JPS62501467A - ポリヌクレオチドプロ−ブ - Google Patents
ポリヌクレオチドプロ−ブInfo
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- JPS62501467A JPS62501467A JP50460585A JP50460585A JPS62501467A JP S62501467 A JPS62501467 A JP S62501467A JP 50460585 A JP50460585 A JP 50460585A JP 50460585 A JP50460585 A JP 50460585A JP S62501467 A JPS62501467 A JP S62501467A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
1,21Fとr顆
この発明は、ヒト又は動物のゲノムを探索(probiB)するのに有用なプロ
ーブとして役立つようにラベルすることができるポリヌクレオチド、及びこのプ
ローブを使用してゲノムDNAを固定する方法に関する。この固定方法は、例え
ば、父系及び母系試験、法医学、並びに遺伝性疾患及び癌の診断において有用で
ある。
2・ 狐迷ぷ」紹lCM
ゲノムDNA中の遺伝子の相違を固定するだめの主要な従来方法は、制限断片長
の多望性(restriction fragmentlength poly
morphismS; RFLP)を検出することによるものである。例えば、
J、F、Gusella等、Nature 306.234−238(1983
)によるハンチングトン舞踏病を生じさせるDNA欠損の座の同定、およびW、
に、Cavanee等、Nature 305.779−7(1984)による
網膜芽腫の素因の分析を参照のこと。
はとんどのRFLPは、DNA中の小規模な変化、通常、制限エンドヌクレアー
ゼ開裂部位を形成し又は破壊する塩基置換から生ずる。ヒトDNAの平均へテロ
接合性(mean hetero−zygos i ty)は低い(塩基対当り
約0.001)であるから、制限エンドヌクレアーゼは所与の遺伝子座における
RFLPを稀にしか検出しないであろう、検出される場合でさえ、はとんどのR
FLPは、決して50%を超えずそして通常は非常に低い、対立遺伝子頻度によ
って決定される、雑種性を伴う2形性(diIIlorphic) (制限エン
ドヌクレアーゼ開裂部位の存在及び不存在)に過ぎない。結果として、このよう
なすべてのRFLPは決定的固体がホモ接合的である場合は常に血統分析におい
て均質である。
遺伝的分析は、多数対立遺伝子変化を示す超可変領域のプローブの入手可能性に
より、そして対応して高いヘテロ接合性(he terozygos i ty
)により相当に単純化され得るであろう。
このような第1の領域は、A、R,Wyman等、Proc、Nat、Acad
、Sci。
USA 、 ??、 6754−6758(1980)ニより、 偶然に、ヒ)
DNAのランダムセグメントのライブラリーから単離された。この遺伝子座の多
数対立遺伝子変化(multiallelic variatton)の構造的
基礎がまだ不明である。その後、そしてやはり偶然に、幾つかの他の高可変領域
がヒトインシュリン遺伝子(G、J、Be11等、Nature 29531−
35(1982)) 、ゼータ・グロビン遺伝子(N、 J、 Proudfo
ot等、Ce11 3L 553−563(1982) 、及びS、E、 Y、
に□odbourn等、Proc、Nato Acad、Sci、USA、 8
0.5002−5026(1983)) 、及びC−■a−ras−1発癌遺伝
子(1)、J、Capon等、Nature 302.33−37 (1983
) )の近傍で見出された。各場合において、可変領域は短い配列(“ミニサテ
ライト”)のタンデム反復から成り、そして変化性(polymorphism
)は−有基***性もしくは減数***性非同−交換(unequal excha
nge)により、又は複製中のDNAの滑り(slippage)により生ずる
反復数の対立遺伝子的相違に基く。生ずるミニサテライトの長さの相違は、反復
単位を開裂しない制限エンドヌクレアーゼを用いて検出され得る。
本発明者及びその共同研究者はすでにヒト−ミオグロビン遺伝子のイントロン中
の33bp配列の4個のタンデム反復を含んで成る短いミニサテライトを記載し
ている(P、Weller等、EMBOJ、ユ、439−446(1984)
)。この33bp反復はすでに特徴付けられている上記の他のヒト−ミニサテラ
イトに対して、配列における弱い類似性を示すことが注目された。この1文はミ
ニサテライト領域が転位(transposition)により生ずることを推
定した。ヒト−ミオグロビン遺伝子の33bp反復が転位性(transpos
able)であれば、このものは、反復数の相違に基き多数対立遺伝子変化性と
しばしば関連するヒト−ゲノムのクンデム反復領域のためのプローブを提供する
ことヒト−ゲノムDN八がミオグロビン遺伝子からの33bp配列のタンデム反
復を含んで成るDNAプローブにより探索(probing)された。多望性相
違が3人の個体(父、母、及び娘)のゲノムDNA中の幾つかの異る領域におい
て観察され、この相違は一層大きな断片(2〜6 kb)のサイズにおいて生ず
る。データーは1個より多くのミニサテライト領域の長さの相違に基く安定に遺
伝される変化性と一致した。
2訓し月1皿
−5の研究が、ミオグロビン遺伝子33bρ−反復プローブを使用するのよりも
はるかに効果的にミニサテライト又は超可変領域中の変化性を表示する方法でゲ
ノムDNAを探索することが可能であることを示した。
この発明は、ヒト又は動物のゲノムDNA中の多くのミニサテライトが異るミニ
サテライト間で高度の相同性を有するD N A 9M域を含有するという発見
に基いている。この共通のコアー領域は短かく、約16塩基対である。今や、少
なくとも3回りンデムに反復されるヌクレオチドの類コアー配列をその必須構成
成分として有するプローブが、ゲノムDNA中の多くの異るミニサテライト領域
を、そしてこれらの領域中のそれらのDNAの相違に言及することにより個体が
同定され又は識別され得る程の精密さをもって検出するために役立つであろうこ
とが見出された。これらの従来のプローブはRFLPにより与えられるのよりも
良好な程度の識別に通じるが個体について本質的に特異的である指紋(fing
erprint)には通じない。注目すべきことには、1個より多くのミニサテ
ライト領域又は超可変遺伝子座への言及によってこの発明のコアープローブはD
NAを指紋採取することができることが見出され、そして通常でない程度の非自
明性を発明性に加えているのはこの発見であり、これが基本的で科学的新規性と
重要性を有する発明にしている。
コアー配列の知見から、ゲノム中の種々の遺伝子座からのミニサテライト領域と
ハイブリダイズする性質を有するDNAプローブを製造することができる。しか
しながら、特定のコアー配列の単なる認識又は同定は、それ自体では、役立つプ
ローブの製造のために不十分である。コアー領域のクンデム反復配列を含有する
ポリヌクレオチド又はその誘導体を製造することも必要である。このようなプロ
ーブは、ヒト又は動物のDNAからのミニサテライトとして単離することができ
、又はこれとは異り合成技法によって造成することができる。好結果のハイブリ
ダイゼーションを行う追加の制約を達成することも重要である。これらは、許容
され得るコンセンサス−コアーとの相同性の程度及び全体として反復単位の内及
び外の非−コアーDNAの許容される長さの知見を包含する。
こうして、この発明は次の認識及び発見を用いる:(1)任意の1つのコアー配
列の知識がこの方法において使用され得ること。これはさらに次の認識を含む:
(2)ゲノム中の異る超可変遺伝子座を研究することによって、必要な程度のコ
ンセンサスを有する異るコアー配列が見出され得ること;
(3)変化性の異るフベクトルを認識するであろうDNAプローブの一層が蓄積
され得ること;
(4)特定の遺伝子分類があるプローブによって、他のプローブによるよりも好
結果に達成され得ること;(5)任意の1つの分類における1個より多くのプロ
ーブの使用により、同定の確率が増幅されること;(6)好結果のプローブの第
1世代の一層の研究により、より簡純で且つより好結果のプローブが、例えば合
成により製造され得ること。
こうして、この発明の第1の観点に従えば、多望性ミニサテライト−長さ特異的
結合特性を有するポリヌクレオチドの製造方法が提供され、この方法は:
(i)他の多望性D N A ’pM域への制限されたハイブリダイゼーション
を行うことができる、DNA中の天然タンデム反復配列を同定し、
(ii)そのような結合を担当することが推定される該反復配列の天然コンセン
サス−コアー配列を同定し、そして(iii )天然反復配列よりも低いゲノム
−遺伝子座−特異性及び高い多望性断片受容性を有する、ミニサテライト結合性
を有する天然コンセンサス−コアー配列由来の完全な又は不完全なタンデム反復
配列を単離するか又は人工的に造成する、ことを含んで成る。
プローブのコアー成分は同じ基礎原理に暴く種々の方法により定義され得る。最
も基本的な基礎原理はプローブの反復配列がヒト又は動物のゲノムDNAのミニ
サテライトに共通の、共通コアー領域からのヌクレオチド配列から成るか又はそ
れを含むべきことである。この共通コアー配列は、1つのミニサテライトと他の
ものとの間に高度の、例えば80%以上のコンセンサスを示すという意味におい
て“共通”である。
これらのミニサテライトは、例えば、ミオグロビン遺伝子33bp反復配列によ
りゲノムDNAを探索して、この明細書において1λ33−陽性”断片と称する
ハイブリダイズした断片を得ることにより検出される。これらの断片及びミオグ
ロビン遺伝子の33bp反復は約16bpの共通コアー配列を含む。
このλ33−陽性断片を、やはり共通コアー配列を有する他の断片を形成するた
めのゲノムDNAのプローブとしてそれ自体として使用することができるが、そ
のなんらかの小変化を伴うこともできる。
他の原理は、コアーヌククレオチド配列が、ザンブルDNAのミニサテライト領
域に効果的にハイブリダイズすることができない程短くなく、多望性をうまく検
出できない程長くないこと、例えばミニグロビン遺伝子中の33bpタンデム反
復に非常に類似することである。一般に、コアーは6ヌクレオチドないしミニサ
テライトの共通コアー中に見出される最大、約16を有すべきである。プローブ
の反復配列はもっばらコアーから成る必要はなく、コアー配列のいずれかの端に
少数のフランキングヌクレオチドを含有することができる。
反復単位は、ヌクレオチドの数又は種類のいずれについても、及び反復単位のコ
アー又は非コアー成分のいずれについても正確な反復である必要はない。しかし
ながら、これがおよその用語であるとしても、この明細書において反復単位とし
て記載しそして定義するのが便利である。n反復単位のブロックはいずれかの末
端に任意のヌクレオチド配列を有していてもよ(、その程度及び種類は通常無関
係である。
この発明のポリヌクレオチドは、次の方法のいずれかにおいて定義されるものを
特に包含する。
第」」υ’fJL
5’−3’の意味に読まれる次の一般式%式%(1)
〔式中、
“コアー”は少なくとも6個の連続するヌクレオチドを有する配列を表わし、こ
のヌクレオチドは同じ意味で読まれる次の配列:
GGAGGTGGGCAGGAXG (2)AGAGGTGGGCAGGTGG
(3)GGAGGYGGGCAGGAGG (4)T (C) I、1GGA
GGAXGG (G) 、C(5A)T(C)、GGAGG八(A) QGGG
C(5B)のいずれかの中から選択され、ここで、XはA又はGであり、YはC
又はTであり、mは0.1又は2であ、pは0又はlであり、qは0又は1であ
り、nは31以上であり;
J及びKは一緒になって反復単位内の0〜15個の追加のヌクレオチドを表わし
;そして、
H及びI、はそれぞれ反復配列を挟む0又は1以上の追加のヌクレオチドであり
:そして次のこと、すなわち:(i) “コアー”並びにJ及びKは各(J、コ
アー、K)反復ユニットで同じ配列又は長さを必ずしも有するわけではなく;
(ii ) “コアー”はさらに異るコアー配列を表わすこともでき;
(iii )全n反復単位中の実際の合計コアー配列は、同じ数nの反復単位に
おける式2〜5について上に定義した“真の”合計コアー配列と70%以上の相
同性を有する;ことを条件とする〕
を有するポリヌクレオチド:並びに
これに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド。
星叉少Z嚢
次の一般式:
%式%(1)
〔式中、
“コアー”は同じ5 ’−3’の意味読まれる6〜16個の連続するヌクレオチ
ドの配列を表わし、(1)反復単位当り約33ntのミオグロビンタンデム反復
配列を含有すプローブDNAを用いてヒト又は動物のゲノムDNAを探索するこ
とによって得られる第1のヒト又は動物のミニサテライトの5′=3′共通コア
ー領域、(2)第1のミニサテライトの共通コアー領域を含んで成るタンデム反
復配列を含有するプローブDNAを用いてヒト又は動物のDNAを探索すること
によって得られる第2のヒト又は動物のミニサテライトの5′→3′共通コアー
領域、及び(3)第2のミニサテライトの共通コアー領域を含んで成るタンデム
反復配列を含有するプローブDNAを用いてヒト又は動物のゲノムDNAを探索
することにより得られる第3のヒト又は動物のミニサテライトの5′=3′共通
コアー領域から選択され、上記の各タンデム反復配列は3単位以上の反復である
〕
を有するポリヌクレオチド;並びに、これに次して相補的な配列のポリヌクレオ
チド。
玉主■定五
次の一般式:
%式%(1)
〔式中、
“コアー”は、75%以上、好ましくは80%のコンセンサスを示すヒト又は動
物のゲノムDNAのミニサテライトの共通コアー領域内からの6個以上の連続す
るヌクレオチドを有する配列のいずれかを表わし;
“コアー”は各反復単位中で必ずしも同じ配列を有するわけではなく、そして他
のすべての記号は上に定義した通りである〕
を有するポリヌクレオチド;並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチ
ド。
ゑ土■定義
次の式:
%式%(6)
(式中、PはGではなく、WはA又はTであり、そしてXはA又はGである)
で表わされる配列、又はその変形体から選択される連続する(5′→3′)コア
ー配列を含む6〜35ntの配列の3以上の反復を有するポリペプチド(全反復
中の実際の合計コアー配列は、同じ数の反復における式(6)について定義した
“真の”コアー配列に対する70%以上の相同性を有することを条件とする);
並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチド。
上記の式中で、そしてあまねく、配列は通常の表記法5′→3′で示される。
この発明は、DNAの、RNAの、及びDNAとハイブリダイズし得る任意の他
の種類のポリヌクレオチドを包含する。
上に定義されたポリヌクレオチドはラベルされておらず、そして2本鎖(ds)
形又は単鎖(ss)形であることができる。
この発明は、プローブとして使用するためのss形のラベルされたポリヌクレオ
チド、及びこれらのラベルされた前駆体であってそれからss−プローブを製造
することができるものを包含する。
これらは好ましくは任意の常法において33p−放射性ラベルされるが、しかし
この方法に代って、ハイブリダイゼーション技術においてよ(知られている他の
手段により放射性ラベルされることができ、Proceedings of t
he 19811CN −UCLA Symposium on Develo
pmental Biology using PurifiedGenes
、キーストン、コロラド、1981年3月15〜20日、VolX X nl
1981.647−6
D、Brown等編、に記載されているり、CyWard等の方法によりビオチ
ンもしくは同様の種でラベルされることができ、又はA。
D、B、 Malcolm等、Abstracts of the 604th
BtochemicalSociety Meeting、ケンブリッジ、英
国(1983年7月1日の会)の方法により酵素ラベルされることさえできる。
そして、この発明の他の観点に従えば、ヒト又は動物のDNAを含有するサンプ
ルの遺伝子の由来の決定に有用なポリヌクレオチドプローブが提供され、このも
のは、ラベルされた成分又はマーカー成分を含むと共に、サンプルDNAを制限
エンドヌクレアーゼにより断片化することにより得られ対応するDNA断片への
プローブのハイブリダイゼーションを可能にする程度にヒト又は動物のゲノムの
ミニサテライト領域と相同である配列の3回以上のタンデム反復(変形体を包含
する)を含んで成るポリヌクレオチドを含んで成り、そして次のこと、すなわち
:
a)各反復が、異るゲノム遺伝子座からの多数のミニサテライト中に存在する同
様な長さのコンセンサス−コアー領域と70%以上相同であるコアーを含有し;
b)コアーが6〜16ヌクレオチドの長さををし;C)コアーに寄与しない、反
復単位内のヌクレオチドの合計数が15以下である;
ことを特徴とする。
この発明はさらに、ヒト又は動物のゲノムDNAのサンプルの同定方法を包含し
、この方法は、この発明のプローブにより該DNAを探索し、そしてDNAのハ
イブリダイズした断片を検出することを含んで成る。
この発明のこの観点は:
細胞性材料のサンプルからの全DNAを制限エンドヌクレアーゼを用いて断片化
し、
高可変DNA断片を、ラベル化された成分又はマーカー成分に加えて反復コアー
成分を含有する上に定義したプローブとハイブリダイズせしめ、そして
異る長さのDNA断片に、又はさらに一般的には異る分子サイズのバンドに結合
したラベル又はマーカーの濃度を決定通常、断片化されたDNAは、ハイブリダ
イゼーションの前に、鎖長に従って、例えば電気泳動により分別又は分離し、そ
してマーカー濃度を検知してその個々の要素が遺伝的由来に特異的である特徴的
パターンを得る。
定−義
この発明及び今までの記載中に使用される下記の定義が助けとなろう。
趨ユ斐負
1つの認められた遺伝子座又は部位におけるヒト又は動物のDNAの領域が長さ
又は配列について多くの異る形態で存在する場合、それは超可変的であると言わ
れる。
Ij 片夕刑(RFLP)
これは、電気泳動後に分離されそしてプローブにより検出されたヒト又は動物の
DNA断片のパターンにおける遺伝子的多様性である。
ミニサテライト
これは、短いDNA配列のタンデム反復から構成されるヒト又は動物のDNAの
領域である。すべての反復単位が完全な同一を示すことは必ずしも必要でない。
(この発明のプロ−ブは条里性であるミニサテライトを含んで成る。)監皿件
個体ごとに相違を示す遺伝子、又はD N Aの他のセグメントは条里性である
と言われる。
ユヱニ」μ刀り一
本来、コンセンサス−コアー配列の意味に用いられるが、しかしそれに由来する
任意の反復される配列又は変形配列に拡張される。
且/丸スカ各−ニュ7−<μA月
由来又は遺伝子座を異にする2以上のミニサテライトの反復単位間で実質的な又
は完全にマツチするものとして同定され得る配列である。
反復1旺−
所与のコアー配列又はコアー配列を含有するセグメントの完全な又は不完全なタ
ンデム反復たる配列である。
定1されなコアー(配列Y−
それ自体の長さ内で弐(2)〜(8)の1つと完全に一致するコアー配列である
。
変月葬」旦にμ刀9一
定義されたコアー配列かられずかな程度界る(相同性50%以上)実際のコアー
配列である。
完冷返腹ユに刀と
所与のコアー配列の又はコアー配列を含有するセグメントの正確なタンデム複製
たる配列である。
・6全 ′ (配置)
少なくとも1つの単位が塩基対置換及び/又は長さにおいて少なくとも1つの他
の、中位から異る配列である。(通常、1つのプローブ配列中に少なくとも3個
のタンデム配列が存在し、プローブ配列内に少なくとも1つの定義されたコアー
配列及び少なくとも1つの変形体が存在するであろう。)■珂且X
同じ長さの2つの配列の比較において、塩基対(bp)の数がらbp置換数を差
引きしたもののbp数に対する%である。
区l〜ヒt±I’Cnt)及び塩基対(bp)は同義に使用される。両者はDN
A又はRNAに当てることができる。略号C,A。
G、Tは常用通り(デオキシ)シチジン、(デオキシ)アデノシン、(デオキシ
)グアノシン、及びデオキシデミジン又はウリジンのいずれかを意味する。
タンデム反復配列(人工的な、又は天然、Qj離体)は完全反復であることがで
きるが、しかしさらに好ましくは不完全反復である。好ましくは少なくとも2個
の反復がコンセンサス−コアー配列の不完全反復である。好ましくは、3個以上
の反復、そしてさらに好ましくは7個以上の反復がプローブ配列中に存在する。
プローブの製造は、クローニングによる天然ミニサテライトの単離及びDNA配
列決定による同定を含むことができる。
これはまた、必要とされるコアーの切り出し及びそれに続くそのタンデム反復へ
の転換、又は由来を異にする断片との非同−交換の促進を含むことができる。こ
れはまた、ポリヌクレオチドのクローニングを含むことができる。
他方、造成段階は同定されたコンセンサス−コアー配列又はその断片の合成を含
むことができる。コンセンサス−コアー配列は好ましくは6bp以上を含有しそ
して好ましくは16bρ以下を含有する。次に合成コアーのタンデム反復を造成
する。
言うまでもなく、ポリヌクレオチドは、好結果の又は部分的に好結果の中間体の
クロー、−ングの後の異る時における操作の連続の結果であることができ、そし
て最終ポリベブヂドが親ミニサテライトへのわずかな類似性を有するように天然
起源又は合成起源の断片を含むことができる。
この発明のプローブは次の分野において有用である。
1、 ヒトにおける父系及び母系試験。
2、例えば入植紛争及び相続紛争における家族群の立証。
3、 双生児におけるチゴシティ−(Zygas i ty)試験。
4、 ヒトにおける血族結婚についての試験。
5、 ヒトにおける一般的血統分析。
6、 ヒトにおける遺伝的疾患の遺伝子座の同定。これにより遺伝的欠点を検出
するだめの特異的プローブの造成が可能となる。
7、法医学 (a)強姦の犠牲者からの***の特定、(b)例えば汚れた衣類か
らの血液、髪及び***の特定、
(c)ヒトの遺体の特定。
8、セル・チメラリズム(Cell Chimaerism)の研究、例えば骨
髄移植後の提供細胞対受容体細胞の追跡。
9、家畜の育種及び血統分析/証明。(これは例えば動物の純系の日常的調節及
び点検、並びに例えば競争馬及び犬の繁殖に係る訴訟事件における血統の点検を
含むことができよう。)さらに、経済的に重要な遺伝的形質との関係を示すであ
ろう遺伝マーカーを提供すること。
10、純粋なセルラインの汚染及びE1常酌量定作業を点検する、培養された動
物セルラインの日常的品質管理。
11、腫瘍細胞及び腫瘍の分子異常についての分析。
12、ポリヌクレオチド又はそれに由来するプローブは植物育種における潜在的
用途を有するものと期待される。
貝頁tyv1■V口W肌
第1図は、ミオグロビン遺伝子の33hp反復配列をプラスミドに挿入しそして
それをクローニングする、その製造方法の模式的説明である。
第2図は種々のD N Aブロー・ブにハイブリダイズするゲノムDNAの断片
のオートラジオグラフの写真のフォトコピーであり、そしてさらにそのDNAが
2つのオートラジオグラムにおいて同定された親類個体血統を示している。
第3図は、この発明の3種類の異るプローブにより探索された、親類関係にない
3人のヒトの個体からのDNAサンプルのオートラジオグラフを示す。
第4図は、この発明のプローブにより探索された、9大のヒトの個体からのDN
Aサンプルのオートラジオグラフを示し、その数人は親類関係にあり、そして2
人は一卵性双生児である。
第5図は、この発明のプローブにより探索された、2人のヒト及び17のヒト以
外の動物からのDNAサンプルのオートラジオグラフを示す・
第6図は、この発明に従って探索された、入植紛争にまき込まれたガーナ人家族
の構成員からのDNAサンプルの1連のオートラジオグラフを示す。
第7図は神経線維腫症に罹患した血縁者からのDNAサンプルのオートラジオグ
ラフを示す。
第8図は、ミニサテライト断片の可能性ある共同受は継ぎ及び胎児性ヘモグロビ
ンの遺伝的存m(HPFI+)の試験のために作られたGujerati血統か
らのDNAのオートラジオグラフを示す。
第9図A及びBは、大きな親類関係におけるHPFH及び種々のミニサテライト
の受け継ぎを示す遺伝的ダイアグラムである。
第10図はクローン化された人工的ミニサテライトの調製を示すダイアグラムで
ある。
第11図は、新規な合成プローブにより探索された、親類関係にない2個体の胎
盤からのDNAサンプルの1連のオートラジオグラフを示す。
第12図は大きな親類関係からの探索されたDNAサンプルの1連のオートラジ
オグラフを示す。
第13図は異る2つのプローブを用いて双生児について得られる種々のD N
Aバンドパターンを示すオートラジオグラフである。
第14図は単鎖プローブ及び2本鎖プローブを用いて形成されるバンドパターン
を比較するオートラジオグラフである。
第15図及び第15A図は、法医学サンプルから得られるDNA指紋を示すオー
トラジオグラフである。
第16図はイヌの一族から得られたDNA指紋を示すオートラジオグラフである
。
第17図は短毛家庭用ネコの一族からのDNA指紋を示すオートラジオグラフで
ある。
第18図は2つの異るプローブを用いて種々のヒツジから得られたDNA指紋を
示すオートラジオグラフである。
第19図は3頭の異るブタからのD N A指紋を示すオートラジオグラフであ
る。
第20図はウシの一族及び追加のウシについてのDNA指紋を示すオートラジオ
グラフであり:そして第21図は異るプローブを用いる第20図に類似するオー
トラジオグラフである。
好ユニ%(社)a威
ファージλL47.1中にクローン化されたヒトDNAの10〜20kb S
au3A部分のヒトゲノムライブラリーを、33bpミオグロビン反復プローブ
″pAV33.7とのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。3X
10’組換体のライブラリー中に40以上の強くないし弱くハイブリダイズする
プラークが同定された。これらの陽性プラークの8個の無作為選択物を精製しく
λ33.1−15) 、そしてファージDNAのサザンプロット分析を用いて、
各組換体においてハイブリダイズするDNAが組換体のユニーン短(0,2〜2
kh)領域内に位置することが示された。配列分析は、8個の組換体の各々の
この領域が反復配列の3〜29タンデムコピーを含んで成るミニサテライトを含
有し、該反復配列の長さはλ33.15中の16bp〜λ33.4中の64の範
囲であることを示した。はとんどのミニサテライトは整数個の反復を含有してい
た。次に、λ33.6においては、37bp反復が基本的12bpユニツトの分
岐したトリマーから成っていた。各λ33組換体は、各ミニサテライトを挟むク
ローン特異的DNA配列により判定した場合ヒトゲノムの異る領域を代表してい
た。
8個のクローン化ミニサテライト領域は、ヒトDNAのHinfl消化物中でp
AV33.7により検出され得るβ型性2〜6kbDNA断片より小さい0.5
〜2.2kbHinf I DNA断片内に位置していた。クローン化されたミ
ニサテライト領域のいずれかも多量性であるか否かを決定するため、″tP−ラ
ベル化単鎖DNAプローブを各ミニサテライトの適当なM13サブクローンから
調製し、そして高厳重さで、HtnfIで消化された14人の親類関係にない英
国白人のDNAのパネルにハイブリダイズせしめた。典型的なハイブリダイゼー
ションパターンは、これらのハイブリダイゼーション条件下で各プローブがヒト
ゲノムのユニーク領域を検出すること、及びこれらの領域の3個は高度に多量性
であることを示す。
上記の手順の、これ以上の詳細は例に記載する。
今や、前記のポリヌクレオチドの定義に関し、定義は次の一般式
%式%(8)
(式中Cはコアー配列を示し、そして他の記号は上記の通りである、)
と一致する。すべての定義において、1つの単位のコアー配列は次のものと同じ
でも異っていてもよい。例えば、全体として反復単位に当てはまるコンセンサス
配列と比べて1もしくは2個の途分のヌクレオチドを含有し、1もしくは2個の
ヌクレオチドを欠き、又は(例えば)1〜4個のヌクレオチドが異なっていても
よい。
コアーは種々の方法で定義され得る。一般的定義はコアー配列を同定することが
できる手順に言及することにより得ることができる。ゲノムDNAのサテライト
領域は例えば、GGAGGTGGGCAGGAXG (2)のごとき配列と比較
される。式(2)に含まれるすべての可能なX−ヌクレオチド長配列から選択さ
れるX−ヌクレオチドと最大の相同性を示すミニサテライトから取られるX−ヌ
クレオチド長配列は、コアー配列であるとされる。言うまでもなく、これはコア
ーを定義する非常に狭い方法であり、そして1又は少数のコアーの6ヌクレオチ
ド長、1又は少数の7ヌクレオチド長、そして16までのヌクレオチド長をもた
ら存在するであろうから“少数”である)。このように定義されたコアーに対す
るこれらのコアーの平均70%以上の相同性を全n反復単位が有する程度に多様
性が存在し得ることが仮定される。反復配列内のフランキング配列JおよびKは
相同性についての計算には含まれず、コアー間でのみ比較される。定義されるコ
アーは種々の長さを有することができ、そして“混合”され得る。すなわち、幾
つかの反復単位においては例えば式(2)のGGGCAGGAXGと相同であり
そして他においては例えば式(3)のGGGCAGGTGGと相同である。従っ
て、変形体は、必然的に“コアー“自体との相同性ではなく (コアー)nとの
相同性として考慮すべきである。
前に定義された“第1の”定義は、上記の考慮に由来するが、しかし示されてい
る式(2)〜式(5)巾、事情次第で、6〜最高12〜16のいずれかの長さの
配列としてコアーが定義される点において単純化される。変形体について同様の
規定が存在する。
第2の定義は、それぞれが追加のミニサテライト断片を生成し得る連続するハイ
ブリダイゼーション段階としてコアーを定義する。ヒトゲノムDNAの広範なラ
イブラリーに対して十分な数のハイブリダイゼーションを行い、十分な数のハイ
ブリダイズした断片を試験し、これらからプローブを作り、ゲノムDNAを再び
探索し7、そして理論的にはこれを無限回行うことにより、ミニサテライトDN
A中で広く象徴されるコンセンサスコアー配列の範囲に到達することが可能であ
ることが容易に理解されよう。実際には、十分に広いコンセンサスコアー領域に
到達するために非常に多数回そして大規模にこれらの操作が行われなければなら
ないとは予想されず、そしてそれ由に(勝手に)3回のみの探索操作が定義内に
含まれる。
“第3の”定義において、Wがコアー・を表わし、そして25%(例えば16ヌ
クレオチド中4ヌクレオチド)より多く異らない多様性を伴う広く共有されるコ
ンセンサスコアー領域の可能性に頼る。25%以下の可能性ある可変性を伴う約
16ヌクレオチド以上のコアー領域をこのように定義すれば、コアーWはその領
域内からの6以上の連続するヌクレオチドの配列として定義される。
“第4°の定義は、合成ポリヌクレオチドに係る研究から得られた再定義された
コンセンサスコア一式(6)を含む。
これらの研究は、一層短いコアー配列の他の定義を導く。
従って、好ましくは連続する(5’−3’)配列:PGGGC讐G(7)
がすべての反復単位中に保存され、ここでP及びWは上の第4の定義において与
えられた意味を有する。Pは好ましくはTであり、Wは好ましくはAである。
好ましくはまた、連続する(5 ’ 3 ’)配列:TGGGCA (8)
が全反復単位に保存される。
他の観点に従えば、連続する5 ’−3’コアー配列:
GGPGGGCWGGWXG (7)
(式中、Pはc −c itなく、WはA又はTであり、そしてXはA又はGで
ある)
を含む3以上の反復を有するポリヌクレオチド、又はその変形体(全反復中の実
際の合計コアー配列が同じ数の反復中式(7)に関して定義された“真の“合計
コアー配列と70%以上の相同性を有することを条件とする)、及び上記のもの
と相補的な配列のポリヌクレオチドが提供される。
上記のすべての定義において、コアーは少なくとも6ヌクレオチド長であり、さ
らに好ましくは7又は8ヌクレオヂドであり、そして最も好ましくは12又はそ
れより大で例えば14〜16である。弐(2)の配列GGGCAGGAXG (
3’末端の末端10ヌクレオチド)は高コンセンサスであり、そして特に有望な
ようである。
変形体コアーは、好ましくは70%以上、そしてさらに好ましくは80又は85
%以上の相同性を有する。
各反復単位内のフランキング配列J及びKは好ましくは各端において省略され、
又は短かく、例えば0.1又は2ヌクレオチドにされ、そして好ましくはJ及び
Kは一緒になって20を超えるべきではな(、さらに好ましくは20を超えるべ
きではない。反復単位内のJ+コアー十にの合計中の全ヌクレオチド数は好まし
くは36を、そしてさらに好ましくは31を、そして最も好ましくは25を超え
るべきでない。
反復単位の数nは好ましくは少なくとも1o、便利には10〜4oであるが、し
かし原理的には任意の数であることができ、10.000までの数でさえ可能で
ある。
フランキング配列11及びI5は無関係である。これらは省略されることができ
、又は任意の数の、例えば20、000までのヌクレオチドとして存在すること
ができるが、このような長いプローブを用いることはあまり賢明ではない。反復
配列が5s−DNAである場合でも、これらはcps−DNAを含有することが
できる。
同定方法は任意の既知の探索技法を用いることができ、その最も通常の方法はサ
ンプルDNAを、タンデム配列を開裂せしめないか又はそれらの探索される能力
を妨害しない無意味な程度に開裂せしめるに過ぎない制限酵素(適当であれば1
種類又は複数種類)により開裂せしめることである。
肛 ヒトーミオ外田臣ン」市jシ帆伝転lしり身G己ム瓦復父丑血倉1を泰1孔
二ズ近裁。
このプローブの造成が(a)〜(e)で表示される5段階を示す第1図中に模式
中に説明されている。出発ミオグロビン遺伝子(a)はP、Weller等、E
?IBOJ、3.439−446(1984)により記載されている。そこに示
されているように、該遺伝子は、はとんど同一の9bp配列(第1図中r)に挟
まれた33bp配列の4個の反復から成る、第1イントロン中に位置する領域を
有する。この領域を169bp 仙f I断片(b)中に単離し、それを末端修
復しそしてプラスミドp UCl3のSma1部位にクローニングすることによ
り増幅した(J、Vieira等、Gene19゜259−268 (1982
)を参照のこと〕。制限エンドヌクレアーゼ人va n (A)により第3及び
第4反復を開裂ゼルめることによリモノマーを単離した(c)。(反復1及び2
中の1基置換がこの部位を除去し、そして代りにDde I (D)部位を形成
する。)非−同一人vaI[接着末端を介する33bpモノマーの連結により反
応単位数不明の頭:尾ポリマー(d)が生成した。少なくとも10個の反復を含
むポリマーを分取用アガロースゲル電気泳動により単離し、末端を修復し、p
UCl3のSma1部位に連結し、そしてE、コリJM83中にクローン化した
(J、Vieiva等、前掲を参照のこと)。p AV33.7と称する生じた
プラスミド(e)中のポリマーDNA挿入部の構造を、旦amHI + Eco
R工によりポリリンカーにおいて該挿入部を切り出し、α−3!P−dCTPに
より旦amH1部位においてフィル−インラベル化し、そして人vaIrにより
部分消化することにより確認した。
ラベルされた部分消化生成物を2%アガロースゲル上での電気泳動により分離し
た。p AV33.7は(e)に示すように767bpBamHI一旦coRI
断片中に含まれる33bpモノマーの23反復を含有することが見出された。
(2)ミオグロビン33b ′プローブによるヒトー゛ツムのミニサテーイト令
にの゛ の配置′
バタテリオファージλL47.1中にクローン化された10〜20kbヒトDN
A断片のライブラリー(P、Weller等、前掲、及びW、A、M、レネン等
、Gene20.249−259(1980) )を、P。
Weller等、前掲、の方法により32p−ラベルされた、前記段階(1)中
に記載した767bp pAV33.7挿入部とのハイブリダイゼーションによ
りスクリーニングした。8個の陽性プラークの選択物を精製してλ33.1−1
5と称する組換体を得た。これらのファージDNAのそれぞれを且1nfI又は
且aemにより消化し、1.5%アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてそ
の中の33−反復関連配列をp AV33.7 D N Aとのサザン・プロッ
ト・ハイブリダイゼーションにより位置決定した。各組換体は1個の“λ33−
陽性”1釦fl及び且亜■断片を与えたが、λ33.4及び11は検出可能なユ
aeI[I断片を与えなかった(これらの組換体中の反復領域中にHaelll
開裂部位が存在するため)。λ33−陽性Hinfl及び且aeIn断片を分取
用ゲル電気泳動により単離し、所望により末端修復し、そして2本積D N A
M133mp8の盈ma1部位に平滑末端連結した(J。
Messing等、Gene19.269−276(1982) ) 、 E、
コリ(E、coli)JMIOIに形質転換した後隅性55−M13組換体を単
離し、そしてジデオキシヌクレオチド・チェイン−ターミネーション法により配
列決定した。すべてのλ33−陽性断片がタンデム反復領域を含有しており、こ
れは幾つかの場合には直接配列決定することができた。反復領域が配列決定プラ
イマ一部位から遠すぎる他の場合には、M13挿入部を制限エンドヌクレアーゼ
による開裂によって短縮し、そして再度配列決定した。
λ33−陽性断片の構造を、λ33.1、33.3、33.4、33.5 。
33.6.33.10.33.11及び33.15と称する8個の地図の形で後
に示す。使用された実際の制限酵素及びヌクレオチド中の断片の長さはλ33.
1:旦憇■、2000; 33.0 :1釦fl、465;33.4:且inf
I 、 2000; 33.5: 旦in f I 、1600; 33.6
:1耗■、720; 33.10:旦憇■、720; 33.11:1釦f I
、 1020゜ccag ta tcc tgggaa t tcg taa
tca tgg tca tagc tg t t tcc tg tg 狽
■≠■
ラムダ 33.10
a gacac tgccc tgg tgBc tc tgacceec t
gcagcc tce ta tge tc ta−−−−−tgc t tg
gggca gcac tcacacacag taag tgcceaag
tcaaa tgaaa tacctacaga tgagg tg tg t
gc tta t tc tc tg tgcaaga t t tcagag
@t
(3) λ33−” の「′西 ■ に しそしてそれに丑 される丑[コアー
”西 1の および6各領域の反復配列を、ドツトマトリクス分析を用いて、p
AV33.7中のミオグロビン33bp反復配列と、及びその逆方向相補体と
比較した。非常に顕著に、ミオグロビン33bp反復配列とλ33−陽性断片の
コンセンサス反復配列との間に配列類似性の1つの小さい明瞭な領域が見出され
た。同じ領域が8個のすべてのλ33断片の反復により共有されており、そして
“共通コアー”と称されよう。下記のチャートはその比較を示す。
このチャートにおいて、前記段階(2)において決定された各コンセンサス配列
の全体が示される。これらは、ミオグロビン33bpプローブ中及びヒト−ゲノ
ムDNAから単離されたλ33−陽性断片中のタンデムに反復する部分である。
このチャートは共通コアー領域を大文字スクリプトの16ヌクレオチド長として
示す。
共通コアー領域
*この配列はトリマーであり、従ってフランキング領域はコアーに寄与する。
やはり、XはA又はGであり、YはC又はTであり、−は欠けたヌクレオチドで
ある。これら16ヌクレオチドについて実質的な程度の一致が存在し、その8個
は100%の一致を示し、そして9番目の“X”はA又はGのいずれかである範
囲で一致する。これら9ヌクレオチドには底列にアンダーラインが付されており
、共通コアー領域のヌクレオチドを示す。
小文字スクリプトで示されたタンデム反復配列の残基が共通コアー領域の縁に存
在する。各反復コンセンサスの始/終端が記号マにより特定され;λ33.4及
びλ33.15の場合には非−整数の反復が存在し、そしてそのために別々の反
復開始及び終端が異る記号で示されている。共通コアー領域は複雑な分析によっ
てのみ同定され得たことが認識されよう。
なぜなら、これはしばしばλ33−陽性断片の1個のコンセンサス配列に全体と
して属さず、そしてミオグロビン遺伝子33bP反復の2個の連続する配列にま
たがるからである。
この発明の範囲内にあるものとして定義されるポリヌクレオチドとの一致の程度
を説明するため、種々の決定要素を次の第1表に示す。
(4)多−型性」ヨトニゲノー表耽Nムー脈片涛j個次p区33二」味性世り矛
4とブ」巳−:ブーζ−の、Aイニ4.ジノζ−イ二虻−二−クーしン」ごよ−
チー複街委−tbJL不、:、、4s−y発甚第2図に関し、英国系ニーカサス
人(1〜6)の無作為サンプル及び大きな英アジア家系(7〜18)の選ばれた
構成員から採取された白血球からDNAを調製した。血統は便宜上男性を示す正
方形、女性を示す円形、及びこれらの間の線による結婚により示される。いとこ
間の2件の近身結婚を両親間の2木線で示す。DNAの10ugのサンプルをH
4nfIで消化し、20em長の2%アガロースゲルを通して電気泳動し、その
場で変性し、そしてプロッティングによりサルトリウス(Sartorius)
ニトロセルロースフィルターに移した。
単鎖の32p−ラベル化ハイブリダイゼーションプローブを、ミニサテライト(
クンデム反復)領域を含有するM13組換体から調製した。使用した正確なプロ
ーブは後で記載する。
手順は次の通りとした。約0.4μgの単鎖DNAを4ngのツクーマー配列決
定プライマー団ル、Dock匈orth等、NucleieAcids Res
、 9、1691−1706(1981))と、10ttlの10mM1’1g
cff2 、’10+nM Tris−14Cj! (pH8,0)中で60℃
にて30分間アニールした。プライマー延長を、16μ2の80uM dATP
、 80 、ljM dGTP、 80 μM dTTP、 10mM Tri
s −11C!! (p)[8,0) 、0.1mM EDTA及び3 pE
(30u C3)ir −”P −dCTP(3000Ci mmole−’)
及び1.crj?の5ユニツトμl −’ Kleno−断片(ベーリングー)
を添加し、そして37℃にて15分間インキュベートすることにより行った。延
長は2.5ttl!の0.5 mMdCTPを添加しそして37℃にてさらに1
5分分間上−リンク(chasing)することにより完成した。
じチェーリンク” (Chas ing)とはM13ss D N Aの鋳型上
にdsDNAの輪を完成するためにdNTP混合物苓添加rることを意味する。
DNAを、挿入部中又は挿入部に対し7て遠位のM13ポリリンター中の適当な
制限エンドヌク!/ア・−上部位において開裂せしめ、1/10容量の1.5
M Na11(、0,1M DKTAを添加することにより変性し、そしてプラ
イマーから伸びる32p−、ラベル化単鎖DNA1tlr片を1.5%低融点ア
ガロースゲル(シー・プラク)による電気泳動によって回収した。切り出された
バンド(比活性> 109CpH1/、!jg DNA)を1mgのアルカリ奪
取(sheare) シたキャリヤーヒト胎Qi D N A(0,3MNa0
14、20 mM EDTA中で100℃にて5分間奪取し次にH(Jにて再中
和)の存在下で100℃にて溶融せしめ、そL7てハイブリダイゼーションチャ
ンバーに直接加えた。キャリヤーDNAはまた反復DNA配列へのその後のハイ
ブリダイゼーションを抑制するためにも役立った。
使用した正確なハイブリダイゼーションプローブは、(A)33.1、ミニサテ
ライト(62nt配列の26反復−1612nt) +約360n tのフラン
テングヒトDNAを含む約2000ntサブクローン化Haelll断片; (
B) 33.4、2015nt)fin f I断片中に含まれるミニサテライ
トのプライマー近位側の695n を非−ミニサテライトEcoRI断片;及び
(C、D 、 E) 33.15 、λ33.15ミニサテライト配列(上に示
した共通コアー領域から平均2ヌクレオチド異る、16nt配列の29反復)
+128ntフランキングヒトDNAを含む592n tサブクローン化断片、
であった。A、J、 Jeffreys等、Ce1121、555−564(1
980)により記載されているようにしてハイブリダイゼーションを行った。
但し、バンクグラウンドラベル化を低くするためデキストランサルフェートを6
%(W/V)ポリエチレンゲルコール6000により置き換えた。フィルターA
及びBを0.5 xssc中で65゛にて一夜ハイブリダイズせしめ、そして6
5℃にて0.2XSSC中で洗浄した。フィルター〇−Eはハイブリダイズせし
め、そしてIxssc中で65℃にて洗浄した。フィルターを固定したタングス
テン酸強化スクリーンを用いて一80℃にて1〜3日間オートラジオグラフ処理
した。
第2図に示すように、反復コアープローブ33.15は且inf■で消化された
ヒトDNAにおいてハイブダイズする断片の極めて複雑なプロフィールを検出し
た。最大(4〜20knt)助fI断片のみが十分に分離され得、そしてこれら
はハイブリダイゼーションプロフィールが固体特異的DNA“指紋″を提供する
程度に極度の多望性を示した。
血統分析は、いとこ結婚の単一の血縁関係(第2図の16〜18)の間でさえ、
すべての個体が識別され得る程の、極度の多望性の多様性を確認した。第2図中
の家族<D、E)は、大Hinfl断片のほとんどが各親から子孫のいくらかに
のみ伝達されることを示し、これによって、これらの断片のほとんどかへテロ接
合状態で存在すること、及びこれらの大きな超可変断片のへテロ接合性は100
%に達しなければならないことが示される。これに対して、子孫中のすべての断
片は一方又は他方親に起因せしめることができ(唯1の例外を伴って)、そして
それ由に1セントの安定に遺伝される遺伝マーカーを提供する。特異的に父から
むすこに、又は母からむすめに伝達されるバンド屯奏モ犬、 (フィルターD、
第2図を参照のこと)。これはそれぞれY及びXリンケージを除外し、そしてこ
れらのミニサテライト断片が主として常染色体に由来することを意味する。これ
らのDNA断片が常染色体のセット中のどこに由来するかはまだ知られていない
が、これらは1つの常染色体の単一の領域に由来するのではない。そうではなく
、子孫中で独立して分離する親断片の対が同定され得る(フィルターD、第2図
を参照のこと)。正確には、少なくと61のAB又は−一子孫が存在すれば、1
方の親における(そして他方から欠けている)1対のバンドABは対立遺伝子的
ではあり得ず; A−又は−3組換子孫の存在はさらに、A及び8間の密接なリ
ンケージの欠如を確立する。第2図り中に示される家族のもとのオートラジオグ
ラフの注意探し)検討は、それらの規準により、母における少なくとも10個の
分離可能なバンドを示し、その内の8個は相互に非対立遺伝子的であり、そして
密接にリンクしていない。他の2個のバンドはそれぞれ8個の非リンク断片の1
つの対立遺伝子であるかもしれず、ここで八−及び−B子孫のみが分析される子
孫の限定された数においてのみ観察され、但しこのような少数のサンプルは、こ
のような断片対が単一遺伝子座の対立遺伝子であることを証明するには十分でな
い。
結論として、コアープローブは、少なくとも幾つかの非すンク超可変遺伝子座上
で同時に有用な情報を与えることができる。この結論は例8においてさらに詳細
に検討される。
他方、他の2つのプローブ(フィルターA及びB、第2図)は、この発明に従わ
ず、1個又は2個のバンドを与えるに過ぎず、そして多くの異るβ型性領域を同
時に検出することができず、そしてそれ由に一般的診断に用いることができない
。
班又
ヒトDNA の たなセントの口可・令すを lJ るためのプローブ の゛
■の゛づ (コアー)のクローン化λ33−陽性断片λ33.5及びλ33.6
に由来する他の2つのプローブを例1、段階(4)と同様にして調製した。
33.5プローブはM13mp8中にクローン化された308nt D N A
断片から成りそして上記のコンセンサス配列の14反復を含んで成り、これは7
0ntフランテングヒトDNAと共に共通コアー配列の17nt長の変形体であ
る。33.610−ブは18反復の37nt配列を含み、今度はこの配列は共通
コアー領域由来の約12ntの短縮配列の3反復+その5′−末端における追加
のTCを含んで成る。18 X 17nt反復ブロックは97ntヒトDNAに
挟まれていた。37nt配列の構造は次のように表わすことができる。
TGG AGG AGG GGC
TGG AGG A−G GGC(又はTGG AGG AGG G−C)TC
CGG AGG AGG GGに
のプローブは同様にしてM13mp8にクローン化された。
後の記載において、1intコンセンサス配列AGGGCTGGAGGがこのプ
ローブのために与えられる。
両プローブを32pによりラベルし、そして例11段階(4)と同様にして14
の親類関係にない白人のパネルからのヒトDNAにハイブリダイズせしめた。両
プローブは複雑な1セツトのハイブリダイスする断片を検出し、その多くは極度
にβ型性の変化を示した。33.5により検出される幾つかの断片は新規であり
、そして33.15コアープローブによっては今まで検出されていないものであ
る。33.6プロープはほとんど完全に新しいセントのミニサテライトを検出し
、そしてこれらの正しいうけ継ぎが血統分析により証明された。(例8を参照の
こと)。
次の例はこの発明をさらに説明しそして例示する。
サンプルDNAの消化は好ましくは、ヌクレオチドの4塩基対を認識する制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて行われる。
最も長い超可変断片についてのDNA指紋パターンが使用される4bp認識制限
エンドヌクレアーゼから太き(独立していることが見出された。このことは、こ
れらの大断片がより長いミニサテライトに由来するのではなく、そしてそれぞれ
が、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を欠きそして正常な高密度の4bp開裂部
位を含有するヒ)DNAに挟まれた完全長の均一なミニサテライトを含有するこ
とを強く示唆する。これは、これらの大ミニサテライト断片のほとんどがリンク
しておらずそして独立して血統中に分かれることを示す前記の例及び例日におい
て示される結果と一致する。
好ましい態様においては、DNAのサンプルを、2つの異る指紋をもたらす別々
のハイブリダイゼーションにおいて、2つの異るプローブ、例えばラムダ33.
15及び33.6断片からのプローブを用いて、二重指紋採取する。2人の無関
係の個体が同じ指紋を有する、すでに低い確率が、この手段によりさらに低下す
る。例えば、例4は、好ましくは4kb末端の長さの不完全に分離するハイブリ
ダイズDNA断片が無視される場合でさえ10−19という低い確立を示す。
この発明は父系試験の方法を含む。子におけるβ型性ミニサテライト断片の約半
分が父に由来し、そしてこれらの父系断片は母及び子のDNA指紋の比較により
同定することができる。これらの父系断片のすべてが通常父のDNA中に存在す
るであろう。プローブ33.15及び4kb以上の長さのDNA断片を用いて、
仮定の父が子において典型的に同定される6つすべての父系特異的DNA断片を
偶然に有する確率は10−’のオーダーであり、そして両プローブ33.6及び
33.15の使用はそれを10−sのオーダーに低下せしめることが予想される
。
当然、正確な確率は正確な分離及び得られるDNAパターンの複雑さに依存し、
そして4kb未満の長さの追加の父系断片が分析され、又は第3のプローブが用
いられれば、改善されるであろう。
DNA指紋のため、1滴のヒト血液から十分なりNA(0,5〜5マイクログラ
ム)を迅速に単離することができる。
そして、そのDNAがすでに指紋採取されている2人+2人の姉妹を含む個体の
無作為パネルからDNA指紋が作成された。2人のあらかじめ特徴付けられた個
体はDNA指紋比較に基いて容易に且つ明瞭に同定することができ、実質的な数
のミニサテライト断片を共通に有する2人の姉妹も同様であった。
DNAは所与の個体の種々の細胞から採取することができ、すべて同じ指紋を与
える。従って***及び血液DNAについてDNA指紋は識別されず、−卵性双生
児のパターンも同様である。さらに、血液DNAのDNA指紋と、同じ個体に由
来するエプスタイン−バールウィルスで形質転換されたリンボブラストイドセル
ラインから単離されたDNAとの比較により示されるように、パターンは培養細
胞においても維持されるようである。
この発明を適用することができるヒト以外の動物にはほとんどの哺乳類、鳥、両
槽類及び魚が含まれる。例えば鶏、ハムスター、ラビット、マウス、スズメ、マ
グソダカ、カエル、イモリ及び魚である。鶏の場合、ハイブリダイズするDNA
断片の非常に複雑な不鮮明な部分が生成した。Haemによる消化が“明瞭”な
指紋を残して不鮮明部分を除去した。従って、鶏のDNAはまた、その反復単位
が1又は複数の且aem開裂部位を含有する長いコアー含有サテライトを含有し
、従ってHaelI[による開裂が、DNA電気泳動中にゲルの底部に泳動除去
される非常に小さいDNA断片にこのサテライトを縮小すると考えられる。時お
り、他の動物が不鮮明なバンドを生成し、そしてこれらは、一層長い断片を開裂
せしめる適当な酵素により4)NAが消化される場合、分離可能となるであろう
と考えられる。
次の追加の例において、温度は°Cである。
例−亀
A、J、Jaffreys、 Ce1118−11−L O(1979)により
記載されているようにして新鮮なヒト胎盤からDNAを中離した。3つの個々の
胎盤を使用し、1〜3と標識した。I)NAの8マイクムダラムのサンプルを、
完全消化を助けるため4mMスペルミジントリクロリドの存在下でHinfl及
び/又はΣ憇3Aで消化し、フェノール抽出後にエタノール沈澱により回収し、
そして20cm長の0.6%アガロースゲルを通して30Vにて約24時間、1
.5 kb長未満のすべてのDNA断片がゲルから泳動除去されるまで電気泳動
した。次に、DNAをプロッティングによりサルトリウム−ニトロセルロースフ
ィルターに移した。高圧活性(109epm” P /マイクログラムDNAよ
り大)単鎖M13DNA、プローブを例1、段階1に記載されているようにして
調製した。使用された正確なプローブは=(a) λ33.5ミニサテライト(
17ntX14反復)のほとんど十約60ntフランキングヒトDNAを含んで
成る、M13mp8のSma■部位にサブクローニングされた、220ntHa
eIII D N A断片から成る33.5プローブ;(b)ミニサテライト+
約50ntフランテングヒトDNAから成る、M18mBのΣ=X部位にサブク
ローン化された、720n を且aelll断片から成る33.6ブローブ;及
び(c)例1、段階(4)と同じ33.15プローブ(これは、ミニサテライト
+128ntフランキングヒトDNAを含む、Pst I + Sm5−1で消
化されたM13mp19 D N A中にサブクローン化された、599ntP
st I −AhalII断片である)であった。
サザンブロソトハイブリダイゼーション及び洗浄は、Ixssc中で65℃にて
、例1、段階(4)においてフィルター(>E!7ついてずでに記載し7たよう
にして行った。フィルターを、室温にて強化スクリーンを用いないで4日間オー
トラジオグラフ処理した。
各プローブは異る断片パターンを生成し、その複雑さは使用されるテI・ラヌク
レオチド制限エンドヌクレアーゼ゛から大いに独立である。第3図は得られたパ
ターンを示す、dkb長未満の多形性断片の分離はHi+BfI+〜S」旦3A
による二重消化において改良され、これは、1又は複数の反復単位内に蓄積され
た一達u3A開裂部位を有する比較的分かれたそして不変の且1nflミニサテ
ライト断片によりおそらく生ずるバンクグラウンドハイブリダイゼーションの除
去に基く。二重消化においては、プロ・−ブ33.15により検出される分離可
能な多望性断片の数は、はとんどの又はすべての単復争位中に盈憇3A開裂部位
をおそらく含有する長い阜消化化ミニサテライl−断片の約20%を失うという
犠牲において、個体当り約15から約23に増加することができる。
u−
20人の血縁のない英国の白色人種の無作為抽出試料か1″)採取したヒト血液
DNA8マイクログラムの試料を1釦f 1で消化し、例3に記載したミニザテ
ライトブローブ33.6又は33.15を用いてサチン法によりハイブリッドを
形成した。各DNAの指紋(個体A)を隣接ゲルトランクにおけるパターン(個
体B)と比較し、Bには明らかに存在しない、Aにおけるバンドの数及びBにお
番、)るほぼ同じオートラジオグラフ強度の同時泳動対応部を有するバンドの数
を記録した。下記の表に示した結果は、すべて対での比較に関する平均値である
。Aにおける夕景(約6%)の付加的な弱いハイブリッド形成断片は、Bにおけ
る強いハイブリッド形成断片と一致した。このような場合には、Aにおけるバン
ドがBにも存在するか否かを決定することができないので、このような断片を無
視した6A及びBにおける同時泳動バンドが、常にLQミニサテライト座の同一
対立遺伝子である場合には、Aにおける対立遺伝子がBにも存在する平均確率X
は、=2(1−qZ、従ってq=1−(1−x)”2によって平均対立遺伝子頻
度(同型接合性)qに関係する。実際、A及びBにおける同時泳動バンドの(未
知)割合は、異久エミニサテライト座から偶然に誘導され、従って平均対立遺伝
子頻度及び同型接合性の概算値は最大であり、ミニサテライト断片の電気泳動分
離に左右される。
第1表に示した確率は、示したDNAの個々のサイズ断片に関するものである。
指紋の最も読みやすい部分、すなわち、大きさが4kb以上のすべてのDNAに
関する全体的確率を得るため、3個の数値を組合せなければならない。例えば、
個体A中のプローブ33.15によって検出されるすべての断片がBにも存在す
る平均確率は0.OB”・’ Xo、20’−’ Xo、276−’ =3 X
10−目である。Aにおける2種のプローブ33.15及び33.6によって
検出されるすべての断片がBにも存在する確率は、5 X 10−”である。
第2表
33.610−202.8−’:1.OO,110,066−105,1±1.
3 0.18 0.094−6 5.9±1−6 0.28 0.1533.1
510−202.9 ::i、o O,080,046−105,1±1°1
0.20 0.114−6 6.7±1.2 0,27 0.15形
この例は、DNA指紋の体細胞安定性及び父子鑑別への用途を説明するものであ
る。
EBウィルスによって形質転換され、液体窒素中に貯蔵されたリンパ芽球細胞系
統を2年後に液体培養で再び株化した。
これらの培養したリンパ球を住理食塩液で2回洗浄し、リンパ球ベレット及び白
血球からのDNAをA、J、JcffreysによってCe11.18巻1〜1
0 (1979)に記載されようにして製造した。***から集めた***を、SD
Sで溶解する前に、室温で5分間IM2−メルカプトエタノールで処理した以外
は同様にして***DNAを製造した。HlnfIで消化し、プローブ33.6(
a)又は33.15 (b)でハイブリッド形成したDNAの5マイクログラム
の試料を使用して例3に記載したようにしてDNA指紋を製造した。
i汁1
この例は、種々のを椎動物のDNAにおける極めて多形の領域を検出するための
本発明のプローブの使用を説明するものである。
鶏、すずめ及びちょうげんぼうから採取した血液、うさぎ及びマウスの肝臓、ヒ
トの胎盤並びに蛙及び魚の消化管を除去した死体からDNA試料を製造した。8
μgのDNA試料をHinflで消化したが、鶏のDNAについてはHinfl
で消化した。制限消化物を0.6%アガロースゲルを通して電気泳動し、変性し
、サルトリウス(Sartorius)ニトロセルロースフィルターに転移させ
、ヒトミニサテライトプローブ33.15を用いて前記のようにしてハイブリッ
ドを形成した。
ハイブリッド形成の厳格さは1xssc中で65℃であった。
結果を、下記の試料について第5図に示す。
1.2 :血縁のないヒト胎盤DNA
3 :アラスカ及びウィーンホワイト種のF1ハイブリッドからのウサギDNA
4 :アラスカ種からのウサギDNA
5.6 :野性で捕獲された2匹のギリシャマウスからのマウス(Mus mu
sculus) DNA7 :近交系DBA−2からのマウス(Mus mus
culus)NA
8 1近交系C57/BLIOからのマウス(ル捷−rnuscu1us) D
N A
9.10:鶏DNA :注、DNAを1憇■で消化した。
11.12:すずめDNA
13.14.15.:ちょうげんばうDNA16.1’7:蛙(Xenopus
tropicalis) D N A18.19:小魚DNA
試験したほとんどすべてのを椎動物から有効な種々のDNA指紋が得られ、明ら
かにヒトDNA指紋と同程度に情報を与えることが判る。
また、Hinflで開裂したニワトリDN’Aは、ハイブリッド形成成りNAの
あまり強くないが、極めて複雑な不明瞭部分く図示せず)を生じた。しかしなが
ら、HaeII[で消化すると、この汚点は除去され、きれいな多形指紋パター
ンを生じた。
2つの近交系のマウスは、野性マウスより簡単な指紋を有する。これは、野性で
は、はとんどの超可変ミニサテライト座が異型接合性であるが、近親交配すると
、同型接合性であり、近交系ではハイブリッド形成りNA断片の数を半減するか
らであると考えられる。
下記の例は、前記の特定のプローブの適用を更に説明するものである。
例j−
この例では、従来の遺伝的方法では、解決が不可能ではないにしても、極めて困
難であった移民の場合へのDNA指紋分析の使用を記載する。
この事例は、英国で生まれ、父親と再会するためガーナへ移民し、その後、母親
、兄弟及び2人の姉妹と再び一緒になるためため一人で英国へ戻ったガーナ人の
少年に関する。しかし、そこに、血縁のない少年又は全員がガーナで生活してい
る母親の姉妹のうちの一人の息子とすり換えが起こったことを示唆する証拠があ
った。その結果、帰国する少年は、英国への居住を許oJされなかった。その家
族の弁護士の請求により、少年の母親を決定する分析が行われた。事を複雑にす
るので、父親も、母親の姉妹も分析に利用されなかった。更に、母親は、少年が
彼女の息子であることを確信していたが、彼女は息子の父親については確かでな
かった。従って、家族の利用しうる人員(母親M、兄弟B、姉妹S1及びSl並
びに問題の少年X)から採取した血液DNA試料からのDNA指紋を、それぞれ
、ヒトDNAにおいて超可変ミニサテライトの異なる組み合わせを検出する、前
記の2種のミニサテライトプローブ33.6及び33.15に対するサザン法に
よるハイブリッド形成によって製造した。
母親(M)、問題の少年(X)、彼の兄弟(B)、姉妹(S11.Sl)及び血
縁のない個体(U)からの血液DNAの8μgの試料をHinflで消化し、0
.7%アガロースゲルにより電気泳動し、プローブに対してサザン法でハイブリ
ッドを形成させた。オートラジオグラフを第6図に示す。母親(M)のDNA指
紋に存在する断片を短い水平線で示す。Mには存在しないが、問題となっていな
い同胞(B、Sl、Sl)の少なくとも一人に存在する父性断片は、長い線で示
されている。Xに伝達された“母性”断片及び父性断片は、点で示されている。
XのDNA指紋は、付加的分離断片を含まない。種々の照射で取ったオリジナル
オートラジオグラフからすべての断片を記録した。確実には記録できず、特にゲ
ルの底部に向かう、部分的に分解された、比較的に弱いバンドは無視した。
第一工程は、超可変断片のパターンからXの父性を確定することであった。父親
を利用できなかったが、彼のDNA指紋の大部分は、3人の問題になっていない
同胞(BS31、Sl)の少なくとも一人に存在するが、Mには存在しない父性
異性DNA断片から再構成することができた。こうして同定された39の父性断
片のうち約半分が、XのDNA指紋に存在した。DNA断片は、血縁のない個人
のDNA指紋(第6図における個人U参照)の間で共有されるのは希であるので
、これは、XがB、Sl及びSlと同一の父親を持つことを極めて強く示唆する
。これらの父性異性DNA断片を除外した後、Xには40個の断片が残りそのす
べてがMに存在していた。このことは、MがXの母親であり、従ってX、B、S
】及びSlは真実の同胞であることを強く証明する。
−人の人のDNA指紋における断片が無作為に選択した第二の個体中に存在する
平均確率は、北口−0フパ人では約0.2であることは、既に上記した。父及び
Mに関する対応する数値は0.26であり、これらのガーナ人におけるDNA指
紋変異性は、北口−0フパ人のそれと有意には異ならないことを確定する。下記
の確率概算において、すべてのバンドが0.26の均一な確率で共有されるとい
う極めて控え目な仮定を行う(以下に、数量化する)。
第−の問題は、Xがこの家族の血縁であるか否かである。
Xのr)N A指紋は、61の記録可能な断片を含み、そのすべてがM及び/又
は父親に存在する。Xが血縁を有しない場合には、彼のバンドのそれぞれがこれ
らの両親に存在する確率は、1− (1−0,26)” =0.45である。従
って、M及び/又は父親がXのバンドの61全部を偶然に有する確率は、0.4
5”=7X10−”である6Xは、明らかにこの家族の血縁である。
次の間頭は、Mでない、曲縁のない婦人がXの母親でありうるか否かである。X
のDNA指紋は40の゛母性”断片を含み、そのうち、われわれは約25が特に
母親から受け継いだものと評価している。残りの断片は、母親、と父親との間で
共有され、従ってMの母性についての証拠を挙げるため使用することはできない
、Xにおける25の母性異性断片はずべて、Mに存在L7ている。MがXと血縁
でないが、25の断片をすべて共有する機会は、0.26”= 2 X 10−
”である。従って、X及びMは血縁を有し2なければならない。
最後の、最も困難な問題は、分析に利用されなかったMの姉妹がXの母でありう
るか告かである(父親はもちろん、Mの夫でなければならない)。バンドが0.
26の平均確率で任意の人に共有される場合、−人の人の断片が同胞にも存在す
る対応する可能性は0.62である。MがXの真実の母の姉妹であり、偶然Cご
Xの母性異性バンドを25個すべて含む可能性は、従って、0.62”= 3
X 10−’である。従って、われわれは、なんら合理的な疑いをいれる余地も
なく、MはXの真実の母でなければならないと結論する。この証拠を、移民当局
に提供したところ、当局はXに対する論争を止め、彼の英国居住を許司し、彼が
彼の家族とともに残ることを許した。
この困難な事例は、D N A指紋が6重要な家族の人員が見つからない場合で
さえ、親族関係の明白な積極的証拠を与λることができることを示す。この事例
は、Xが彼の同胞と同じ父親を有し1、この父親がXにだけ伝えたバンドはなか
った(平均して、1/16の父性バンドが伝達される)という事実乙こよって簡
素化された。、“−のようなXに独特な断片は、XとMとの親族関係に関する証
明を明らかに弱めるが、実際には、必ずしも分析を無効にするものではない、X
は25の母性異性断片の他に、このような父性断片を5個より多数有するとは思
われない、XとMlご血縁関係がない場合又はMがXの叔母である場合に、30
の特定のバンドのうら少なくとも25(1ffiがXとMとで偶然に一致する可
能性は、それぞれ8×10−”及び9X10−’である。従って、この分析は、
強いものであり、このような事例のほとんどにおいて主張された親族関係を肯定
又は否定する明白な証拠を与える。通常は、もちろん、家族の関係者の全員を、
例えば父親論り弓こ父C1!、移民によって家族が再び一緒になるのが困難な場
合に、利用できるであろう。DNA指紋は、はとんど常にこのような問題を解決
することができる。
−pN〜へ指紋p−数更化
父親から特異的に安心3継いだ断片が39個であるのに対し、Mには61のD
N A断片が記録されていた。父親の異型接合性DNA断片の1/8はB、Sl
又はS2に伝達されておらず、従って父性異性断片の数に対する補正値は、39
X8/7=45である。、M及び父のDNA指紋における断片の総数はほぼ等し
いので、父の共有する、Mにおける断片の数は、約(6m−45)=16である
。M及び父親におけるバンド共有の平均確率Xは、従って、16/61 =0.
26であり、北ヨーロッパ人の無作為試料をスクリーニングすることからめた予
備概算値と一致する(x−0,2、対照2)。
45の父性バンドの約半分は、異型接合性バンドについて予測されるように、B
、Sl及びs2に(それぞれ18゜24及び18個)伝達された。Mのバンドの
若干が父親にも存在し、従って子供のほとんど又は全員に伝達されていることか
ら予測されるように、Mの61のバンドのうち、半分より多くがB、Sl及びS
2によって(それぞれ32.38及び39個)受は継がれた。MのDNA指紋が
子供全員に伝達されたn (j?tlの共有バンド、及び半数の子供に伝えられ
た(61−n)個の異型接合性バンドを含む場合には、n + Q。
5 (61−n) =36.3であり、n=12の場合、M及び父親に共通の1
6個のバンド(上記参照)の概算値と一致する。
XのDNA指紋は、21の父性異性断片と40のMと共有するバンドからなる。
母性異性であり、父と共有でない後者のバンドの割合は、2つの方法で算出され
る。第一に、母性異性バンドの数は、父性異性の数とほぼ等しく 45/2 =
22.5である。第二に、Xにおける4oの母性バンドのうちn個(約12)は
、共有の母性/父性バンド(前記参照)であり、X乙こ2Hの母性異性バンドを
残す、Xが彼の母親から特異的に獲得し7た断片の数は従−2で、約25である
。
イΣン ドー共−イ1−92−廊定率
14’t111人にナタける断片が第二の任意の人における同様な電気泳動分離
変及びオートラチジオグラフ強度のバンドによって一致する平均確率は、x (
x = 0.2−0°26、前記参照)と定義さh、る。ミニサテライト断片が
大きい程、恐らく、対立遺伝子頻度が低くなり、電気泳動分離が良くなるので、
共有される頻度は少なくなり、従って断片共有確率Xは不均一である。はとんど
すべtの断片は、独立して受け継がれるので、4+ld人におけるn個すべての
断片が第二の任意の個人に存在する最高確率は、従って、xnである。Xにおけ
る不均一性は、この確率を低下する。
U賂、田トリノ達ン!u1カー有
共有されるバンドが、常に、同じ超可変座の同一の対立遺伝子を表す場合には、
Xはx”1q−q”によって平均対立遺伝子頻度qに関係し、これにより個人に
おける所定のバンドが同胞にも存在する確率は(4+5q−6q” +q’ )
/4(2−q)であることが示される。
X =0.26であるから、qは0.14であり、記録により共有されている、
第一の同胞に存在するバンドの割合は、0.62である。この確率は、任意の人
によって共有されるバンドが決して同一の対立遺伝子でない、即ち、多数のミニ
サテライトが同一の大きさの対立遺伝子を有すると仮定すると、僅かに低下する
。
遺伝監q分所公1匹ひりりいえ9道里
ヒトにおける連鎖分析、特に、大きい家系における病気の座と一緒に分離される
超cIJ変DNA断片の研究のため、DNA指紋を使用する可能性を測定するた
め、2つの大家族のDNA指紋を調査した(一方は神経線維腫瘤に関して分離し
、他方はβ〜グロビン遺伝子集団に連鎖しない常染色体優性遺伝子によって明ら
かに測定される胎盤ヘモグロビンの遺伝的残存に関して分離した)。
勇1
頃1に した西 群のDNA1″′ におけるd可崖ユ三」jゴヒL目り虹悲分
離
1旦flで消化した血液DNA試料を長さ35■の0.7%アガロースゲル上で
電気泳動し、ミニサテライトプローブ33.6及び33.15に対してサザン法
でハイブリッドを形成させた。罹病していない父親(F) 、5人の息子(S)
及び6人の娘(D)について、DNA指紋を第7図に示す、罹病した母親は研究
に利用しなかった。多数の神経線維腫にかかった子孫は(+)で示し、残りの子
孫は、神経線維腫瘤の敞候を示さなかった。分離した父性(・)及び母性(0)
異型接合性DNA断片を示し、短期間、中期及び長期照射でとったオリジナルオ
ートグラフから直接、子孫への分離を記録した。
それぞれの子孫における位置及び相対的強度が両親のものと一致するDNA断片
だけを記録した。AB又は−一を子孫に分離するDNA断片の連鎖対ABは、連
続線によって結合されている。A−及び−Bを分離する対立遺伝子は点線で結合
されている。神経線維腫瘤に対する相引状態での連鎖の証拠を示す一つの母性断
片は、星印で示し、罹病した6人の子孫全員は、この断片を受け継ぎ、罹病して
いない子供5人のうち4人はこのバンドを持たず、このバンドの遺伝と神経線維
腫瘤との間に10/11の一致を生じる。
林料及互方丈
旦Σ人皇岨
新鮮な血液を等容量の1 xSSC(SSC、クエン酸ナトリウム食塩水、0.
15MNaC1,15mMクエン酸三ナトリウム、pH7,0)、ヒストベーク
(Histopaque−1077) (Sigma)上に積層し、遠心分離に
より有核細胞を集めた。或いは、凍結した血液を二倍容量の1xssc中で解凍
し、10.000gで15分間、遠心分離することにより有核細胞及び核をベレ
ット化した。Jeffreys;A、J、著、(1979)、Ce11、土工、
1〜10に記載されテいるようにして高分子量DNAを製造した。
サザン法によるノ
ヒトDNAの試料5μgを4mMのスペルミジントリクロリドの存在で20単位
のHinfIを用いて37℃で2時間消化し、フェノール抽出及びエタノール沈
殿によって回収した。
制限消化物を16μlのuzo+4μrのゲル負荷混合物(フィコール4001
2.5%、ブロモフェノールブルー0.2%、トリスアセテート0.2M、酢酸
ナトリウム0.1 MSEDT^ 1mM、p)l 8.3 ”)及び、5mg
/ nj!エチジウムプロミド2μ!中に溶解し、水平アガロースゲル(トリス
アセテート40mM、酢酸ナトリウム20mM、EDT^0.2mM、エチジウ
ムプロミド0.5.crg/ ml (pH8,3)中の0.7%シグマ(Si
gma) I型アガロース、厚さ0.7 cm X長さ20cm又は35印のゲ
ル)上に置いた。
10分間平衡化した後、長さ1.5kb未満のDNA断片すべてがゲルから電気
泳動するするまで、2V/amで24〜48時間ゲルを電気泳動した。ニトロセ
ルロースフィルター(Sart−OrlLIS %孔径0.45μm)上にプロ
ンティングさせることによりDNAを転移させた。ヒトミニサテライトM13組
み換え型33.6及び33.15から、32pでラベルした一本鎖プローブDN
Aを製造し、1xssc中で65℃でサザン法によるプロットに対してハイブリ
ッド形成をし、腫瘍用途に記載したようにオートラジオグラフィする。
i二文光梶
BBCモデルBマイクロコンピュータ−に分離データ及び連鎖の分析を記憶させ
た。
第2表には、神経線維腫瘤の家族におけるミニサテライト標識をまとめる。
第3表
父親 母親
プローブ 邸、6 33.15 翌、6 33.15記録された断片数(n)
24 17 16 16対立遺伝子対の数(a) 3 3 2 4連鎖対の数(
b> 1 0. 1 0
記録された種々の座
の数(C) 20 14 13 12
概算の総座数(N) 43 23 27 16記録された種々の座の数(c)は
、n−a−bによって得られる。未分離、従って未記録の断片を含むDNA指紋
全体を、N個の異型接合性座(2N断片)から誘導する。記録された(n−b)
の明らかな断片がDNA指紋における2Nのバンドの無作為試料であると仮定す
ると、所定のプローブによって検出される超可変声の概算の総数Nは、下記の式
により対立遺伝子対の数に関係する:
(以下余白)
第4表神経線維腫瘤の家族における
(た7トAしWJf:: 53.0:!:2.4%5超可変断片の分離
47.7±2.7%
超OJ変断片の伝達頻度(第7図)を研究するため、11人の同胞における正確
に1人の子供に伝達され、記録されたn個のうち、プローブ33.6及び33°
15によって検出される断片の数を、伝達率50%(第4表)と仮定して、二項
分布に存在する断片は同型接合性座からのものであってよ(、無視された。どの
子供にも伝達されなかった母性断片は7、母性DNAを利用できなかったので、
記録できなかった。平均伝達頻度(+3.2.M、)も得られる。
最初に除外された対立遺伝子及び連鎖したバンドを有する父性又は母性断片の可
能なすべての対での比較を使用して、AB (AB又は−−)に関して一致する
子孫の数を記録することによって断片の対ABの間の連鎖を調べた(即ち、C座
を各両親について分析した。第3表参照、c(c−1)/2の対照比較を得る)
。0又は11人の子供群中に現れる断片の対は、それぞれ対立遺伝子又は緊密に
連鎖した対を表す。
定義により、対はどの群にも属さない、観察された分布をC座のすべてが連鎖さ
れていない場合(U)の予測値と比較する。この場合、正確にr(AB又は−一
−)の子孫を与える対による比較の数は、二項分布
座が密集し・均一に離れており、隣接する座が組み換え頻度θによって分離され
ている(10.2o又は30cM離れている)場合に予測されるものと分布を比
較する。従って、集団は、(c−1)’Pffl華位〔式中、甲−−1/2 I
n (1−20)〕にわたって広がっているであろう、C座(一方又は他方の対
立遺伝子のところで無作為に抽出)に関して、11人同胞群中の正確にr (A
B又は−一)の子孫を生じる対にる比較の数は、下記の弐によ−9て得られる:
Σ゛“′
〔式中X、はi同車位離れた2個の座の間の組み換えフラクションであり、Xi
は間作製関数;
x 、−+ /ア(le −Z i 甲)によって得られる〕。
精
」λ−
この研究に使用する2種のミニザテライトハイブリッド形成プローブを、主な用
途で詳述する。プローブ33.15は、コア配列の16bp変異体が29反復し
て成るクローン化したヒトミニサテライトから成る。プローグ33.6における
ミニサテライトの反復単位は、コア配列の最も保存された11bp3’末端の種
々の三量体であり、18回反復される。コア及びブし1ブ反復単位の配列は、下
記のとおりである:A
コア GGAGGTGGGCAGGAGG33.15 AGAGGTGGGCA
GGTGG33.16 AGGGCTGGAGG
プローブ33.6及び33.15プローブの配列及び反復長における差異により
、ヒトDNAのHinfl消化物中の長い超El変ミニサテライト断片の異なる
パターンを検出することになるこの4bp制限エンドヌクレアーゼは、小さなフ
ランキングDNAを有するDNA断片における長い縦列−反復性ミニサテライト
を放出することによって種々のミニサナライ]・の分離を最大にする。
nJ且拉t3 ケルD N A J!# ■q分梶個々のミニサナライ1−DN
AltJi片の分離を調べるため、11人の英国人の大きい同胞群を神経線維腫
瘤〔レフタリングハウゼン(Reek 1 inghausen)民宿の〕、末
梢及び中枢神経系の腫瘍に伴う常染色体優性障害について分離した。遺伝的標識
形質は、まだ、この病気に連鎖されていなかった。
l】人の子供(6人は罹病、5人は未罹病)の、プローブ33.6及び33.1
5で検出される血液DNA指紋を、第7図において、かれらの未罹病の父親と比
較した。ミニサナライトDNA1tJr片の分離を、長さ35cmのアガロース
ゲルでの電気泳動によって最大にした。
これらの超可変ミニサテライトの多く、特に極めて大きいDNA断片は、低い対
立遺伝子頻度を有し、前記のように血縁のない個体には、はとんど受け継がれな
いので、神経線維腫瘤の家族におけるこれらの断片の多くは、異型接合状態で存
在し2、後代の若干の老乙このみ伝達される。罹病した母110)DNAを入手
できない場合でさえ、母に由来するミニサテライト
す い断片として容易C3−同定する、−とができた。父性断片も同様e Lこ
して同定することができた。ノ゛ローブ33,6及び33.15を用いて、この
同lIa群口、罠、昌lる41の父性DNA断片及び32の母性DNA断片の分
離(第7図、第3表)を記録する、”〉とがト、 できた。多数のイく1加的多
形断片も存在するが、ゲルから電で511 ゛泳動で除去さβ′)、るか又は不
完全に分離さ、!11、従って、錆実には記録できなかった。
この人きい同胞1!Y tこ、:;;けろづ“べての父性又は母性DNA断片の
分離パターンを対ごLl−較するごとによって1、断片の対立遺伝子対及び相中
状態での緊密な連鎖4示す対を同定することがでAる(この同胞群乙におけるバ
ンドの所定の対の同時分巽 離の可能牲は1/1024である)6父性及び母性
断片の対立遺伝子対の若干の例を、両方のプr)−ブで同定することができ一゛
だ(第7図)。また、ブl」−ブ33 、6は母親及び父親に断片の連鎖対を
検出した。同様な連鎖は、第二の家系(以下に示す)に見られ、これは、ブY1
−ブ33°6にハイブリッド形成する少\ なくと≠)1つの超可変領域が、−
5i−!1.fNに関する内部開裂部位を含み、従って、開裂して家系にナタけ
るミニサテライト“ハブロタイブ゛として同時に分離ずイ、2個以トの断片を生
じl る長いミニサテライト/′ザテライトであることを示唆する。
笛 プローブ33.15を用いY−記録した多形D N A断片は、33.6に
よって検出される断片の組み合わせには存在しなかった。両方のプローブにハイ
プリントを形成した、このような断片は、同じ親から同じ子供へ伝達されたく即
ち、′連鎖した”)等しい大きさのバンドとして検出されたであろう。従って、
これらの2種のプローブは、ヒトミニサテライトの木質的に完全に異なるサブセ
ットにハイブリッドを形成する。
対立遺伝子及び連鎖した断片を排除することによって、父親及び母親にそれぞれ
34及び25の明瞭な座が記録される(第3表)と結論された。座の約80%に
関して、2個の対立遺伝子の1個だけが分離され、第二の対立遺伝子は恐らく比
較的短いミニサテライト断片のあまり分離されていない複合体に存在する。この
ことは、恐らく、これらの縦列反復領域における等しくない交換によって起こる
、ミニサテライト対立遺伝子対に大きい差異が存在することを意味する。第7図
において確認された数個の対立遺伝子対は、実際に、実質的な長さの差異を示す
。対立遺伝子中に対合しうるバンドの割合から、プローブ33.6及び33.1
5によって検出される全DNA指紋に存在する異型接合状態の総数は、約43〜
66であると概算することができ、このうち約半数は父親及び母親に記録される
(第3表)。この同胞群における父性断片と母性断片との間の対立性を測定する
ことはできない。
記録された父性座のすべては、常染色体性であり、娘(X連鎖)又は息子(Y連
鎖)への特別な伝達を示さない。更に、父性DNA断片のすべての対ABは、明
らかに独立して子孫に分離して、平均して同数の(AB、−−)又は(A−1−
B)後代を生じる* 、、+tE確な数りよ、連鎖!−7ない座に関する予測さ
れる2IQ分布に従う。N、性D N A断片は同様な挙動を示した。更に詳細
に分析すると1、−れらの座に関する最小の座−陣間隔は、≦3 (lcM (
46図単位)“でなければならないことが判る。それより間陥が狭いと、同時に
分離(相中状態で連鎖)するか、又は偽対立遺伝子rと17で分離(相反状態で
連鎖)する傾向のある断片の対を相当数住しる(第4表)。従って、分離可能な
ミニサナライl−座ば、長さ3000eMのヒトゲノムの少なくとも半分にわた
ー、て広げられていなければならず、従っマ”、ヒトの常染色体の多数又は全品
にねたって散乱していなければならない。
一つの母性ミニサテライト断片(第71図)は、神経線維腫瘤との相中連鎖の弱
いfi+E拠を示し、10/11人の子供はこの断片及び病気に関し了一致j7
ている。(θ=10cM、p=0、006)。し7かしながら1.25個の箕な
る母性遺伝子座が記録さり、たので、これらの座の少なくとも1個の対立遺伝子
が、イル外C;:、!U月!、、、x鴛411−反欺慇での観察される連鎖度を
示す確率は、高い(p =0.24)ゎ
件亀
広−シフー家系q旦y9人、指紋−、、111817p lj今一11D−可−
能−ηす1鎖β−地中海貧血痙及び遺伝性高胎児ヘモグロビン血症(HP F
H)について分離するグジャラ・−ト人の広範な4世代家系にDNA指紋の分析
を広げた。
第8A図及び第8B図に示した標識分離パターンのオートラジオグラフを下記の
ようにして製造した。
血液D N Aの10μgの試料を一旦−1pflで消化し、プローブ33.6
(A )又は33.15 (13)を使用り、て、第7図に記載したよ・)に
U2てI) N A指紋を製造した。比較的短い(20cm)のアガロースゲル
で電気泳動を行った。ah1人の間の関係を第9図にボす。Aでは、超可変断片
a、b及びCは緊密に連鎖し、家系の各個人にすべて存在するか又はすべて存在
しない。Bでは、バンドg及びIIl’Fll (H)が同時に分離する。個人
■7及び■8は、−理性双生児であり、区別できないDNA指紋を有する。
材料及び方法は、例8と同じであった。 ”同時分離分析を第9A図及び第9B
図に示す。
第9A図において、■4からの30個の超可変断片及び■5からの27個の断片
の、子孫!111−11への分離を、両親の断片の対ABの可能な連鎖について
スクリーニングした。
少なくとも6/7の(AB、−m−)子孫を示す連鎖の可能な例を更にイ」加的
血縁関係で訓べた。2つの極めて明瞭な連鎖例を示す(a−f、個人における断
片a−fの存在;・断片不存在)。断片a−C及びe、fはそれぞれ完全な同時
分離を示し、断片dは、a−cと同時に分離する傾向を有するが、同胞IV 1
−4は、情報を与えず1.・−理性双生児■7.8は、遺伝したa−cを有する
が、dを有し7ない組み換え型である。
第9B図には、β−地中海貧血症形質(0、IF) 、H1’Fl((l()及
びミニサテライト断片gの遺伝を示す。個人が〉1%HhF(正常)又は〉3%
1bF(β−地中海貧血症形質)を示した場合、その(l/、1人は、II P
F Hを有するものと記録する。l P F H及びβ−地中海貧1flt症
形質は、III 1.−11及び■5−8に独立して分離1−、−1連鎖し、な
い座によって測定される。断片gば、試験した個人においてII 11 F +
1と完全61−同時に分離する。
枯−限
第9図A及び+3に示したように、II I)Fの上昇は、β〜地中海貧血症形
質とは独立して伝達され、明らかにβ−グロビン遺伝子墾団に連鎖していない常
染色体優性座によって測定される。同様なサルチーニヤ人の家系はGianni
らによ−)てE?1BOJ0.2.921〜925 (1983)に報告されて
いる。
第8A図及び第8 B図には、祖父(II 4)における300種にの断片及び
祖母(■5)における27の断片を記録した。
彼らの7人子孫(lull−11)の研究により、神経線維腫瘤家族に関して記
載した基準を使用して、これらの断片は少なくとも22の明瞭な非運t)Y父性
常染色体座及び18の母性常染色体座から由来することが分かった。残りのDN
A断片は、対立性又は他の断片−・の連鎖を証明するが、この小さい同胞群での
証明は可能ではない(両親のI) N A断片の所定の対は、7の同胞群に連鎖
して又は対存遺伝子とし−C偶然に伝達される1/64の可能性を有する)。更
に、家系の付加的人員において、連鎖の証拠を探し、2つの極めて強い連鎖例を
第8図及び第9図に示す。プローブ33.6?::よっ゛C検出される断片a、
b及びCは、■4からその子供(Illl−11)及びそれから孫(IV 18
)に完全な連鎖で伝達される。組み換え型は、14人の情報を与える後代に見ら
れる(同時に分離するバンドに関してp=4X 10−’) 、 J=記のよう
に、これは、断片a−Cが一つの超司変座から由来するミニサテライ1“ハブロ
タイブを表すことを意味する。また、ブ1コープ33.15によって検出される
バンドdは、バンドa −Cへ連鎖j7たことを証明する。し2かしながら、一
方の同胞群(IV l −4)は、両親が断片dを有するので、情報を与えない
、モして、他方(IV5−8)は組み換え型を含む(−理性双生児IV7.8)
、バンドdとa−c集団との間の連鎖の証明は、従って弱い(θ−10eM、
p=0.01) 、母性バンドe (33,6によって検出される)及びr(3
3,15によって検出される)は■4及び■5の子孫及び付加的血縁同胞群11
115−20及び■1 ’7−22において緊密な連鎖を示ず(20人の情報を
与える後代、絹、み換え型なし、θ−OcM、p=10−6)。プローブ33.
6及び33.15がミニサテライトの種々の組み合わせを検出し、断片e及びf
に交雑−ハイブリッドを形成しないので、これらの断片は2つの異なる常染色体
ミニサテライト座の間の確実な連鎖の例を表す。最後に、2個の連鎖群(断片a
−C及びe−f)は、同・−の座の対立遺伝子ではない* (i!i人の■1
は、父性a〜C集団と母性e−f対とを有する複合異型接合体である。両方の集
団は、彼の4人の子供のうち2人に伝達され、対立遺伝子として分離せず、その
代わりに、2つの連鎖しでいない超可変領域からNM Rされなければならない
ことを確認する。
母性(■5)ミニサテライト断片は、β−地中海貧血h1形質への著し、い連鎖
を示さず、従って、染色体111のβ−グロビン遺伝子集団へ緊密に連鎖してい
ない。これに反して、長さ8.6kbの母性断片(g)&よ1人の子孫及び孫の
3人の情報を与える同胞BYにおいて旧〕F11と同時に分離した(第9図)。
緊密な連鎖を、−]\ず(θ−OcM、p=2X10”4)12人の後代におい
ては、KMみ換え型は認められなか、った、115における17個の座を調べた
とい・う事実を、ち廟:しても、この連鎖は、なお有意である<17の記録され
た座の少なくとも一つの座の対立遺伝子が偶然に1什FHと同時分離を示す鱈率
は、()。004である)、更に、■5の断片gがただ1個のミニザテライト対
立遺伝子であり、−にに4聾っている2つの分離DNA断片でないことを、Hi
nflO代わりに;pu3Aで消化した、第9図に示した全個人のo N A指
紋を調査することによって検討した。すべての積極的指紋は、ただ〜つのミニサ
テライト断片について予測されたコ、うに、断片gと同様の大きさの対応する5
aq3A断片(8,2kb対8.6kb)を含んでいた。
ノ澤
ヒトの家系分析は、ミニサテライト断片1!・−ブによって検出されるDNA指
紋が、一方又は他方の両親を研究に利用できない家族においてさえ、多数の異型
接合性1)Nへ断片の分離を研究するため確実に使用できることを示す。このよ
うな2つのプロ・−ブを使用し7で、1個人において同時に34個までの超ii
J変座を分析することができ、ヒトの遺伝学において、RFLPを含めて、従来
法で得られるよりはるかに高い遺伝的標識形質生成速度を分析することができる
。個々の断片の低い四囲頻度と一緒に種々のミニザテラ−(1=断片の安定な遺
伝により、分析された2・′)の家系に発見された連鎖例に示されるように、そ
れらの断片は連鎖分析に理想的に好適になる。これらの超口1変ミニサテライト
はx、11み換えホットスポットでありうるが、長いミニサテライトで起こる不
等交換の概′J:J−速度(l配遇了当たり約0.001)は、ミニサテライト
座と近隣道伝、例えば病気の座との間の連鎖を著しく混乱させるには充分ではな
い。
ミニサテライトプローブ33.6及び33.15によって一緒に検出される超可
突座の総数は約60であると算定される。これらの座の約半分の2個の対立遺伝
子の少なくとも1 (1i1は、所定のDNA指紋で分離することができ、従っ
て、DNA指紋が異なれば、試験した座のスペクトルは同一ではなくなる。
これらの座のはとんど又は全部は、遺伝的には連鎖していす、従って、ヒトゲノ
ムの相当な割合にわたって散乱1.7でいなければならない。それらの正確な位
置は、分かっていないので、クローニング及び個々の超可変ミニサテライト座の
領域的位置決定を待たねばならない。奇妙にも、研究したどちらの家系におし)
、でも、X又はY染色体上にミニサテライトはまだ認められなかった。約43の
異なる座を、IPFB家族における(flit人■4と一緒に、神経線維腫瘤家
族の父親における可能な体性について記録した。X及びY染色体は一緒に雄のゲ
ノムの約5%を構成するので、43の無作為に分散した座がこれらの染色体上に
存在しない確率は、(0,95) ” = 0.1である。従って、体性ミニサ
テライトの明らかな欠損は、有意ではない。
これらの分散した超可変ミニサテライト座は、神経線維腫瘤及びHPFHへの連
鎖の仮の例によって示したよ・うに、病気の座に連鎖しまた標識0)研究G、二
Q(嫡子・あり)1、(if’、来のtp座遺伝分析とは萱なり、異なろミニ、
叶ううイト対立遺伝子は、名−家系6、′、13げる病気の鹿とII i!!
!−了いろと思ねh、ろので、血縁のない小さい家系の間でfl!: %連鎖デ
・・夕を即めるこ^がでさない。
その代わりに、1)へIA指紋だけが、広範な家系によマいC及び最も理セ、的
には、ただ−パ′すの大きい同胞群において、特に優性障害の速鎖の研究に適当
である31
、二こまでで、ブ1」・−フ(刊;(,6及び3:3.15ば、4181人C,
7おいて34までの常梁色イ、ドυ’−’i+J変庫・を記2スきせる、2こ:
!7.らの庫の少なくとも一つが所定の病気、の座に緊密に連鎖づるOJ能性は
、」3さ3000cMのヒ′、I・l!l gA pl 、74、の3 = ’
t ’j−’fyイ[・の任意分散を仮定しで、20%である。、、11円;1
(家族の、l−うな広範な家系については、はとんどの座のただ1個の対ず1遺
伝子が記録され−)るので、この確率は約10?(になり、連鎖を検出するには
、この対立遺伝子は病気の座に相中−iメζnBで連鎖しなければならない。こ
れらの確率を50 % ’)’)y 、、、b、 Lこトげるt、′は7、−・
つの大きい同胞群?7こ号いて104を越スる超可突座の記録及び広範な家系に
おいて208を越える座の記録が必要である5、これらの数ば、こ力、まで使用
1−また2種のミーサテライトプローブによっ了検出される吟の総数を越える。
しか1.7ながら、プローブ33.6及び33.15は、超可突座の本質的とに
全体と1.て異なる組み合わせを検出し1、これは、種々のコア配列を^むヒト
ミニサテライトの総数が大きいこ、トを示唆する。
限定した単座標識を使用する従来のIIZ )・家系分析においては、!!識と
病気の座との間の連鎖の証明は、通常直接、病気の遺伝子のおよそのゲノムの位
置を与え、付加的家系を分析することによって更に確立することができる6DN
A指紋に関しては、逆も真である。超6J変DNA断片と病気との間の可能な連
鎖を更に分析することは、分取用ゲル電気泳動及びクローニングによって断片を
単離して可能になる。単離したミニサテライトから、ミニサテライトを直接はさ
む特異配列DNA分節を使用するか、又は高厳格ハイブリッド形成における全ミ
ニサテライトを使用することによって、座持異性ハイブリッド形成プローブを設
計することができる。このよ・うな座持異性プローブは、連鎖データを付加的家
族に広げるため及びヒトゲノム内にミニサテライトを局在化させるため使用する
ことができる。この°アプローチは、グジャラート人の家系における、明らかに
11 P F Hに連鎖した8、2に1シュ3Aミニサテライト断片をクローニ
ングすることによって現在確認されている。
前記のように、それぞれがコア配列の異なる変異体を含むヒトミニサテライトか
ら成るプローブ33°5.33.6及び33.15は、異なるDNA指紋を住じ
、従って、ヒト及び他のを椎動物のI) N Aにおける超可変ミニサテライト
領域の種々の組み合わせを検出する。特に、プローブ33o6及び33.’15
は、各プローブに存在する反復コアの長さ及び正確な配列に差異がある結果とし
て、ミニサテライトの種々の組み合わせを大部分又は全部検出する(第三の用途
及び八、J、Jeffrcys、 V、Wilson、S、L、Thejn %
D、J、Weatherall & B、A、J、Ponderによる“DN
A ”指紋°及びヒトの家系における連鎖分析”参照)他の:Jア配列の縦列反
復を(lap用し27付加的超01変領域を検出する=f能性を試験するため、
一連の合成ミニサテライトを製造した。
イクリ−j 、、−(t−
人[′−ミニーサテーライー上−02合成及びクロ −二ンーリ1多コアプロ・
−ブを製造するアプローチを第10図に概説する。第1()図はE、7リ (E
、col i)の乗換ホソトスボソ!・イニシエーター配列(Ch i 、 G
CTGGTGG)のり「】−ン化j7たヤI列反復を製造する方法を説明するも
のである。ポリ・−Chi ブ1コープを作る工程は、標準DNA技法を使用し
1、下記の、I:おりである:
1、長さ!(ヌク1/オ丁〜ドのCbi配列の縦列反復を含む合成オリゴヌクレ
オチドを、Il、 W、 D、Matt、esらの(1984) (■2.)I
I(OJ、、−1支、801〜805)及びり、 G、 Brenner &
W、ν、 Shaw(1985)EMBOJ、4.561〜568の方法によっ
て製造した。 ChiO相補配列の二重体から成る第一のオリゴヌクレオチドを
合成りまた。
2、 こ力2らの2種のオリゴヌ・クレオチドを10mM MgC1□、10m
M)リス−)1cI (pH8,O)中で37℃で一緒にア、ニールしで、DN
Aの短い二本鎖分節を形成した5、第二のオリゴヌクレオチドの配列を、頭−尾
連結に適当な3−ヌクレオチド長の5′突出末端を有するアニールしまた分子を
生じるように選択した。
3、T4ポリヌク1/オチドキノ゛−・ゼ及びATI’を用いて5′末端を燐酸
化した。
4、 ア;、−ルしたDNA断片をT4 DNAリガーゼ及びATI’を用いて
鴎−属性で一緒に連結させて反復したChi ポリマーを製造した。
5、連結したポリマーを1.5%アガロースゲルでの電気泳動により大きさで分
離し、長さ15(l塩基対より大きいポリマーをDE810紙上での電気泳動に
より単離した(+)retzen。
G、 、Be11ard、 M、 % 5assone−Corri+ P、
& Chambor+、 p、、■のフレノウ断片を使用してフィルイン修復に
よりプラント末端とし、J3mp19 RFD N A (J、 Messin
g & J、 Vieira、1982、 Gene I L、269〜276
)のS ma I部位中に連結した。
連結したD N A ;ji、、−凡エニー去JM 101中に形質転換し、個
々の白色プラークから一本鎖ファージDNAを単離した。
7°各クローン化単離物のDNA挿入部をジデオキシヌクレオチド法(M、 +
3.旧ggin 、、 T、 J、 Gibon & H,F、 llongs
1983、Proc、 Nat、 Acad、 Sci、 t!SA80.39
63〜3965)によって配列させて、ポリマー挿入部の長さ、方向及び配列を
測定した。成熟−末鎖ファージDNA中に5′→3′に指向するChi配列の5
0の12列反復を含む組み換え型M13ファージが見出され、これをM13・コ
アAと言う〔即ち、挿入部は、ポリ (Chi)であり、ポリ(Chiの補体)
ではない〕。
8、3J)−標識一本鎖ハイブリッド形成プローブを、ファージ33°6及び3
3.15からプローブを製造するのと同じ方法を用いて、プライマー・エクステ
ンション法により製造した。
例−↓−↓2πし−5−
)−」を走q入史−ρ4−2斤←()人−エーミ−そ一専一テーラーイ一−ト、
、 0)9製−j1シ1−記の技法を用いて、更に5種のコ゛ア配列を合成し7
、M】:3に多コア組みI費え型と1.2てクローン化して、組み換え型M 1
:3・−1アA−Fを得た。コアの長さ及び正確な配列を変えるようにコア変
異体を選択した。第り1表には、クローンM13・コアA−Fにおける反復配列
をコア配列及び初期の用途で記載した、6簡に使用したプローブ33o5.33
.6及び33.15と比較してまとめる。コア配列における極めて変化し7ない
塩基に1−線を付ける。ヘクターM13mp19中の各挿入部の指向も示す〔−
・・は、挿入部がポリ (コ゛ア)であり。・−は、挿入部がポリ (:J、ア
)の相補配列であることを示す。〕小文字で六二かれた塩基は、二17配列から
の離脱を示す。各配列の@華な特性を“注釈”にまとめる。
(以下余白)
例16
初期スクリーニングにおいて、2人の血縁のない個人のDNA消化物を33.1
5及びプローブM13・コアA−Fのそれぞれで探索した(probed)。2
個の血縁のない胎盤(1゜2)から(DDNへの8pg(7)試料をHinfI
で消化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、サチン法でプロットし、主用
途に記載した操作により32pでラベルした各プローブに対してハイブリッドを
形成させた。生じるオートラジオグラフを第11図に示す。全プローブは、各個
人における多数のDNA断片を検出した。
膨米
プローブB、C及びDは、それぞれ、2人の個人の間で実質的に異なるDNA断
片の指紋を検出した。指紋は、プローブによって変動するが、若干の断片は1個
より多数のプローブによって選出され、ある程度、プローブ33.15によって
検出される超可変断片の組み合わせと重なった。プローブB−Dは、ずべてDN
A指紋作装に適当であり、−緒に、ヒト及び他のを椎動物において試験すること
ができる超可変ミニサテライトの数を拡張すると結論する。ここで、コア配列の
中心の最も保存される7塩基対分節だけを含むコアCを用いて得られる有効な指
紋は、重要である。
コアの先端を更に切断してコアEにおける6塩基対反復を生成させると、DNA
指紋バクーンは、完全に変化して、試験した2人の個人によってほとんど共有さ
れている断片の組み合わせを示した(即も、これらの断片は極端な多形変化を示
さない)。従って、コアEは、DNA指紋分析に対して、前に使用したプローブ
33.5.33,6及び33.15と同程度に有用なプローブであるとは思われ
ない。このことは、また、−mに有効なりNA指紋作製には、実際に最低7塩基
対のコア配列が必要であることを示唆する。また、コア(M2S・コアG)の中
心の最も保存的領域の破壊は、DNA指紋パターンの複雑さ及び変動性を低減す
ると思われる。
M2S・コアA(ポリChi )は、ハイブリッド形成りNA断片の新規かつ強
いパターンを生じる。これらの断片の多くは、極めて太きく (> 15kb)
、あまり分離されず、場合によっては存在するHinfl開裂部位を含む従来
の長いサテライト配列から誘導することができる。
プローブ33.6及び33.15を使用して広範に特性決定した神経線維腫瘤に
罹病した家族で、M2S・コアAによって製造されたパターンを更に分析した(
例8及び第7図参照)。第12図には、父親(F) 、6人の娘(D)及び5人
の息子(S)からのDNAのHinfl消化物からのDNA指紋を示す。常染色
体優性遺伝癌である神経線維腫瘤に罹病した個人は、十で示す。罹病した母親か
らのDNAは入手できなかった。分離する父性(・)及び母性(○)バンドを示
す。実線で結合したバンドは、連鎖され、点線で結合されたバンドは対立遺伝子
として分離する。(x)を付υたバンドは、ブr)−ブ33°15を用いて予め
検出された。
J、l′i果
ブ1コープ33.6及び33.15を用いで得られたD N A指紋とは異なり
、変動性のレベルば比φ、り的低く、多数のlvi片がすべての子孫に伝達され
る(即−Jul 、2、これらの断)1はその45団1.二おいて一般的ごあり
、J慴1.ではなく、しば1−2ば同型接合状態で存在する)。6個の異型接合
性父性バンド及び9個の異型接合性母性バンドの置部(が、11人の子供の同胞
群で記録された。
父性バンドの一つ及び母性バンドの対立遺伝子対をプローブ33.15でfめ検
出した。バンドの対立遺伝子対及び連111シた対を排除した後、2個の新(,
7い父性遺伝子座及び6個の新しい母性遺伝f座をプローブ33.6又は33.
15で予め記録されないまま残L、予め記録された34@の父性遺伝子座及び2
5個の母性遺伝子座と比較する。従って、ポリChi プローブは、ヒトの遺伝
分析に限られた用途を有する。
例16及び17の結果は、第5表の最−に列に下線を付け、主用途の個所に論じ
た9個の優性ヌクレオチドの重要性を確認させる。これらは、また、有効なプロ
ーブコアには、ヌクレオチド6個の最小配列が必要であるという、主用途におい
て行った予言を確認するのに大いに有効である。従って、コアEは、最小利用性
を表し2、ヌクレオチド6個の他の配列、例えば以下に論じる配列TGGGCA
は、限界的に改良された利用性を示すことができる。ヌクレオチド7個への増加
は、調査の枠内で極めて劇的である。
有用なコア配列の本質的要素を明確にする試みにおいて、代わりのヌクレオチド
を示すため上に使用した変異体X及びYを、下記のように完全な理論に有用に広
げることができる:X=A又はCP=Gではない
y=c又はT (Q=Aではない)
W=A又はT (R=Cではない)
V=C又はG (S =Tではない)
(〇−任意)
()=下記の考察には利用していない。
この用語を使用すると、本発明の態様は、下記の反復コア配列:
GPGGGC見GGWXG (6)
を含むポリヌクレオチドを含むと言うことができる。
前記の配列は、もちろん、最も代表的な12個のヌクレオチドの配列を示す。し
かしながら、7ヌクレオチドのコアCも著しい利用性を有することが判り、上記
の12コア配列からの“許容された”変異体を有するものを含めるため、一つの
態様は、下記の7コア配列:
PGGG(JG (7)
の反復を含むポリヌクレオチドをも含むと言うことができる。
もちろん、PはコアCにおけるのと同様にTに等しいのが好ましい。他の最も好
適なものは、八であろう。
明瞭にするため、相同パーセンテージは第3表に既に示した。この用途の人ニブ
ローブに関しては、反復は正確な反復であって、全体としてのミニサテライトの
相同性はコア配列の相同性によ、て示す(とができる。ζ二のことは、相同性を
括弧内に示した前記のブ1コープ33.6.33.15及び33.5には必ずし
も真実でない。これは、反復間に生じる変異体による。
コアFは、恐らく、有用性に関して最低相同率を示す。しかしながら、この不一
致は、恐らく、コア中に存在する中心基:TGGGCA (8)
の破壊によって誇張された。前記の基が最も有効なプロ・−ブB、C及びY)中
に存在し、あまり有効でないプローブA、 E及びIパのずべてにおいては破壊
されていることは注目に値する。従って、式(6)をイjする最低70%の全相
同率を有する更に有効なプローブが得られることが予想される。
式(8):
%式%)
の中心6ボリスクレオチドがコアE中でも破壊されていることは注目に値する。
恐らく、前記の6ヌクレオチドコア配列は、更に有効であるが、長さをヌクレオ
チド6から7に増加すると、更に優性な特性が証明されることが予想される。
従−って、本発明の態様は、コ゛ア配列TGGGCAの反復を含むポリヌクレオ
チドを含むと言うことができる。
更に一般的には、本発明は、・−態様として、すべての反復配列中に配列TGG
GCAが存在する前記の“第一の”定義によるポリヌクレオチドを含むと言うこ
とができる。
別の態様から見れば、本発明は、コ)・が、式(2)に示しまた配列から選択さ
れた、同じ5’−3’の意味で読まれる・少なくとも6個の連続したヌクレオチ
ドの配列を表す前記の“第一の”定義のポリスクレオチドの変性を含むと言うこ
とができる。“コア”は、すべての単位が配列TGGGCAを含む限り、各反復
iji位に同じ配列を必ずしも有しない。
各単位の残りの基は、全単位長の束縛の範囲内で式(6)(又は更に好まし2く
は(2))の配列と少なくとも70%の相同率を有する。
肌生詩至双生児普府ま■性■剖淀−
双生児における接合生殖性の測定は、疫学的、遺伝的及び産科学的研究のためば
かりでなく、−理性と二卵性双生児との予測に差異があるので、重要である。−
卵性双生児は、二卵性双生児より出生率が低く、体重が低く、医学的合併症が多
く、死亡率が高い。カフカズ人では、新生児の約30%が異なる性を有し、従っ
て二卵性である。胎盤膜を試験すると、別の20%の事例が単絨毛膜性であり、
これらは常に一卵性であることが判る。残りの50%は、集団のうちで比較的一
定な割合であり、同じ性を有し、二絨毛膜二羊膜胎盤を有し、−理性又は二卵性
でありうる。これらの場合の接合生殖性を測定するため、一般的外観の評価、指
紋、皮膚移植片、味覚試験及び遺伝的標識形質の測定を含めて種々の方法が使用
された。後者は、95〜98%の精度で、最も信頼性がある。しかし、はとんど
の蛋白質及び抗原変異体の平均異型接合性が比較的低いので、通常、このような
標識形質を多数、調べなければならない。
下記の例では、12M1の新生双生児からのDNAを、前記のようなミニサテラ
イトDNAブロー・−ブを用いて試験した。
得られたD N A“指紋”は、個人ごとに変化し、−卵性双生児だけが同一・
のバク−、ンを示ずことを証明する。性観察又は胎盤μ;験から接合生殖性を測
定することのできた7例においては、DNAの結果はこれらの所見と一致した。
他の5組の双生児対及び2組の三つ子において、DNA分析により接合生殖性を
迅速に測定することができた。従って、本発明によるDNAプローブは、多給妊
娠のすべての場合に、接合生殖性を積極的に測定することができる・一つの遺伝
的試験を31供−末鎖DNAプローブ33.6及び33.15を使用して、12
絹の新生双生児の接合生殖性を測定し、た。その詳細を第6表に示す。
第6表
症例 4胎年令 性別、 胎盤付着 DNAバ−一一〜−祥−へ−一−7−−、
ターニス−138週間 FF 単絨毛膜性 同一
238週間 MF 二絨毛膜性 非同−330週間 MM 二絨毛膜性 同一
433週間 FF 単絨毛膜性 同一
540週間 FF 二絨毛膜性 非同−637週間 MF 二絨毛膜性 非同−
732週間 FF 二絨毛膜性 同一
834週間 MF 二絨宅膜性 非同−939週間 MM 二絨毛膜性 非同−
1038週間 MF 二絨毛膜性 非同−1127週間 MM 二絨毛膜性 同
一1235週間 FM 二絨毛膜性 非同−*すべでの胎盤は、二羊膜性であっ
た。
出産時に集めた成帯血液の試料又は誕生の翌日に各乳児から得た末梢血液の試料
(0,5〜1.0miすをDNA抽出のため使用した。胎盤を試験して、胎盤が
単又は二羊膜性及び単又は二絨毛膜性であるかを測定した。DNAを標準法(O
ld。
J、 M、、111gg5. D、 R,著、遺伝子分析、D、J、 Weat
herall、編集、The Thalassacmias、血液学における方
法、チャーチル・リビングストーン、1.983)によって抽出し、110−1
5pを旦1nfIで消化した。試料を長さ22c+mの0.6%アガロースゲル
で45Vで約36時間、長さ1.5kb未満のDNA断片がすべて、電気泳動に
よりゲルから除かれるまで、電気泳動した。DNAをニトロセルロースフィルタ
ーへプロッティングによって転移させ、真空下に80℃で2時間ベーキングした
。−末鎖DNAプローブ、33.15及び33.6を前記のように32pでラベ
ルした。
結果を第13図に示す。
第13図において、列l及び2は、33°6一本積ミニサテライトプローブを用
いて、症例1の各双生児に関して得られたDNAバンドパターンを示す。例3〜
19は、一本tM33.15プローブを用いて得られた“指紋”を示し、症例1
は、列3及び4に、症例2は、列5及び6に、症例3は、列7及び8に、症例4
は、列9及び10に、症例5は、列11及び12に、症例6は、列13及び14
に、症例7は、列15及び16に示ず。列17〜19は、女性、男性及び女性の
3人の三つ子を示す。列l及び2を列3及び4と比較すると、2種のプローブ3
3.6及び33.15がミニサテライトバンドの種々の組み合わせを検出するこ
とが判る。大きさの標識は、キロ塩基で示す。
7つの症例(第6表参照)では、双生児の性及びその胎盤膜の試験によって節単
に接合生殖性を測定することができた。
単絨毛膜性(又はり1羊膜性)胎盤を1fする双生児(例えば、症例1)はすべ
て−理性であるが、−卵性双生児の約50%が単絨毛膜性胎盤(2)を有するに
すぎなかった。従って、症例1における双生児は、−理性でなければならず、3
3.15及び33.6ブローブにより同一のDNAパターンを示した(第1図)
、5つの症例においては、双生児は異なる性を有し、33.15及び33.6ブ
ローブにより異なるバンドパターンを示した。症例3.5.7.9及び11にお
いて、双生児は同じ性を有し、二絨毛膜性胎盤を有し、−理性又は二卵性であり
うる。DNA分析により、2&Ilの双生児(症例5及び9)が異なるバンドパ
ターンを有し、従って、二卵性であったが、他の3組(症例3.7及び1])で
は同一のバンドパターンを有し、−理性を示すことが判った。
2組の新生三つ子を同様に研究した。両方の場合に、母親は妊娠を誘発するため
受精剤を服用していた。各三つ子は、特異なバントパターンを示した(例えば、
第13図、列17〜19)。
結果を第14図に示す。第14図において、列1及び2は、一本13433.1
5を用いた結果を示し、列3及び4は、二本鎖33.15を用いた結果を示す。
貫上ニ
一本鎖又は二本鎖プローブは、それぞれの診断をするのに適切であるが、多数の
放射性−末鎖プローブを用いて多数のバンドを区別することができたく第14図
)。
これらの−末鎖プローブの代替物として、はとんどの実験室で一層親しまれてい
る対応する二本鎖プローブを使用する可能性を調べた。使用した二本鎖プローブ
は、i)λ33.15からの“コア”ミニサテライトを含む二本ti600bp
Pst I −Aham断片及び1i)233.6からの“コア゛ミニサテラ
イトを含む二本t4 ’720bp Hae m断片であった。これらをDNA
1μg当たり0.5−1. OX 10”cpmO比活性になるまでニックトラ
ンスレーションによってラベルした。予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形
成条件は、二本鎖プローブ用のハイブリッド形成緩衝液にi xssc及び10
%デキストラン硫酸を使用した以外は、前記の標準法に記載したとおりであった
。
フィルターを65℃で1xssc中で1時間洗浄し、増強スクリーンを用いて一
70℃で1〜3日間、電気泳動した。
皿土工及び上l優考察
接合生殖性を独立に測定することができた7つの症例において、D N Aの結
果は、性の観、察及び胎盤試験に基づく結論と一致した。他の5組においては、
ミニサテライトプローブを用いて接合生殖性の明快な測定が可能であった。同様
に、研究した2組の三つ子は二卵性であることが判った。
性の相違(二卵性)又は単絨毛膜性胎盤(−理性)によっては双生児の接合生殖
性を測定できない症例の50%において、遺伝子分析を使用しなLJればならな
い。このような試験による情報量は、試験する遺伝子座における多望性の程度及
び試験する座の数に比例する。多数の赤血球抗原及び酵素測定より、集団におけ
る関係対立遺伝子頻度が既知である場合にだけ、95−98%程度の接合生殖性
の精度を達成できる(Nylarider、 P、 P、 S、著、双生児出産
現象、Barron、 S。
Lo、Thomson+^、M、Pffi、0bst、etrical Epi
demiology、ロンドン、Academic Press、 1983
: 143〜165 ) *同様に、数種の異なるDNAプローブを用いる多数
の制限酵素部位多型性を分析すると、−理性の“誤った陽性”の診断がかなりの
パーセンテージで生じる(Derom、 C2、Bakker、 E、、Vli
et−ineck、 R,Derom、 R,、Van der Berghe
、H,、Th1ery、 M、%Pearson、 P、著、DNA変異体を用
いる新生双生児の接合生殖性測定、J、 Med、 Genet。、1985.
228279〜282) 、本発明によるミニサテライトプロー・ブは、この問
題を克服している。それというのは、検出する超可変DNA分節が多数で、著し
く変化しうるからである。前記のように、ハイブリッド形成ミニサテライト断片
は、無作為に選択された個人の間ではほとんど共有されない。血縁のない二人の
個人が、超可突座の種々の組み合わせを検出するプローブ33.6及び33.1
5で同一のDNA指紋を示す可能性は、従って、天文学的であることは既に示し
た(p < <No−” 、例4参照)。断片の約半分を共有する同胞において
は、遺伝的同一性をこのように“誤った陽性”に診断する確率は、<10−”で
ある。従って、−末鎖ハイブリッド形成プローブ33.6及び33.15を組み
合わせて使用すると、従来の遺伝的試験より高い精度が得られる。
−末鎖プローブによって検出される比較的弱いバンドの若干のものにハイブリッ
ドを形成しない、一層普通の二本鎖ミニサテライトプローブを使用してさえ(第
14図) 、DNA指紋から、“誤った一卵性”の割合を<10−’に低下する
のに充分な情報を得ることができる。
この接合生殖性測定法の別の利点は、分析には極めて僅かな試料しか必要でない
ことである。通常、半m!!の末梢血液又は調帯血液で、充分なりNAが得られ
た。新生並びにそれより年令の高い双生児及び三つ子における接合生殖性を測定
する、この明瞭な手段を利用しうろことにより、種々の型の多脂妊娠の決定要素
及び影響に関する一層正確な疫学的研究が可能である。
下記の例では、分子量標識はオートラジオグラフでは得られないが、他の結果に
おけるように、有効な一般的範囲は、1.5〜20kbであった。
S へのDNA5 の゛
ミニサテライトプローブ33.6及び33.15によって検出されるDNA指紋
の個体特異性により、DNA指紋は法医学において個人の確認に理想的に適当に
なる。ただ一つ不確かなことは、DNAが例えば乾いた血液又は***の庖疹中で
DNA指紋分析を行うのに充分に未分解状態で生存するか否かである。法医学検
体の分析可能性を測定するため、Ilome 0fficeCentral R
e5earch Establishment、 AldermastonのP
eterGill博士によって供給されたD□NA試料について予備研究を実施
した。
fl岨
布上の乾いた血液及び***のQ痕を、G111博士によって実施されたDNA抽
出(IMDTTの存在でSO5で溶解し、次いでフェノールで抽出し、エタノー
ルで沈澱させる)の前に、種々の時間室温で放置した。同様に、新鮮な毛根及び
***の前後に採取した膣スワブからDNAを抽出した。DNA試料をHinfI
で消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルター
上にプロットした。フィルターを前記の本発明の標準技法を用いて″tp−ラベ
ル一本鎖本ロブローブ335でハイブリッドとした。
電気泳動した試料は、下記のとおりであった:1、布上の***庖疹40μm、4
週間後のもの。
2、新鮮な***40μl。
3、新鮮な血−fi60μm0
4、布上の血液廐痕60μN、4週間後のもの。
5、布上の血液序痕6oμr、2年後のもの。
6、毛根15個。
注、1−6は、同じ人から採取した。
76布」二の血液庖疹60ttl、男性、新鮮。
8.7と***後1時間Gこ11から採取t7た膣スワブ。
9、***後7時間に採取した以外は8と同じ。
10.11から採取した膣スワブ。
11、布上の血液庖疹60p12.女性、新鮮。
得られたDNA指紋を第15図に示す、各試料から分析のため充分なりNA (
約0.5〜3μg)を抽出した。DNAは、乾いた血液庖疹では2年経過したも
のまで、乾いた***では2ケ月経過したものまで、あまり分解していす1.同じ
個人の新鮮な血液及び***から得られるものと同一のD N A指紋を生じた。
15個の毛根程度の小さいものからも同様にl) N A指紋を得ることができ
た。
***後に採取した膣スワブも、分解していないDNA指紋を生じた。しかしなが
ら、スワブパターンは、主とし2て、男性の血液ではなく、女性の血液のものに
一致した。このことは、スワブから集められるDNAはほとんど、綿棒で採取す
る間に剥離した膣」二皮細胞からのものであり、***からのものではなかったこ
とを示す。それにもかかわらず、***後の試料においては、3個の付加的な女性
のものではないバンドが検出された。これらは、男性の血液における主バンドに
・一致し、***からHlされたものでなければならない。このようなバンドを、
***後7時間に採取した試料で検出することこれらの予備実験の結果は、DNA
が種々の法医学的検体中で損なわれずに維持され、従−3で、同定の目的で1.
:) N A J’j□゛紋を少ムくとも若干の法医学的試料に適用しうろこ1
とを示す。
例えば、被店老の着衣の情液癲痕から強姦犯人の積極的確認が可能Lコなる。強
姦被害者からの膣スワブを用いる場合は、。
膣DNAが混入する点であまり確実ではない。し7かし、***D N AO単;
■(7ご必要な***の2−DTT又はメルカブトエクノール〜媒介還元の前に償
1s熔解によってこの女性のDNAを除去すると、一層明白なり NA指紋が生
じる。この場合に、強姦犯人の同定は、鞘液庖疹及び/又は膣スワブのDNA指
紋分析によって可能になる。
その後、G111博士と協力して行った最近の研究で、−最的に上述しまた予備
分離技法苓使用して、***後の膣スワブから***DNAの明瞭な“指紋”が得ら
れることが確認された。
第15A図は、***後6.5時間に採取した2つの膣スワブからのDNA指紋(
列3)を示す。列lには、相手の男性の血液試料からの指紋を示し、列2には、
女性から得た血液からのDNA指紋4示ず。スワブからの女性の細胞核を、SD
S/プロティJ〜−ゼ1(混合物中での予備培養によって優先的に溶解させた。
***核は、この処理に影古されず、従って、遠心分離によって女性の成分から分
離することができる。その後、***核をSOS /プロテイナーゼに/DTT混
合物で処理することにより溶解させた。
この分離操作が完全に有効であったことは明らかである。
***で汚染された膣スワブからの***DNA指紋は、相手の男性の血液から得ら
れた指紋と完全に一致した。
ヒトのミニサテライー」L隻二りを月1と(得り才11i済句寥、運Jμd丸初
9Jす幻A!紋。
剌」」ニー−25
犬、猫、羊、豚、烏及び牛から採取した血液からDNA試料を製造した。8μg
の試料を適当な制限、エンドヌクレアーゼ(特に断らない限り、Hinf I)
で消化し、制限消化物をフェノール抽出後にエタノール沈澱によって回収した。
制限消化物を水中に再溶解し、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、変性し、
5chleicher−Schuellニトロセルロースフィルターに転移させ
、前記のように′32P−ラベルヒトミニサテライトプローブ33.6又は33
.15を用いてハイブリ、ドを形成させた。
□犬
プローブ33.6を用いて犬の家族から得られたDNA指紋を第16図に示す。
電気泳動した試料は、下記のとおりであった:
列1 ビーグル大の父親
列2 グレーバウンドの母親
例3.4及び5 これらの両親の“グリ−グル(Greagle) ”の子犬(
それぞれ雌、雄、雄)。
ヒトDNAから得られたものと同様に複雑な、詳細なりNA指紋が各人から得ら
れた。父親及び母親(列1.2)から得られたパターンを比較することによって
判るように、DNA指紋は著しい変異性を示した。3匹の子犬はすべて、それぞ
れ、すべて父親及び/又は母親に由来をたどることのできるバンドから成る、異
なるDNA指紋を有する。従って、これらのDNA指紋は、人の場合と同様に、
犬における父性試験及び家系分析に有用である。
試料1〜3のDNAは、僅かに分解しており、それにより、最大(最も緩徐に泳
動する)バンドの強度を優先的に減少した。この分解にもかかわらず、両親から
子孫へのバンドの伝達は、容易に測定できた。
皿又叉 購
第17図は、(左)プローブ33.6及び(右)プローブ33.15を用いて、
毛の短い家猫の家族からのDNA指紋を示す。
列1 母親
列2 父親
列3 小猫
プローブ33.6及び33.15は、情報に富むDNA指紋を生じる。小猫のほ
とんどのバンドは、母性又は父性であると記録することができ、従って、これら
のDNA指紋は、猫における家系試験並びに個体の同定に適当である。
tLL ニ
ブローブ33.6 (左)及び33.15 (右)を用いて種々の羊から得たD
NA指紋を第18図に示す。試料は下記のものであった:
列1 交雑育種した雌
列2 交雑育種した雌
列3 ドーセット種の雌
列4 ハンプシャー×ドーセソト種の雌列5 ドーセント種の雄
両方のプローブにより冬草から個体特異性DNA指紋が得られた。DNA指紋は
、ヒトのDNA指紋より弱く、それほど複雑ではないが、同定及び遺伝学的目的
にはなお有用である。プローブ33.6は、弱いバンドの範囲の他に、冬草にお
いて1又は2個の極めて強い多形バンドを検出する。これらのバンドは、恐らく
、極めて高いプローブ33.6相同性を示す、ただ一つのミニサテライト座から
誘導されたものである。
■11 五及グユ
第19図は、3頭の異なる豚(列1〜3)及び3頭の異なる馬(列4〜6)〔性
別及び育種は、特定されていない〕からのDNA指紋を示す。プローブ33.6
及び33.15は、各種と個体特異性DNA指紋を生じる。特にプローブ33.
15によるDNA指紋は、弱く、対応するヒトDNA指紋と比べて極めて少ない
バンドを含むが、それでも両方のプローブの併用は、個体の同定に有用である。
ルl牛
第20図は、牛家族及び付加的な牛についてプローブ33.6を用いて得られた
基1nflDNA消化物のDNA指紋を示す。
試料は、下記のとおりである:
〔列1 ヒト〕
列2 社中
列3 父牛
列41及び2の子牛
列5 アンガス雄牛
列6 フレシアン底生
羊、豚及び馬の場合と同様に、かなり前車であるが、それでも個体性)1性のD
NA指紋が各動物から得られた。子牛では、すべてのバンドは、社中及び/又は
父牛に由来をたどることができ、この動物の家系を確認することができた。
第21図は、同じウジDNAについてプローブ33.15を用いた結果を示す。
個々の列は、下記のものを示す。
3、 1及び2の子牛
4° アンガス雄牛
5° フレシ)′ン諸牛
るハイブリッド形成りNAバンドの強くて、分離できない程、複雑なパターンを
生じる。 BJLLII消化物においては、この強いシグナルは、主として極め
て大きいDNA断片に限られ、このシグナルが、ふさ状配列又は領域、恐ら〈従
来のサテライトDNAから誘導されたものであることを示唆する。
基1nfl消化物を短時間、オートラジオグラフィに付すと、45−50塩基対
の間の“横木”の間で周期性をもって(データは示さない)、ゲルの底部に向か
・う“はしご”状バンドを示す。従って、強いシグナルは、恐らく長さ45−5
0塩基対の反復単位を有するサテライトから誘導されたものである。強いシグナ
ルは、P vu Ti 、旦封1又はAluIで消化されたウシDNAにおいて
著しく破壊されており、サテライトDNA反復単位がこれらの制限エンドヌクレ
アーゼのそれぞれに対する1個以上の部位を含むが、Hinfi又はB LL
II対する部位を含まないことを示唆する。これらは、正確に、46塩基対反復
単位の100000縦列反復から成る1、720ウシサテライト(E、Po5c
hl及びR,E、 5treek著、′ウシ1.720サテライトDNAのプロ
トタイプ配列”、J、 Mo1. Biol、皿、147〜153 : 198
0)の性質である。
1.720反復単位の配列とコアプローブ33.6反復単位及び33.155反
復単との比較を、以下に示す;コア GGAGGTGGGCAGGAXG 11
ha I DdeN33.15 − 八GAGGTGGGCAGGTGG IA
LLL 133.6 八GGGCTGGAGG Pvu II前記の式から明ら
かなとおり、1.720サテライト反復単位は、コア配列の3′領域のほぼ完全
な複写を含む(一致部を*で示した)。1.720反復におけるこの領域は、3
3.15の反復単位と優れた一致を示すが、33.6とはあまり完全でない一致
を示す。これは、1.720サテライトDNAがプローブ33.15によって検
出されるが、33.6によっては検出されない(第20図)理由を説明する。(
1,720サテライト反復単位(ミオグロビンλ33ミニサテライトの反復単位
と偵でいる)は、コア(式(1)におけるH+J>15)の各側にあまり多数の
ミクレオチドを含みすぎて、本発明による多座プローブとして作用しない〕。
プローブ33.15にハイブリッドを形成するウシミニサテライトを検出するた
め、DNAを人」ul又は−pdelで消化して、1.720サテライトをこの
ゲルの底部から電気泳動により除かれる46塩基対モノマーに還元した。第21
図は、ウシDNAからのこれらの制御!!!酵素のそれぞれについて明瞭なりN
A指紋が実際6ご得られたことを示す(M3)。しかしながら、これらのバンド
のほとんど全部は、各反復においてAju I及びDdeI部位を失った(恐ら
く、前記の下線を付した塩基の一方又は他方の突然変異により、重なる込〜1!
!I及び−pdeI部位が破壊されることによって)、正常な1.720 DN
A内に埋めこまれた1、720サテライトDNAの変異体ブロックから誘導され
たものである。このことは、下記の事実を説明するであろう:
31人n1及び中通ql庇用いて、実際に同一のウシDNA指紋が得られた。
b、極めて大きい断片は、−貫して5.、小さいものより強力にハイブリッドを
形成する(これらは対応して多くの1.720サテライト反復単位を含むからで
ある。極めて大きいウシDNA!l!J′r片は、これらの単位を440個含む
)。ヒトにおいては、バンド強度は、大きさと共に連続して増加しない(第21
図)。
C,ウシDNA指紋断片のほとんど全部は、1.720反復単位内で1度で切断
する一!(h−a Iによって除去される(前記参照、データを示さない)。
d、父牛(N(12) IL人=1−μm消化物中にハイブリッド形成断片をほ
とんど有しない。このこ−己よ、これらの変異体反復ブoツクを含む1.’??
0サテラ・イ)DNAの領域が1、rL:Dlすl物では欠失したことを示唆す
る。
e、社中(嵐1)及び子牛(Na 5 )のDNA指紋は、はとんど同一・であ
る。社中は、恐らく欠失tコ関して異型接合性で、父牛に見られるのと同等で、
非欠失染色体(及び従って、全部のバンド)を偶然、子牛に伝達し7ていた。従
って、これらのバンドはすべてi’!! 鎖IJ、ヒトにおいで起こるのと同様
に子孫に独立して伝達されない。
それにもかかわらず、試験した5頭のウシは、異なる“サテライト”DNA指紋
パターンを示し、これらの異常な型の指紋は、個体の同定に有用であるが、多座
標識情報を得るには使用できない。
式(1)において、nが必ずしも3に等しくない場合にも、あるプローブは有効
に機能することができる。このようなプローブにおいては、コアを含まないDN
A配列によって少なくとも1対の(J、コア、K)の反復を少なくとも更に2個
の反復から分離することができる。従って、“非コア”DNA配列によって隔て
された対中に(J、コア、K)配列が配列されている充分に長いブロー・ブを1
1!成することができる。
浄書(内容に変更なし)
浄書(内容に変更なし)
F[G、5
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FIG、6
F[G、7
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FIG、13
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FIG、15
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FIG、18
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3ら x3?3/fFfG、20
―
X χ × / X ×
手続補正書(方式)
%式%
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
名称 リスター インスティチュート オブプリベンティブ メディスン
4、代理人
住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番lO号5、補正命令の日付
昭和62年2月24日(発送日)
6、補正の対象
(1) 特許法第184条の5第1項の規定による書面の「特許出願人の代表者
」の欄
(2)委任状
(3) 明細書の翻訳文
(4)請求の範囲の翻訳文
(5) 法人証明書
(6) 図面の翻訳文
7、補正の内容
(11(2) (5) 別紙の通り
(3)明細書の翻訳文の浄書(内容に変更なし)(4)請求の範囲の翻訳文の浄
書(内容に変更なし)(6) 図面の翻訳文の浄書(内容に変更なし)8、添付
書類の目録
(1) 訂正した特許法第184条の5第1項の規定による書面 1通
(2)委任状及びその翻訳文 各1通
(3)明細書の翻訳文 1通
(4)請求の範囲の翻訳文 1通
(5)法人証明書及びその翻訳文 各1通(6)浄書した図面の翻訳文 1通
国際調査報告
―h11111^n内a++an’= PCT/GB 851004?)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.5′→3′の意味に読まれる次の一般式:H.(J.コアー.K)n・L( 1) 〔式中、 “コアー”は6個以上の連続するヌクレオチドを有する配列を表わし、該ヌクレ オチドは同じ意味に読まれる次の配列:【配列があります】(2) 【配列があります】(3) 【配列があります】(4) 【配列があります】(5A) 【配列があります】(5B) (式中、XはA又はGであり、YはC又はTであり、TはT又はUであり、mは 0.1又は2であり、pは0又は1であり、qは0又は1であり、nは3以上で ある)のいずれかの中から選択され; J及びKは一緒になって、反復単位内の0〜15個の追加のヌクレオチドを表わ し;そして H及びLはそれぞれ、反復配列の端に位置する0又は1以上の追加のヌクレオチ ドを表わし;そして次のこと、すなわち: (i)“コアー”並びにJ及びKは各(J.コアー.K)反復単位中同じ配列又 は長さを有することは必ずしも必要でなく; (ii)“コアー”はまた変形体コアー配列を表わすこともでき; (iii)全n反復配列中の実際の合計コアー配列は、同じ数nの反復単位にお いて、式2〜5について上に定義した“真”の合計コアー配列との70%以上の 相同性を有する〕を有するポリヌクレオチド、並びにこれに対して相補的な配列 のポリヌクレオチド。 2.各(J.コアー.K)反復配列中に存在するヌクレオチドの合計数が25を 超えない、請求の範囲第1項に記載のポリヌクレオチド。 3.コアーが最高16のヌクレオチドを有する、請求の範囲第1項に記載のポリ ヌクレオチド。 4.コアーが7個以上の連続するヌクレオチドの配列を表わす、請求の範囲第1 項に記載のポリヌクレオチド。 5.コアーが12個以上の前記連続するヌクレオチドの配列を表わす特許請求の 範囲第1項に記載のポリヌクレオチド。 6.コアーが、式(2)、(3)又は(4)中に示された配列から選択される1 4〜16個の前記連続するヌクレオチドの配列を表わす請求の範囲第1項に記載 のポリヌクレオチド。 7.実際のコアー配列が真のコアー配列との80%以上の相同性を有する、前記 いずれかの請求の範囲に記載のポリヌクレオチド。 8.Jが0又は1であり、そしてKが0又は1である、請求の範囲第7項に記載 のポリヌクレオチド。 9.各(J.コアー.K)反復単位中に存在するヌクレオチドの合計数が20を 超えない、前記いずれかの請求の範囲に記載のポリヌクレオチド。 10.5′→3′の意味に読まれる次の一般式:H.(J.コアー.K)n・L (1) 〔式中、 “コアー”は同じ意味に読まれる6〜16個の連続するヌクレオチドの配列を表 わし、次のもの:(1)ヒト又は動物のゲノムDNAを、反復単位当り約33n tのミオグロビンタンデム反復配列を含有するプローブにより探索することによ り得られる第1のヒト又は動物のミニサテライトの共通コアー領域; (2)ヒト又は動物のDNAを、(1)を含んで成るタンデム反復配列を含有す るプローブにより探索することにより得られる第2のヒト又は動物のミニサテラ イトの共通コアー領域; (3)ヒト又は動物のゲノムDNAを、(2)を含んで成るタンデム反復配列を 含有するプローブにより探索することにより得られる第3のヒト又は動物のミニ サテライトの共通コアー領域; から選択され、 前記タンデム反復配列が3つ以上の単位から成る〕で表わされるポリヌクレオチ ド;並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチド。 11.5′→3′の意味に読まれる次の一般式:H.(J.コアー.K)・L( 1) 〔式中、 “コアー”は75%以上のコンセンサスを示すヒト又は動物のゲノムDNAの多 数のミニサテライトの共通コアー領域内からの6個以上の連続するヌクレオチド を有する配列のいずれかを示し; “コアー”は各反復単位中で同じ配列を有することは必ずしも必要でなく;そし て 他のすべての記号は請求の範囲第1項において定義される通りである〕 を有するポリヌクレオチド;並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチ ド。 12.次の式: (5′)【配列があります】(3′)(6)(式中PはGではなく、WはA又は T又はUであり、そしてXはA又はGである) 内から選択される連続する(5′→3′)コアー配列を含有する6〜36ntの 配列の3以上の反復を有するポリヌクレオチド、又はその変形体(全反復中の実 質の合計コアー配列は、同じ数の反復内の式(6)について定義された“真”の 合計コアー配列との70%以上の相同性を有することを条件とする);並びにこ れに対して相同な配列のポリヌクレオチド。 13.各反復又は変形体反復が式(6)の配列を含む、請求の範囲第12項に記 載のポリヌクレオチド。 14.連続する(5′→3′)配列: 【配列があります】(7) がすべての反復単位中に保存されており、P及びWが請求のの範囲第12項にお いて与えられた意味を有する、前記いずれかの請求の範囲に記載のポリヌクレオ チド。 15.連続する(5′→3′)配列: 【配列があります】(8) がすべての反復単位中に保存されており、そしてTがT又はUである、前記いず れかの請求の範囲に記載のポリヌクレオチド。 16.PがT又はUである、請求の範囲第12項〜第15項のいずれかに記載の ポリヌクレオチド。 17.WがAである、請求の範囲第12項〜第16項のいずれかに記載のポリヌ クレオチド。 18.再度引用された連続するコアー配列又は保存された配列が反復配列と同一 である、請求の範囲第12項〜第17項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 19.次の連続する5′→3′コアー配列:【配列があります】(7) (式中PはGではなく、WはA又はT又はUであり、そしてXはA又はGである ) を含む3以上の反復を有するポリヌクレオチド、又はその変形体(全反復中の実 際の合計コアー配列が同じ数の反復中の式(7)について定義した“真”の合計 コアー配列との70%以上の相同性を有することを条件とする)、並びにこれに 対して相補的な配列のポリヌクレオチド。 20.Wが5′末端においてAであり、そして3′末端においてT又はUである 、請求の範囲第19項に記載のポリヌクレオチド。 21.多型性ミニサテライト−長さ特異的結合特性を有するポリヌクレオチドの 製造方法であって、(i)他の多型性DNA領域に対して限定されたハイブリダ イゼーションを行うことができるDNA中の天然タンデム反復配列を同定し、 (ii)そのような結合を仮に担当する反復配列の天然コンセンサスコアー配列 を同定し、そして (iii)天然反復配列より低いゲノム−遺伝子座特異性及び高い多形性断片受 容性を示す、ミニサテライト結合性を有する天然コンセンサスコアー配列に由来 する完全又は不完全タンデム反復配列を単離するか又は人工的に造成する、こと を含んで成る方法。 22.ポリヌクレオチドが請求の範囲第1項〜第20項のいずれかにおいて定義 されている通りである請求の範囲第21項に記載の方法。 23.ヒト又は動物のDNA含有サンプルの遺伝的由来の決定において有用なポ リヌクレオチドプローブであって、ラベルされた又はマーカー成分を含むと共に 、制限エンドヌクレアーゼによるサンプルDNAの断片化により得られる対応す るDNA断片への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする程度にヒ ト又は動物ゲノムのミニサテライト領域と相同である配列の3以上のタンデム反 復を含んで成るポリヌクレオチド(変形体を包含する)を含んで成り、そして次 のこと: a)前記反復がそれぞれ、異るゲノム遺伝子座からの多数のミニサテライト中に 存在する同様な長さのコンセンサスコアー領域と70%以上相同であるコアーを 含有し;b)前記コアーが6〜16ヌクレオチド長であり;c)コアーに寄与し ない反復単位内のヌクレオチドの合計数が15以下である; ことを特徴とするプローブ。 24.前記コアーが、5′→3′と連続する配列:【配列があります】(7) 又は【配列があります】(8) (式中、PはGではなく、WはA又はT又はUである)を含有する、請求の範囲 第23項に記載のプローブ。 25.前記ポリヌクレオチドが請求の範囲第1項〜第20項に記載のポリヌクレ オチドであり、少なくとも前記反復ユニットが単鎖型である、請求の範囲第23 項に記載のプローブ。 26.請求の範囲第1項〜第20項のいずれかにおいて定義された、ラベルされ たポリヌクレオチドから成り、少なくとも反復単位が単鎖形であるポリヌクレオ チドプローブ。 27.全体として単鎖形である請求の範囲第23項〜第26項のいずれかに記載 のプローブ。 28.ヒト又は動物のDNAを含有するサンプルの遺伝的由来の決定において有 用なプローブの製造方法であって、請求の範囲第1項〜第20項のいずれかの、 又は請求の範囲第21項の方法により製造されたポリヌクレオチドにラベル又は マーカーを導入することを含んで成る方法。 29.ヒト又は動物のゲノムDNAのサンプルを同定する方法であって、該DN Aを請求の範囲第23項〜第27項のいずれかに記載のプローブにより探索し、 そして該DNAのハイプリダイズした断片を検出することを含んで成る方法。 30.前記検出される断片が、サンプルDNAのタンデム反復配列を損傷するよ うに開裂しない制限酵素により開裂せしめることにより得られる、請求の範囲第 29項に記載の方法。 31.請求の範囲第23項〜第27項のいずれかに記載の2種類以上のプローブ を用いて得られる陽性断片のパターンを比較する、請求の範囲第29項又は請求 の範囲第30項に記載の方法。 32.遺伝される疾患、異常又は形質と関連するヒト又は動物のゲノムのミニサ テライト領域に遺伝子座特異的であり、そして家庭又は血統分析において請求の 範囲第23項〜第29項の1又は複数のプローブにより形成される個々のパター ンの比較により観察される前記疾患、異常又は形質に関連するバンドの単離を介 して得られるプローブ。 33.請求の範囲第23項〜第27項のいずれかに記載の1又は複数のプローブ を用いて得られ、そして癌と関連する染色体又はDNAの異常と関連することが 観察される指紋バンドに由来するプローブ。 34.請求の範囲第23項〜第27項のいずれか又は第33項に記載のプローブ の変形であって、(J.コアー.K)のタンデム配列の少なくとも1対がコアー を含まない配列によって少なくとも2つの他の配列から分離されており、これに よってnが必ずしも3に等しくなく、他のすべての拘束が存在する変形。
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59199000A (ja) * | 1983-02-28 | 1984-11-10 | ライフコーズ・コーポレイション | 父系の決定および個々の遺伝的同一性を確立する方法 |
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-
1985
- 1985-10-17 JP JP50460585A patent/JPS62501467A/ja active Granted
- 1985-10-18 ZA ZA858045A patent/ZA858045B/xx unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59199000A (ja) * | 1983-02-28 | 1984-11-10 | ライフコーズ・コーポレイション | 父系の決定および個々の遺伝的同一性を確立する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0463680B2 (ja) | 1992-10-12 |
GB8428491D0 (en) | 1984-12-19 |
ZA858045B (en) | 1987-06-24 |
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