト遺 伝子座の１つを有する全遺伝子に共通の捏持異的決定基と免疫学的に反応するか らである。Classes individually from within the HLA complex! Genes and classes ■ Specific products of genes The ability to produce monoclonal antibodies that can recognize all polymorphisms associated with disease diagnosis of Qi trends, transplant matching, and possibly immunotherapy for various disease stages. It would be very valuable. Immunize mice with monoclonal antibodies Efforts to achieve this have been met with very limited success. □ means Rather than polymorphic determinants that vary between individuals in a population, some human genes Does it react immunologically with a genetic determinant common to all genes that have one of the loci? It is et al.

ＨＬＡ抗原のクラスＩとクラス■の遺伝子は、いくっがのマウスＭＨＣのクラス ■とクラス■の遺伝子に相当する。２つの系の比較研究は、いくつかのヒトとマ ウスのクラス■と■遺伝子間の相応を示した（例えば参考文献２−４を参照）、 遺伝子の相応、そして特に類似したヒトＨＬＡ遺伝子とマウスＭＨＣ遺伝子との 構造上および機能上の相同性により、クラス！ヒト遺伝子の最初の３つのエキソ ンあるいはクラス■遺伝子の最初の２つのエキソンのようなヒトの多形性コード 領域、および相補的なマウスの非多形性領域を含むハイブリッド遺伝子の構築が 可能となろう。HLA antigen class I and class II genes are classified into several mouse MHC classes. Corresponds to ■ and class ■ genes. Comparative studies of the two systems include several human and showed the correspondence between the class ■ and ■ genes of the mouse (for example, see references 2-4), Genetic correspondence, especially similar human HLA genes and mouse MHC genes Due to structural and functional homology, the class! The first three exos of the human gene human polymorphic code such as the first two exons of a gene construction of a hybrid gene containing a complementary mouse non-polymorphic region It will be possible.

理論的には、ハイブリッドクラス■およびＩＩ　）ＩＬＡ／Ｍ）Ｉｃ遺伝子は、 単離したクローン化ヒトおよびマウス遺伝子を適当なイントロン領域でともに継 ぎ、そして成功した形質転換体を選択し遺伝子構築に関して確認するという、ハ イブリッド抗体遺伝子の構築について上で述べたものと同じように構築できるで あろう。しかしながらこの方法は、上で述べたのと同じ制限で苦労するであろう し、また各メンバーが異なるＨＬＡ多形性領域を持つハイブリッド組織適合性複 合体遺伝子の一部を生じさせることは相応して困難であろう。Theoretically, hybrid class ■ and II) ILA/M) Ic genes are The isolated cloned human and mouse genes are passed together at appropriate intron regions. The process involved selecting successful transformants and confirming their genetic construction. The hybrid antibody gene can be constructed in the same way as described above. Probably. However, this method would suffer from the same limitations mentioned above. and hybrid histocompatibility complexes in which each member has a different HLA polymorphic region. It would be correspondingly difficult to generate part of the combined gene.

このように、ハイブリッド抗体や移植抗体を含み、またＴ細胞受容体抗原のよう な他の構造をも含み、比較的非多形性の領域に結合している高度に多形性の遺伝 子コード領域からなる一部の遺伝子によっても特徴づけられるような、ハイブリ ッド免疫学的構造のいくつかの重要な応用がある。それ故に、ハイブリッド遺伝 子の一部を容易に生じさせ得る方法を提供することは、ハイブリッド免疫学的構 造の一部を構築する手順の一部として非常に望ましいであろう。This includes hybrid antibodies, transplanted antibodies, and antibodies such as T-cell receptor antigens. A highly polymorphic gene that also contains other structures and is linked to relatively non-polymorphic regions. A hybrid that is also characterized by some genes consisting of child coding regions. There are several important applications of immunological structures. Therefore, hybrid inheritance Providing a method by which part of the offspring can be easily generated is a hybrid immunological construct. would be highly desirable as part of the procedure for constructing part of a structure.

光尻■旦翌 従って２本発明の一般的な目的は、高度に多形性の免疫学的タンパクをコードす るハイブリッド遺伝子の一部の構築を容易にする方法を提供することにある。Hikarijiri■dansu Therefore, it is a general object of the present invention to encode highly polymorphic immunological proteins. The object of the present invention is to provide a method that facilitates the construction of a portion of a hybrid gene.

本発明の他の目的は、ハイブリッド遺伝子構築法において使用される新規なカセ ットベクターを提供することにある。Another object of the present invention is to develop novel cassettes for use in hybrid gene construction methods. The aim is to provide vectors for

本発明のより特定的な目的は、ハイブリッド遺伝子の一部の構築において以下の 利点を持つような方法およびカセットベクターを提供することにある： （ａ）ハイブリッド遺伝子は、単離したクローン化遺伝子よりもむしろ、ＤＮへ 断片ライブラリーより構築する；（ｂ）ハイブリッド遺伝子は、遺伝子の切断や スプライシングの操作なしで形成する；そして。A more specific object of the present invention is to carry out the following in the construction of a portion of the hybrid gene: The purpose of the invention lies in providing a method and cassette vector that has the following advantages: (a) The hybrid gene is transferred to the DN rather than the isolated cloned gene. (b) Hybrid genes are constructed from fragment libraries; formed without splicing operations; and.

（Ｃ）正確な方向性と構造を持つハイブリッド遺伝子の形成により、ハイブリッ ド遺伝子の簡便な選択を可能にする選択可能なマーカーが生じる。(C) Hybridization occurs through the formation of hybrid genes with precise orientation and structure. A selectable marker is generated that allows convenient selection of genes.

本発明のカセットベクターは、１つあるいは好ましくは一部のハイブリッドＡ、 −Ｂ’遺伝子を構築する際に使用するものとする。The cassette vector of the present invention comprises one or preferably a portion of hybrid A, - It shall be used when constructing the B' gene.

ここで、　（ａ）　Ａｉは、　Ａ−Ｂ遺伝子の一部中のＡ、−Ｂ、遺伝子に由来 する多形性のコード領域であり；…）Ｂ′は選択したＡ’−Ｂ′遺伝子に由来し ；（Ｃ）Ａ、とＡｌ、およびＢ、とＢ゛は、構造的そして機能的に相同な遺伝子 領域であり；そして （ｄ）　ＡとＢのコード領域、および八”とＢ゛のコード領域は。Here, (a) Ai is derived from the A, -B, and genes in a part of the A-B gene. ...) B' is derived from the selected A'-B' gene; (C) A, and Al, and B, and B are structurally and functionally homologous genes. area; and (d) The code regions of A and B, and the code regions of 8'' and B'' are.

それぞれイントロンＩとビで隔てられている。They are separated by introns I and B, respectively.

ベクターは以下のものを含む：（１）ベクターとの組換えによりマ−カー遺伝子 を獲得するゲノムライブラリーのクローンの選択を可能にする選択可能なマーカ ー遺伝子、　（２）Ｂ”コード領域、および（３）そのコード領域に隣接してＡ −Ｂ遺伝子族由来の遺伝子のＡ／ＢイントロンＩと相同性のある塩基配列を持つ イントロンに由来する遺伝子断片。本発明の好ましい実施態様では１選択可能な マーカー遺伝子は１組換えによりカセットベクターを獲得するファージクローン 中でアンバー変異の構造遺伝子を発現させるサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子である 。The vector contains the following: (1) marker gene by recombination with the vector; Selectable markers that allow selection of genomic library clones to obtain - gene, (2) B” coding region, and (3) adjacent to that coding region A -Has a base sequence homologous to A/B intron I of genes derived from the B gene family Gene fragments derived from introns. In a preferred embodiment of the present invention, one selection is possible. The marker gene is a phage clone that obtains a cassette vector by one recombination. It is a suppressor tRNA gene that expresses the amber mutation structural gene in .

ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子を構築するのに用いるために設計されるカセ ットベクターでは　Ｂ＋コード領域は。A cassette designed for use in constructing hybrid immunoglobulin genes. In the cut vector, the B+ coding region is.

選択されたクラス、すなわち、にあるいはλ軽鎖クラス、あるいはα、δ、′ε 、γ１．γ２．γ３．γ４．あるいはμ重鎖クラスのどちらか、の好ましいヒト Ａ−Ｂ遺伝子の定常コード領域を含む。ハイブリシト遺伝子を構築する際に用い るＡ、−Ｂ、遺伝子は９選択された抗原、典型的にはマウスハイプリドーマ細胞 系列に対して特異的な抗体を産することのできる細胞に由来する。Ａｉ−Ｂ、遺 伝子は、そのハイブリドーマが産した抗体のクラスを変えることが望まれる場合 は、ヒトのハイプリドーマ細胞系列に由来することもできる。selected class, i.e. or λ light chain class, or α, δ, ′ε , γ1. γ2. γ3. γ4. or the preferred human of either the μ heavy chain class. Contains the constant coding region of the AB genes. Used when constructing hybrid genes A, -B, genes are 9 selected antigens, typically mouse hybridoma cells. Derived from cells capable of producing antibodies specific for the lineage. Ai-B, deceased If the gene is desired to change the class of antibodies produced by the hybridoma, can also be derived from human hybridoma cell lines.

本発明の方法によりハイブリッド免疫グロブリンを構築するためには、望ましい Ａ、−８，を機能的なく再編成された）形で含むことが解っている細胞に由来す るゲノムＤＮＡのライブラリーをまず作る。Ａ、−Ｂ、遺伝子のＡ、可変部コー ド領域、および隣接する下流のイントロン、を含むいくつかのＤＮＡライブラリ ーの断片を９本発明のカセットベクターを保持する組換え陽性宿主に導入する。In order to construct hybrid immunoglobulins by the method of the present invention, it is desirable to derived from cells known to contain A, -8, in a functionally rearranged) form. First, create a library of genomic DNA. A, -B, gene A, variable region code Several DNA libraries containing the domain region and adjacent downstream introns This fragment is introduced into a recombinant positive host carrying the cassette vector of the present invention.

５五イントロンのゲノムライブラリーの断片とカセットベクターとの間の組換え 事象により、ゲノムクローンにベクターが取込まれて、カセットベクター中のＢ °コード領域がクローニングベクターのＡ、遺伝子に隣接するところに位置し、 カセットベクターの残りの部分は９組換えが起こったイントロン領域と９組換え 領域の下流にあるＡｉ　４ｉ遺伝子の部分との間に位置する。組換えた遺伝子中 のＡｉ　、！：Ｂ’領域は１組換え事象によりカセットベクターから獲得された 免疫グロブリンのエンハンサ−区分を含むかもしれない“混成“イントロンによ り隔てられている。カセットベクター中の選択可能なマーカーのクローン化遺伝 子。Recombination between 55-intron genomic library fragments and cassette vectors The event causes the vector to be incorporated into the genomic clone, and the B in the cassette vector °The coding region is located adjacent to the A gene of the cloning vector, The remaining part of the cassette vector is an intron region where 9 recombinations have occurred and 9 recombinations have occurred. It is located between the Ai4i gene part located downstream of the region. in the recombinant gene Ai,! :B' region was acquired from the cassette vector by one recombination event by “hybrid” introns that may contain immunoglobulin enhancer segments. separated. Cloning genetics of selectable markers in cassette vectors Child.

例えばサプレッサーｔＲＮ＾遺伝子による獲得は、適当な選択宿主１例えばサプ レッサー欠損細菌宿主中で成育すると選択できるように、ベクターに所望のハイ ブリッド遺伝子を含ませる。For example, acquisition by the suppressor tRN^ gene can be carried out in a suitable selected host, e.g. The vector has the desired hypertrophy so that it can be selected for growth in a lesser-deficient bacterial host. Contains the hybrid gene.

ヒト／マウスの移植抗原遺伝子を構築するのに設計されたカセットベクターは９ 選択したマウスＭＨＣ遺伝子の主な非多形性のエキソンに由来するＢ゛コード領 域含む。イントロン遺伝子の断片は、相当するヒＩ−ＭＨＣ遺伝子中の相同なり １コード領域と、遺伝子中で相補的な主に多形性のＡ、コード領域との間のイン トロンに由来している。There are 9 cassette vectors designed to construct human/mouse transplant antigen genes. B coding region derived from major non-polymorphic exons of selected mouse MHC genes Including area. Intronic gene fragments are homologous in the corresponding human I-MHC gene. 1 coding region and the complementary, mainly polymorphic A, coding region in the gene. It comes from Tron.

ハイブリッド組織適合性抗原遺伝子を構築するために、特別なりラス■およびク ラス■遺伝子多形性を持つ個々の細胞に由来するゲノムＤＮＡライブラリーが第 １に提供される。遺伝子のＡ、多形性コード領域と隣接するイントロンとを含む いくつかのクローン化ＤＮＡライブラリー断片を、カセットベクターを保持する 組換え陽性宿主に導入する。カセットベクター中の相同なイントロン領域とＡｉ を含む挿入物のイントロン領域との間での組換え事象により、クローン化Ｂ゛遺 伝子にカセットベクターが取込まれて、ベクター中のＢ”非多形性コード領域が 、ファージのＡ、ヒト多形性領域に隣接して下流に位置する。To construct a hybrid histocompatibility antigen gene, a special class ■ and cross Genomic DNA libraries derived from individual cells with gene polymorphisms 1. A of the gene, containing the polymorphic coding region and adjacent introns Several cloned DNA library fragments carrying the cassette vector Introduce into recombinant positive host. Homologous intron region in cassette vector and Ai A recombination event between the intronic region of the insert containing the cloned B The cassette vector is incorporated into the gene, and the B” non-polymorphic coding region in the vector is , A of the phage, located adjacent to and downstream of the human polymorphic region.

本発明はまた。クローニングベクターとカセットベクター間での組換え事象によ り形成された混成体イントロンを含む。The present invention also includes: due to recombination events between the cloning vector and the cassette vector. Contains a hybrid intron formed by

ハイブリッド抗体遺伝子および細胞表面抗原遺伝子、そして本発明の方法により 形成したハイブリッド組織適合性抗原。hybrid antibody gene and cell surface antigen gene, and by the method of the present invention. Hybrid histocompatibility antigen formed.

を含む。including.

これらおよび他の目的、そして本発明の特徴は２本発明の以下の詳しい記述を添 付図とともに読むことにより、いっそう充分に明らかとなるであろう。These and other objects, and features of the invention, will become apparent in the following detailed description of the invention. It will become clearer when read together with the accompanying figures.

（以下余白） 図１４」１幻狛翫肌 第１図は本発明のカセットベクターを構築するための概要を説明する； 第２図はハイブリッドＡ、−Ｂ’遺伝子を形成するための。(Margin below) Figure 14” 1 Phantom Komahanhada FIG. 1 provides an overview for constructing the cassette vector of the present invention; FIG. 2 is for forming a hybrid A, -B' gene.

λフアージベクター中に保持されたＡｉ−Ｂ、遺伝子中の相同性イントロン領域 と第１図のカセットベクターとの間の組換え事象を説明する： 第３図はヒトに定常領域のコード配列を有するハイブリッド軽鎖遺伝子の調製に 使用されるカセットベクターの構築を説明する； 第４図はＸｂａ　ＩとＨｉｎｄ　ＩＩ［（Ａ）もしくはＥｃｏＲｌ　（Ｂ）での 分解後の第３図のカセットベクターでえられた電気泳動パターンを示す； 第５図はλフアージ中および第３図のカセットベクター中に含まれるマウス生殖 系列に遺伝子のＩＳ２Ｓ２領域組換え事象を説明するもので、これにより、その ＩＳ２領域の上流の配列がマウスのに遺伝子に由来し、そしてその定常コード領 域がカセットベクター中に含まれるヒトに鎖遺伝子のヒト定常コード領域に由来 する。ハイブリッド軽鎖遺伝子が形成される； 第６図は、ＥｃｏＲＩによる分解とπａｎ１３プローブへのハイブリダイゼーシ ョン後の、第５図からのハイブリッドに遺伝子のオートラジオグラフィーパター ンを示す：第７図はヒトＩｇＧ４の重鎮のコード領域を含むハイブリ・ノド重鎖 遺伝子の調製に使用されるカセットベクターの構築段階を説明する； 第８図はＰｓｔＩでの分解後の第７図のカセットベクターで得られた電気泳動パ ターンを示す； 第９図はλフアージ中および第７図のカセットベクター中に含まれるマウス生殖 系列μ遺伝子のＩＳ２Ｓ２領域組換え事象を説明するもので、これによりその上 流配列がマウスμ遺伝子に由来し、そしてその定常コード領域がカセットベクタ ー中に含まれるヒトＩｇＧ４鎖遺伝子のヒト定常領域に由来する。ハイブリッド 重鎮遺伝子が形成される：第１０図はハイブリッドのＤＲα／マウスマウＥα免 疫応答遺伝子を調製するためのカセットベクターの構築段階を説明する；そして 。Ai-B retained in the lambda phage vector, homologous intron region in the gene and the cassette vector of Figure 1: Figure 3 shows the preparation of a hybrid light chain gene containing the human constant region coding sequence. Describe the construction of the cassette vectors used; Figure 4 shows Xba I and Hind II [(A) or EcoRl (B) Showing the electrophoretic pattern obtained with the cassette vector of Figure 3 after disassembly; Figure 5 shows the mouse reproduction contained in the λ phage and the cassette vector of Figure 3. It explains the IS2S2 region recombination event of the gene in the series, and thereby the Sequences upstream of the IS2 region are derived from the mouse gene and its constant coding region The region is derived from the human constant coding region of the human chain gene contained in the cassette vector. do. A hybrid light chain gene is formed; Figure 6 shows degradation by EcoRI and hybridization to πan13 probe. Autoradiographic patterns of genes in the hybrid from Figure 5 after Figure 7 shows the hybrid node heavy chain containing the human IgG4 heavyweight coding region. Describe the construction steps of the cassette vector used for gene preparation; Figure 8 shows the electrophoretic pattern obtained with the cassette vector of Figure 7 after digestion with PstI. indicate a turn; Figure 9 shows the mouse reproduction contained in the λ phage and in the cassette vector of Figure 7. This describes the IS2S2 region recombination event of the series μ gene, which The flow sequence is derived from the mouse μ gene, and its constant coding region is a cassette vector. It is derived from the human constant region of the human IgG4 chain gene contained in -. hybrid Key genes are formed: Figure 10 shows the hybrid DRα/mouse Eα immune system. Describe the construction steps of a cassette vector for preparing epidemic response genes; and .

第１１図は、ハイブリッドのＤＲα／Ｉ−Ｅα遺伝子を形成するための、λフア ージ中に含まれるヒトＤＲα遺伝子と第９図のカセットベクターとの間の組換え 事象を説明する。FIG. 11 shows the lambda phase for forming a hybrid DRα/I-Eα gene. Recombination between the human DRα gene contained in the page and the cassette vector shown in FIG. Explain the event.

第１２図は実施例■で述べられる。λＥｌ’１ＢＬ３およびλＣＨ４ａからのフ ァージベクターλＧＬ１ａの構築を説明する。FIG. 12 is described in Example 2. Flux from λEl’1BL3 and λCH4a The construction of phage vector λGL1a will be explained.

第１３図は実施例Ｉで述べられている。に軽鎖のカセットベクターπＬＣゎ・Ｎ ｏｔｌの制限地図である。FIG. 13 is described in Example I. Light chain cassette vector πLCゎ・N This is an OTL restriction map.

第１４図はＴ４４重鎖カセットベクターπＨＣｒ４・Ｎｏｔｌの制限地図であり 、その構築は実施例■に述べられている。Figure 14 is a restriction map of the T44 heavy chain cassette vector πHCr4・Notl. , its construction is described in Example ■.

第１５図は実施例■に述べられている１１重鎖のカセットベクターπＨＣγ８・ ＮｏｔＩの構築を説明する。Figure 15 shows the 11 heavy chain cassette vector πHCγ8 described in Example ①. The construction of NotI will be explained.

第１６図は実施例■で述べられているＴ３３重鎖カセットベクターπＨＣγ、・ Ｎｏｔｌの構築を説明する。FIG. 16 shows the T33 heavy chain cassette vector πHCγ, described in Example ①. The construction of Notl will be explained.

第１７図は実施例Ｘで述べられている。イソタイプを切り換゛　えるカセットベ クターπＳＷＭＧ　３・Ｎｏｔｌの構築を説明する。FIG. 17 is described in Example X. Cassette base for switching isotypes The construction of the vector πSWMG 3/Notl will be explained.

第１８図ＡおよびＢはそれぞれ、実施例ＸＩで述べられているイソタイプを切り 換えるカセットベクターπＳＷＭＧＩおよびπＳＷＭＧ＋−Ｎｏｔｌの構造を説 明する。Figures 18A and B each cut the isotypes described in Example XI. The structures of the cassette vectors πSWMGI and πSWMG+-Notl are explained. I will clarify.

第１９図はマウスの再配列されていない軽鎖遺伝子の領域の制限地図であり、こ れからＪＩ：と−Ｊｃプローブが単離され。Figure 19 is a restriction map of the region of the mouse light chain gene that has not been rearranged. From this, JI: and -Jc probes were isolated.

実施例ｘｎで用いられる。Used in Example xn.

第２０図はマウスの再配列されていない重鎮遺伝子の領域の制限地図であり、こ れからＪ、プローブが単離され、実施例ｘｎで用いられる。Figure 20 is a restriction map of the regions of key genes that have not been rearranged in the mouse. From this, the probe was isolated and used in Example xn.

、第２１図は第１３図の軽鎖カセットベクターとλＧＬ１ａの中でクローン化さ れたマウス抗−Ｌｅｕ３軽鎖遺伝子との間の組換えを説明するもので、これによ り実施例Ｘ■で述べられるようにプラスミドπＬｅｕ−３・ＬＣ中でハイブリッ ドのマウス／ヒト軽鎖遺伝子が形成される。, FIG. 21 is cloned into the light chain cassette vector of FIG. 13 and λGL1a. This paper describes the recombination between the mouse anti-Leu3 light chain gene and the resulting mouse anti-Leu3 light chain gene. Hybridization in plasmid πLeu-3.LC as described in Example X. A new mouse/human light chain gene is formed.

主里■立豊ム星述 ■、カセットベクターの　築 第１図は本発明のカセットベクターの構築に一般に応用可能な方法を説明する。Yuri ■ Tatehomu Seishi ■Construction of cassette vectors FIG. 1 illustrates a generally applicable method for constructing the cassette vectors of the invention.

ベクターの構築に使われ、　ｐＲＬと名付けたプラスミドは、（１）複製の開始 点（ｏｒｉ）　、　（２）選択可能なマーカー遺伝子（ｓｕｐ）　、および（３ ）付加的な遺伝子断片を挿入することのできるいくつかの好ましくは唯一の制限 部位を含むポリリンカー（ＰＬ）　、を含む。複製の開始点は、後述されるよう に、ハイブリッド遺伝子を形成するときに、カセットベクターか組換えを起こす クローン化ライブラリー遺伝子断片をも保持する宿主内でプラスミドの複製を可 能にするものである。クローン化ライブラリー遺伝子がλフアージ中に保持され ている場合、複製の開始点は９代表的には、エセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｔ ）のようないろいろなλ感染可能な細菌宿主中で複製を可能にするＣｏ１Ｅルプ リコンである。クローン化ライブラリー遺伝子がプラスミド中に保持されている 場合。The plasmid used to construct the vector and named pRL has the following functions: (1) initiation of replication; point (ori), (2) selectable marker gene (sup), and (3 ) some preferably only restrictions on which additional gene fragments can be inserted A polylinker (PL) containing a site. The starting point for replication is When forming a hybrid gene, the cassette vector or recombination occurs. The plasmid can be replicated in a host that also carries cloned library gene fragments. It is something that makes it possible. Cloned library genes are maintained in lambda phages 9, the starting point of replication is typically E. coli (E, colt). Co1E group that allows replication in a variety of λ-infectable bacterial hosts, such as It's Recon. Cloned library genes are maintained in plasmids case.

カセットおよびクローニングベクタープラスミドは、２つのプラスミドをレプリ コン部位での組換えなしに共通の宿主中で複製させる異なった（相同でない）レ プリコンを用いて設計する。この型の２つのプラスミドの系は参考文献５に記述 されている。The cassette and cloning vector plasmid replicates two plasmids. Different (non-homologous) genes that replicate in a common host without recombination at con sites Design using precon. A system of two plasmids of this type is described in reference 5. has been done.

選択可能なマーカー遺伝子は好ましくは９Ｍｉ換えにより５ｕｐＦ遺伝子を獲得 するクローン化ライブラリーベクター中でアンバー突然変異遺伝子を発現させる 。サプレッサー−ｔＲＮＡ遺伝子（ｓｕｐＦ）である。サプレッサー−ｔＲＮＡ 遺伝子の利点は、典型的には２００から３ｏｏｂｐのその比較的に小型の大きさ 、そのよく研究された性質、そして異なった型のアンバー突然変異をもつベクタ ー系でのその多能性にある。例えば、アンバー突然変異のかかった構造遺伝子を 保持するλフアージライブラリーベクター中で、ファージによるサプレッサー遺 伝子の獲得により、サプレッサー欠損宿主中でのλの増殖に基づく組換え選択を 可能とする。アンバー突然変異のかかった抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミド のライブラリーベクターを用いれば、サプレッサーの獲得により、抗生物質の存 在下での増殖を基としたプラスミド選択を可能とする。もちろん。The selectable marker gene preferably acquires the 5upF gene by 9Mi recombination. Express the amber mutant gene in a cloning library vector . Suppressor-tRNA gene (supF). Suppressor-tRNA The advantage of the gene is its relatively small size, typically 200 to 3 oobp. , its well-studied properties, and vectors with different types of amber mutations. - due to its versatility in the system. For example, a structural gene with an amber mutation In the λ phage library vector, suppressor genes generated by phages are Gene acquisition allows for recombinant selection based on the propagation of λ in suppressor-deficient hosts. possible. Plasmid containing an amber mutated antibiotic resistance gene By using this library vector, the presence of antibiotics can be suppressed by acquiring suppressors. This enables plasmid selection based on growth in the presence of plasmids. of course.

カセットベクターの選択可能なマーカー遺伝子がプラスミドのライブラリーベク ターにより獲得される場合、マーカー遺伝子それ自身が抗生物質耐性遺伝子であ ってよいことが注意される。The selectable marker gene in the cassette vector is linked to the library vector in the plasmid. the marker gene itself is an antibiotic resistance gene. It is important to note that

λライブラリーベクターでの使用が可能な選択可能なマーカーの代わりの型は、 λと比較的大きなカセットベクターとの間の組換えにより生成するファージの大 きさの増大を基にしている。この実施態様では、ファージは１条件付きで生存可 能、たとえばある化学的な培地の条件下で殺すことができるような大きさで構築 される。組換えにより、ファージはそのような条件下でも容易に生存可能になる 付加的な長さのカセットベクターを獲得する。Alternative types of selectable markers that can be used in lambda library vectors are: The size of the phage produced by recombination between λ and a relatively large cassette vector It is based on the increase in size. In this embodiment, the phage is conditionally viable. for example, constructed in such a size that it can be killed under the conditions of certain chemical media. be done. Recombination makes phage easily viable under such conditions Obtain additional length cassette vectors.

本発明のカセットベクターを構築するときに使用される好ましいプラスミドは、 参考文献６に述べられている型のπプラスミドである。参考文献６に述べられて いるものに類似したプラスミドは第３図の右上に示され、　ｐＭＢ１由来の６４ ５ｂｐのレプリコン、　１９８ｂＰのチロシンｔＲＮＡのアンバーサプレッサー 遺伝子（ｓｕｐＦ）　、および拡大した尺度で示されている制限部位を含む４９ ｂｐのポリリンカー区分を含む。Preferred plasmids used when constructing the cassette vectors of the invention are: A π plasmid of the type described in reference 6. As stated in reference 6 A plasmid similar to the one shown in the upper right of Figure 3 is the 64 5bp replicon, 198bP tyrosine tRNA amber suppressor 49 containing the gene (supF) and restriction sites shown in enlarged scale. Contains a polylinker segment of bp.

カセットベクターの構築の最初の第１段階として、ベクターを用いて形成される ハイブリッドＡ、−Ｂ”遺伝子のＢ゛コード部分５”Ｉ−Ｂ”との連結に寄与す るであろうＢ”コード領域を。As a first step in the construction of a cassette vector, the vector is formed using The hybrid A, -B” gene contributes to the linkage with the B code part 5 “I-B”. B” code area that will be present.

前出のプラスミド中の適当な部位中に挿入する。Insert into the appropriate site in the plasmid described above.

カセットベクターがハイブリッド免疫グロブリン遺伝子を調製するときに用いら れる場合、典型的には　Ｂ＋コード領域は３選択された免疫グロブリン遺伝子の クラスおよび供給源の定常部コード領域を含む。カセットベクターがハイブリッ ド組織適合性抗原遺伝子を調製するときに用いられる場合。Cassette vectors are used when preparing hybrid immunoglobulin genes. If selected, the B+ coding region typically consists of three selected immunoglobulin genes. Contains constant code regions for classes and sources. Cassette vector is hybrid When used when preparing a histocompatibility antigen gene.

Ｂ”コード領域は典型的には１選択された組織適合性抗原からの１つ以上の非多 形性エキソンを含む。Ｂ゛コード領域好ましくは、単離したＡ’−Ｂ’遺伝子　 ｓｌを含む遺伝子断片、もしくはクローン化されたＢ゛のｃＤＮＡから得られる 。B” coding region typically contains one or more non-multiple sequences from one selected histocompatibility antigen. Contains morphic exons. B' coding region, preferably isolated A'-B' gene Obtained from a gene fragment containing sl or cloned B cDNA .

適当なりローンされたゲノムのもしくはｃＤＮＡのＢ゛コード領域一般的な方法 により得ることができる。大多数のヒトおよびネズミの免疫グロブリン遺伝子も しくは遺伝子断片はクローン化されており、完全もしくは部分的な制限地図、そ しである場合には、それらのいくつかにおいて部分的な遺伝子配列が報告されて いる。クローン化された免疫グロブリン遺伝子に関する最新の制限部位とコード の情報は、アメリカ国立衛生研究所、ワシントンＤ、Ｃ，の遺伝子配列データバ ンク。A suitable loaned genomic or cDNA B coding region.General method It can be obtained by The majority of human and murine immunoglobulin genes also or gene fragments have been cloned, complete or partial restriction maps, etc. In some cases, partial gene sequences have been reported for some of them. There is. Current restriction sites and codes for cloned immunoglobulin genes The information is from the gene sequence database of the National Institutes of Health, Washington, D.C. Nku.

もしくはＥＭＢＬ核酸配列データライブラリーより入手することができる。これ らのデータバンクの両方はインテリジエネティクス、インコーポレイテッド（１ ９７５ＥＩ　Ｃｏｍ１ｎｏ　Ｒｅａｌ　Ｗｅｓｔ。Alternatively, it can be obtained from the EMBL nucleic acid sequence data library. this Both of their databanks are owned by Intelligentinetics, Inc. (1 975EI Com1no Real West.

Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９４０４０−２２１６ ）を通して入手可能である。これらのデータバンクを通して入手可能な情報には 。Mountain View, California 94040-2216 ) available through. The information available through these databanks includes .

最新の配列と制限地図の情報に加えて、情報が由来する参考文献のリストが含ま れる。ヒトおよびネズミのクラスＩと■のＭＨＣ遺伝子に関する類似した最近の 情報は、これらの２つのデータバンクから手に入れることができる。後出の表Ｉ は。Contains up-to-date sequence and restriction map information, as well as a list of references from which the information is derived. It will be done. Similar recent studies on human and murine class I and ■ MHC genes Information is available from these two databanks. Table I below teeth.

ヒトおよびネズミの免疫グロブリンとＭＨＣ遺伝子の部分的なリストであり、そ れらについてデータベースの情報が入手可能である。A partial list of human and murine immunoglobulin and MHC genes, including Database information is available for these.

（以下余白） クローン化されたＡ’−Ｂ’遺伝子またはＢ゛を含む遺伝子断片を単離するため のもしくはｃＤＮＡクローンを得るための方法は。(Margin below) To isolate the cloned A'-B' gene or gene fragment containing B' or a method for obtaining cDNA clones.

徹底的に記述されており、前出のデータベースの情報から問題とする遺伝子の各 々について適切な参考文献を得ることができる。多くの場合、クローン化断片お よび／もしくはクローン化断片の単離に合うプローブは入手可能である。プロー ブもしくはクローン化遺伝子断片が容易に入手できない場合。It is thoroughly described, and each gene in question can be extracted from the information in the database mentioned above. Appropriate references can be obtained for each. Often cloned fragments and Probes suitable for isolation of cloned fragments and/or cloned fragments are available. plow or cloned gene fragments are not readily available.

後者は従来通りに、まず最初に遺伝子の配列決定された部分と配列で対応する合 成オリゴヌクレオチドを構築し２次にそのプローブを用いて適当なりローン化遺 伝子断片を同定することにより、得られるだろう。クローン化遺伝子中の問題と する領域の制限地図が入手できない場合、これらは参考文献７で述べられている ような従来通りの制限地図作成方法により構築されるだろう。The latter, as usual, first involves matching the sequenced part of the gene with the sequenced part of the gene. construct oligonucleotides and then use the probes to generate appropriate cloned oligonucleotides. This could be obtained by identifying the gene fragments. Problems in cloning genes If restricted maps are not available for the area covered, these are described in reference 7. It will be constructed using conventional constraint mapping methods such as

選択されたＢ゛を含む遺伝子断片が単離された後　ｓｌ領域クローニングベクタ ーを１つもしくはそれ以上の選択された制限エンドヌクレアーゼで処理すること により、従来通りにＢ゛コード領域切り出す。公の供給源、データベースの情報 。After the selected gene fragment containing B is isolated, the sl region cloning vector - with one or more selected restriction endonucleases. The B code area is extracted in the conventional manner. Information from public sources and databases .

もしくは従来通りのクローン化Ｂ”断片の制限分析により得られる。　Ａ’−Ｂ ’遺伝子の制限地図から、適当な制限部位を決定することができる。Alternatively, it can be obtained by conventional restriction analysis of the cloned B'' fragment.A'-B Appropriate restriction sites can be determined from the restriction map of the 'gene.

Ｂ゛遺伝子は好ましくは、その５°末端近くの、５”に隣接するイントロンの領 域で、そしてその３“末端の、転写後および翻訳後のシグナルの下流、即ち遺伝 子のポリアデニル化部位の下流の位置で切り出される。免疫グロブリン遺伝子で は、５゜の切断部位は、遺伝子の可変領域と定常領域との間のＩＳ２イントロン 中にある。クラス■またはクラス■のＭＨＣ遺伝子では、５′の切断部位は、遺 伝子の多形性と非多形性のエキソン間のイントロン、例えばネズミＭＨＣＩ−Ａ またはＩ−Ｅ、αまたはβ遺伝子では、エキソン２と３の間のイントロン中にあ る。The B' gene preferably has a region of the 5'' adjacent intron near its 5° end. downstream of post-transcriptional and post-translational signals, i.e. genetic It is excised at a position downstream of the child polyadenylation site. with immunoglobulin genes The 5° cleavage site is the IS2 intron between the variable and constant regions of the gene. It's inside. In class ■ or class ■ MHC genes, the 5' cleavage site is Introns between polymorphic and non-polymorphic exons of the gene, e.g. murine MHCI-A or in I-E, α or β genes, in the intron between exons 2 and 3. Ru.

後出の実施例Ｉは、そのＢ゛コード領域ヒト生殖系列に遺伝子由来であるカセッ トベクターの構築を記述している。そのＢ′領領域ヒト生殖系列Ｔ４免疫グロブ リン鎖遺伝子の定常コード領域由来であるカセットベクターの構築は、実施例■ に詳述されている。後出の実施例■は、Ｂ゛コード領域同様に、ネズミのＩ−Ｅ α鎖のイントロン２の主要部分から、その遺伝子のポリアデニル化部位を越えて コードする下流領域までを保持するカセットベクターの構築を記述している。そ の遺伝子は多くのネズミのゲノムライブラリーからクローン化することができ、 そして参考文献８の手順に従い単離することができる。Example I below shows a cassette derived from a gene in the B coding region of the human germline. It describes the construction of vectors. Its B' region human germline T4 immunoglobulin Construction of a cassette vector derived from the constant coding region of the link chain gene is described in Example ■ detailed in. Example 2, which will be described later, uses mouse I-E as well as the B code region. from the main part of intron 2 of the alpha chain, beyond the polyadenylation site of the gene. It describes the construction of a cassette vector that carries up to the downstream coding region. So The gene can be cloned from many murine genomic libraries, It can then be isolated according to the procedure of Reference 8.

Ｂ゛−コード断片を最初のプラスミド（第１図のｐＰＬ）中に導入するために、 カセットプラスミドを１つまたはそれ以−ヒの選択された制限エンドヌクレアー ゼにより、好ましくはプラスミドのポリリンカー領域中に含まれる唯一の制限部 位で分解して、単離されたＲ”断片の挿入に適した部位でプラスミドを直線状に する。Ｂ゛断片よび／もしくはプラスミドが切断されるであろう部位は、１つも しくは両方の断片末端での粘着末端連結により、プラスミド中でＢ′断片の適当 な方向性を与える部位が好ましい。直線状にしたプラスミドと単離したＢ′断片 とを従来通りに粘着末端および／もしくは平滑末端の条件下で連結し、成功した 形質転換体を一般的な手順を用いて選択する。選択可能なマーカーがサプレッサ ー−ｔＲＮＡ遺伝子である場合、宿主は、プラスミドのサプレッサー−ｔＲＮＡ の存在下でのみ発現される１つもしくはそれ以上のアンバー突然変異のかかった 抗生物質遺伝子を持つ第２のプラスミドを含むことが好ましい。そのような選択 系は実施例１．ＩＩ［。To introduce the B-code fragment into the first plasmid (pPL in Figure 1), The cassette plasmid contains one or more selected restriction endonucleases. Preferably, the only restriction region contained in the polylinker region of the plasmid is to linearize the plasmid at a suitable site for insertion of the isolated R” fragment. do. There is no single site where the B fragment and/or plasmid would be cut. or by sticky end ligation at both fragment ends. It is preferable to use a site that provides a certain directionality. Linearized plasmid and isolated B' fragment were successfully ligated under sticky and/or blunt end conditions. Transformants are selected using general procedures. Selectable markers are suppressors - In the case of a tRNA gene, the host uses a plasmid suppressor - tRNA gene. carry one or more amber mutations that are expressed only in the presence of Preferably, it includes a second plasmid carrying the antibiotic gene. such a choice The system is as in Example 1. II[.

そして■に記述されている。得られたプラスミドは第１図中でｐＢ゛　と名付け られている。And it is described in ■. The obtained plasmid is named pB in Figure 1. It is being

カセットベクターの構築における２番目の一般的な段階で。In the second general step in the construction of cassette vectors.

イントロン遺伝子断片をプラスミド中にＢ゛コード断片隣接して導入する。本発 明の重要な特徴に従えば、イントロン遺伝子断片は、カセットベクターを用いて 調製されるハイブリッドＡ、−８’遺伝子の相補的なＡ、コード領域を含む遺伝 子中のイントロン領域に相同的である。特に、遺伝子断片は。The intronic gene fragment is introduced into the plasmid adjacent to the B' code fragment. Main departure According to the key features of the present invention, intronic gene fragments can be Hybrid A to be prepared, A complementary to the -8' gene, the gene containing the coding region It is homologous to the intron region in the child. Especially gene fragments.

組換え一反応能宿主系で２つのインドロン碩域間の組換えが可能であるほど＋　 Ａｉを含む遺伝子のイントロン領域と充分な相同性をもっている。一般的には、 カセットベクターの遺伝子断片とＡ、を含む遺伝子のイントロンのそれとの間の 相同性の程度は、そのような組換えが有効に起こるには少なくとも約９０％以上 でなくてはならないが、しかし要求される相同性の程度は比較的短い相同性領域 ではより大きくなる。好ましくは、イントロン遺伝子断片は、それ自身が（Ａ、 コード領域をハイブリッドＡ、−８’遺伝子に与える’）Ａｉ−Ｂｉ遺伝子を含 むＡ−Ｂ遺伝子群のメンバーである遺伝子のＡとＢのコード領域の間のイントロ ン由来である方がよい。本発明で用いられるＡ−Ｂ遺伝子群には、限定はされな いが９次のものが含まれる： ａ、いくつかの既知のλとに遺伝子を含むヒトの免疫グロブリン軽鎖遺伝子の群 で、ここでＡとＢは各々可変および定常コード領域である。The more recombination between two indolone domains is possible in a recombination-competent host system, the more It has sufficient homology with the intron region of the gene containing Ai. In general, between the gene fragment of the cassette vector and that of the intron of the gene containing A. The degree of homology must be at least about 90% for such recombination to occur effectively. However, the degree of homology required is a relatively short region of homology. Then it gets bigger. Preferably, the intronic gene fragment itself has (A, Contains the Ai-Bi genes. An intro between the A and B coding regions of a gene that is a member of the A-B gene group. It is better if the source is derived from The A-B gene group used in the present invention is not limited. It includes the following: a, a group of human immunoglobulin light chain genes including several known λ and λ genes; where A and B are variable and constant coding regions, respectively.

ｂ、いくつかの既知のα、δ、ε、μ、そしてＴ遺伝子を含むヒトの免疫グロブ リン重鎮遺伝子の群で、ここでＡとＢは各々可変および定常コード領域である。b. Human immunoglobules containing several known α, δ, ε, μ, and T genes. A group of phospho-heavy genes, where A and B are variable and constant coding regions, respectively.

Ｃ，ネズミの軽および重鎮遺伝子の対応する群；ｄ０個々のヒトのクラスＩとク ラス■の組織適合性遺伝子の群で、ここでＡには組織適合性抗原の多形性領域を コードする上流のエキソンが１つもしくはそれ以上台まれ、Ｂにはその遺伝子の 残りの下流のエキソンが含まれる。C, corresponding groups of murine light and heavy genes; d0 individual human class I and class A group of histocompatibility genes, where A contains the polymorphic region of the histocompatibility antigen. One or more upstream coding exons are disrupted, and B has The remaining downstream exons are included.

免疫グロブリン鎖遺伝子の群では、イントロン遺伝子断片はその遺伝子の可変お よび定常コード領域の間のｌ５２Ｔｉｌ域から由来し、後述されるように、　Ｉ Ｓ２　Ｓｉ域に含まれるエンハンサ−因子を含むであろう。イントロンはまた。In the group of immunoglobulin chain genes, intronic gene fragments represent the variable or and from the l52Til region between the and constant coding regions, and as described below, the I S2 will contain the enhancer factor contained in the Si region. Introns again.

再配列されない免疫グロブリン遺伝子中ではクラスの切り換えが起こる切り換え シグナルの上流にあるＩＳ２？＋ｉ域から由来することが好ましい。クラスＩと ■のｖＡ繊織適合遺伝子では、イントロン遺伝子断片はもちろん選択されたＡと Ｂのコード領域中の隣接するエキソン間のイントロンから由来する。免疫グロブ リン遺伝子の１３２部分を含む適当な単離されたクローン化遺伝子または遺伝子 断片、もしくは組織適合性遺伝子中の目的のイントロンを得るための供給源およ び方法は、その遺伝子領域の制限地図を得るための供給源および方法である　Ｂ ｔコード遺伝子断片を含む遺伝子断片に関する前述のそれらと同様である。Class switching occurs in immunoglobulin genes that are not rearranged IS2 upstream of the signal? It is preferable that it originates from the +i region. class I and In the vA fiber-compatible gene of It is derived from an intron between adjacent exons in the coding region of B. immunoglobe A suitable isolated cloned gene or gene containing the 132 portion of the Lin gene source and source for obtaining fragments or desired introns in histocompatibility genes. and methods are sources and methods for obtaining restriction maps of the genetic region. Similar to those described above regarding gene fragments including t-code gene fragments.

クローン化されたイントロンを含む遺伝子または遺伝子断片を１つもしくはそれ 以上の選択した制限エンドヌクレアーゼで処理して、目的のイントロン遺伝子断 片を切り出す。切り出される断片の大きさと位置は、イントロン領域中の適当な 制限部位が利用できることを含む２種々の考慮に依存するであろう。免疫グロブ リン鎖のＡ−Ｂ群由来のイントロン断片は、ＩＳ２遺伝子領域中にエンハンサ− 因子を含んでいることが好ましい。この因子は、ヒトとマウスの免疫グロブリン 遺伝子中で、同種のＢ類縁細胞中での免疫グロブリン遺伝子の効率的な転写に寄 与することが示されている（参考文献９−１２）。イントロン断片の全体の長さ は約６０と１０００ｂｐＯ間であるのがよく、望まれない組換えを避けるために は、断片は反復配列があってはならない。反復配列の存在について遺伝子断片を 選別するための方法はよく知られている。最後に、遺伝子断片は、Ｂｏを含む（ ｐＢ″）プラスミド中への適切な方向性での挿入を容易にする部位で切ってもよ い。one or more cloned intron-containing genes or gene fragments; Treatment with the above-selected restriction endonucleases allows for desired intron gene cleavage. Cut out pieces. The size and position of the fragment to be excised are determined at an appropriate location within the intron region. It will depend on two different considerations including the availability of restriction sites. immunoglobe The intron fragment derived from group A-B of the link chain contains an enhancer in the IS2 gene region. Preferably, it contains a factor. This factor is a human and mouse immunoglobulin in the gene that contributes to the efficient transcription of immunoglobulin genes in homologous B-related cells. (References 9-12). Total length of intron fragment is often between about 60 and 1000 bpO, to avoid unwanted recombination. The fragment must be free of repetitive sequences. Gene fragments for the presence of repetitive sequences Methods for screening are well known. Finally, the gene fragment contains Bo ( pB'') may be cut at a site that facilitates insertion into the plasmid in the proper orientation. stomach.

実施例Ｉは、マウスのに遺伝子の１（ｉｎｄ　Ｉ［ｌ　／　Ｂａｆｆ１ｔ（Ｉ区 分由来のｌｋｂのＩＳ２領域を持つカセットベクターの構築を説明し。Example I is a mouse gene 1 (ind I [l / Baff1t (I section) We describe the construction of a cassette vector carrying the IS2 region of lkb derived from min.

実施例■は、その遺伝子断片がマウスのμ遺伝子のｌｋｂのＸｂａ１区分である 重鎮カセットベクターの構築を述べている。両方のＩ　Ｓ　２　領域にはそれぞ れの遺伝子からのエンハンサ−領域が含まれる。In Example 2, the gene fragment is the lkb Xba1 section of the mouse μ gene. The construction of heavyweight cassette vectors is described. Both IS2 areas each have The enhancer region from both genes is included.

後出の実施例Ｖは、参考文献１３に従って得られたヒ）　ＤＲ−α鎖からの２番 目の介在配列の５゛部分からの２７２ｂｐの遺伝子を含むハイブリッドＭＨＣ− クラス■重鎖のカセットベクターの構築を述べている。Example V, which will be described later, is based on the second sample from the human) DR-α chain obtained according to reference 13. A hybrid MHC-containing 272 bp gene from a 5' portion of the eye intervening sequence. Describes the construction of a class ■heavy chain cassette vector.

引き続き第１図を参照して、前出のように構築されたｐＢ’プラスミドを、ポリ リンカーおよび／もしくはＢ“コード領域の上流のＢ゛区分イントロン部分中で のみプラスミドを選んで切断する１つもしくはそれ以上の制限エンドヌクレアー ゼでの分解により直線状にする。直線状にしたプラスミドを従来通りに単離し、 従来通りの粘着末端および／もしくは平滑末端連結の条件を用いて前出からの単 離されたイントロン遺伝子断片に連結し、イントロン遺伝子断片をＢ”コード断 片の５゛末端に隣接して挿入する。前に検討したように、カセットベクターの選 択可能なマーカー遺伝子の存在を必要とする増殖条件下で、適当な宿主において 成功した形質転換体を選択する。第１図の下にｐＩＢ’　で示しである目的の構 築物を制限分析により確認することができる。Continuing to refer to Figure 1, the pB' plasmid constructed as described above was in the linker and/or the B' section intron section upstream of the B' coding region. one or more restriction endonucleases that selectively cut only plasmids It is made into a straight line by decomposition with zeolite. Isolate the linearized plasmid as usual; The simplex from above using conventional sticky end and/or blunt end ligation conditions. The intron gene fragment is ligated to the separated intron gene fragment, and the intron gene fragment is made into a B” code fragment. Insert adjacent to the 5' end of the piece. As discussed earlier, the selection of cassette vectors in a suitable host under growth conditions requiring the presence of selectable marker genes. Select successful transformants. The desired structure is shown as pIB' at the bottom of Figure 1. Buildings can be confirmed by restriction analysis.

■、ハイフ゛１ッド′　云　の８．ｇ１１Ｉハイブリッド遺伝子を調製するとき のカセットベクターの使用を第２図に説明する。ハイブリッド遺伝子を構築する 通常の方法では、λファージのような適当なベクター中でクローン化されたＤＮ Ａ断片のゲノムＤＮＡライブラリーを、ハイブリッド遺伝子にＡ、コード領域を 与えるＡ、−Ｂ、遺伝子を含む供給源より調製する。例えば、その可変コード領 域がマウス遺伝子由来であるヒト／マウスのハイブリッド免疫グロブリン遺伝子 の構築では、遺伝子の供給源は典型的には９選択された抗原に対する抗体を生産 するように調製したマウスのハイブリドーマ細胞系列である。ハイブリッド組織 適合性抗原遺伝子の構築では、ゲノムＤＮ＾材料の普通の供給源は１問題とする 実験材料から標準的な手段により得られたあらゆるＥＢＶ−形質転換のリンパ芽 球系列である（参考文献１４−１６）。■、8 of hyphenid. When preparing g11I hybrid gene The use of the cassette vector is illustrated in FIG. Construct a hybrid gene The usual method is to clone the cloned DNA in a suitable vector such as λ phage. Genomic DNA library of A fragment, A, coding region to hybrid gene Prepared from a source containing the A, -B gene. For example, the variable code area Human/mouse hybrid immunoglobulin genes whose regions are derived from mouse genes In the construction of a gene source typically produces antibodies against 9 selected antigens. This is a mouse hybridoma cell line prepared as follows. hybrid organization In the construction of compatible antigen genes, common sources of genomic DNA materials are a problem. Any EBV-transformed lymphoid buds obtained by standard means from experimental material. It is a sphere series (References 14-16).

Ａ、−Ｂｉ遺伝子の供給源を供する細胞を標準的な条件下で培養し、そして既知 の手順に従って、ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、　５ａｕ３ａのような適当な 制限エンドヌクレアーゼを用いて部分分解する。制限分解断片をベクター中に連 結し、続いて適当な細菌宿主に入れてプレートにまく。そのようなゲノムライブ ラリーを作る方法はよく知られており９例えば参考文献１７に詳述されている。A, - Cells providing a source of Bi genes were cultured under standard conditions and known Genomic DNA was extracted from the cells according to the procedure of Partially digested using restriction endonucleases. Linking restriction fragments into vectors cells and then plated in suitable bacterial hosts. such genome live Methods for making larries are well known and are detailed in eg ref. 17.

ゲノムＤＮＡ断片の好ましいクローニングベクターは、λのパフケージングと増 殖に必要なＡ　ｍ　ｍ　Ｂ　＆　″構造遺伝子を含むシャロン４Ａフアージのよ うなλファージである。サプレッサー　ｔＲＮＡ遺伝子の非存在下では、λ構造 遺伝子は不完全なタンパクをコードしており、ファージはサプレッサー欠損宿主 に入れてプレートにまいた時にプラークを形成することができない。組換えによ りファージがカセットベクターを組み込んだ時、カセットベクター中のサプレッ サーｔＲＮＡ遺伝子はファージのアンバー突然変異を抑制することができ、プラ ークの形成を基にしてカセットベクターを獲得したファージの選択ができる。組 換え一選択方法はここでは、この型のファージλ／サプレッサーｔＲＮＡ系を特 に参照して述べられるが、カセットベクター中の抗生物質耐性遺伝子がクローニ ングプラスミドにより獲得され、抗生物質選択培地中でのクローニングプラスミ ドの増殖が可能となるような他の組換え選択系も。Preferred cloning vectors for genomic DNA fragments include puff caging and expansion of λ. Sharon 4A Phage, which contains the A, B, &'' structural genes necessary for reproduction. It is a λ phage. In the absence of the suppressor tRNA gene, the λ structure The gene encodes an incomplete protein, and the phage is a suppressor-deficient host. Plaques cannot be formed when placed in water and plated. By recombination When a phage integrates a cassette vector, the suppressor in the cassette vector The sir tRNA gene can suppress the amber mutation in phages and Phage that have acquired the cassette vector can be selected based on the formation of the marker. set A selective selection method is here used to specifically identify this type of phage λ/suppressor tRNA system. However, the antibiotic resistance gene in the cassette vector can be cloned. cloning plasmid in antibiotic selection medium. Other recombinant selection systems also allow for the propagation of

当業者により容易に実施できることがわかる。この系におけるわずかな束縛は以 下の通りである：（１）カセットベクターとクローニングベクターとの間の組換 えは、カセットベクター中にあるものと相同性のあるイントロン領域を含むクロ ーン化ライブラリー遺伝子中でのみ起こること、そして（２）そのような組換え により、ハイブリッド遺伝子の形成へと導く組換えを受けたそれらのクローニン グベクターのみの９選択培地中での選択を可能とする選択可能マーカーのクロー ニングベクターへの組み込みが生じること。It will be appreciated that it can be easily carried out by those skilled in the art. The slight constraint in this system is As follows: (1) Recombination between cassette vector and cloning vector The vector contains a clone containing an intron region homologous to that in the cassette vector. (2) that such recombination occurs only in engineered library genes; cloning those that have undergone recombination leading to the formation of hybrid genes. Cloning of selectable markers to enable selection in 9 selection media of vector-only integration into a vector.

ファージを細胞へ前もって吸収させることによる。λファージの宿主細胞への感 染の手順は５例えば参考文献１８に述べられている。λファージのライブラリー ベクターをまず１組換え陽性、サプレッサー陽性の宿主にかける。この宿主中で 。By pre-absorbing the phages into the cells. Sensitivity of λ phage to host cells The dyeing procedure is described in eg ref. 18. Lambda phage library The vector is first applied to one recombinant-positive, suppressor-positive host. in this host .

相同なイントロン領域をもつカセットベクターとクローニングベクターとの間の 目的のｍ換えが、典型的には約１０−４と１０−２の間の頻度で起こるであろう 。第２図に見られるように、）Ｊｌ換えによりカセットベクター中のＢ゛コード 領域クローニングベクター中の＾エコード領域に隣接して置かれて、目的のハイ ブリッドへニーＢ゛遺伝子が形成され、そして全てのカセットベクター断片がコ ードベクター中の最初のＡ、とＢ、のコード領域の間に置かれる。Between a cassette vector and a cloning vector that have homologous intron regions The desired transmutation will typically occur with a frequency of between about 10 and 10 . As seen in Figure 2, the B code in the cassette vector is The region cloning vector is placed adjacent to the encoding region and contains the desired high The hybrid B gene is formed and all cassette vector fragments are co-located. It is placed between the first A and B coding regions in the code vector.

最初の感染の後、拡大したファージ集団を２組換えによりカセットベクターを獲 得したファージでのみプラークの形成が可能なサプレッサー陰性宿主に入れてプ レートにまく。プラークは１回またはそれ以上の回数、戻り組換えを防ぐために はサプレッサー陰性の宿主が好ましいが、適当な宿主へ再感染され、ハイブリッ ド遺伝子のファージの総量を増加させるであろう。ハイブリッド遺伝子のファー ジの構築は、制限分析により確認され、カセットベクターと不活性または不完全 なＡ、を含む遺伝子断片との組換えの結果生成するハイブリッド遺伝子が除去さ れる。After the initial infection, the expanded phage population undergoes two recombinations to acquire the cassette vector. Plaques can only be formed using the obtained phages by placing them in a suppressor-negative host. Sprinkle on the rate. Plaques are formed one or more times to prevent back recombination. A suppressor-negative host is preferred, but if reinfected into a suitable host, hybridization can occur. This will increase the total amount of phages containing the degenerate gene. hybrid gene fur The construction of the vector was confirmed by restriction analysis, and the cassette vector and inactive or incomplete The hybrid gene generated as a result of recombination with the gene fragment containing A is removed. It will be done.

本発明の特に好ましい実施態様では、ゲノムライブラリーを構築するために用い られるλファージのベクターは、Ａ、−ＢｉまたはＡ”−Ｂ′遺伝子の供給源中 ではまれにしか制限部位を認識しないＮｏｔＩ　、　５ｆｉＩまたはＸｈｏＩの ような酵素により認識される２つの制限部位を含むように修飾される。これらの ２つの同一の制限部位１例えば両方のＮｏｔｌ　、はλファージの“スタッファ −”断片のいずれかの末端に挿入され、ＢａｍＨＩ。In a particularly preferred embodiment of the invention, the The lambda phage vector used is in the source of the A, -Bi or A''-B' gene. NotI, 5fiI, or XhoI, which rarely recognize restriction sites, modified to contain two restriction sites recognized by such enzymes. these Two identical restriction sites 1, e.g. both Notl, -” inserted at either end of the fragment, BamHI.

ＨｉｎｄｎｒそしてＥｃｏＲＩのようなより＠繁に認識される制限部位の１つも しくはそれ以上の組に隣接している（第１２図を参照）。Hindnr and also one of the more commonly recognized restriction sites such as EcoRI or adjacent to more than one set (see FIG. 12).

好ましくは、ゲノムライブラリーを作成するときに用いるのに適当であるほど十 分な部位でゲノムＤＮＡを切断する酵素であるのがよい。さらに好ましくは、そ れはライブラリーを作成するために用いられる酵素であるのがよい。ゲノムＤＮ ＾の供給源を頻繁に認識される酵素で分解し、スタッファ−の対応する制限部位 でファージに挿入すると、その結果得られるゲノムの挿入物には、普通の制限部 位が最も近くに隣接し。Preferably, the number is sufficient to be suitable for use when creating a genomic library. It is preferable that the enzyme be an enzyme that cuts genomic DNA at a specific site. More preferably, the This may be the enzyme used to create the library. Genome DN The source of ^ is digested with frequently recognized enzymes and the corresponding restriction site of the stuffer is into a phage, the resulting genomic insert contains the usual restriction regions. The position is the closest neighbor.

まれな制限部位が遠位に隣接する。第２１図のＡは、普通のＥｃｏＲ１部位とま れなＮｏｔＩ部位がネズミの軽鎖免疫グロブリン遺伝子のゲノムのクローンに隣 接するという、そのような構築を示す。A rare restriction site is distally adjacent. A in Figure 21 shows the normal EcoR1 site and A unique NotI site is located next to a genomic clone of the murine light chain immunoglobulin gene. It shows such a construction called "contact".

ライブラリーを含んでいるベクター中にまれな制限部位を持つことの利点は、適 切なゲノムのクローンが、同じまれな制限部位を含んでいるカセットベクターと 組換えを生じた後に起こる。第１図を参照すれば、その制限部位はカセットベク ター中に区分■の５゛末端に隣接して位置しなければならず。The advantage of having rare restriction sites in vectors containing libraries is that A clone of the unique genome can be cloned with a cassette vector containing the same rare restriction site. Occurs after recombination occurs. Referring to Figure 1, the restriction site is located on the cassette vector. It must be located adjacent to the 5' end of section 2 in the center.

選択マーカー（例えば５ｕｐＦ）もカセットあ複製開始点もまれな制限部位と■ との間にあってはならない。よって、第１図のｐＩＢ’　では、その制限部位は ｓｕｐと１との間の区分中に位置するであろう。（第１３図と第１４図のＮｏｔ １部位も参照。）述べたようなまれな制限部位を含むｐＩＢ’が第２図に示され るように（まれな制限部位に隣接する）λゲノムのクローンへ組み換えられると 、その結果生成するλは３つのまれな制限部位をもち、１つはｓｕｐとゲノム■ との間に位置し、そして２つはゲノム挿入物に隣接している（ＡｉとＢ、の遠位 末端）。そのファージをまれな制限部位で切断し、低濃度で環状化することによ りｒ　Ａｔ−１−８’　−ｏｒｉ−ｓｕｐ−の区分からのプラスミドを得ること ができ、それを次に−Ｉ−Ｂ、−λと−Ａ’″１−Ｂｌ−λ−の区分から容易に 単離することができる。Both selectable markers (e.g. 5upF) and cassette replication origins are rare restriction sites. There should not be any between. Therefore, in pIB' in Figure 1, the restriction site is It will be located in the division between sup and 1. (Not in Figures 13 and 14) See also part 1. ) A pIB' containing rare restriction sites as mentioned is shown in Figure 2. When recombined into a clone of the λ genome (adjacent to rare restriction sites) such that , the resulting λ has three rare restriction sites, one sup and one genomic ■ and two flank the genomic inserts (Ai and B, distal to terminal). By cutting the phage at rare restriction sites and circularizing it at low concentrations, Obtaining plasmids from the division of At-1-8'-ori-sup- , which can then be easily distinguished from -I-B, -λ and -A'''1-Bl-λ-. Can be isolated.

ハイブリッド遺伝子を含む区分を除去することにより、目的のファージが２つの ■領域の間の組換えによる挿入カセットを失うことが防がれる。ライブラリーの 構築のための好ましいλベクターは、実施例■で述べられそして第１２図に示さ れるλＧＬ１ａである。ゲノム挿入物をもつこのλの、同じまれな制限部位（Ｎ ｏｔＩ）を含むカセットベクターとの組換えでの使用は、実施例ｘ■で述べられ ており、そして第２１図に示されている。By removing the section containing the hybrid gene, the phage of interest is divided into two ■Loss of the inserted cassette due to recombination between regions is prevented. library's A preferred λ vector for construction is described in Example II and shown in Figure 12. λGL1a. The same rare restriction site (N The use in recombination with a cassette vector containing otI) is described in Example and is shown in FIG.

ちょうど述べられた遺伝子調製方法は、Ａ、−Ｂ”型のあらゆるハイブリッド遺 伝子を形成するのに一般的に適用可能である。ここで： （ａ）Ａｔは、　Ａ−Ｂ遺伝子群の中のＡ、−Ｂ、遺伝子由来の多形性コード領 域である； （ｂ）Ｂ”は選択されたＡ”−Ｂ“遺伝子に由来する；（Ｃ）Ａ、とＡ、そして Ｂ、とＢｏは構造的そして機能的に相同性の遺伝子領域である；そして （ｄ）　ＡとＢのコード領域、そしてＡ’とＢｏのコード領域は、各々イントロ ンＩとＩ゛により分離している。ｉと■°のイントロンは必ずしもそうではない が、相同的であろう。The gene preparation method just described can produce any hybrid gene of type A, -B. It is generally applicable to forming genes. here: (a) At is a polymorphic coding region derived from A, -B, and genes in the A-B gene group. is the area; (b) B" is derived from the selected A"-B" genes; (C) A, and A, and B, and Bo are structurally and functionally homologous gene regions; and (d) The code regions of A and B, and the code regions of A' and Bo are each introductory They are separated by pins I and I'. This is not necessarily the case for i and ■° introns. would be homologous.

実施例によって、そのＢ゛コード領域ヒト免疫グロブリンに一鎖のコード領域で 、そのイントロン遺伝子断片がネズミ軽鎖遺伝子群の１つからのものであるカセ ットベクターを。In some embodiments, the B coding region human immunoglobulin has a single chain coding region. , a cassette whose intronic gene fragment is from one of the murine light chain gene clusters. vector.

マウスのに−とλ−可変／ヒト−に　ハイブリッド遺伝子の両方を形作るのに用 いることができる。同様に、そのＢ′コード領域がヒトγ１遺伝子コード領域で あり、そのイントロン遺伝子がネズミ重鎮遺伝子群の１つからの切り換え領域に 関して５゛側にある遺伝子部分由来であるカセットベクターを。Used to create both mouse and λ-variable/human hybrid genes. I can be there. Similarly, the B' coding region is the human γ1 gene coding region. Yes, and the intron gene is a switching region from one of the key mouse gene clusters. The cassette vector is derived from the gene part on the 5' side.

。、δＩ　’ｌ　γＩ＋７２＋７３＋　γ４およびμからのマウスのに用いても よい。後者のカセットベクターがネズミのイントロン遺伝子断片の代わりにヒト の重鎮遺伝子群の１つからのイントロン遺伝子断片を含む場合、ヒトの可変α、 δ、Ｃ２γＩ＊ｒＲ＋ｒ２＋　γ４およびμ／ヒトの定常領域　ハイブリッド遺 伝子を調製するのにそのベクターを用いてもよい。. , δI'l γI+72+73+ γ4 and μ good. The latter cassette vector replaces the murine intronic gene fragment with human human variable α, δ, C2γI*rR+r2+ γ4 and μ/human constant region hybrid gene The vector may be used to prepare the gene.

実施例■と■は、マウス−可変／ヒト一定常の各々軽と重鎮のハイブリッド遺伝 子の構築を述べている。Examples ■ and ■ are mouse-variable/human constant hybrid genetics of light and heavy, respectively. It states the construction of a child.

本発明に従って調製することができるハイブリッド組織適合性遺伝子の例として 、ネズミＩ−Ｅα遺伝子のエキソン３−５とヒトＤＲ−α遺伝子のＩＳ２からの イントロン遺伝子断片とを含むカセットベクターを、ヒト多形性ＤＲ−α／マウ ス１４αハイブリッド遺伝子の群のそれぞれを調製するのに用いることができる 。このような遺伝子の構築を実施例■に説明する。As an example of a hybrid histocompatibility gene that can be prepared according to the present invention , from exons 3-5 of the murine I-Eα gene and IS2 of the human DR-α gene. The cassette vector containing the intron gene fragment was can be used to prepare each of a group of 14α hybrid genes. . The construction of such a gene is explained in Example (2).

■、ハイフ゛１−ド゛云　の 前述の方法に従って形成したハイブリッド遺伝子を２種々の細胞系中で発現させ ることができる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子の発現について、マウスの 骨髄腫細胞系列（参考文献１）とプラズマサイトーマとマウス−ハイプリドーマ 細胞系列（参考文献１９）による機能的免疫グロブリン遺伝子の生産が、クロー ン化された免疫グロブリン鎖遺伝子でトランスフェクションされた細胞中で示さ れている。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子を発現させるのに用いる細胞は。■, hyphen 1-d word The hybrid genes formed according to the method described above were expressed in two different cell lines. can be done. Regarding the expression of hybrid immunoglobulin genes, Myeloma cell lineage (Reference 1), plasmacytoma, and mouse hybridoma Production of functional immunoglobulin genes by cell lineages (Reference 19) demonstrated in cells transfected with transfected immunoglobulin chain genes. It is. What cells are used to express the hybrid immunoglobulin genes?

ハイブリッド遺伝子のイントロン中に含まれるエンハンサ−因子に和合性である ものが好ましい。先に参照した最近の研究は９発現細胞が、エンハンサ−因子が 由来するのと同じ種のＢ−類縁細胞であるときに、エンハンサ−因子が最もよく 機能することを示している。本発明のハイブリッド遺伝子中のエンハンサ−因子 は典型的にはカセットベクターから獲得され、ハイブリッド遺伝子中の可変領域 を与える遺伝子と同じ群の遺伝子由来であるので９発現系は、その遺伝子中の可 変領域が由来するものと同じ種のＢ類縁細胞であるのが好ましいであろう。よっ て、ハイブリッドのマウス−可変／ヒト一定常領域遺伝子を発現させるには、プ ラズマサイトーマ、ハイブリドーマ、または骨髄腫細胞系列のようなマウス細胞 系が好ましいであろう。Compatible with enhancer elements contained in the introns of the hybrid gene Preferably. The recent studies referenced above showed that 9-expressing cells were Enhancer factors are best expressed when they are B-related cells of the same species from which they are derived. It has been shown to work. Enhancer elements in the hybrid genes of the invention are typically obtained from cassette vectors and include variable regions in hybrid genes. The 9 expression system is derived from the same group of genes as the genes that give Preferably, it will be a B-related cell of the same species from which the variable region is derived. Okay To express hybrid mouse variable/human constant region genes, Mouse cells such as plasmacytoma, hybridoma, or myeloma cell lines system would be preferred.

ハイブリッドＭＨＣ遺伝子の発現のための好ましい系はネズミのリンパ球細胞で あるが、免疫グロブリン鎖ハイブリッド遺伝子を発現させるのに適したもののよ うな他の細胞系列も用いてよい（参考文献２０．２１）。ネズミのリンパ球細胞 は。A preferred system for expression of hybrid MHC genes is murine lymphoid cells. However, there are some that are suitable for expressing immunoglobulin chain hybrid genes. Other cell lines such as eel may also be used (ref. 20.21). murine lymphocyte cells teeth.

特に、細胞表面抗原の種々のヒト多形性領域のそれぞれに対して向けられるネズ ミモノクローナル抗体を生成するのに用いられる。ハイブリッドのヒト／マウス 免疫応答遺伝子を発現させることにおいて有利である。この適用では、ハイブリ ッドのαまたはβ免疫応答遺伝子を、マウスのリンパ球にトランスフェクション させる。ハイブリッドのαまたはβ鎖の発現により、細胞により通常生産される 相補的なマウスαまたはβ鎖へその鎖が連合する結果となり、ハイブリッド細胞 表面抗原が発現される。混成遺伝子を発現するリンパ球は。In particular, mice directed against each of the various human polymorphic regions of cell surface antigens. used to generate monoclonal antibodies. hybrid human/mouse Advantageous in expressing immune response genes. In this application, hybrid transfection of mouse lymphocytes with α or β immune response genes let Normally produced by cells by expression of hybrid α or β chains This results in association of that chain with the complementary mouse α or β chain, resulting in a hybrid cell. Surface antigens are expressed. Lymphocytes that express hybrid genes.

次に、供与株のマウスを免疫化するのに用いられる。これらの細胞中での主な外 来免疫応答抗原は、ハイブリッド遺伝子のヒト多形性コード領域にコードされて いるものである。The donor strain is then used to immunize mice. The main outside in these cells The next immune response antigen is encoded by the human polymorphic coding region of the hybrid gene. It is something that exists.

選択された発現系細胞の、ハイブリッド遺伝子ファージもしくは他の適当なトラ ンスフェクションベクターによるトランスフェクションは、既知の方法により行 われる。１つの標準的な技術には、リン酸カルシウム沈澱、　ＤＮＡ仲介の遺伝 子移入が包含される（参考文献２２）。プロトプラスト融合は。Hybrid gene phages or other suitable vectors of the selected expression system cells. Transfection with transfection vectors is performed using known methods. be exposed. One standard technique includes calcium phosphate precipitation, DNA-mediated genetic Child importation is included (Reference 22). protoplast fusion.

ある細胞中でより高いトランスフェクション効率を与える代わりの手順である（ 参考文献２３）、比較的最近の手順は、トランスフェクションするベクターに対 する細胞の透過性を増加させるための高電圧変動に依っている（参考文献２４） 、どのようなトランスフェクションの方法を用いても、トランスフェクションの 効率は、ネオマイシン耐性遺伝子のような細菌の抗生物質耐性遺伝子をもつ選択 可能マーカープラスミドを用いたコトランスフェクションにより監視することが できる（参考文献２５）。ファージＤＮＡと選択可能マーカープラスミドとによ る細胞のコトランスフェクションは高い確率で起こるので、抗生物質耐性選択可 能マーカーを含むプラスミドによる共感染も、ハイブリッド遺伝子ベクターによ りトランスフェクションされている細胞の選択を可能にする。An alternative procedure that gives higher transfection efficiency in some cells ( Reference 23), a relatively recent procedure is (Reference 24) , no matter what transfection method is used, transfection The efficiency of selection with bacterial antibiotic resistance genes such as the neomycin resistance gene can be monitored by co-transfection with a marker plasmid. It is possible (Reference 25). by phage DNA and selectable marker plasmids. co-transfection of cells with a high probability of occurrence, allowing selection for antibiotic resistance. Co-infection with plasmids containing functional markers is also possible with hybrid gene vectors. allows selection of cells that have been transfected.

ハイブリッド遺伝子の転写と発現の量は、放射能ラベルした転写物とポリペプチ ドが生産される条件下で、各々既知のハイブリダイゼーション法と抗体沈澱法に より決定することができる。機能的ハイブリッド抗体の生産は、もちろん１選択 された抗原との免疫特異的反応により監視することができる。同様に、多形性ヒ ト・クラス■またはクラス■領域を含むハイブリッド組織適合性遺伝子の生産は 、典型的には細胞に付着している抗原のヒト特異的抗体誘温能により確認するこ とができる。Transcription and expression levels of the hybrid gene were determined using radiolabeled transcripts and polypeptides. under the conditions under which the antibodies are produced using known hybridization methods and antibody precipitation methods, respectively. You can decide more. Production of functional hybrid antibodies is of course the only choice. The immune system can be monitored by immunospecific reaction with the antigen. Similarly, polymorphic The production of a hybrid histocompatibility gene containing a class■ or class■ region is This is typically confirmed by the ability of the antigen attached to the cell to induce human-specific antibodies. I can do it.

前出のものから１本発明の非常にさまざまな目的が満なされていることを認める ことができる。本発明の方法は、単一のカセットベクターを用いた。ハイブリッ ド遺伝子群の構築を可能にし、その中ではその群のメンバーは、カセットベクタ ー中に含まれるコード領域に相補的なハイブリッド遺伝子の領域中で多形性であ る。群の各メンバーは、単離したクローン化遺伝子断片からよりもむしろライブ ラリーゲノムＤＮＡから調製することができ、遺伝子の構築はインビトロでの制 限切断とスプライシングの段階を回避する。ハイブリッド遺伝子、そして特に大 きな群のハイブリッド遺伝子を得るために必要な努力は、このようにして大幅削 除される。さらに。From the foregoing it is acknowledged that the very various objects of the present invention are met. be able to. The method of the invention used a single cassette vector. hybrid allows the construction of gene clusters in which the members of the cluster are polymorphic in the region of the hybrid gene that is complementary to the coding region contained in the Ru. Each member of the group is derived from live rather than isolated cloned gene fragments. Can be prepared from rally genomic DNA, and gene construction is controlled in vitro. Avoids the cleavage and splicing steps. Hybrid genes, and especially large The effort required to obtain a large group of hybrid genes is thus greatly reduced. removed. moreover.

本発明の方法に従ってのハイブリッド遺伝子の形成は、容易に検出が可能であり 、またハイブリッド遺伝子は９例えばプラーク形成ファージから簡単に単離され る。The formation of hybrid genes according to the method of the invention is easily detectable. , and hybrid genes are easily isolated from e.g. plaque-forming phages. Ru.

次の実施例は１本発明に従って作成された種々のベクター構築とハイブリッド遺 伝子の調製を説明するものであるが。The following example illustrates various vector constructions and hybrid genes made in accordance with the present invention. This explains the preparation of the gene.

決して本発明の範囲を限定するものではない。It is not intended to limit the scope of the invention in any way.

（以下余白） ス」１舛 良月」■ＬＬ記汰 部位特異的ＤＮＡ切断は、当業者に通常知られている条件下での適当な制限酵素 （あるいば複数の制限酵素）での処理によって行われ、そしてその特色は、これ らの市販の制限酵素の製造者によって特徴づけられている。例えば＋　Ｎｅ５ｖ 　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、製品カタログを見よ。通常、約１μｇのプラ スミドあるいはＤＮＡ配列は、約２０μｌの緩衝溶液中１ユニツトの酵素によっ て切断される；ここでの実施例では、典型的には。(Margin below) 1 piece Yoshizuki”■LL record Site-specific DNA cleavage can be performed using appropriate restriction enzymes under conditions commonly known to those skilled in the art. (in other words, multiple restriction enzymes), and its characteristics are commercially available restriction enzyme manufacturers. For example + Ne5v EnglandBiolabs, see product catalog. Usually about 1 μg of plastic DNA sequences or DNA sequences can be prepared with 1 unit of enzyme in approximately 20 μl of buffer solution. in this example, typically.

ＤＮＡ基質の完全な分解を確実にするために、過剰の制限酵素を用いている。約 ３７℃で、約１時間か２時間の保温時間で十分であるが８条件を変えることも許 される。各々の保温後。Excess restriction enzyme is used to ensure complete degradation of the DNA substrate. about It is sufficient to keep the temperature at 37°C for about 1 or 2 hours, but it is also possible to change the conditions. be done. After each warming.

タンパクは、フェノール／クロロホルムでの抽出によって取り除き、続いてエー テル抽出を行ってもよい。そして、核酸をエタノールでの沈澱によって水分画か ら回収する。もし望むなら、切断した断片の大きさによる分離を、ポリアクリル アミドゲル、あるいはアガロースゲルの標準手法を用いた電気泳動によって９行 ってもよい。大きさによる分離の一般的な記述は参考文献２６に見られる。Proteins were removed by extraction with phenol/chloroform, followed by Ter extraction may also be performed. Nucleic acids are then separated from water by precipitation with ethanol. Collect from. If desired, size separation of the cut pieces can be done using polyacrylic 9 rows by electrophoresis using standard techniques on amide gels or agarose gels. You can. A general description of size separation can be found in reference 26.

制限切断された断片は、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ　、　ｐＨ７，６，５ ０ｍＭ　ＮａＣ１。The restriction cleaved fragments were treated with 50mM Tris-1 (CI, pH 7,6,5 0mM NaCl.

６ｍＭ　ＭｇＣｈ、６ｍＭ　ＤＴＴおよび５〜１０ｐＭ　ｄＮＴＰ中で、２０か ら２５℃で、約１５〜２５分の保温時間を用い、４つのデオキシヌクレオチド三 リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下、　Ｅ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼ■の巨大断 片（クレノー）で処理することによって、平滑末端にできる。クレノー断片は５ ゛の粘着末端を埋め、４つのｄＮＴＰの存在下でさえ、突き出ている３゛の一本 鎖を消化する。In 6mM MgCh, 6mM DTT and 5-10pM dNTPs, 20 The four deoxynucleotide trinucleotides were incubated at 25°C for approximately 15 to 25 minutes. In the presence of phosphoric acid (dNTP), large fragmentation of E, colt DNA polymerase ■ Blunt ends can be obtained by treating with Klenow. Klenow fragment is 5 Even in the presence of four dNTPs, one of the three dNTPs sticks out. Digest the chain.

もし望むなら、その粘着末端の性質により指図される限度内で選択された１つあ るいはそれ以上のｄＮＴＰのみを供給することによって９選択的な修復を行うこ とができる。クレノーでの処理の後、その混合物をフェノール／クロロホルムで 抽出して、エタノールで沈澱させる。Ｓ１ヌクレアーゼによる適切な条件下での 処理により、あらゆる一本鎖部分の加水分解を生じる。If desired, one selected within the limits dictated by the nature of its sticky end. 9 Selective repair can be performed by supplying only 9 or more dNTPs. I can do it. After treatment with Klenow, the mixture was treated with phenol/chloroform. Extract and precipitate with ethanol. under appropriate conditions with S1 nuclease. Treatment results in hydrolysis of any single-stranded moieties.

合成オリゴヌクレオチドは、　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ等（参考文献２７）のトリエ ステル法、あるいは１９８３年１１月１５日発行の米国特許第４，４１５．７３ ２号に記述されているＣａｒｕｔｈｅｒｓのジエチルホスホアミダイド法によっ て調整される。Synthetic oligonucleotides are described by Matteucci et al. (Reference 27). Steal Act, or U.S. Patent No. 4,415.73, issued November 15, 1983. by the diethylphosphoamidide method of Caruthers, described in No. 2. It is adjusted accordingly.

連結は、典型的には、以下の標準的な条件と温度下で、１５〜３０ｐｌの容量中 で行われる：　５０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−Ｃ１，ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣｈ　、 １０ｍＭ　ＤＴＴ、１１００１ｊ　／−ＢＳＡ、１ｍＭ　ＡＴＰ、そして０℃で は０．０１−０．０２　（Ｗｅｉｓｓ　）ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（“ 粘着末端”連結用）あるいは１４℃では、０．３　０．６　（Ｗｅｉｓｓ　）ユ ニッ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（“平滑末端”連結用）。分子間の“粘着末端”連結 は普通、３３〜１００μｇ／−の総ＤＮＡ濃度（５−１１００ｎ総最終濃度）で 行われる。分子間の平滑末端連結は典型的には、約１μｈ総最終濃度で行われる 。Ligation is typically performed in a volume of 15-30 pl under standard conditions and temperatures as follows: Performed with: 50mM Trts-C1, pH 7,5, 10mM MgCh, 10mM DTT, 11001j/-BSA, 1mM ATP, and at 0°C. is 0.01-0.02 (Weiss) units of T4 DNA ligase (“ (for sticky ends) or 0.3 to 0.6 (Weiss) units at 14°C. N) T4 DNA ligase (for "blunt end" ligations). “sticky end” linkage between molecules is typically at a total DNA concentration of 33-100μg/- (5-1100n total final concentration). It will be done. Intermolecular blunt end ligations are typically performed at approximately 1 μh total final concentration. .

“ベクター断片”を用いるベクター構築においては、５′のリン酸を取り除き、 ベクターの再連結を防ぐために、ベクタ−断片を一般にウシ腸ホスファターゼ（ ＣＩＰ　）で処理する。In vector construction using “vector fragments,” the 5′ phosphate is removed, To prevent vector religation, vector fragments are commonly treated with calf intestinal phosphatase ( CIP).

ＣＩＰ分解は典型的には、約ｐＨ９で、およそ５０ｍ１ｉ　Ｔｒｉｓ中で。CIP digestion is typically in about 50 ml of Tris at about pH 9.

Ｚｎ″２とＭｇ″２の存在下、大きさによりベクターｌμｇにつきＣＩＰ約０． ０１ユニツトを用いて、３７℃、約１時間行われる。核酸断片を回収するために 、その調整液をフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノールで沈澱させる 。代わりに、望まない断片が付加的な制限酵素分解によって二重に分解されたベ クターにおいては、再連結を防ぐことができる。In the presence of Zn″2 and Mg″2, CIP of approximately 0.0.1 μg of vector was obtained depending on the size. 01 unit at 37° C. for about 1 hour. To recover nucleic acid fragments , the prepared solution is extracted with phenol/chloroform and precipitated with ethanol. . Instead, the unwanted fragments are doubly degraded by additional restriction enzyme digestion. reconnection can be prevented in the vector.

下記の実施例で述べる構築において、プラスミド構築のための正しい連結は、　 Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ博士、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｍａｓ ｓＧｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　０２１１４＋ から得たＥ、　ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１（Ｒ３）を最初に形質転換することによ って確認される。In the constructions described in the examples below, the correct ligation for plasmid construction is Dr. Br1an 5eed, Mo1ecular Biology, Mas sGeneral Ho5pital, Boston, MA 02114+ By first transforming E. coli strain MC1061 (R3) obtained from It is confirmed.

成功した形質転換体はアンピシリン、テトラサイクリン、およびカナマイシン抗 生物質耐性によって選択される。形質転換体からのプラスミドは次いで参考文献 ６に従って調整される。ベクター構造は制限分析によって確かめられる。カセッ トベクターとの組換えによって得られるｓｕｐ　ｔＲＮＡを持つλの選択は、こ れもまた５ｅｅｄ博士から得たサプレッサー陰性Ｅ、　ｃｏｌｔ株ＬＧ−７５中 で行われる。　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹから入手できる細菌株−３１１ Ｏｒ−ｍ”　（Ｒ３）と−Ｒ１１０ｒ−ｍ”　、　Ｓｕ−もまた用いられる（参 考文献２８）。Successful transformants were treated with ampicillin, tetracycline, and kanamycin anti- Selected for biological resistance. Plasmids from transformants are then referenced in ref. 6. Vector structure is confirmed by restriction analysis. Cassette The selection of λ with sup tRNA obtained by recombination with the vector Suppressor negative E, also obtained from Dr. 5eed, in colt strain LG-75 It will be held in Co1d Spring Harbor Laboratory Bacterial strain-311 available from Cold Spring Harbor, NY Or-m" (R3) and -R110r-m", Su- are also used (see Reference 28).

尖施拠−上 マウス　ヒト　−ｒ′のカセットベタ　−の　りこの実施例は、マウス／ヒトゎ 一鎖遺伝子の調整に使用されるために設計されたプラスミドの構築を記述してい る。Tips - Part 1 This example of the mouse/human -r' cassette pattern is Describes the construction of plasmids designed to be used for single-strand gene regulation. Ru.

ヒト生殖系列の、遺伝子は、最初は、参考文献２９に記述されるように、ヒトＤ ＮＡのＢａｍ旧のファージライブラリーから得、そしてｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ Ｉ部位にサブクローン化して、　ｐＨｕｃｃベクターを形成した。そのゎ−遺伝 子挿入物は第３図のＡに示されている。ｐＨｕＣ（プラスミドをＥｃｏＲＩで完 全に分解して。In the human germline, the gene was originally derived from human D, as described in reference 29. obtained from the Bam old phage library of NA and EcoR of pBR322. It was subcloned into the I site to form the pHucc vector. That wa - genetics The child insert is shown in FIG. 3A. pHuC (plasmid completed with EcoRI) Completely disassemble it.

定常部のコード領域Ｃ３を含む２．５ｋｂの断片を電気泳動とアガロースゲルか らの溶出によって分離する。A 2.5 kb fragment containing the constant region coding region C3 was subjected to electrophoresis and agarose gel. Separate by elution.

カセットベクターを構築するのに用いたπａｎ１３プラスミドは、参考文献６に 概略が述べられているのと同様な操作に従って作られ、また５ｅｅｄ博士から得 ることも可能である。第３図Ｂで示されるそのプラスミドは、　ｐＭ８１からの ６４５塩基対の複製起点、１９８塩基対の合成チロシンｔＲＮＡサプレッサー遺 伝子、および図に拡大して示されているポリリンカー領域を含んでいる。このプ ラスミドはＥｃｏＲＩでの処理によって線状化され、５”−リン酸を除くために ウシ腸ホスファターゼで処理し、そして０．９ｋｂのプラスミド断片を電気泳動 とアガロースゲルからの溶出によって精製する。The πan13 plasmid used to construct the cassette vector is described in reference 6. Made according to similar operations as outlined and also obtained from Dr. 5eed. It is also possible to The plasmid shown in Figure 3B was derived from pM81. 645 base pair origin of replication, 198 base pair synthetic tyrosine tRNA suppressor gene gene, and the polylinker region shown enlarged in the figure. This program The lasmid was linearized by treatment with EcoRI to remove the 5”-phosphate. treated with calf intestinal phosphatase and electrophoresed the 0.9 kb plasmid fragment. and purify by elution from an agarose gel.

’＋　ｐＨｕＣ（からの２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ　Ｃ（断片と０．９ｋｂの線状 化πプラスミド断片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結し、連結産物をＥ、ｃｏｌ ｉ株ＭＣ１０６１（Ｒ３）を形質転換するのに用いた。この細菌は。'+ pHuC (2.5 kb EcoRI C (fragment and 0.9 kb linear The conjugated π plasmid fragments were ligated with T4 DNA ligase, and the ligated product was ligated with E, col It was used to transform i strain MC1061 (R3). This bacteria.

アンピシリンとテトラサイクリン耐性の両方の遺伝子にアンバー変異を持つＲ３ プラスミドを保持している。従って、すてにＲ３を持っている細胞のπａｎ１３ プラスミドでの形質転換は、これらの細胞に同時にアンピシリンとテトラサイク リンに対する耐性を与える。Ｒ３プラスミド上のカナマイシン−耐性遺伝子１よ 、πプラスミド非存在下で宿主中のそのプラスミｆを維持するのに用いられる。R3 with amber mutations in both ampicillin and tetracycline resistance genes It carries a plasmid. Therefore, πan13 in cells that all have R3 For transformation with plasmids, these cells were simultaneously treated with ampicillin and tetracycline. Provides resistance to phosphorus. Kanamycin-resistance gene 1 on R3 plasmid , is used to maintain its plasmid f in the host in the absence of the π plasmid.

成功した形質転換体を、５０μｇ　／　ｍｌカナマイシン、１５μｇ／−テトラ サイクリン、および２５μｇ／−のアンピシリンを含むＬＢプレート上で、標準 的な方法を用いて選択する。ミニライゼートプラスミド調整液を５ａｃｌでの分 解によって分析して、正しい方向に２．５ｋｂ　Ｃゎ断片をもつプラスミドを選 択する。πＣ３と名付けた選択したプラスミドの制限地図は。Successful transformants were treated with 50 μg/ml kanamycin, 15 μg/-tetra standard on LB plates containing cyclin, and 25 μg/− ampicillin. Select using a method. Dilute the minilysate plasmid preparation solution with 5 acl. Select plasmids with a 2.5 kb C2 fragment in the correct orientation. Choose. The restriction map of the selected plasmid, named πC3.

第３図Ｃに示されており、Ｃｃ挿入物と隣接ポリリンカー区分は拡大尺度で示し である。Shown in Figure 3C, the Cc insert and adjacent polylinker section are shown in enlarged scale. It is.

マウス、遺伝子からのＩＳ２遺伝子断片は、　ｐＢＲ３２２プラスミド中に含ま れるマウス、遺伝子のＨｉｎｄ　ｍ　／　ＢａｍＨＩ区分を含むｐＢＩｌｃ、、 クローニングベクター（参考文献１２）から得た。ゎ−遺伝子断片挿入物の地図 は第３図りに示されている。ｐＢＨＣゎプラスミドを旧ｎｄＩ［ＩとＸｍｎ　Ｔ で完全に分解して＋　（−遺伝子Ｉｓ２領域中にエンハンサ−因子を含むｌｋｂ 断片を、電気泳動とアガロースゲルからの溶出によって精製した。The IS2 gene fragment from the mouse gene is contained in the pBR322 plasmid. pBIlc containing the Hindm/BamHI division of the gene, It was obtained from a cloning vector (Reference 12).ゎ-Map of gene fragment inserts is shown in the third diagram. The pBHCゎ plasmid was converted into the old ndI[I and XmnT It is completely degraded by The fragment was purified by electrophoresis and elution from an agarose gel.

πＣＩニブラスミドをアルカリ溶菌によって調整し、　ＨｉｎｄＩ［［／Ｓｍａ ｌで分解して、プラスミドのポリリンカー領域から小さなＨｉｎｄ　ｍ　／　Ｓ ｍａＩ断片を放出する。大きい方の線状化π−プラスミド断片を電気泳動とアガ ロースゲルからの溶出によって精製した。この断片をｐＢＨＣｃからのｌｋｂの 旧ｎｄ　ＩＩ［／　Ｘｍｎ　Ｉ断片へＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結し、その連結 産物をＭＣ１０６１（Ｒ３）を形質転換するために用いた。成功した形質転換体 を上記のように選択した。軽鎖−遺伝子カセットの期待される構造は、第３図已 に図解されている。πCI niblasmid was prepared by alkaline lysis, and HindI[[/Sma A small Hindm/S is extracted from the polylinker region of the plasmid by Release the maI fragment. The larger linearized π-plasmid fragment was electrophoresed and agarized. Purified by elution from a rose gel. This fragment was added to the lkb from pBHCc. Ligate to the old nd II [/Xmn I fragment using T4 DNA ligase, and ligate The product was used to transform MC1061 (R3). successful transformants was selected as above. The expected structure of the light chain-gene cassette is shown in Figure 3. Illustrated in.

πＬＣゎと名付けた軽鎖−遺伝子カセットの最終的な構造は。The final structure of the light chain-gene cassette, named πLCゎ.

ＥｃｏＲＩでの分解およびＸｂａ　Ｉと旧ｎｄＩ［［での二重分解によって確か められた。２つの分解からの制限断片はゲル電気泳動によって各々分画され、従 来通りエチジウムブロマイド染色によって可視化した。ＥｃｏＲＩ断片のパター ンを第４図へのレーン２−４に示している。レーン１は野生型のλＤＮＡの旧ｎ ｄＩ［Ｉ断片のサイズマーカーのパターンを示している。２．５ｋｂと１．９ｋ ｂの断片は、第３図に示されたπＬＣ１：構築物から期待されるＥｃｏＲＩ断片 の正しい大きさに対応している。ＸｂａＩ／ＨｉｎｄｌｌＩ断片を同様に分画し て、その結果を第４図Ｂのレーン２−４に示した。Confirmed by decomposition with EcoRI and double decomposition with Xba I and old ndI I was caught. Restriction fragments from the two digestions were each fractionated by gel electrophoresis and subsequently Visualization was performed by ethidium bromide staining as usual. EcoRI fragment pattern The line is shown in lanes 2-4 of FIG. Lane 1 is the old n of wild-type λ DNA. The size marker pattern of the dI[I fragment is shown. 2.5kb and 1.9k Fragment b is the EcoRI fragment expected from the πLC1: construct shown in Figure 3. corresponds to the correct size. The XbaI/HindllI fragment was similarly fractionated. The results are shown in lane 2-4 of FIG. 4B.

レーン１はまた。野生型λＤＮＡの旧ｎｄＩ［［断片を表している。Lane 1 again. Represents the old ndI fragment of wild-type λ DNA.

２．４ｋｂと２．０ｋｂの断片もまた。第３図に示されたπＬＣ，構築物からの 期待される大きさに対応している。Also the 2.4 kb and 2.0 kb fragments. πLC, from the construct shown in Figure 3. It corresponds to the expected size.

次に、　ＮｏｔＩ部位をプラスミドπＬＣＩ：に導入した。初めに。Next, a NotI site was introduced into the plasmid πLCI:. at first.

プラスミドを第３図Ｅに示した一つのＨｉｎｄＩ［［部位での分解によって線状 化した。４．４ｋｂの線状断片を精製して、ポルＩ−クレノー断片を用いて埋め ることによって平滑末端にする。The plasmid was linearized by digestion at the single HindI[[ site shown in Figure 3E. It became. A 4.4 kb linear fragment was purified and filled in using the Pol I-Klenow fragment. Make blunt ends by

リン酸化したＮｏｔＩリンカ−（アダプターＡＢ　、第１２図および実施例■） を次いでその平滑末端に連結し、続いてＮｏｔＩで分解する。ＮｏｔＩ粘着末端 を持つ得られた線状断片を再環化し。Phosphorylated NotI linker (adapter AB, Figure 12 and Example ■) is then ligated to its blunt ends, followed by digestion with NotI. NotI sticky end Recircularize the obtained linear fragment with .

ＭＣ１０６１（Ｐ３）細胞を形質転換するために用いた。形質転換体はＳｕｐの 存在で選択して、そしてプラスミド構造はＮｏｔｌで切断することによって確か めた。πＬＣ，・Ｎｏｔｌ　（第１３図）と名付けたプラスミドを回収した。It was used to transform MC1061(P3) cells. The transformant is Sup. plasmid structure was confirmed by cutting with Notl. I met. A plasmid named πLC,•Notl (Figure 13) was recovered.

実施五−エ マウス／ヒト　ハイフ゛す・ド　゛　云　の　′Ｂａ１ｂ／ｃマウス生殖系列細 胞からのＥｃｏＲＩ　、−遺伝子挿入物を含む、ＣｈＣｃ−＋と呼ぶ、シャロン ４Ａフアージを得た（参考文献３０）。第５図の最上部に示したように、このベ クターはアンバー変異のあるＡとＢファージ遺伝子を含み、　ＥｃｏＲＩ、−遺 伝子挿入物はその遺伝子の３゛末端の上流の位置から定常Ｃ（Ｓｉ域の部分にわ たって拡がっている。Ｐ３プラスミドのみを持つＭＣ１０６１宿主細胞（ＭＣ１ ０６１（Ｐ３）と呼ぶ）、あるいはＰ３プラスミドと実施例Ｉからのπ−プラス ミドカセットの両方を持つＭＣ１０６１宿主細胞（ＭＣ１０６１（Ｐ３）　（π ＬＣＩ：）と呼ぶ）は、１０６のＣｈＣＩニー１ファージを前もって吸収させて 、　ＬＢプレートにまいた。ＭＣ１０６１（Ｐ３）ではプラークは得られず、す なわち、ｃｈｃ　（−＋ファージ保存液は野生型の復帰変異体を含んでいないこ とを示す負のコントロールである。コンフルーエンドなライゼートがＭＣ１０６ １（Ｐ３）　（πＬＣ，）細胞で得られた。Implementation 5-D 'Ba1b/c mouse germline of mouse/human high-speed denomination EcoRI from the - containing gene insert, called ChCc-+, Sharon 4A phage was obtained (Reference 30). As shown at the top of Figure 5, this base The vector contains A and B phage genes with amber mutations, EcoRI, - The gene insert extends from a position upstream of the 3' end of the gene to the constant C (Si region). It is expanding. MC1061 host cell carrying only P3 plasmid (MC1 061 (P3)), or the P3 plasmid and π-plus from Example I. MC1061 host cell (MC1061(P3) (π (referred to as LCI:)) was preabsorbed with 106 ChCI Nee 1 phages. , sowed on LB plate. No plaque was obtained with MC1061 (P3), and all In other words, the chc (-+ phage storage solution does not contain wild-type revertants). This is a negative control indicating that Confluent end lysate is MC106 1 (P3) (πLC,) cells.

Ｓｕｐ＋細胞上のプレートライゼートの力価は１．５　ｘ　１０’ファージ／− であった。The titer of plate lysate on Sup+ cells was 1.5 x 10' phage/- Met.

最初の感染後、拡がったファージ集団をサプレッサー陰性宿主株ＬＧ７５に再び かけた。カセットベクターとの組換えによってサプレッサー−ｔＲＮＡ遺伝子を 得た組換えファージを増殖によって選択した。ファージの組換え領域の構造を、 第５図の下部に示す。見ての通り９組換えにより９組換え部位の上流のヒトゎ− コードＭ域と組換え部位の下流のマウス、−コード領域のハイブリッドが産生さ れている。サプレッサー陰性株のプレートライゼートでの力価は４Ｘ１０ｂフア ージ／艷であった。従って、カセットプラスミドとファージの相同な２つの領域 間の組換え頻度は約３Ｘ１０−３であった。After the initial infection, reintroduce the expanded phage population into the suppressor-negative host strain LG75. I put it on. suppressor-tRNA gene by recombination with a cassette vector. The resulting recombinant phages were selected by propagation. The structure of the phage recombination region is It is shown at the bottom of FIG. As you can see, due to the 9 recombination, the human body upstream of the 9 recombination site A hybrid of the coding M region and the mouse-coding region downstream of the recombination site is produced. It is. The titer in the plate lysate of the suppressor-negative strain is 4X10b. It was a ship/ship. Therefore, two regions of homology in the cassette plasmid and phage The recombination frequency between them was approximately 3×10−3.

ＬＧ７５プレートからのプラークをＬＧ７５寒天プレートに再び拡げ、そして２ ．３のプラークを拾った。組換えファージからのＤＮＡをＥｃｏＲＩで分解し、 アガロースゲル電気泳動によって分画し、３２Ｐでラベルしたπａｎ１３プロー ブにハイブリダイズさせる。その結果を第６図に示した。レーン１はｃｈｃ　ｃ −１ＤＮＡのオートラジオグラムパターンを示し、レーン２−４は３つの異なる プラークから選択した組換えファージＤＮＡを示す。見ての通り、プロ、−ブは 組換えファージＤＮＡからの２．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片にハイブリダイズして おり、第５図の下に示した構造を確かにした。そこでは９組換えは、ＥｃｏＲ１ 部位と隣接サプレッサー−ｔＲＮＡ遺伝子とをファージλに導入し、示されてい る２、７　ＥｃｏＲＩ断片を与えている。５ｋｂと２．７ｋｂのＨｉｎｄｎ［断 片もまたｌ　Ｊ、プローブにハイブリダイズした（第１９図）。Plaques from LG75 plates were spread again onto LG75 agar plates and 2 ．． I picked up 3 plaques. The DNA from the recombinant phage was digested with EcoRI, πan13 probe fractionated by agarose gel electrophoresis and labeled with 32P. hybridize to the bu. The results are shown in FIG. Lane 1 is chc c -1 DNA autoradiogram patterns, lanes 2-4 show three different Recombinant phage DNA selected from plaques is shown. As you can see, the pro is Hybridized to a 2.7 kb EcoRI fragment from recombinant phage DNA. The structure shown at the bottom of Figure 5 was confirmed. There, 9 recombinations were carried out by EcoR1 The site and the flanking suppressor-tRNA gene were introduced into phage λ and the indicated 2 and 7 EcoRI fragments are provided. 5kb and 2.7kb Hindn The fragment also hybridized to the lJ probe (Figure 19).

爽旌握−見 マウス　ヒト　γ４カセートベタ　−のこの実施例は、ハイブリッドのマウス／ ヒトγ４遺伝子の調整に使用するために設計されたプラスミドの構築を記述して いる。Refreshing grip - see This example of mouse human γ4 cassate beta is a hybrid mouse/human describes the construction of a plasmid designed for use in the regulation of the human γ4 gene. There is.

ヒトのゲノムＴ４は、参考文献３１で記述されたのと同様に得、そしてｐＢＲ３ ２２にサブクローン化して、　ｐ２４ＢＲＨベクターを形成した。その挿入構築 は第７図の最上部に示す。その挿入領域はγ４の定常コード領域を含んでおり、 これは２．０　ｋｂのＥｃｏＲＩ／）ｌｉｎｄＩ［［断片中にＣｒ４で示した。Human genome T4 was obtained similarly as described in reference 31 and pBR3 22 to form the p24BRH vector. its insert construction is shown at the top of FIG. The insertion region contains the constant coding region of γ4, This is a 2.0 kb EcoRI/)lindI [[indicated by Cr4 in the fragment.

ｐ２４ＢＰＨプラスミドを旧ｎｄＩ［［で完全に分解し、平滑末端にして、それ からＥｃｏＲＩで完全に分解する。定常領域を含む２．０ｋｂ断片を電気泳動と アガロースゲルからのｔ８出によって単離する。The p24BPH plasmid was completely digested with old ndI, made blunt-ended, and then Completely decompose with EcoRI. The 2.0 kb fragment containing the constant region was electrophoresed. Isolate by t8 extraction from an agarose gel.

実施例Ｉからのπａｎ１３プラスミドを５ａｃｌでの分解によって線状化して、 　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にして、それがらさらにＥｃｏＲｌで完 全に分解した。０．９ｋｂのプラスミド断片を電気泳動とアガロースゲルからの 溶出によって精製した。The πan13 plasmid from Example I was linearized by digestion with 5acl and Make blunt ends with T4 DNA polymerase and complete with EcoRl. Completely disassembled. The 0.9 kb plasmid fragment was analyzed by electrophoresis and agarose gel analysis. Purified by elution.

１）２４ＢＲＨからの２．０ｋｂの旧ｎｄｎｌ／ＥｃｏＲＩ　ＣＴ　４断片と０ ．９ｋｂの線状化πプラスミド断片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結し、そして その連結産物を、実施例Ｉで記述したのと同様に、　Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＭＣ１０ ６１（Ｐ３）を形質転換するために用いた。1) 2.0kb old ndnl/EcoRI CT 4 fragment from 24BRH and 0 ．． The 9 kb linearized π plasmid fragment was ligated with T4 DNA ligase, and The ligation product was transferred to E. coli strain MC10 as described in Example I. 61 (P3) was used for transformation.

成功した形質転換体を、　５０μｇ／ＩＲ１カナマイシン、１５μｇ／−テトラ サイクリン、および２５μｇ／−アンピシリンを含むＬＢプレート上で、標準的 な方法を用いて選択した（参考文献６）。プラスミドの少量調整液を、　Ｘｂａ ｌ、　ＰｓｔｌおよびＳｍａ　Ｉでの単一分解によって分析して、正しい方向に ２．０ｋｂ　Ｃｒ　４断片を持つプラスミドを選択した。πＣγ４と呼ぶ１選択 したプラスミドの制限地図を第７図の中央部分に示し、Ｃｒ４挿入物と隣接ポリ リンカー区分は拡大尺度で示しである。Successful transformants were treated with 50 μg/IR1 kanamycin, 15 μg/-tetra cyclin, and standard on LB plates containing 25 μg/- ampicillin. were selected using a method described in Reference 6. Add a small amount of the plasmid preparation solution to l, Pstl and Sma I by single decomposition in the right direction. A plasmid with a 2.0 kb Cr4 fragment was selected. 1 selection called πCγ4 The restriction map of the plasmid is shown in the center part of Figure 7, showing the Cr4 insert and the adjacent polypeptide. Linker divisions are shown in enlarged scale.

ＩＳ２遺伝子断片を９重鎮エンハンサーＥ８を含むマウスＣμ遺伝子区分から得 た。μ−遺伝子の地図を第７図に示す。生殖系列Ｃμを持つＣｈ４Ａファージを Ｘｂａｌで完全に分解して、　ＥＭを含むｌｋｂ断片を電気泳動とアガロースゲ ルからの溶出によって精製した。πＣγ４プラスミドをＸｂａ　Ｉで分解して、 線状化π−プラスミド断片を電気泳動とアガロースゲルからの溶出によって精製 した。この断片をｌｋｂのＸｂａ　Ｉμｍ遺伝子断片にＴ４　ＤＮＡリガーゼで 連結して、その連結産物をＭＣ１０６１（Ｐ３）を形質転換するために用いた。An IS2 gene fragment was obtained from the mouse Cμ gene segment containing the ninefold enhancer E8. Ta. A map of the μ-gene is shown in FIG. Ch4A phage with germline Cμ After complete digestion with Xbal, the lkb fragment containing EM was subjected to electrophoresis and agarose gel. Purification was performed by elution from The πCγ4 plasmid was digested with XbaI, Purify the linearized π-plasmid fragment by electrophoresis and elution from an agarose gel. did. This fragment was converted into a lkb Xba Iμm gene fragment using T4 DNA ligase. ligation and the ligation product was used to transform MC1061(P3).

成功した形質転換体を上述と同様に選択した。重鎖−遺伝子カセットの期待され る構造を。Successful transformants were selected as described above. Heavy chain - expected gene cassette structure.

第７図の下に図解する。πＨＣγ４と呼ぶ、カセットベクターの最終的な構造は 、　Ｐｓｔｌでの分解（これは予期される２、Ｏｋｂ。It is illustrated below in Figure 7. The final structure of the cassette vector, called πHCγ4, is , decomposition in Pstl (this is expected 2, Okb.

１．５ｋｂおよび０．４ｋｂ断片を与える（第８図））によって、そしてＳｍａ 　ＩとＥｃｏＲＩでの二重分解（これは予期される１、８．１．７７および０． ３ｋｂ断片を生じる）によって確認された。giving 1.5 kb and 0.4 kb fragments (Fig. 8)) and Sma Double decomposition with EcoRI (this is the expected 1, 8.1.77 and 0. (resulting in a 3 kb fragment).

ＮｏｔＩ部位が、実施例Ｉで記述された手法によって、カセットベクターπＩＣ γ４に導入された。πＨＣγ４・Ｎ　ｏ　ｔ　Ｉと呼ぶプラスミド（第１４図） を回収した。The NotI site was added to the cassette vector πIC by the procedure described in Example I. Introduced into γ4. Plasmid called πHCγ4・NotI (Figure 14) was recovered.

去見糎−ヱ マウス／ヒト　ハイフ゛ｉ−ドμ゛　云　のマウス細胞からのマウスμ−遺伝子 挿入物を含む、　ｃｈｃμ２７と呼ぶシャロン４Ａフアージベクターを参考文献 ３２に記述されているのと同様に得る。第９図の最上部に示されているファージ ベクターは、アンバー変異のあるファージ遺伝子と。Kyomifu - ヱ Mouse μ-gene from mouse cells of mouse/human high i-domain μ The Sharon 4A phage vector, called chcμ27, containing the insert is referenced in obtained in the same manner as described in No. 32. Phage shown at the top of Figure 9 The vector is a phage gene with an amber mutation.

その遺伝子の３“末端上流位置から定常Ｃμ領領域わたって拡がっているμ−遺 伝子挿入物とを含んでいる。Ｐ３プラスミドと実施例■からのπ−カセントブラ スミドの両方を持つＭＣ１０６１宿主細胞（ＭＣ１０６１（Ｐ３）　（πＨＣγ ４）と呼ぶ）に、１０ｂのｃｈｃμ２７フアージを前もって吸収させて、　ＬＢ プレートにまく。The μ-element extends from a position upstream of the 3′ end of the gene to the constant Cμ region. and a gene insert. P3 plasmid and π-cacentoblasts from Example ■ MC1061 host cells (MC1061(P3) (πHCγ 4)) was pre-absorbed with chcμ27 phage of 10b, and the LB Sprinkle on a plate.

最初の感染後、拡がったファージ集団をサプレッサー陰性宿主株ＬＧ７５に再び かける。そして、カセットベクターとの組換えによってサプレッサー−ｔＲＮＡ 遺伝子を得た組換えファージを増殖によって選択する。ファージの組換え領域の 構造を第９図の下に示す。見ての通り２組換えにより、１３２組換え部位の上流 のネズミＪ、ｌコード領域と組換え部位の下流のヒトγ４−遺伝子コード領域と を持つハイブリッド遺伝子が産生される。After the initial infection, reintroduce the expanded phage population into the suppressor-negative host strain LG75. put on. Then, by recombining with the cassette vector, suppressor-tRNA Recombinant phage that have obtained the gene are selected by propagation. of the recombinant region of the phage. The structure is shown below in Figure 9. As you can see, by 2 recombinations, the upstream of the 132 recombination site The mouse J, l coding region and the human γ4 gene coding region downstream of the recombination site. A hybrid gene with

ＬＧ７５プレートからのプラークをＬＧ７５寒天プレートに再び拡げて、２．３ のプラークを拾う。組換えファージからのＤＮＡをＥｃｏＲＩでの分解によって 分析して　ｐ３ｔでラベルしたπａｎ１３プローブにハイブリダイズさせ９組換 えによって産生された期待される３、９ｋｂの断片の存在を確認する。Respread the plaques from the LG75 plate onto the LG75 agar plate and repeat 2.3 Pick up the plaque. DNA from recombinant phage was digested with EcoRI. Analyze and hybridize to p3t-labeled πan13 probe to generate 9 recombinations. confirm the presence of the expected 3.9 kb fragment produced by the experiment.

災施ｌ−呈 ヒ　ＤＲマウスＩ−Ｅ゛′カセ・　トベクター〇　ケネズミＩ−Ｅα鎖遺伝子を 参考文献８の操作に従って単離する。簡単に言えば、固定された遺伝子クローン をファージベクター中で増殖させて、それからｐＢＲ３２２にクローン化する。disaster relief l-presentation Human DR mouse I-E゛′ case vector Isolate according to the procedure of reference 8. Simply put, fixed gene clones is propagated in a phage vector and then cloned into pBR322.

その遺伝子の３”末端を通してエキソン２を含むＩ−Ｅα遺伝子断片を、第１０ 図Ａに示す。代わりに、５ａｕ３ａで部分分解してλにクローニングして得たマ ウス−ｆｉＪｌｉ　ＤＮ＾のゲノムＤＮＡライブラリーを、Ｉ−Ｅα遺伝子の公 知配列を用いて作った合成オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングして、 その同じ遺伝子を選択することができ、制限された配列分析によって確認するこ とができる。The I-Eα gene fragment containing exon 2 through the 3” end of the gene was inserted into the 10th Shown in Figure A. Instead, the map obtained by partially disassembling 5au3a and cloning it into λ The genomic DNA library of the U.S. Screening with synthetic oligonucleotide probes made using known sequences, That same gene can be selected and confirmed by limited sequence analysis. I can do it.

πａｎ１３プラスミド（実施例Ｉ）をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩでの分解によって線 状化して、０．９ｋｂプラスミド断片を電気泳動とアガロースゲルからの溶出に よって精製する。上記からのＩ−Ｅα遺伝子ベクターをＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで 完全分解して、２．５ｋｂ断片と０．９ｋｂの線状化π−プラスミド断片を７４ 　ＤＮＡリガーゼで連結する。その連結産物をＥ、　ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１（ Ｐ３）を形質転換するために用いる。成功した形質転換体を、５０μｇ／ｄカナ マイシン、１５μｇ／−テトラサイクリンおよび２５μｇ／ｄアンピシリンを含 むＬＢプレート上で選択する。ミニライゼートプラスミド調整液をＥｃｏＲＩと Ｐｓｔｌでの分解によって分析して。The πan13 plasmid (Example I) was purified by digestion with EcoRI and PstI. The 0.9 kb plasmid fragment was subjected to electrophoresis and elution from an agarose gel. Therefore, it is purified. The I-Eα gene vector from above was digested with PstI and EcoRI. Complete digestion yielded a 2.5 kb fragment and a 0.9 kb linearized π-plasmid fragment. Connect with DNA ligase. The ligation product was transferred to E. coli strain MC1061 ( P3) is used to transform. Successful transformants were treated at 50 μg/d. Contains mycin, 15 μg/-tetracycline and 25 μg/d ampicillin. Select on the LB plate. Mix the minilysate plasmid preparation solution with EcoRI. As analyzed by digestion with Pstl.

２．５ｋｂ　Ｉ−Ｅα断片を持つプラスミドを選択する。このプラスミドを、第 １０図ＣでπＩ−Ｅαと呼んでいる。Select a plasmid with a 2.5 kb I-Eα fragment. This plasmid In Figure 10C, it is called πI-Eα.

第１０図りに示したヒ）　ＤＲ−α鎖遺伝子を、参考文献１３の操作に従って単 離する。その遺伝子は９図中で拡大して示された制限部位を持つ４９１ｂｐのイ ントロン２を含んでいる。ＯＲ−α遺伝子断片を持っているプラスミドをＲｓａ 　ＩとＥｃｏＲＶで完全分解して、電気泳動とアガロースゲルからの溶出によっ て精製した２１２ｂｐのイントロン２断片を産する。ＥＣ０ＲＩリンカ−を次い で２７２塩基対のＲｓａ　Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片に連結して９次いでその断片をＥ ｃｏＲｌで分解する。πＩ−ＥαプラスミドをＥｃｏＲＩで分解して、ホスファ ターゼ処理をして、線状化π−プラスミド断片を電気泳動とアガロースゲルから の溶出によって精製する。この断片を、ＤＲ−α遺伝子からの２８０ｂｐのリン カ−をつけた断片に、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで連結し、そして連結産物をＭＣ １０６１（Ｐ３）を形質転換するために用いる。成功した形質転換体を上記と同 様に選択し、２８０塩基対断片の方向をＮｃｏｌを用いて確認する。第１０図已 に示され、πＤＲ／　Ｉ−Ｅαと称されるＭＨＣ重鎮遺伝子カセントの最終的な 構造は、ＥｃｏＲＩでの分解で予期される２８０と３４００断片を与えることと 、　ＰｓｔＩとＮｃｏ　Ｉでの二重分解で予期される１１１０と２５７０ｂｐ断 片を与えることによって、確認される。The human) DR-α chain gene shown in Figure 10 was isolated according to the procedure in reference 13. Let go. The gene is a 491 bp vector with restriction sites shown enlarged in Figure 9. Contains trontron 2. The plasmid containing the OR-α gene fragment was transformed into Rsa Completely digested with I and EcoRV, and separated by electrophoresis and elution from agarose gel. A purified 212 bp intron 2 fragment is produced. Following the EC0RI linker into the 272 base pair Rsa I-EcoRV fragment and then ligated the fragment to the EcoRV fragment. Decompose with coRl. The πI-Eα plasmid was digested with EcoRI and the phosphatase After treatment with Tase, linearized π-plasmid fragments were subjected to electrophoresis and agarose gel. Purify by elution. This fragment was converted into a 280 bp link from the DR-α gene. The tagged fragments were ligated with T4 DNA ligase, and the ligated product was ligated to MC. 1061 (P3). Successful transformants were transformed as above. and confirm the orientation of the 280 base pair fragment using Ncol. Figure 10 The final gene cluster of the MHC heavyweight gene, designated πDR/I-Eα, is shown in The structure shows that digestion with EcoRI gives the expected 280 and 3400 fragments. , 1110 and 2570 bp breaks expected from double decomposition with PstI and NcoI Confirmed by giving a piece.

尖施［ ヒトＤＲ／マウスＩ−Ａ　ハイブリッド　ｔ゛°゛　云　のヒ）　ＥＢＶで形質 転換されたリンパ芽球系を標準的な手段によって問題とする被験体から得る。そ の細胞を標準的な条件下で培養する。ゲノムＤＮＡをその細胞から抽出して、５ ａｕ３ａで部分分解する。分解断片を標準的条件下でλＥＭＢＬ３ａに連結させ 、続いてｉｎ　ｖｉｔｒｏパフケージングを行い、適当な細菌宿主にかけてまく 。ライブラリーファージベクターをまず。Tianshi [ Human DR/mouse I-A hybrid t゛°゛゛　human) EBV trait Converted lymphoblastoid lines are obtained from the subject in question by standard means. So cells are cultured under standard conditions. Genomic DNA is extracted from the cells and Partially decomposed with au3a. The degraded fragment was ligated to λEMBL3a under standard conditions. , followed by in vitro puff caging and plating on suitable bacterial hosts. . Library phage vector first.

Ｐ３プラスミド（実施例Ｉ）と実施例■からのπＤＲ／　Ｉ−Ｅαカセットベク ターの両方を持つＭＣ１０６１細胞にがける。P3 plasmid (Example I) and πDR/I-Eα cassette vector from Example ■ Patch onto MC1061 cells containing both of the following proteins.

最初の感染後、拡がったファージ集団をサプレッサー陰性宿主株ＬＧ７５に再び かけて、カセットベクターとの組換えによってサプレッサーｔＲＮＡを得た組換 えファージを増殖によって選択する。ファージの組換え領域の構造を第１１図の 下に示す。見ての通り１組換えにより、１５２組換え部位の上流のヒトＤＲ−α 遺伝子のエキソン１と２および組換え部位の下流のマウスＩ−Ｅα遺伝子のエキ ソン３−５を持つハイブリッド遺伝子が産生される。After the initial infection, reintroduce the expanded phage population into the suppressor-negative host strain LG75. The suppressor tRNA was obtained by recombination with the cassette vector. phages are selected by propagation. The structure of the phage recombination region is shown in Figure 11. Shown below. As you can see, 1 recombination results in human DR-α upstream of 152 recombination sites. Exons 1 and 2 of the gene and the exons of the mouse I-Eα gene downstream of the recombination site. A hybrid gene with son 3-5 is produced.

ＬＧ７５プレート力）らのプラークをＬＧ７５寒天プレート上に拡げる。これら の組換えファージからのＤＮＡをｐ３ｇでラベルしたＤＲ−αエキソン■プロー ブにハイブリダイズすることによって分析し２組換えによって産生じた期待され るＯＲ−αエキソンＩ断片の存在をｖｉ認する。Spread the plaques on LG75 agar plates. these DR-α exon ■ probe labeled with p3g from recombinant phage The expected results produced by the two recombinants were analyzed by hybridizing to We confirm the presence of an OR-α exon I fragment.

去並■−亘 フ　−ジベク　−λＧＬ１ａの 以下の実施例は、λＧＬ１ａ、本発明のカセットベクターの使用のための遺伝子 ライブラリー作成のための改良されたλフアージベクター、の構築を述べる。Yonami■-Wataru Fujibek-λGL1a The following examples illustrate the use of λGL1a, a gene for use in the cassette vector of the invention. We describe the construction of an improved lambda phage vector for library creation.

第１２図に示す制限地図を有するファージベクターλＥＭＢＬ　３（参考文献４ ０　；　Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅＣｈ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）のＤＮ ＡをＢａｍＨＸで分解し、　１４ｋｂの“スタッファ−”断片を精製した。第１ ２図に示すアダプターＡＢオリゴヌクレオチドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｗｓ。Phage vector λEMBL 3 with the restriction map shown in Figure 12 (Reference 4 0 ; Promega BioteCh, Madison, Wl) DN A was digested with BamHX and a 14 kb "stuffer" fragment was purified. 1st The adapter AB oligonucleotide shown in Figure 2 was applied using Applied Biosys. tews.

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡより合成した。それはまた、不活性化したＥｃ ｏＲ１部位、および活性ＸｈｏＩ部位とＢａｍ旧部位を含むＮｏｔＩリンカ−分 子である。アダプターＡＢをｒ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下でリン酸化する。次いで 、この精製スタッファ−を過剰のアダプターＡＢと２２℃、１時間かけて連結す る。連結後１反応混液をＢｌｏ−Ｇｅ１　Ａ１５ｍ　（ＢｉｏＲａｄ）を含むカ ラムを通すことにより、過剰のアダプターを除去する。Synthesized by Foster C1ty, CA. It also contains inactivated Ec oR1 site, and a NotI linker containing an active XhoI site and a Bam old site. It is a child. Adapter AB is phosphorylated in the presence of r-”P-ATP. Then This purified stuffer was ligated with excess adapter AB at 22°C for 1 hour. Ru. After ligation, add one reaction mixture to a solution containing Blo-Ge1 A15m (BioRad). Remove excess adapter by passing it through a ram.

ファージスベクターＣｈ４ａ　（参考文献４１）を得、そのスタッファ−断片を 除（ためにＥｃｏＲＩで分解した。Ｃｈ４ａの両アーム、を精製し１次いでＮｏ ｔｌリンカ−を有するＥＭＢＬ　３スタッファ−断片と標準条件下で連結した。Phage vector Ch4a (Reference 41) was obtained, and its stuffer fragment was Both arms of Ch4a were purified and then digested with EcoRI. The EMBL 3 stuffer fragment with tl linker was ligated under standard conditions.

この望ましい組換えλベクターは、第１２図の下に示す制限地図を有する。この 構築物を単離するために、この連結混合物をパッケージし、Ｘ−ｇａｌ培地（参 考文献３６）の存在下でＬＥ３９２由来の１ａｃ−宿主、　ＫＭ３９２（参考文 献４３）の形質転換に用いた。Ｃｈ４ａからこのスタッファ−断片を欠失した組 換えファージは、無色のプラークを生じる。無色のプラークからファージＤＮＡ を単離し、　Ｎｏｔｌでの分解による酵素制限分析に供した。期待される２０ｋ ｂ、　１４ｋｂ。This desired recombinant λ vector has the restriction map shown at the bottom of FIG. this To isolate the construct, this ligation mixture was packaged and grown in X-gal medium (reference 1ac-host derived from LE392 in the presence of KM392 (ref. 36); Reference 43) was used for transformation. A group in which this stuffer fragment was deleted from Ch4a Replaced phages produce colorless plaques. Phage DNA from colorless plaque was isolated and subjected to enzyme restriction analysis by digestion with Notl. Expected 20k b, 14kb.

および１ｌｋｂ断片を与える組換えファージをλＧＬ１ａと名付けた。and the recombinant phage giving the 1 lkb fragment was named λGL1a.

１施％−ｌ マウス　ヒトＴ　カセットベクターの　“この実施例は、ハイブリッド　マウス ／ヒトγ１遺伝子の調製に用いるように設計されたプラスミドの構築を示す。1%-l This example uses a hybrid mouse human T cassette vector. / shows the construction of a plasmid designed for use in the preparation of the human γ1 gene.

πａｎ１３　（実施例Ｉ）を）ｌｉｎｄＩ［［で線状化し、　ＮｏｔＩ部位を実 施例１のプラスミドπＬＣ，について記述のごとく、第１５図に示す構造Ｂを生 じるように挿入した。次いで、πａｎ１３・ＮｏｔｌをＸｂａで分解し、πＨＣ γ４　（第７図）から得たエンノλンサー断片Ｅ、と連結した。次いで、再環状 化したプラスミドＤＮＡをＭＣ１０６１（Ｐ３）細胞の形質転換に用い、そして 形質転換体からのプラスミドをＥｃｏＲＩで分解することにより、このＥＨ断片 の正しい方向性を分析した。第１５図の構造Ｃで示されるπＥＭ・ＮｏｔＴと名 付けたプラスミドは９期待される３３０と１５７０ｂｐの大きさの断片を生じた 。πan13 (Example I) was linearized with )lindI[[, and the NotI site was implemented. As described for plasmid πLC in Example 1, structure B shown in FIG. 15 was produced. I inserted it so that it would fit. Next, πan13・Notl is decomposed with Xba and πHC It was ligated with ennoλ surfer fragment E obtained from γ4 (Figure 7). Then re-circular The transformed plasmid DNA was used to transform MC1061 (P3) cells, and This EH fragment was obtained by digesting the plasmid from the transformant with EcoRI. analyzed the correct direction. The name πEM・NotT shown in structure C in Figure 15 The attached plasmids yielded fragments of the expected sizes of 330 and 1570 bp. .

ヒトゲノムのＣｒ１をｐＢＲ３２２に含むプラスミド１３ＡＨＰ　（参考文献３ ４）を叶、　Ｊａｙ　Ｅｌｌｉｓｏｎから得た。１３ＡＨＰを旧ｎｄｌＩ［およ びＰｖｕ　Ｕで分解後、Ｃγ、を含むこの３．０ｋｂ断片を精製し末端を削った 。リン酸化した５ｓｔ−１リンカ−を３．０ｋｂ断片の平滑末端に連結し２次に ５ｓｔ−１で分解した。πＥ、　−ＮｏｔＩを５ｓｔ−１で分解し、第１５図に 示すように、５ｓｔ−１分解Ｃγ、断片と再環状化させるように連結した。この 連結されたＤＮＡをＭＣ１０６１（Ｐ３）細胞の形質転換に用い、そして正しい 方向でＣγ□を含むプラスミドについて形質転換体を分析した。この方向性はＰ ｓｔｌ単独およびＰｓｔｌとＥｃｏＲＩの組合せの分解により調べた。Plasmid 13AHP containing Cr1 of the human genome in pBR322 (Reference 3 4) was obtained from Jay Ellison. 13AHP to the old ndlI [and After digestion with PvuU, this 3.0 kb fragment containing Cγ was purified and the ends were trimmed. . A phosphorylated 5st-1 linker was ligated to the blunt end of the 3.0 kb fragment and the second Decomposed at 5st-1. πE, -NotI is decomposed in 5st-1 and shown in Figure 15. As shown, the 5st-1-cleaved Cγ was ligated to recircularize the fragment. this The ligated DNA was used to transform MC1061 (P3) cells and the correct Transformants were analyzed for plasmids containing Cγ□ in the orientation. This direction is P This was investigated by digestion of stl alone and the combination of Pstl and EcoRI.

第１５図の構造りで示されるπＨＣｒ、・ＮｏｔＩと名付けられたプラスミドは ９分解後に期待される大きさの断片：　ＰｓｔＩ　−４００゜１５００、１８５ ０および１０５０ｂｐ　；　Ｐｓｔｌ　＋　ＥｃｏＲＩ　−４００，３００，１ ２００゜１８５０、　１５０および９００ｂｐを生じた。The plasmid named πHCr,・NotI shown in the structure of Figure 15 is 9 Expected size of fragment after decomposition: PstI -400°1500, 185 0 and 1050bp; Pstl + EcoRI -400,300,1 200°1850, 150 and 900 bp were generated.

実施例−に マウス／ヒトγ３カセットベクターの この実施例は、マウス／ヒトγ３遺伝子の調製に用いるように設計されたプラス ミドの構築を記述する。Example- Mouse/human γ3 cassette vector This example shows a plus Describe the construction of Mido.

λファージＣｈ４ａ−Ｈ−１ｇＴ１２２　（参考文献３９）を叶、　Ｔａ５ｕｋ ｕＨｏｎｊｏ、　Ｋｙｏｔｏ　１Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｊａｐａｎから得た 。このヒトＣｒ３領域を含むこのファージは、第１６図の構造Ａとして示される 。λ phage Ch4a-H-1gT122 (Reference 39), Ta5uk Obtained from uHonjo, Kyoto 1Juniversity, Japan . This phage containing the human Cr3 region is shown as structure A in Figure 16. .

ファージＤＮＡを旧ｎｄＩ［ＩおよびＥｃｏＲＩで分解し、Ｃｒ３を含む３．２ ｋｂ断片を溶出した。この３．２ｋｂ断片がこのＣｒ３配列を含むことを確認す るために、この断片を、ヒトＣｒ４プローブとハイブリダイズさせた。次いで、 この断片の粘着末端を削った。その後、すでに５ａｃＩで線状化し、粘着末端を 削り。Phage DNA was digested with old ndI[I and EcoRI, and 3.2 containing Cr3 The kb fragment was eluted. Confirm that this 3.2kb fragment contains this Cr3 sequence. This fragment was hybridized with a human Cr4 probe to determine the identity of the human Cr4 probe. Then, The sticky ends of this fragment were shaved off. Then, already linearized with 5acI and the sticky ends Sharpen.

そして５゛末端を脱リン酸化したπａｎ１３　（実施例■）にこの断片を連結し た。このＣｒ３をコードする配列を含むπａｎ１３をＭＣ１０６１（Ｐ３）細胞 の形質転換に用い、形質転換体をこの挿入の方向性決定のために選択した。This fragment was then ligated to πan13 (Example ■) whose 5′ end was dephosphorylated. Ta. πan13 containing this Cr3-encoding sequence was transferred to MC1061 (P3) cells. transformants were selected for directionality determination of this insertion.

πＣｒ３−１４と名付けたプラスミドを、誤った方向でのＣｒ３挿入とともに得 た。πＣｒ３−１４は、予期しない余分の１１．ｃｏＲＩ部位を有した。このＣ ｒ３挿入の方向性は旧ｎｄＩ［Ｉ　＋　ＢｇｌｌＩの二重分解で決定され、以下 の大きさの断片を生じた：ＨｉｎｄＩ［［＋　ＢｇＩ　ｎ−１８００および２３ ００ｂｐ０次いで、πＣｒ３−１４をＥｃｏＲ１で分解し、この０１３区分の再 配列のために再連結した。その後、形質転換体からのプラスミドを、正しい方向 性について再び調べた。第１６図の構造ＣのπＣｒ３と名付けたプラスミドは、 正しい大きさの断片：　Ｈｉｎｄｎ［＋　Ｂｇｌ　ＩＩ　−９００および３２０ ０ｂｐを生じた。A plasmid named πCr3-14 was obtained with a Cr3 insertion in the wrong orientation. Ta. πCr3-14 is an unexpected extra 11. It had a coRI site. This C The directionality of r3 insertion is determined by double decomposition of old ndI[I + BgllI, as follows: yielded fragments of size: HindI[[+BgI n-1800 and 23 00bp0 Next, πCr3-14 is decomposed with EcoR1, and this 013 segment is reconsidered. Religated for alignment. Then, insert the plasmid from the transformant in the correct orientation. I looked into sex again. The plasmid named πCr3 with structure C in Figure 16 is Correct size fragments: Hindn [+ Bgl II -900 and 320 yielded 0 bp.

πＣｒ３をＸｂａで分解し、エンハンサ−Ｅ、の１　ｋｂ−Ｘｂａ断片を実施例 ■に示したように挿入した。これらの組換えプラスミドをＭＣ１０６１（Ｐ３） 細胞の形質転換に用いた。次いで、形質転換体をエンハンサ−領域が正しい方向 に含んでいるプラスミドの存在について調べた。第１６図の構造りのπＨＣｒ３ と名付けたプラスミドをＥｃｏＲＩで分解すると、正しい大きさの断片：３２０ ０．１６００および３４０ｂｐ、が生じた。Ｎｏｔ１部位をｙｒＨｃｒ３の旧ｎ ｄｎ［部位へ実施例Ｉに述べたように挿入した。これは。πCr3 was decomposed with Xba, and the 1 kb-Xba fragment of enhancer-E was prepared as an example. Insert as shown in ■. These recombinant plasmids were transformed into MC1061(P3) Used for cell transformation. The transformants were then aligned with the enhancer region in the correct orientation. We investigated the presence of plasmids contained in πHCr3 with the structure shown in Figure 16 When the plasmid named ``is'' digested with EcoRI, a fragment of the correct size: 320 0.1600 and 340 bp, were generated. The Not1 site was replaced with the old n of yrHcr3. dn[ site as described in Example I. this is.

第１６図の構造Ｅで示されるπＨＣｒ３・ＮｏｔＩと名付けたプラスミドを生じ た。A plasmid named πHCr3.NotI, shown in structure E in Figure 16, was generated. Ta.

尖隻炎−人 １Ｍの■Ｇ３へのヒトイソタイプ　えカセートベタ　−の築 この実施例は、ヒト免疫グロブリンの重鎮遺伝子のイソタイプの変換に用いるよ うに設計されたプラスミドの構築を述べる。本実施例では、このカセットベクタ ーはＩｇＭ抗体のイソタイプをＩｇＧ３に変換するのに有用である。Chimpanitis - people 1M ■ Construction of human isotype Ekasete beta to G3 This example is intended for use in isotype conversion of key human immunoglobulin genes. We describe the construction of a plasmid designed to In this example, this cassette vector - is useful in converting the isotype of IgM antibodies to IgG3.

ヒト生殖系列の免疫グロブリン重鎮遺伝子（第１７図の構造Ａ）のクローンを、 第１７図の構造Ｂに示すプラスミドＰＪに得た（参考文献３３および３５）。プ ラスミドＰＪをＢｇｌＩＩおよび旧ｎｄＩＩ［で分解し、イントロンＩＳを含む ０．７５ｋｂ断片を精製する。叶、　Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ　（参考文献６）に より得られそして第１７図の構造Ｃに示されるプラスミドπａｎ７を、Ｂｇｌｌ ｌおよび旧ｎｄｌ［［で分解した。この５°末端を脱リン酸化した後、大きい方 の線状断片をＩｓ断片との連結により環状化した。この連結混合物をＭＣ１０６ １（Ｐ３）細胞の形質転換に用い、ｐ）Ｉｃ−１と名付けたプラスミドを得た（ 第１７図の構造Ｄ）。次いで、　ＨｉｎｄＩ［Ｉリンカ−を付加したＣｈ４ａの Ｃγ３含有３．２ｋｂ断片（実施例■）をｐＨＣ−１のＨｉｎｄｎ［部位へ挿入 した。ＭＣ１０６１（Ｐ３）細胞をこの連結混合物で形質転換し、そして形質転 換体についてプラスミドが正しい方向にあるかどうかをＢｇＩｎ分解により調べ た。第１７図の構造ＥのπＳＷＭＧ　３と名付けたプラスミドは、正しい大きさ の断片：　１６００および３２００ｂｐ、を生じた。Ｎｏｔ１部位（アダプタ− ＡＢ　、実施例Ｉ）をｆｆ　ＳＷＭＧ　３のＥｃｏＲ１部位とＢａｍ旧部位との 間に連結し、第１７図の構造Ｆに示されるπＳＷＭＧ　３・ＮｏｔＩと名付けた プラスミドを生じた。A clone of the human germline immunoglobulin heavyweight gene (structure A in Figure 17) was The plasmid PJ shown in structure B of FIG. 17 was obtained (References 33 and 35). P The lasmid PJ was digested with BglII and old ndII, including the intron IS. Purify the 0.75 kb fragment. Kano, Br1an 5eed (Reference 6) The plasmid πan7 obtained from Bgll and shown in structure C in FIG. Decomposed with l and old ndl [[. After dephosphorylating this 5° end, the larger The linear fragment of was circularized by ligation with the Is fragment. This ligation mixture was added to MC106 1 (P3) cells to obtain a plasmid named p)Ic-1 ( Structure D in Figure 17). Next, Ch4a with HindI[I linker added The Cγ3-containing 3.2 kb fragment (Example ■) was inserted into the Hindn site of pHC-1. did. Transform MC1061 (P3) cells with this ligation mixture and transform Check whether the plasmid is in the correct orientation for conversion by BgIn digestion. Ta. The plasmid named πSWMG3 with structure E in Figure 17 has the correct size. Fragments of: 1600 and 3200 bp were generated. Not1 part (adapter) AB, Example I) between the EcoR1 site of ff SWMG 3 and the old Bam site. It was named πSWMG 3.NotI as shown in structure F in Figure 17. A plasmid was generated.

実差Ｍ−人上 ＷのＩＧｌへのヒトイソ　イブ　えカセットベクターの築 この実施例は、前の実施例で構築されたベクターに類似のカセットベクターの構 築を示すが、それはＩｇＭをＩｇＧ、に切換える。Actual difference M-human Construction of human isoplasmic cassette vector to IGl of W This example demonstrates the construction of a cassette vector similar to the vector constructed in the previous example. However, it switches IgM to IgG.

このカセットベクター構築に用いる手順は、３．２ｋｂ　Ｃγ３断片をｐＨＣ− １に挿入する代わりに、　Ｈｉｎｄｌ［ｒリンカ−を付加した実施例■に記述の ３．Ｏｋｂ　Ｃγ１断片（第１５図）を挿入し。The procedure used to construct this cassette vector is to convert the 3.2 kb Cγ3 fragment into a pHC- Instead of inserting it into 1, insert the Hindl [r linker described in the example 3. Insert the Okb Cγ1 fragment (Figure 15).

πＳＷＭＧＩ　（第１８図の構造Ａ）と名付けたプラスミドを得ること以外、実 施例Ｘで述べた手順と実質的に同じである。ＮｏｔＩ部位を実施例Ｘに記述のよ うに挿入し、πＳＷＭＧ　ｌ・ＮｏｔＩ　（第１８図の構造Ｂ）と名付けたプラ スミドを得た。Other than obtaining a plasmid named πSWMGI (Structure A in Figure 18), The procedure is substantially the same as described in Example X. The NotI site was prepared as described in Example X. and named πSWMG l・NotI (Structure B in Figure 18). Got Sumido.

去血旦−人工 −Ｌｅｕ３マウス／マウ　Ｖ′　グロブ菖ンの以下の手順では数個のプローブを 用いた。第１９図は、再配列されていないマウス遺伝子のＪゎ−Ｅｃ−Ｃｃ領域 の制限地図を示す（参考文献４５）。Ｊｃプローブおよび−Ｊｃプローブ群は、 それぞれ２．７ｋｂおよび０．７ｋｂＨｉｎｄ　ｍ断片である。このＪ３プロー ブは、正しく再配列された免疫グロブリン遺伝子だけでなく、再配列されていな い免疫グロブリン遺伝子の両方に存在する。この−Ｊ、プローブは、この正しく 再配列された遺伝子には存在しないが、この再配列されていない遺伝子に存在す る。第２０図は、マウスの再配列されていない重鎮免疫グロブリン遺伝子の−Ｊ 、Ｊ、Ｃ，領域の制限地図を示す（参考文献４６）。この１．．７ｋｂのＢａｍ Ｈ−ＥｃｏＲＩ断片をＪＨプローブとして用いた。Blood test - artificial -Leu3 Mouse/Mouse Using. Figure 19 shows the Jゎ-Ec-Cc region of the unrearranged mouse gene. (Reference 45). Jc probe and -Jc probe group are: 2.7 kb and 0.7 kb Hindm fragments, respectively. This J3 pro The library contains not only correctly rearranged immunoglobulin genes but also unrearranged immunoglobulin genes. present in both immunoglobulin genes. This −J, probe is this correctly It is not present in the rearranged gene, but it is present in this non-rearranged gene. Ru. Figure 20 shows -J of the unrearranged major immunoglobulin gene in mice. , J,C, shows a restriction map of the region (Reference 46). This 1. ．． 7kb Bam H-EcoRI fragment was used as JH probe.

この実施例は、ハイプリドーマにより生産されるネズミの軽鎖の可変部類域およ びこのカセットベクターのヒドラ領域からなるハイブリッド免疫グロブリン遺伝 子の構築のための、πＬＣＩ：　・ＮｏｔＩカセットベクター（実施例■、第１ ３図）の使用およびλＧＬ１ａ　（実施例■、第１２図）への抗−Ｌｅｕ　３ネ ズミハイプリドーマのライブラリーの使用を示す。This example demonstrates the variable regions and regions of murine light chains produced by hybridomas. Hybrid immunoglobulin gene consisting of the hydra region of the cassette vector For construction of child, πLCI: ・NotI cassette vector (Example ■, 1st (Fig. 3) and anti-Leu 3 net to λGL1a (Example ■, Fig. 12). Demonstrates the use of the Zumi Hypuridoma library.

抗Ｌｅｕ　３抗体を生ずるハイプリドーマ細胞系列ＳａＧ　３．５は。The hybridoma cell line SaG3.5 produces anti-Leu3 antibodies.

Ｄｒ、　Ｅｄｅｙａｒｄ　Ｅｎｇｌｅｍａｎ、　５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙから得た。このバイプリドーマの細胞［ＩＮＡを抽出し、　Ｈｉｎｄ ｎｌで分解した。制限パターンをＪｃプローブを用いてサザンプロット分析で解 析した（第１９図）、このサザンプロット分析は、５Ｐ２（このハイプリドーマ の融合の相手）およびＢａｌ　ｂ／ｃ肝［ＤＮＡと比較したとき、この抗−Ｌｅ ｕ　３　／％イブリドーマに特有な４．２ｋｂバンドを示した。このことは、こ の４．２ｋｂバンドが、再配列された抗−Ｌｅｕ　３軽鎖遺伝子を含むことを示 唆する。このＪ）ｌプローブを用いるハイブリダイゼーションは、肝ＲＤＮＡに 対するオートラジオダラムの強度から判断して、この抗−Ｌｅｕ　３重鎖遺伝子 のコピー数が軽鎖のコピー数よりもかなり低いことを示した。Dr. Edeyard Engleman, 5tanford Unive Obtained from rsity. Extract the bilidoma cells [INA, Hind Digested with nl. Restriction patterns were resolved by Southern blot analysis using Jc probes. This Southern blot analysis showed that 5P2 (this hybridoma fusion partner) and Bal b/c liver [DNA. It showed a 4.2 kb band characteristic of u3/% hybridoma. This means that The 4.2 kb band of suggest Hybridization using this J)l probe was performed on liver RDNA. Judging from the strength of autoradiodrum against this anti-Leu triple chain gene, showed that the copy number of the light chain was significantly lower than that of the light chain.

次いで、ハイプリドーマＯＮ八を抽出し、断片の平均の大きさ、　１５ｋｂを生 じる条件下で、ＥｃｏＲＩ”活性（参考文献４４）で一部分解した。その後、大 きさで選別したＤＮＡをλＧＬ１ａ　ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部位へ連結し、パフケ ージした。組換えファージの数はＳｐｉ選択（参考文献４２）により計算した。Next, extract the hybridoma ON8 and generate the average fragment size of 15kb. It was partially degraded by EcoRI'' activity (Reference 44) under conditions of The DNA selected by the particle size was ligated to the EcoRI site of λGL1a DNA, and The page was edited. The number of recombinant phages was calculated by Spi selection (ref. 42).

１．２Ｘ１０６ｍ換えファージを１２のサブライブラリーに分け、エセリシア・ コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＫＭ　３９２　（ＳｕｐＦ″″）で増幅した。この平板 溶菌液を、カセットベクターπＬＣ，・ＮｏｔＩを含むＭＣ１０６１（Ｐ３）ｉ ｆｆ胞上に再プレートし、ここで、おそらく再配列された活性ネズミ軽鎖を含む ファージとこの軽鎖カセット（第２１図の構造ＡおよびＢ）との間で組換えが起 こった。この得られたファージを、エセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＬＧ −７５（ＳｕｐＦ−）　とＫＭ３９２の両者で調べることにより選択した。ＬＧ −７５のＫＭ　３９２に対するタイターの比は１０−Ｓから１０−７であった。The 1.2×106m recombinant phage was divided into 12 sub-libraries and The cells were amplified using E. coli KM 392 (SupF″″). this flat plate The lysate was transformed into a cassette vector πLC, MC1061(P3)i containing NotI. ff cells, now containing the presumably rearranged active murine light chain. Recombination occurs between the phage and this light chain cassette (structures A and B in Figure 21). It's so bad. This obtained phage was transferred to Ethelicia coli (E, coli) LG. -75 (SupF-) and KM392. LG The titer ratio of -75 to KM 392 was 10-S to 10-7.

次いで、このＪ、プローブとのハイブリダイゼーションによりファージを選別し た。この１２のサブライブラリーのうち１１が陽性であった。その後＊　Ｊ（” 　５ｕｐＦ”ファージをプラーク精製し、未再配列クローンの除去のために、こ のヒトＣよのＪｃ（第３Ａ図）と、−Ｊ、プローブとをハイブリダイズさせた。Phage are then selected by hybridization with this J probe. Ta. 11 of these 12 sub-libraries were positive. After that *J(” 5upF” phage was plaque purified and this was used to remove unrearranged clones. The human C and Jc (Figure 3A) were hybridized with -J and the probe.

この１１のサブライブラリーのうち３つは、プローブ−Ｊ。Three of these 11 sub-libraries are probe-J.

とのハイブリダイゼーションで示されたように、未再配列軽鎖遺伝子に属した。It belonged to the unrearranged light chain gene, as shown by hybridization with.

残りの８フアージクローンのすべては。All of the remaining 8 Phage clones.

Ｊｃプローブおよびヒトｃｒニブロープとハイブリダイズし。Hybridized with Jc probe and human cr nibrope.

それらが正しい配列を含むことを示唆した。suggested that they contained the correct sequence.

−次溶菌液を単一プラークから調製した。抽出ＤＮＡを、適当な酵素までの分解 、およびプローブＪｃ、ヒトＣｃおよび５ｕｐＦへのハイブリダイゼーションに より確認した。約０．５μｇのファージＤＮＡをＮｏｔＩで分解し、低ＤＮＡ濃 度で連結した（参考文献３７：第２１図の構造ＢおよびＣ）。次いで、　ＭＣ１ ０６１（Ｐ３）コンピテント細胞を各環状πプラスミドＤＮＡで形質転換した。- A secondary lysate was prepared from a single plaque. Decompose extracted DNA into appropriate enzymes , and for hybridization to probes Jc, human Cc and 5upF. I confirmed it more. Approximately 0.5 μg of phage DNA was digested with NotI and reduced to a low DNA concentration. (Reference 37: Structures B and C in Figure 21). Next, MC1 061 (P3) competent cells were transformed with each circular π plasmid DNA.

形質転換体を２枚のニトロセルロースフィルターに取り、これをＪＩニブロープ およびヒトＣ，プローブとハイブリダイズさせた。９５％以上のコロニーは両プ ローブ配列を含んでいた。Transfer the transformant to two nitrocellulose filters and transfer it to a JI nib rope. and human C, hybridized with the probe. More than 95% of colonies are from both plants. It contained a lobe array.

πＬｅｕ−３・ＬＣと名付けたプラスミドを選び、制限酵素分析および適当なプ ローブとのハイブリダイゼーションにより、第２１図の構造りを有することが明 らかとなった。A plasmid named πLeu-3・LC was selected and subjected to restriction enzyme analysis and appropriate plasmid. By hybridization with the lobe, it was revealed that it had the structure shown in Figure 21. It became clear.

生生林料至岑皿 特許手続のための微生物の寄託の国際規定に関するブタベスト協約に従い、以下 の材料を、　１９８６年３月１４日付でＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）＋　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ 　Ｄｒｉｖｅ。Fresh forest ingredients plate In accordance with the Butapest Agreement on the International Regulations for the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure: The materials of American Type Cu1tu dated March 14, 1986. re Co11ection (ATCC) + 12301 Parklawn Drive.

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２．　Ｕ、Ｓ、Ａ、に寄託 した。Rockville, Maryland 20852. Deposited with U.S.A. did.

（以下余白） ｎｎｎｎｎ トトトトトト へ、＼、＼へへ、＼ ややややヤや 本発明の特定の応用および実施態様をここに示したが、当業者にはハイブリッド 免疫グロブリン鎖調製に用いられる一般的方法や１組織適合性抗原遺伝子が、多 形性遺伝子の群がｈ含される場合、他のハイブリッド遺伝子への適用に応用でき ることが、容易にわかるであろう。上記実施態様の修正は当業者には明らかなの で１本発明の範囲は添付する特許請求の範囲によってのみ定義するつもりである 。(Margin below) nnnnnnn Totototototo Hehe, \, \Hehe, \ Somewhat not so good Although specific applications and embodiments of the invention have been shown herein, those skilled in the art will appreciate that hybrid The general methods and histocompatibility antigen genes used for immunoglobulin chain preparation are If a group of morphic genes is included, it can be applied to other hybrid genes. It will be easy to see that. Modifications to the above embodiments will be obvious to those skilled in the art. The scope of the invention is intended to be defined solely by the appended claims. .

ＥＭＢＬ　３　７９−＊”ターＡＢ ＦＩＧ、２１Ａ ＥｃｏＲＩ　ＥｃｏＲＩ ’７ｒＬｅｕ−３−ＬＣ 国際調査報告 １ｍ５−−＋ｍ−ａｕｖＣｕ＋−ＩＩ＋ｉ＠Ｐｃｒｌｕｓａ６１ｏｏｓ６６EMBL 3 79-*”tar AB FIG. 21A EcoRI EcoRI '7rLeu-3-LC international search report 1m5--+m-auvCu+-II+i@Pcrlusa61oos66

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ハイブリッドＡｉ−Ｂ′遺伝子の構築に使用するカセットベクターであって ，ここで， （ａ）Ａｉは多形性Ａ−Ｂ遺伝子の群のＡｉ−Ｂｉ遺伝子に由来する多形性コー ド領域である； （ｂ）Ｂ′は選択されたＡ′−Ｂ′遺伝子に由来する；（ｃ）ＡｉとＡ′および ＢｉとＢ′は，構造的かつ機能的に類似の遺伝子をコードする領域である；そし て（ｄ）このＡとＢのコード領域およびこのＡ′とＢ′のコード領域は，それぞ れイントロンＩとＩ′により分断されている；選択可能なマーカー遺伝子，この Ｂ′コード領域および遺伝子断片を含有するカセットベクターであり，該マーカ ー遺伝子が，クローニングベクター（これは，カセットベクターでの組み換えに よりこのマーカー遺伝子を獲得する）の宿主内での選択を許し， 該遺伝子断片が，このＡ−Ｂ遺伝子群の１つの遺伝子内のイントロンＩに由来し ，かつこの遺伝子断片の３′末端が該Ｂ′コード領域の５′末端に隣接している ことを包含するカセットベクター。 ２．２つのアンバー変異遺伝子を含むλファージクローニングベクターと使用す るための特許請求の範囲第１項に記載のベクターであって、 該アンバー変異遺伝子の発現がサプレッサー陰性宿主内でファージの選択を許し ， ここで，前記選択可能なマーカー遺伝子がサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子であるベ クター。 ３．マウス−可変部およびヒト−定常部コード領域からなるハイブリッド免疫グ ロブリン遺伝子の構築に用いるための特許請求の範囲第１項に記載のベクターで あって，ここで，前記Ｂ′がヒト免疫グロブリン遺伝子の定常部コード領域を含 み，そして前記遺伝子断片がマウス免疫グロブリン遺伝子のＩＳ２イントロンに 由来するベクター。 ４．特許請求の範囲第３項に記載のベクターであって，ここで，前記イントロン 遺伝子断片が転写エンハンサー要素を含むベクター。 ５．特許請求の範囲第３項に記載のベクターであって，ここで，前記イントロン 遺伝子断片が，未再配列免疫グロブリン遺伝子内の切り変えシグナルの上流のＩ Ｓ２領域に由来するベクター。 ６．ハイブリッド軽鎖免疫グロブリン鎖の構築に使用する特許請求の範囲第１項 に記載のベクターであって，ここで，前記Ｂ′がヒトκまたはλ遺伝子の定常部 コード領域を含み，そして前記遺伝子断片がマウスκまたはλ遺伝子のＩＳ２領 域に由来するベクター。 ７．プラスミドπＬＣκ・ＮｏｔＩである特許請求の範囲第６項に記載のベクタ ー。 ８．ハイブリッド重鎖免疫グロブリン鎖の構築に用いる特許請求の範囲第１項に 記載のベクターであって，ここで，前記Ｂ′がヒトα，δ，ε，γ１−γ４また はμ遺伝子の定常部コード領域を含み，そして前記遺伝子断片がマウス重鎖遺伝 子のＩＳ２領域に由来するベクター。 ９．πＨＣγ１・ＮｏｔＩ，πＨＣγ３・ＮｏｔＩおよびπＨＣγ４・ＮｏｔＩ からなる群から選択されたプラスミドである特許請求の範囲第８項に記載のベク ター。 １０．異なった重鎖クラスからの定常部コード領域およびヒト可変部からなるハ イブリッド重鎖免疫グロブリン遺伝子の構築に用いる特許請求の範囲第１項に記 載のベクターであって、 ここで，前記Ｂ′が選択されたクラスのヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子の定常部 コード領域を含み，そして前記遺伝子断片が未再配列遺伝子の切り換えシグナル の上流領域におけるヒト重鎖遺伝子のＩＳ２領域に由来するベクター。 １１．μ可変部領域およびγ定常部領域遺伝子を含むハイブリッド遺伝子の構築 に用いる特許請求の範囲第１項に記載のベクターであって， ここで，前記Ｂ′がヒト遺伝子からの定常部コード領域を含むベクター。 １２．πＳＷＭＧ１・ＮｏｔＩおよびπＳＷＭＧ３・ＮｏｔＩからなる群から選 択されたプラスミドである特許請求の範囲第１１項に記載のベクター。 １３．ヒト多形性コード領域およびマウス非多形性コード領域からなるハイブリ ッドクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ遺伝子の構築に用いる特許請求の範囲第１ 項に記載のベクターであって， ここで，前記Ｂ′がネズミＭＨＣ遺伝子の非多形性エクソンの１つまたはそれ以 上を含み，そして前記イントロン遺伝子断片が相当するヒトＭＨＣ遺伝子の類似 の非多形性エクソンのすぐ上流のイントロンに由来するベクター。 １４．ヒト／マウスのクラスＩＩＭＨＣハイブリッド遺伝子の構築に用いる特許 請求の範囲第１３項に記載のベクターであって，ここで，前記Ｂ′がネズミＩ− Ａα，１−Ａβ，Ｉ−Ｅαまたは１−Ｅβ遺伝子のエクソン３−５を含み，そし て前記イントロン遺伝子断片が類似のＤＲ，ＤＣ，またはＳＢヒトαまたはβ遺 伝子のＩＳ２領域に由来するベクター。 １５．前記Ａｉ−Ｂｉ遺伝子の起源の細胞のゲノムＤＮＡをほとんど切断しない 酵素により切断されるような特異な制限部位をさらに含むプラスミドである特許 請求の範囲第１項に記載のベクターであって， ここで，該特異制限部位がイントロンＩに由来する前記遺伝子断片の５′末端に 隣接して位置しており，そして該プラスミドの複製開始点および前記選択可能な マーカー遺伝子のいずれも，イントロンＩに由来する前記遺伝子断片と該特異制 限部位との間に位置しないベクター。 １６．特許請求の範囲第１５項に記載のベクターであって，ここで，前記特異制 限部位がＮｏｔＩ，ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩからなる群から選択されるベクター 。 １７．特許請求の範囲第１５項に記載のベクターであって．ここで，前記特異制 限部位がＮｏｔＩであるベクター。 １８．ハイブリッドＡｉ−Ｂ′の生成方法であって，ここで，（ａ）ＡｉはＡ− Ｂ遺伝子の群のＡｉ−Ｂｉ遺伝子に由来する多形性コード領域である； （ｂ）Ｂ′は選択されたＡ′−Ｂ′遺伝子に由来する実質的に非多形性のコード 領域である； （ｃ）ＡｉとＡ′およびＢｉ、とＢ′は構造的カつ機能的に類似の遺伝子コード 領域である；そして （ｄ）このＡとＢコード領域およびこのＡ′とＢ′コード領域は，それぞれイン トロンＩとＩ′により分断されている；選択可能なマーカー遺伝子，このＢ′コ ード領域および遺伝子断片を含むカセットベクターを供給すること，このような Ａｉ−Ｂｉ遺伝子を含む細胞源からクローン化遺伝子断片のゲノムＤＮＡライブ ラリーを調製すること，このカセットベクターおよびクローン化ライブラリー断 片を組み換え可能宿主に導入すること，および該選択可能なマーカー遺伝子を含 むライブラリー断片を選択すること， を包含する方法であり， 該選択可能なマーカー遺伝子が，クローニングベクター（これは，カセットベク ターでの組み換えによりこのマーカー遺伝子を獲得する）の宿主内での選択を許 し，かつ該遺伝子断片がこのＡ−Ｂ遺伝子群の１つの遺伝子内のイントロンに由 来し，そしてこの遺伝子断片の３′末端が該Ｂ′コード領域の５′末端に隣接し ている方法。 １９．特許請求の範囲第１８項に記載の方法であって，ここで，前記カセットベ クターがサプレッサーｔＲＮＡ選択可能なマーカー遺伝子とともに供給され，前 記ライブラリー遺伝子断片が，アンバー変異構造タンパクを有するλファージク ローニングベクターにクローン化され，そして前記選択が，サプレッサーを欠く 宿主でのファージプラーク形成に基づいている方法。 ２０．特許請求の範囲第１９項に記載の方法であって，ここで，前記カセットベ クターが選択された制限部位を含み，該制限部位がＡｉ−Ｂｉの前記細胞起源の ＤＮＡ内に特異で，かつ前記イントロンＩ遺伝子断片の５′末端に隣接して位置 し，前記選択可能なマーカー遺伝子および該カセットベクターの複製起源のいず れも，該特異制限部位と前記イントロンＩ遺伝子断片の５′末端との間に位置し ておらず；そして，前記λファージクローニングベクタ一方が，（ｉ）前記一対 の同一制限部位および（ｉｉ）前記一対の特異制限部位を含み，該一対の同一制 限部位が，Ａｉ−Ｂｉの該細胞起源のＤＮＡに該特異制限部位より高い頻度で存 在し，そして前記ライブラリー遺伝子断片の近くに隣接しており，該一対の特異 制限部位が，該ライブラリー遺伝子断片の遠くに隣接している方法。 ２１．特許請求の範囲第２０項に記載の方法であって，ここで，前記頻度で存在 する制限部位が，前記ライブラリー調製段階において，前記細胞起源のゲノムＤ ＮＡの分解に用いられる酵素により切断される方法。 ２２．特許請求の範囲第２０項に記載の方法であって，ここで，前記頻度で存在 する制限部位が，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩからなる群から 選択された酵素により切断される方法。 ２３．特許請求の範囲第２０項に記載の方法であって，ここで，前記特異制限部 位が，ＮｏｔＩ，ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩからなる群から選択された酵素により 切断される方法。 ２４．特許請求の範囲第２０項に記載の方法であって，ここで，前記特異制限部 位が酵素ＮｏｔＩで切断される方法。 ２５．特許請求の範囲第２２項に記載の方法であって，ここで，前記特異制限部 位が酵素ＮｏｔＩで切断される方法。 ２６．特許請求の範囲第２０項に記載の方法であって，ここで，前記λファージ クローニングベクターがλＧＬｌａである方法。 ２７．選択された可変部コード領域，および定常部コード領域を有するハイブリ ッド免疫グロブリン遺伝子の構築に用いる特許請求の範囲第１８項に記載の方法 であって，ここで，前記カセットベクターが，このような選択された定常部コー ド領域を含むＢ′コード領域，およびこのような選択された可変部コード領域を 含む免疫グロブリン遺伝子の群の免疫グロブリン遺伝子に由来するイントロン遺 伝子断片とともに供給され，そして， 該供給されたＤＮＡライブラリーが，該選択された可変部コード領域を含む起源 に由来する方法。 ２８．マウス可変部とヒトハイブリッド免疫グロブリン遺伝子コード領域とを有 し，そして選択された抗原に特異的な抗体の鎖をコードするべく適用される遺伝 子の構築に用いられる特許請求の範囲第２７項に記載の方法であって，ここで， 前記Ｂ′コード領域が選択されたヒト免疫グロブリン定常部領域に由来し，そし て前記供給されたＤＮＡライブラリーが選択された抗原に対し特異的なモノクロ ーナル抗体を生じ得るマウスハイブリッド細胞系列に由来する方法。 ２９．特許請求の範囲第２８項に記載の方法であって，ここで，前記カセットベ クターが，πＨＣγ１・ＮｏｔＩ，πＨＣγ３・ＮｏｔＩ，πＨＣγ４・Ｎｏｔ ＩおよびπＬＣκ・ＮｏｔＩからなる群から選択されたプラスミドである方法。 ３０．第１の重鎖クラスの可変部コード領域および第２の異なる重鎖クラスの定 常部コード領域を有するハイブリッド重鎖免疫グロブリン遺伝子の構築に用いる 特許請求の範囲第２７項に記載の方法であって，ここで， 前記カセットベクターが，未再配列遺伝子の切り換えシグナルの上流領域におい て，このような第２のクラスのヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子およびヒト重鎖遺 伝子のＩＳ２領域に由来するイントロン遺伝子断片を含むＢ′コード領域ととも に供給され，そして前記供給されたＤＮＡライブラリーが，このような第１のク ラスの遺伝子の可変部コード領域を含む細胞起源に由来する方法。 ３１．特許請求の範囲第３０項に記載の方法であって，ここで，前記カセットベ クターが，πＳＷＭＧ１・ＮｏｔＩおよびπＳＷＭＧ３・ＮｏｔＩからなる群か ら選択されたプラスミドである方法。 ３２．特許請求の範囲第２７項に記載の方法であって，ここで，前記カセットベ クターが，エンハンサー要素を含むイントロン遺伝子断片とともに供給される方 法。 ３３．ハイブリッドヒト多形性／マウス非多形性ＭＨＣ遺伝子の構築に用いる特 許請求の範囲第１８項に記載の方法であって，ここで， 前記カセットベクターが，選択されたマウスＭＨＣ遺伝子の実質的に非多形性の エクソンの１つまたはそれ以上を含むＢ′コード領域とともに供給され， 前記イントロン遺伝子断片が，相当するヒトＭＨＣ遺伝子の類似のエクソンのす ぐ上流のイントロンに由来し，そして，前記ＤＮＡライブラリーが，相当するヒ トＭＨＣ遺伝子のヒト多形性遺伝子領域を含むヒト細胞に由来する方法。 ３４．ヒト／マウスクラスＩＩＭＨＣハイブリッド遺伝子の構築に用いる特許請 求の範囲第３３項に記載の方法であって，ここで， 前記カセットベクターが，ネズミＩ−Ａα，Ｉ−Ａβ，Ｉ−ＥαまたはＩ−Ｅβ 遺伝子のエクソン３−５を含むＢ′コード領域とともに供給され，そして， 前記イントロン遺伝子断片が，類似のＤＲ，ＤＣ，またはＳＢヒトαまたはβ遺 伝子のＩＳ２領域に由来する方法。 ３５．多形性Ａ−Ｂ遺伝子の群のＡｉ−Ｂｉ遺伝子に由来する多形性Ａｉコード 領域，選択されたＡ′−Ｂ′遺伝子に由来する実質的に非多形性Ｂ′コード領域 ，および該ＡｉとＢ′とを分割する混成イントロンを含むハイブリッドＡｉ−Ｂ ′遺伝子であって，ここで， 該ＡｉとＡ′およびＢｉとＢ′が，構造的および機能的に類似の遺伝子コード領 域であり，そして該ＡとＢコード領域および該Ａ′とＢ′コード領域が，それぞ れイントロンＩとＩ′により分断されており，そして 該混成イントロンが，該Ａｉコード領域のすぐ３′側のＡｉ−Ｂｉ遺伝子に由来 する上流区分，該Ａ−Ｂ遺伝子群の他の遺伝子に由来する中間区分，および該Ｂ ′コード領域のすぐ５′側のＡ′−Ｂ′遺伝子に由来する下流区分からなるハイ ブリッドＡｉ−Ｂ′遺伝子。 ３６．特許請求の範囲第３５項に記載のハイブリッド遺伝子であって，ここで， 前記Ａｉ−Ｂ′がそれぞれ可変部および定常部コード領域であり，そして異なる 重鎖または異なる軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来するハイブリッド遺伝子。 ３７．特許請求の範囲第３６項に記載の遺伝子であって，ここで，前記中間区分 が転写エンハンサー要素を含む遺伝子。 ３８．特許請求の範囲第３６項に記載の遺伝子であって，ここで，前記中間区分 が未再配列遺伝子の切り換えシグナルの上流の免疫グロブリン遺伝子ＩＳ２に由 来する遺伝子。 ３９．特許請求の範囲第３５項に記載の遺伝子であって，ここで，前記Ａｉがヒ トＨＬＡ遺伝子の多形性エクソンの１つまたはそれ以上を含み，そして前記Ｂ′ が相当するマウスＭＨＣ遺伝子の相補的かつ実質的に非多形性のエクソンを含む 遺伝子。 ４０．特許請求の範囲第３９項に記載の遺伝子であって，ここで，前記Ａｉがヒ トＤＲ，ＤＣ，またはＳＢヒトαまたはβ遺伝子のエクソン１と２とを含み，そ して前記Ｂ′がネズミＩ−Ａα，Ｉ−Ａβ，Ｉ−Ｅα，またはＩ−Ｅβ遺伝子の エクソンを含む遺伝子。 ４１．特許請求の範囲第３５項に記載の遺伝子であって，ここで，前記Ａｉがネ ズミ遺伝子から，そして前記Ｂ′がヒト遺伝子からである遺伝子。 ４２．特許請求の範囲第３６項に記載の遺伝子であって，ここで，前記Ａｉがネ ズミ遺伝子から，そして前記Ｂ′がヒト遺伝子からである遺伝子。 ４３．特許請求の範囲第３７項に記載の遺伝子であって，ここで，前記Ａｉがネ ズミ遺伝子から，そして前記Ｂ′がヒト遺伝子からである遺伝子。 ４４．特許請求の範囲第３８項に記載の遺伝子であって，ここで，前記Ａｉがネ ズミ遺伝子から，そして前記Ｂ′がヒト遺伝子からである遺伝子。 ４５．特許請求の範囲第４２項に記載の遺伝子であって，ここで，前記ＡｉとＢ ′が軽鎖免疫グロブリン遺伝子のコード領域である遺伝子。 ４６．特許請求の範囲第４２項に記載の遺伝子であって，ここで，前記ＡｉとＢ ′が重鎖免疫グロブリン遺伝子のコード領域である遺伝子。 ４７．特許請求の範囲第４５項に記載の遺伝子であって，ここで，前記軽鎖遺伝 子がκ鎖遺伝子である遺伝子。 ４８．特許請求の範囲第４０項に記載の遺伝子であって，ここで，前記Ａｉがヒ トＤＲ−αコード領域のエクソン１および２を含み，そして前記Ｂ′がネズミＩ −Ｅαのエクソン３−５を含む遺伝子。 ４９．スタッファ−ＤＮＡ断片に隣接する２つのファージＤＮＡアームを含むλ ファージクローニングベクターであって，該スタッファーＤＮＡ断片が，（ｉ） ネズミまたはヒトゲノムＤＮＡを分解して遺伝子ライブラリーを作成するのに適 当な単一酵素により切断される第１の制限部位の対に近く隣接し，そして（ｉｉ ）ネズミまたはヒトゲノムＤＮＡをほとんど切断しない単一酵素により切断され る第２の制限部位の対の遠くに隣接するベクターであり， 前記第１および第２の制限部位の対の両方が前記ファージＤＮＡのアームに隣接 しているλファージクローニングベクタ５０．特許請求の範囲第４９項に記載の λファージクローニングベクターであって，ここで，前記第１の制限部位の対が ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩからなる群から選択された酵素 により切断されるλファージクローニングベクター。 ５１．特許請求の範囲第４９項に記載のλファージクローニングベクターであっ て，ここで，前記第２の制限部位の対が，ＮｏｔＩ，ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩか らなる群から選択された酵素により切断されるλファージクローニングベクター 。 ５２．特許請求の範囲第５０項に記載のλファージクローニングベクターであっ て，ここで，前記第２の制限部位の対が，ＮｏｔＩ，ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩか らなる群から選択された酵素により切断されるλファージクローニングベクター 。 ５３．特許請求の範囲第４９項に記載のλファージクローニングベクターであっ て，ここで，前記第１の制限部位の対を切断する酵素がＥｃｏＲＩであり，前記 第２の制限部位の対を切断する酵素がＮｏｔＩであるλファージクローニングベ クター。 ５４．λＧＬｌａである特許請求の範囲第４９項に記載のλファージクローニン グベクター。 [Claims] 1. A cassette vector used for the construction of a hybrid Ai-B' gene, where: (a) Ai is a polymorphic code derived from the Ai-Bi gene of the group of polymorphic A-B genes; (b) B' is derived from the selected A'-B' gene; (c) Ai and A' and Bi and B' encode structurally and functionally similar genes. is an area; (d) The code regions of A and B and the code regions of A' and B' are respectively is separated by introns I and I'; it is a cassette vector containing a selectable marker gene, this B' coding region and a gene fragment; - The gene is transferred to a cloning vector (this is a cassette vector for recombination). This gene fragment is derived from intron I in one gene of this A-B gene group, and the 3' end of this gene fragment is A cassette vector containing adjacent to the 5' end of the B' coding region. 2. Use with λ phage cloning vector containing two amber mutant genes 2. A vector according to claim 1 for use in a suppressor tRNA gene, wherein expression of the amber mutant gene allows selection of phages in a suppressor negative host, wherein the selectable marker gene is a suppressor tRNA gene. Somewhere ctor. 3. A hybrid immunoglobulin consisting of a mouse variable region and a human constant region coding region. A vector according to claim 1 for use in constructing a Robulin gene, wherein said B' contains a constant region coding region of a human immunoglobulin gene. and the gene fragment is derived from the IS2 intron of a mouse immunoglobulin gene. 4. 4. The vector according to claim 3, wherein the intronic gene fragment comprises a transcriptional enhancer element. 5. 4. The vector according to claim 3, wherein the intronic gene fragment is derived from the IS2 region upstream of the switching signal in an unrearranged immunoglobulin gene. 6. 2. A vector according to claim 1 for use in constructing a hybrid light chain immunoglobulin chain, wherein said B' comprises a constant region coding region of a human kappa or lambda gene, and said gene fragment IS2 region of mouse κ or λ gene Vectors derived from the region. 7. The vector according to claim 6, which is a plasmid πLCκ・NotI -. 8. A vector according to claim 1 for use in constructing a hybrid heavy immunoglobulin chain, wherein said B' is human α, δ, ε, γ1-γ4 or contains the constant region coding region of the μ gene, and the gene fragment contains the mouse heavy chain gene. Vector derived from the child IS2 region. 9. The vector according to claim 8, which is a plasmid selected from the group consisting of πHCγ1.NotI, πHCγ3.NotI and πHCγ4.NotI. Tar. 10. A chain consisting of constant region coding regions and human variable regions from different heavy chain classes. Claim 1 for use in constructing hybrid heavy chain immunoglobulin genes wherein said B' comprises the constant region coding region of a selected class of human heavy chain immunoglobulin genes, and said gene fragment comprises a human human heavy chain immunoglobulin gene in the region upstream of the switching signal of the unrearranged gene. A vector derived from the IS2 region of the heavy chain gene. 11. The vector according to claim 1, which is used for constructing a hybrid gene containing μ variable region and γ constant region genes, wherein said B′ contains a constant region coding region from a human gene. vector. 12. Selected from the group consisting of πSWMG1・NotI and πSWMG3・NotI. The vector according to claim 11, which is a selected plasmid. 13. A hybrid consisting of a human polymorphic coding region and a mouse non-polymorphic coding region. 1. A vector according to claim 1 for use in constructing a class I or class II MHC gene, wherein said B' is one or more of the non-polymorphic exons of a murine MHC gene. and wherein said intronic gene fragment is derived from an intron immediately upstream of a similar non-polymorphic exon of the corresponding human MHC gene. 14. A vector according to claim 13 for use in the construction of a human/mouse class II MHC hybrid gene, wherein said B' is murine I-Aα, 1-Aβ, I-Eα or 1-Eβ. Contains exons 3-5 of the gene, and If the intronic gene fragment has similar DR, DC, or SB human α or β genes, A vector derived from the IS2 region of the gene. 15. A vector according to claim 1, which is a plasmid that further contains a unique restriction site that is cleaved by an enzyme that hardly cleaves the genomic DNA of the cell where the Ai-Bi gene originates, , the specific restriction site is located adjacent to the 5' end of the gene fragment derived from intron I, and both the origin of replication of the plasmid and the selectable marker gene are derived from intron I. The gene fragment and the specific regulation A vector that is not located between the restriction site and the restriction site. 16. The vector according to claim 15, wherein the specific restriction is A vector in which the restriction site is selected from the group consisting of NotI, SfiI and XhoI. 17. A vector according to claim 15. Here, the singular rule A vector whose restriction site is NotI. 18. A method for producing a hybrid Ai-B', wherein (a) Ai is a polymorphic coding region derived from an Ai-Bi gene of a group of A-B genes; (b) B' is a selected (c) Ai and A' and Bi, and B' are structurally and functionally similar gene coding regions; and (d) this A and B code region and this A' and B' code region are respectively in Separated by tron I and I'; a selectable marker gene, this B'co providing a cassette vector containing a code region and a gene fragment; preparing a genomic DNA library of cloned gene fragments from a cell source containing such Ai-Bi gene; fragment into a recombinant host and containing the selectable marker gene. selecting a library fragment containing the selectable marker gene in a cloning vector (this is a cassette vector). This marker gene is acquired by recombination in the host). and the gene fragment originates from an intron in one gene of this A-B gene group. and the 3' end of this gene fragment is adjacent to the 5' end of the B' coding region. 19. 19. The method according to claim 18, wherein the cassette base vector is supplied with a suppressor tRNA selectable marker gene and The library gene fragment is a λ phage containing an amber mutant structural protein. phage plaque formation in a host lacking the suppressor. 20. The method according to claim 19, wherein the cassette base the vector comprises a selected restriction site, the restriction site is unique within the DNA of said cellular origin of Ai-Bi and is located adjacent to the 5' end of said intron I gene fragment, and said restriction site is located adjacent to said selectable marker. The origin of replication of the gene and the cassette vector none of the specific restriction sites are located between the specific restriction site and the 5' end of the intron I gene fragment; and one of the lambda phage cloning vectors is located between (i) the pair of identical restriction sites and (ii) containing said pair of specific restriction sites, said pair of identical restriction sites; The restriction site exists at a higher frequency than the specific restriction site in the DNA originating from the cell of Ai-Bi. and closely adjacent to said library gene fragment, said pair of specific restriction sites being distantly adjacent to said library gene fragment. 21. 20. The method according to claim 20, wherein the restriction site present at the frequency is cleaved by an enzyme used for decomposing the genomic DNA of the cellular origin in the library preparation step. How to do it. 22. 21. The method of claim 20, wherein the frequently occurring restriction site is cleaved by an enzyme selected from the group consisting of EcoRI, HindIII and BamHI. 23. 20. The method according to claim 20, wherein the specific restriction portion A method in which the position is cleaved by an enzyme selected from the group consisting of NotI, SfiI and XhoI. 24. 20. The method according to claim 20, wherein the specific restriction portion A method in which the position is cleaved with the enzyme NotI. 25. The method according to claim 22, wherein the specific restriction portion A method in which the position is cleaved with the enzyme NotI. 26. 21. The method of claim 20, wherein the λ phage cloning vector is λGLla. 27. A hybrid having the selected variable region code region and constant region code region. 19. A method according to claim 18 for use in constructing a host immunoglobulin gene, wherein the cassette vector contains such a selected constant region code. B' coding region containing the code region, and intronic genes derived from immunoglobulin genes of the group of immunoglobulin genes containing such selected variable region coding regions. A method in which the DNA library is supplied with a gene fragment, and the supplied DNA library is derived from a source containing the selected variable coding region. 28. A gene comprising a mouse variable region and a human hybrid immunoglobulin gene coding region and adapted to encode a chain of an antibody specific for a selected antigen. 28. A method according to claim 27, wherein the B' coding region is derived from a selected human immunoglobulin constant region; The supplied DNA library is then transformed into a monochrome protein specific to the selected antigen. A method derived from mouse hybrid cell lines capable of producing natural antibodies. 29. 29. The method according to claim 28, wherein the cassette base A method in which the vector is a plasmid selected from the group consisting of πHCγ1·NotI, πHCγ3·NotI, πHCγ4·Not I, and πLCκ·NotI. 30. A variable coding region of a first heavy chain class and a definition of a second different heavy chain class. 28. The method of claim 27 for use in constructing a hybrid heavy chain immunoglobulin gene having a constitutive coding region, wherein the cassette vector comprises a region upstream of a switching signal of an unrearranged gene. Therefore, this second class of human immunoglobulin heavy chain genes and human heavy chain B′ coding region containing an intronic gene fragment derived from the IS2 region of the gene. and said supplied DNA library is supplied to such a first library. A method of deriving from a cellular source containing the variable coding region of a ras gene. 31. 31. The method according to claim 30, wherein the cassette base Is the vector consisting of πSWMG1・NotI and πSWMG3・NotI? A method in which plasmids are selected from 32. 27. The method according to claim 27, wherein the cassette base The vector is supplied with an intronic gene fragment containing an enhancer element. Law. 33. Characteristics used in the construction of hybrid human polymorphic/mouse non-polymorphic MHC genes 19. The method of claim 18, wherein the cassette vector contains a B' code comprising one or more substantially non-polymorphic exons of a selected mouse MHC gene. region, and the intronic gene fragment is supplied with all similar exons of the corresponding human MHC gene. and the DNA library is derived from the corresponding human intron. A method derived from human cells containing human polymorphic gene regions of human MHC genes. 34. Patent application for construction of human/mouse class II MHC hybrid gene Scope of Claim 33. The method according to item 33, wherein the cassette vector contains a B' coding region comprising exons 3-5 of the murine I-Aα, I-Aβ, I-Eα or I-Eβ gene. and the intronic gene fragment is supplied with a similar DR, DC, or SB human α or β gene fragment. A method derived from the IS2 region of the gene. 35. a polymorphic Ai coding region derived from an Ai-Bi gene of a group of polymorphic A-B genes; a substantially non-polymorphic B' coding region derived from a selected A'-B' gene; A hybrid Ai-B' gene containing a hybrid intron separating Ai and B', where Ai and A' and Bi and B' are structurally and functionally similar genetic coding regions. and the A and B code regions and the A' and B' code regions are respectively The hybrid intron is separated by introns I and I', and the mixed intron is separated by an upstream segment derived from the Ai-Bi gene immediately 3' of the Ai coding region, and an upstream segment derived from other genes of the A-B gene group. and a downstream segment derived from the A'-B' gene immediately 5' of the B' coding region. Brid Ai-B' gene. 36. 36. A hybrid gene according to claim 35, wherein said Ai-B' are variable region and constant region coding regions, respectively, and are derived from different heavy chain or different light chain immunoglobulin genes. Hybrid gene. 37. 37. The gene of claim 36, wherein said intermediate segment comprises a transcriptional enhancer element. 38. The gene according to claim 36, wherein the intermediate segment is derived from the immunoglobulin gene IS2 upstream of the switching signal of the unrearranged gene. Genes to come. 39. The gene according to claim 35, wherein the Ai is human. A gene comprising one or more polymorphic exons of a mouse HLA gene, and said B' comprises complementary and substantially non-polymorphic exons of the corresponding mouse MHC gene. 40. The gene according to claim 39, wherein the Ai is human. Contains exons 1 and 2 of the DR, DC, or SB human α or β gene; and said B' contains an exon of a murine I-Aα, I-Aβ, I-Eα, or I-Eβ gene. 41. The gene according to claim 35, wherein the Ai is from the Zumi gene, and said B' is from a human gene. 42. The gene according to claim 36, wherein the Ai is from the Zumi gene, and said B' is from a human gene. 43. The gene according to claim 37, wherein the Ai is from the Zumi gene, and said B' is from a human gene. 44. The gene according to claim 38, wherein the Ai is from the Zumi gene, and said B' is from a human gene. 45. 43. The gene according to claim 42, wherein said Ai and B' are coding regions of a light chain immunoglobulin gene. 46. 43. The gene according to claim 42, wherein said Ai and B' are the coding region of a heavy chain immunoglobulin gene. 47. The gene according to claim 45, wherein the light chain gene A gene whose child is a κ chain gene. 48. The gene according to claim 40, wherein the Ai is human. A gene comprising exons 1 and 2 of the murine DR-α coding region, and said B' comprises exons 3-5 of murine I-Eα. 49. A λ phage cloning vector comprising two phage DNA arms flanking a stuffer DNA fragment, wherein the stuffer DNA fragment is (i) suitable for degrading murine or human genomic DNA to create a gene library; (ii) closely adjacent to a first pair of restriction sites that are cut by a single enzyme of interest, and (ii) distal to a second pair of restriction sites that are cut by a single enzyme that hardly cuts murine or human genomic DNA. 50. A lambda phage cloning vector that is a contiguous vector, wherein both said first and second restriction site pairs flank said arms of said phage DNA. 49. The lambda phage cloning vector of claim 49, wherein the first pair of restriction sites is a lambda phage that is cleaved by an enzyme selected from the group consisting of EcoRI, HindIII and BamHI. cloning vector. 51. 49. The lambda phage cloning vector according to claim 49, wherein the second restriction site pair is NotI, SfiI and XhoI. A λ phage cloning vector that is cleaved by an enzyme selected from the group consisting of: 52. The lambda phage cloning vector according to claim 50, wherein the second restriction site pair is NotI, SfiI and XhoI. A λ phage cloning vector that is cleaved by an enzyme selected from the group consisting of: 53. The λ phage cloning vector according to claim 49, wherein the enzyme that cleaves the first pair of restriction sites is EcoRI, and the enzyme that cleaves the second pair of restriction sites is EcoRI. λ phage cloning vector in which NotI ctor. 54. The λ phage clonin according to claim 49, which is λGLla. vector.