JPS62501467A - ポリヌクレオチドプロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １，２１Ｆとｒ顆 この発明は、ヒト又は動物のゲノムを探索（ｐｒｏｂｉＢ）するのに有用なプロ ーブとして役立つようにラベルすることができるポリヌクレオチド、及びこのプ ローブを使用してゲノムＤＮＡを固定する方法に関する。この固定方法は、例え ば、父系及び母系試験、法医学、並びに遺伝性疾患及び癌の診断において有用で ある。

２・　狐迷ぷ」紹ｌＣＭ ゲノムＤＮＡ中の遺伝子の相違を固定するだめの主要な従来方法は、制限断片長 の多望性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙ ｍｏｒｐｈｉｓｍＳ；　ＲＦＬＰ）を検出することによるものである。例えば、 Ｊ、Ｆ、Ｇｕｓｅｌｌａ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０６．２３４−２３８（１９８３ ）によるハンチングトン舞踏病を生じさせるＤＮＡ欠損の座の同定、およびＷ、 に、Ｃａｖａｎｅｅ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０５．７７９−７（１９８４）による 網膜芽腫の素因の分析を参照のこと。

はとんどのＲＦＬＰは、ＤＮＡ中の小規模な変化、通常、制限エンドヌクレアー ゼ開裂部位を形成し又は破壊する塩基置換から生ずる。ヒトＤＮＡの平均へテロ 接合性（ｍｅａｎ　ｈｅｔｅｒｏ−ｚｙｇｏｓ　ｉ　ｔｙ）は低い（塩基対当り 約０．００１）であるから、制限エンドヌクレアーゼは所与の遺伝子座における ＲＦＬＰを稀にしか検出しないであろう、検出される場合でさえ、はとんどのＲ ＦＬＰは、決して５０％を超えずそして通常は非常に低い、対立遺伝子頻度によ って決定される、雑種性を伴う２形性（ｄｉＩＩｌｏｒｐｈｉｃ）　（制限エン ドヌクレアーゼ開裂部位の存在及び不存在）に過ぎない。結果として、このよう なすべてのＲＦＬＰは決定的固体がホモ接合的である場合は常に血統分析におい て均質である。

遺伝的分析は、多数対立遺伝子変化を示す超可変領域のプローブの入手可能性に より、そして対応して高いヘテロ接合性（ｈｅ　ｔｅｒｏｚｙｇｏｓ　ｉ　ｔｙ ）により相当に単純化され得るであろう。

このような第１の領域は、Ａ、Ｒ，Ｗｙｍａｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　、　？？、　６７５４−６７５８（１９８０）ニより、　偶然に、ヒ） ＤＮＡのランダムセグメントのライブラリーから単離された。この遺伝子座の多 数対立遺伝子変化（ｍｕｌｔｉａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｔｔｏｎ）の構造的 基礎がまだ不明である。その後、そしてやはり偶然に、幾つかの他の高可変領域 がヒトインシュリン遺伝子（Ｇ、Ｊ、Ｂｅ１１等、Ｎａｔｕｒｅ　２９５３１− ３５（１９８２））　、ゼータ・グロビン遺伝子（Ｎ、　Ｊ、　Ｐｒｏｕｄｆｏ ｏｔ等、Ｃｅ１１　３Ｌ　５５３−５６３（１９８２）　、及びＳ、Ｅ、　Ｙ、 に□ｏｄｂｏｕｒｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｏ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８ ０．５００２−５０２６（１９８３））　、及びＣ−■ａ−ｒａｓ−１発癌遺伝 子（１）、Ｊ、Ｃａｐｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０２．３３−３７　（１９８３ ）　）の近傍で見出された。各場合において、可変領域は短い配列（“ミニサテ ライト”）のタンデム反復から成り、そして変化性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ）は−有基***性もしくは減数***性非同−交換（ｕｎｅｑｕａｌ　ｅｘｃｈａ ｎｇｅ）により、又は複製中のＤＮＡの滑り（ｓｌｉｐｐａｇｅ）により生ずる 反復数の対立遺伝子的相違に基く。生ずるミニサテライトの長さの相違は、反復 単位を開裂しない制限エンドヌクレアーゼを用いて検出され得る。

本発明者及びその共同研究者はすでにヒト−ミオグロビン遺伝子のイントロン中 の３３ｂｐ配列の４個のタンデム反復を含んで成る短いミニサテライトを記載し ている（Ｐ、Ｗｅｌｌｅｒ等、ＥＭＢＯＪ、ユ、４３９−４４６（１９８４）　 ）。この３３ｂｐ反復はすでに特徴付けられている上記の他のヒト−ミニサテラ イトに対して、配列における弱い類似性を示すことが注目された。この１文はミ ニサテライト領域が転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）により生ずることを推 定した。ヒト−ミオグロビン遺伝子の３３ｂｐ反復が転位性（ｔｒａｎｓｐｏｓ ａｂｌｅ）であれば、このものは、反復数の相違に基き多数対立遺伝子変化性と しばしば関連するヒト−ゲノムのクンデム反復領域のためのプローブを提供する ことヒト−ゲノムＤＮ八がミオグロビン遺伝子からの３３ｂｐ配列のタンデム反 復を含んで成るＤＮＡプローブにより探索（ｐｒｏｂｉｎｇ）された。多望性相 違が３人の個体（父、母、及び娘）のゲノムＤＮＡ中の幾つかの異る領域におい て観察され、この相違は一層大きな断片（２〜６　ｋｂ）のサイズにおいて生ず る。データーは１個より多くのミニサテライト領域の長さの相違に基く安定に遺 伝される変化性と一致した。

２訓し月１皿 −５の研究が、ミオグロビン遺伝子３３ｂρ−反復プローブを使用するのよりも はるかに効果的にミニサテライト又は超可変領域中の変化性を表示する方法でゲ ノムＤＮＡを探索することが可能であることを示した。

この発明は、ヒト又は動物のゲノムＤＮＡ中の多くのミニサテライトが異るミニ サテライト間で高度の相同性を有するＤ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域を含有するという発見 に基いている。この共通のコアー領域は短かく、約１６塩基対である。今や、少 なくとも３回りンデムに反復されるヌクレオチドの類コアー配列をその必須構成 成分として有するプローブが、ゲノムＤＮＡ中の多くの異るミニサテライト領域 を、そしてこれらの領域中のそれらのＤＮＡの相違に言及することにより個体が 同定され又は識別され得る程の精密さをもって検出するために役立つであろうこ とが見出された。これらの従来のプローブはＲＦＬＰにより与えられるのよりも 良好な程度の識別に通じるが個体について本質的に特異的である指紋（ｆｉｎｇ ｅｒｐｒｉｎｔ）には通じない。注目すべきことには、１個より多くのミニサテ ライト領域又は超可変遺伝子座への言及によってこの発明のコアープローブはＤ ＮＡを指紋採取することができることが見出され、そして通常でない程度の非自 明性を発明性に加えているのはこの発見であり、これが基本的で科学的新規性と 重要性を有する発明にしている。

コアー配列の知見から、ゲノム中の種々の遺伝子座からのミニサテライト領域と ハイブリダイズする性質を有するＤＮＡプローブを製造することができる。しか しながら、特定のコアー配列の単なる認識又は同定は、それ自体では、役立つプ ローブの製造のために不十分である。コアー領域のクンデム反復配列を含有する ポリヌクレオチド又はその誘導体を製造することも必要である。このようなプロ ーブは、ヒト又は動物のＤＮＡからのミニサテライトとして単離することができ 、又はこれとは異り合成技法によって造成することができる。好結果のハイブリ ダイゼーションを行う追加の制約を達成することも重要である。これらは、許容 され得るコンセンサス−コアーとの相同性の程度及び全体として反復単位の内及 び外の非−コアーＤＮＡの許容される長さの知見を包含する。

こうして、この発明は次の認識及び発見を用いる：（１）任意の１つのコアー配 列の知識がこの方法において使用され得ること。これはさらに次の認識を含む： （２）ゲノム中の異る超可変遺伝子座を研究することによって、必要な程度のコ ンセンサスを有する異るコアー配列が見出され得ること； （３）変化性の異るフベクトルを認識するであろうＤＮＡプローブの一層が蓄積 され得ること； （４）特定の遺伝子分類があるプローブによって、他のプローブによるよりも好 結果に達成され得ること；（５）任意の１つの分類における１個より多くのプロ ーブの使用により、同定の確率が増幅されること；（６）好結果のプローブの第 １世代の一層の研究により、より簡純で且つより好結果のプローブが、例えば合 成により製造され得ること。

こうして、この発明の第１の観点に従えば、多望性ミニサテライト−長さ特異的 結合特性を有するポリヌクレオチドの製造方法が提供され、この方法は： （ｉ）他の多望性Ｄ　Ｎ　Ａ　’ｐＭ域への制限されたハイブリダイゼーション を行うことができる、ＤＮＡ中の天然タンデム反復配列を同定し、 （ｉｉ）そのような結合を担当することが推定される該反復配列の天然コンセン サス−コアー配列を同定し、そして（ｉｉｉ　）天然反復配列よりも低いゲノム −遺伝子座−特異性及び高い多望性断片受容性を有する、ミニサテライト結合性 を有する天然コンセンサス−コアー配列由来の完全な又は不完全なタンデム反復 配列を単離するか又は人工的に造成する、ことを含んで成る。

プローブのコアー成分は同じ基礎原理に暴く種々の方法により定義され得る。最 も基本的な基礎原理はプローブの反復配列がヒト又は動物のゲノムＤＮＡのミニ サテライトに共通の、共通コアー領域からのヌクレオチド配列から成るか又はそ れを含むべきことである。この共通コアー配列は、１つのミニサテライトと他の ものとの間に高度の、例えば８０％以上のコンセンサスを示すという意味におい て“共通”である。

これらのミニサテライトは、例えば、ミオグロビン遺伝子３３ｂｐ反復配列によ りゲノムＤＮＡを探索して、この明細書において１λ３３−陽性”断片と称する ハイブリダイズした断片を得ることにより検出される。これらの断片及びミオグ ロビン遺伝子の３３ｂｐ反復は約１６ｂｐの共通コアー配列を含む。

このλ３３−陽性断片を、やはり共通コアー配列を有する他の断片を形成するた めのゲノムＤＮＡのプローブとしてそれ自体として使用することができるが、そ のなんらかの小変化を伴うこともできる。

他の原理は、コアーヌククレオチド配列が、ザンブルＤＮＡのミニサテライト領 域に効果的にハイブリダイズすることができない程短くなく、多望性をうまく検 出できない程長くないこと、例えばミニグロビン遺伝子中の３３ｂｐタンデム反 復に非常に類似することである。一般に、コアーは６ヌクレオチドないしミニサ テライトの共通コアー中に見出される最大、約１６を有すべきである。プローブ の反復配列はもっばらコアーから成る必要はなく、コアー配列のいずれかの端に 少数のフランキングヌクレオチドを含有することができる。

反復単位は、ヌクレオチドの数又は種類のいずれについても、及び反復単位のコ アー又は非コアー成分のいずれについても正確な反復である必要はない。しかし ながら、これがおよその用語であるとしても、この明細書において反復単位とし て記載しそして定義するのが便利である。ｎ反復単位のブロックはいずれかの末 端に任意のヌクレオチド配列を有していてもよ（、その程度及び種類は通常無関 係である。

この発明のポリヌクレオチドは、次の方法のいずれかにおいて定義されるものを 特に包含する。

第」」υ’ｆＪＬ ５’−３’の意味に読まれる次の一般式％式％（１） 〔式中、 “コアー”は少なくとも６個の連続するヌクレオチドを有する配列を表わし、こ のヌクレオチドは同じ意味で読まれる次の配列： ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＸＧ　（２）ＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧ 　（３）ＧＧＡＧＧＹＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧ　（４）Ｔ　（Ｃ）　Ｉ、１ＧＧＡ ＧＧＡＸＧＧ　（Ｇ）　、Ｃ（５Ａ）Ｔ（Ｃ）、ＧＧＡＧＧ八（Ａ）　ＱＧＧＧ Ｃ（５Ｂ）のいずれかの中から選択され、ここで、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ 又はＴであり、ｍは０．１又は２であ、ｐは０又はｌであり、ｑは０又は１であ り、ｎは３１以上であり； Ｊ及びＫは一緒になって反復単位内の０〜１５個の追加のヌクレオチドを表わし ；そして、 Ｈ及びＩ、はそれぞれ反復配列を挟む０又は１以上の追加のヌクレオチドであり ：そして次のこと、すなわち：（ｉ）　“コアー”並びにＪ及びＫは各（Ｊ、コ アー、Ｋ）反復ユニットで同じ配列又は長さを必ずしも有するわけではなく； （ｉｉ　）　“コアー”はさらに異るコアー配列を表わすこともでき； （ｉｉｉ　）全ｎ反復単位中の実際の合計コアー配列は、同じ数ｎの反復単位に おける式２〜５について上に定義した“真の”合計コアー配列と７０％以上の相 同性を有する；ことを条件とする〕 を有するポリヌクレオチド：並びに これに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド。

星叉少Ｚ嚢 次の一般式： ％式％（１） 〔式中、 “コアー”は同じ５　’−３’の意味読まれる６〜１６個の連続するヌクレオチ ドの配列を表わし、（１）反復単位当り約３３ｎｔのミオグロビンタンデム反復 配列を含有すプローブＤＮＡを用いてヒト又は動物のゲノムＤＮＡを探索するこ とによって得られる第１のヒト又は動物のミニサテライトの５′＝３′共通コア ー領域、（２）第１のミニサテライトの共通コアー領域を含んで成るタンデム反 復配列を含有するプローブＤＮＡを用いてヒト又は動物のＤＮＡを探索すること によって得られる第２のヒト又は動物のミニサテライトの５′→３′共通コアー 領域、及び（３）第２のミニサテライトの共通コアー領域を含んで成るタンデム 反復配列を含有するプローブＤＮＡを用いてヒト又は動物のゲノムＤＮＡを探索 することにより得られる第３のヒト又は動物のミニサテライトの５′＝３′共通 コアー領域から選択され、上記の各タンデム反復配列は３単位以上の反復である 〕 を有するポリヌクレオチド；並びに、これに次して相補的な配列のポリヌクレオ チド。

玉主■定五 次の一般式： ％式％（１） 〔式中、 “コアー”は、７５％以上、好ましくは８０％のコンセンサスを示すヒト又は動 物のゲノムＤＮＡのミニサテライトの共通コアー領域内からの６個以上の連続す るヌクレオチドを有する配列のいずれかを表わし； “コアー”は各反復単位中で必ずしも同じ配列を有するわけではなく、そして他 のすべての記号は上に定義した通りである〕 を有するポリヌクレオチド；並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチ ド。

ゑ土■定義 次の式： ％式％（６） （式中、ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴであり、そしてＸはＡ又はＧである） で表わされる配列、又はその変形体から選択される連続する（５′→３′）コア ー配列を含む６〜３５ｎｔの配列の３以上の反復を有するポリペプチド（全反復 中の実際の合計コアー配列は、同じ数の反復における式（６）について定義した “真の”コアー配列に対する７０％以上の相同性を有することを条件とする）； 並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチド。

上記の式中で、そしてあまねく、配列は通常の表記法５′→３′で示される。

この発明は、ＤＮＡの、ＲＮＡの、及びＤＮＡとハイブリダイズし得る任意の他 の種類のポリヌクレオチドを包含する。

上に定義されたポリヌクレオチドはラベルされておらず、そして２本鎖（ｄｓ） 形又は単鎖（ｓｓ）形であることができる。

この発明は、プローブとして使用するためのｓｓ形のラベルされたポリヌクレオ チド、及びこれらのラベルされた前駆体であってそれからｓｓ−プローブを製造 することができるものを包含する。

これらは好ましくは任意の常法において３３ｐ−放射性ラベルされるが、しかし この方法に代って、ハイブリダイゼーション技術においてよ（知られている他の 手段により放射性ラベルされることができ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　１９８１１ＣＮ　−ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｄｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｕｓｉｎｇ　ＰｕｒｉｆｉｅｄＧｅｎｅｓ　 、キーストン、コロラド、１９８１年３月１５〜２０日、ＶｏｌＸ　Ｘ　ｎｌ　 １９８１．６４７−６ Ｄ、Ｂｒｏｗｎ等編、に記載されているり、ＣｙＷａｒｄ等の方法によりビオチ ンもしくは同様の種でラベルされることができ、又はＡ。

Ｄ、Ｂ、　Ｍａｌｃｏｌｍ等、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　６０４ｔｈ 　ＢｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、ケンブリッジ、英 国（１９８３年７月１日の会）の方法により酵素ラベルされることさえできる。

そして、この発明の他の観点に従えば、ヒト又は動物のＤＮＡを含有するサンプ ルの遺伝子の由来の決定に有用なポリヌクレオチドプローブが提供され、このも のは、ラベルされた成分又はマーカー成分を含むと共に、サンプルＤＮＡを制限 エンドヌクレアーゼにより断片化することにより得られ対応するＤＮＡ断片への プローブのハイブリダイゼーションを可能にする程度にヒト又は動物のゲノムの ミニサテライト領域と相同である配列の３回以上のタンデム反復（変形体を包含 する）を含んで成るポリヌクレオチドを含んで成り、そして次のこと、すなわち ： ａ）各反復が、異るゲノム遺伝子座からの多数のミニサテライト中に存在する同 様な長さのコンセンサス−コアー領域と７０％以上相同であるコアーを含有し； ｂ）コアーが６〜１６ヌクレオチドの長さををし；Ｃ）コアーに寄与しない、反 復単位内のヌクレオチドの合計数が１５以下である； ことを特徴とする。

この発明はさらに、ヒト又は動物のゲノムＤＮＡのサンプルの同定方法を包含し 、この方法は、この発明のプローブにより該ＤＮＡを探索し、そしてＤＮＡのハ イブリダイズした断片を検出することを含んで成る。

この発明のこの観点は： 細胞性材料のサンプルからの全ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼを用いて断片化 し、 高可変ＤＮＡ断片を、ラベル化された成分又はマーカー成分に加えて反復コアー 成分を含有する上に定義したプローブとハイブリダイズせしめ、そして 異る長さのＤＮＡ断片に、又はさらに一般的には異る分子サイズのバンドに結合 したラベル又はマーカーの濃度を決定通常、断片化されたＤＮＡは、ハイブリダ イゼーションの前に、鎖長に従って、例えば電気泳動により分別又は分離し、そ してマーカー濃度を検知してその個々の要素が遺伝的由来に特異的である特徴的 パターンを得る。

定−義 この発明及び今までの記載中に使用される下記の定義が助けとなろう。

趨ユ斐負 １つの認められた遺伝子座又は部位におけるヒト又は動物のＤＮＡの領域が長さ 又は配列について多くの異る形態で存在する場合、それは超可変的であると言わ れる。

Ｉｊ　片夕刑（ＲＦＬＰ） これは、電気泳動後に分離されそしてプローブにより検出されたヒト又は動物の ＤＮＡ断片のパターンにおける遺伝子的多様性である。

ミニサテライト これは、短いＤＮＡ配列のタンデム反復から構成されるヒト又は動物のＤＮＡの 領域である。すべての反復単位が完全な同一を示すことは必ずしも必要でない。

（この発明のプロ−ブは条里性であるミニサテライトを含んで成る。）監皿件 個体ごとに相違を示す遺伝子、又はＤ　Ｎ　Ａの他のセグメントは条里性である と言われる。

ユヱニ」μ刀り一 本来、コンセンサス−コアー配列の意味に用いられるが、しかしそれに由来する 任意の反復される配列又は変形配列に拡張される。

且／丸スカ各−ニュ７−＜μＡ月 由来又は遺伝子座を異にする２以上のミニサテライトの反復単位間で実質的な又 は完全にマツチするものとして同定され得る配列である。

反復１旺− 所与のコアー配列又はコアー配列を含有するセグメントの完全な又は不完全なタ ンデム反復たる配列である。

定１されなコアー（配列Ｙ− それ自体の長さ内で弐（２）〜（８）の１つと完全に一致するコアー配列である 。

変月葬」旦にμ刀９一 定義されたコアー配列かられずかな程度界る（相同性５０％以上）実際のコアー 配列である。

完冷返腹ユに刀と 所与のコアー配列の又はコアー配列を含有するセグメントの正確なタンデム複製 たる配列である。

・６全　′　（配置） 少なくとも１つの単位が塩基対置換及び／又は長さにおいて少なくとも１つの他 の、中位から異る配列である。（通常、１つのプローブ配列中に少なくとも３個 のタンデム配列が存在し、プローブ配列内に少なくとも１つの定義されたコアー 配列及び少なくとも１つの変形体が存在するであろう。）■珂且Ｘ 同じ長さの２つの配列の比較において、塩基対（ｂｐ）の数がらｂｐ置換数を差 引きしたもののｂｐ数に対する％である。

区ｌ〜ヒｔ±Ｉ’Ｃｎｔ）及び塩基対（ｂｐ）は同義に使用される。両者はＤＮ Ａ又はＲＮＡに当てることができる。略号Ｃ，Ａ。

Ｇ、Ｔは常用通り（デオキシ）シチジン、（デオキシ）アデノシン、（デオキシ ）グアノシン、及びデオキシデミジン又はウリジンのいずれかを意味する。

タンデム反復配列（人工的な、又は天然、Ｑｊ離体）は完全反復であることがで きるが、しかしさらに好ましくは不完全反復である。好ましくは少なくとも２個 の反復がコンセンサス−コアー配列の不完全反復である。好ましくは、３個以上 の反復、そしてさらに好ましくは７個以上の反復がプローブ配列中に存在する。

プローブの製造は、クローニングによる天然ミニサテライトの単離及びＤＮＡ配 列決定による同定を含むことができる。

これはまた、必要とされるコアーの切り出し及びそれに続くそのタンデム反復へ の転換、又は由来を異にする断片との非同−交換の促進を含むことができる。こ れはまた、ポリヌクレオチドのクローニングを含むことができる。

他方、造成段階は同定されたコンセンサス−コアー配列又はその断片の合成を含 むことができる。コンセンサス−コアー配列は好ましくは６ｂｐ以上を含有しそ して好ましくは１６ｂρ以下を含有する。次に合成コアーのタンデム反復を造成 する。

言うまでもなく、ポリヌクレオチドは、好結果の又は部分的に好結果の中間体の クロー、−ングの後の異る時における操作の連続の結果であることができ、そし て最終ポリベブヂドが親ミニサテライトへのわずかな類似性を有するように天然 起源又は合成起源の断片を含むことができる。

この発明のプローブは次の分野において有用である。

１、　ヒトにおける父系及び母系試験。

２、例えば入植紛争及び相続紛争における家族群の立証。

３、　双生児におけるチゴシティ−（Ｚｙｇａｓ　ｉ　ｔｙ）試験。

４、　ヒトにおける血族結婚についての試験。

５、　ヒトにおける一般的血統分析。

６、　ヒトにおける遺伝的疾患の遺伝子座の同定。これにより遺伝的欠点を検出 するだめの特異的プローブの造成が可能となる。

７、法医学　（ａ）強姦の犠牲者からの***の特定、（ｂ）例えば汚れた衣類か らの血液、髪及び***の特定、 （ｃ）ヒトの遺体の特定。

８、セル・チメラリズム（Ｃｅｌｌ　Ｃｈｉｍａｅｒｉｓｍ）の研究、例えば骨 髄移植後の提供細胞対受容体細胞の追跡。

９、家畜の育種及び血統分析／証明。（これは例えば動物の純系の日常的調節及 び点検、並びに例えば競争馬及び犬の繁殖に係る訴訟事件における血統の点検を 含むことができよう。）さらに、経済的に重要な遺伝的形質との関係を示すであ ろう遺伝マーカーを提供すること。

１０、純粋なセルラインの汚染及びＥ１常酌量定作業を点検する、培養された動 物セルラインの日常的品質管理。

１１、腫瘍細胞及び腫瘍の分子異常についての分析。

１２、ポリヌクレオチド又はそれに由来するプローブは植物育種における潜在的 用途を有するものと期待される。

貝頁ｔｙｖ１■Ｖ口Ｗ肌 第１図は、ミオグロビン遺伝子の３３ｈｐ反復配列をプラスミドに挿入しそして それをクローニングする、その製造方法の模式的説明である。

第２図は種々のＤ　Ｎ　Ａブロー・ブにハイブリダイズするゲノムＤＮＡの断片 のオートラジオグラフの写真のフォトコピーであり、そしてさらにそのＤＮＡが ２つのオートラジオグラムにおいて同定された親類個体血統を示している。

第３図は、この発明の３種類の異るプローブにより探索された、親類関係にない ３人のヒトの個体からのＤＮＡサンプルのオートラジオグラフを示す。

第４図は、この発明のプローブにより探索された、９大のヒトの個体からのＤＮ Ａサンプルのオートラジオグラフを示し、その数人は親類関係にあり、そして２ 人は一卵性双生児である。

第５図は、この発明のプローブにより探索された、２人のヒト及び１７のヒト以 外の動物からのＤＮＡサンプルのオートラジオグラフを示す・ 第６図は、この発明に従って探索された、入植紛争にまき込まれたガーナ人家族 の構成員からのＤＮＡサンプルの１連のオートラジオグラフを示す。

第７図は神経線維腫症に罹患した血縁者からのＤＮＡサンプルのオートラジオグ ラフを示す。

第８図は、ミニサテライト断片の可能性ある共同受は継ぎ及び胎児性ヘモグロビ ンの遺伝的存ｍ（ＨＰＦＩ＋）の試験のために作られたＧｕｊｅｒａｔｉ血統か らのＤＮＡのオートラジオグラフを示す。

第９図Ａ及びＢは、大きな親類関係におけるＨＰＦＨ及び種々のミニサテライト の受け継ぎを示す遺伝的ダイアグラムである。

第１０図はクローン化された人工的ミニサテライトの調製を示すダイアグラムで ある。

第１１図は、新規な合成プローブにより探索された、親類関係にない２個体の胎 盤からのＤＮＡサンプルの１連のオートラジオグラフを示す。

第１２図は大きな親類関係からの探索されたＤＮＡサンプルの１連のオートラジ オグラフを示す。

第１３図は異る２つのプローブを用いて双生児について得られる種々のＤ　Ｎ　 Ａバンドパターンを示すオートラジオグラフである。

第１４図は単鎖プローブ及び２本鎖プローブを用いて形成されるバンドパターン を比較するオートラジオグラフである。

第１５図及び第１５Ａ図は、法医学サンプルから得られるＤＮＡ指紋を示すオー トラジオグラフである。

第１６図はイヌの一族から得られたＤＮＡ指紋を示すオートラジオグラフである 。

第１７図は短毛家庭用ネコの一族からのＤＮＡ指紋を示すオートラジオグラフで ある。

第１８図は２つの異るプローブを用いて種々のヒツジから得られたＤＮＡ指紋を 示すオートラジオグラフである。

第１９図は３頭の異るブタからのＤ　Ｎ　Ａ指紋を示すオートラジオグラフであ る。

第２０図はウシの一族及び追加のウシについてのＤＮＡ指紋を示すオートラジオ グラフであり：そして第２１図は異るプローブを用いる第２０図に類似するオー トラジオグラフである。

好ユニ％（社）ａ威 ファージλＬ４７．１中にクローン化されたヒトＤＮＡの１０〜２０ｋｂ　Ｓ　 ａｕ３Ａ部分のヒトゲノムライブラリーを、３３ｂｐミオグロビン反復プローブ ″ｐＡＶ３３．７とのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。３Ｘ １０’組換体のライブラリー中に４０以上の強くないし弱くハイブリダイズする プラークが同定された。これらの陽性プラークの８個の無作為選択物を精製しく λ３３．１−１５）　、そしてファージＤＮＡのサザンプロット分析を用いて、 各組換体においてハイブリダイズするＤＮＡが組換体のユニーン短（０，２〜２ 　ｋｈ）領域内に位置することが示された。配列分析は、８個の組換体の各々の この領域が反復配列の３〜２９タンデムコピーを含んで成るミニサテライトを含 有し、該反復配列の長さはλ３３．１５中の１６ｂｐ〜λ３３．４中の６４の範 囲であることを示した。はとんどのミニサテライトは整数個の反復を含有してい た。次に、λ３３．６においては、３７ｂｐ反復が基本的１２ｂｐユニツトの分 岐したトリマーから成っていた。各λ３３組換体は、各ミニサテライトを挟むク ローン特異的ＤＮＡ配列により判定した場合ヒトゲノムの異る領域を代表してい た。

８個のクローン化ミニサテライト領域は、ヒトＤＮＡのＨｉｎｆｌ消化物中でｐ ＡＶ３３．７により検出され得るβ型性２〜６ｋｂＤＮＡ断片より小さい０．５ 〜２．２ｋｂＨｉｎｆ　Ｉ　ＤＮＡ断片内に位置していた。クローン化されたミ ニサテライト領域のいずれかも多量性であるか否かを決定するため、″ｔＰ−ラ ベル化単鎖ＤＮＡプローブを各ミニサテライトの適当なＭ１３サブクローンから 調製し、そして高厳重さで、ＨｔｎｆＩで消化された１４人の親類関係にない英 国白人のＤＮＡのパネルにハイブリダイズせしめた。典型的なハイブリダイゼー ションパターンは、これらのハイブリダイゼーション条件下で各プローブがヒト ゲノムのユニーク領域を検出すること、及びこれらの領域の３個は高度に多量性 であることを示す。

上記の手順の、これ以上の詳細は例に記載する。

今や、前記のポリヌクレオチドの定義に関し、定義は次の一般式 ％式％（８） （式中Ｃはコアー配列を示し、そして他の記号は上記の通りである、） と一致する。すべての定義において、１つの単位のコアー配列は次のものと同じ でも異っていてもよい。例えば、全体として反復単位に当てはまるコンセンサス 配列と比べて１もしくは２個の途分のヌクレオチドを含有し、１もしくは２個の ヌクレオチドを欠き、又は（例えば）１〜４個のヌクレオチドが異なっていても よい。

コアーは種々の方法で定義され得る。一般的定義はコアー配列を同定することが できる手順に言及することにより得ることができる。ゲノムＤＮＡのサテライト 領域は例えば、ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＸＧ　（２）のごとき配列と比較 される。式（２）に含まれるすべての可能なＸ−ヌクレオチド長配列から選択さ れるＸ−ヌクレオチドと最大の相同性を示すミニサテライトから取られるＸ−ヌ クレオチド長配列は、コアー配列であるとされる。言うまでもなく、これはコア ーを定義する非常に狭い方法であり、そして１又は少数のコアーの６ヌクレオチ ド長、１又は少数の７ヌクレオチド長、そして１６までのヌクレオチド長をもた ら存在するであろうから“少数”である）。このように定義されたコアーに対す るこれらのコアーの平均７０％以上の相同性を全ｎ反復単位が有する程度に多様 性が存在し得ることが仮定される。反復配列内のフランキング配列ＪおよびＫは 相同性についての計算には含まれず、コアー間でのみ比較される。定義されるコ アーは種々の長さを有することができ、そして“混合”され得る。すなわち、幾 つかの反復単位においては例えば式（２）のＧＧＧＣＡＧＧＡＸＧと相同であり そして他においては例えば式（３）のＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧと相同である。従っ て、変形体は、必然的に“コアー“自体との相同性ではなく　（コアー）ｎとの 相同性として考慮すべきである。

前に定義された“第１の”定義は、上記の考慮に由来するが、しかし示されてい る式（２）〜式（５）巾、事情次第で、６〜最高１２〜１６のいずれかの長さの 配列としてコアーが定義される点において単純化される。変形体について同様の 規定が存在する。

第２の定義は、それぞれが追加のミニサテライト断片を生成し得る連続するハイ ブリダイゼーション段階としてコアーを定義する。ヒトゲノムＤＮＡの広範なラ イブラリーに対して十分な数のハイブリダイゼーションを行い、十分な数のハイ ブリダイズした断片を試験し、これらからプローブを作り、ゲノムＤＮＡを再び 探索し７、そして理論的にはこれを無限回行うことにより、ミニサテライトＤＮ Ａ中で広く象徴されるコンセンサスコアー配列の範囲に到達することが可能であ ることが容易に理解されよう。実際には、十分に広いコンセンサスコアー領域に 到達するために非常に多数回そして大規模にこれらの操作が行われなければなら ないとは予想されず、そしてそれ由に（勝手に）３回のみの探索操作が定義内に 含まれる。

“第３の”定義において、Ｗがコアー・を表わし、そして２５％（例えば１６ヌ クレオチド中４ヌクレオチド）より多く異らない多様性を伴う広く共有されるコ ンセンサスコアー領域の可能性に頼る。２５％以下の可能性ある可変性を伴う約 １６ヌクレオチド以上のコアー領域をこのように定義すれば、コアーＷはその領 域内からの６以上の連続するヌクレオチドの配列として定義される。

“第４°の定義は、合成ポリヌクレオチドに係る研究から得られた再定義された コンセンサスコア一式（６）を含む。

これらの研究は、一層短いコアー配列の他の定義を導く。

従って、好ましくは連続する（５’−３’）配列：ＰＧＧＧＣ讐Ｇ（７） がすべての反復単位中に保存され、ここでＰ及びＷは上の第４の定義において与 えられた意味を有する。Ｐは好ましくはＴであり、Ｗは好ましくはＡである。

好ましくはまた、連続する（５　’　３　’）配列：ＴＧＧＧＣＡ　（８） が全反復単位に保存される。

他の観点に従えば、連続する５　’−３’コアー配列： ＧＧＰＧＧＧＣＷＧＧＷＸＧ　（７） （式中、Ｐはｃ　−ｃ　ｉｔなく、ＷはＡ又はＴであり、そしてＸはＡ又はＧで ある） を含む３以上の反復を有するポリヌクレオチド、又はその変形体（全反復中の実 際の合計コアー配列が同じ数の反復中式（７）に関して定義された“真の“合計 コアー配列と７０％以上の相同性を有することを条件とする）、及び上記のもの と相補的な配列のポリヌクレオチドが提供される。

上記のすべての定義において、コアーは少なくとも６ヌクレオチド長であり、さ らに好ましくは７又は８ヌクレオヂドであり、そして最も好ましくは１２又はそ れより大で例えば１４〜１６である。弐（２）の配列ＧＧＧＣＡＧＧＡＸＧ　（ ３’末端の末端１０ヌクレオチド）は高コンセンサスであり、そして特に有望な ようである。

変形体コアーは、好ましくは７０％以上、そしてさらに好ましくは８０又は８５ ％以上の相同性を有する。

各反復単位内のフランキング配列Ｊ及びＫは好ましくは各端において省略され、 又は短かく、例えば０．１又は２ヌクレオチドにされ、そして好ましくはＪ及び Ｋは一緒になって２０を超えるべきではな（、さらに好ましくは２０を超えるべ きではない。反復単位内のＪ＋コアー十にの合計中の全ヌクレオチド数は好まし くは３６を、そしてさらに好ましくは３１を、そして最も好ましくは２５を超え るべきでない。

反復単位の数ｎは好ましくは少なくとも１ｏ、便利には１０〜４ｏであるが、し かし原理的には任意の数であることができ、１０．０００までの数でさえ可能で ある。

フランキング配列１１及びＩ５は無関係である。これらは省略されることができ 、又は任意の数の、例えば２０、０００までのヌクレオチドとして存在すること ができるが、このような長いプローブを用いることはあまり賢明ではない。反復 配列が５ｓ−ＤＮＡである場合でも、これらはｃｐｓ−ＤＮＡを含有することが できる。

同定方法は任意の既知の探索技法を用いることができ、その最も通常の方法はサ ンプルＤＮＡを、タンデム配列を開裂せしめないか又はそれらの探索される能力 を妨害しない無意味な程度に開裂せしめるに過ぎない制限酵素（適当であれば１ 種類又は複数種類）により開裂せしめることである。

肛　ヒトーミオ外田臣ン」市ｊシ帆伝転ｌしり身Ｇ己ム瓦復父丑血倉１を泰１孔 二ズ近裁。

このプローブの造成が（ａ）〜（ｅ）で表示される５段階を示す第１図中に模式 中に説明されている。出発ミオグロビン遺伝子（ａ）はＰ、Ｗｅｌｌｅｒ等、Ｅ ？ＩＢＯＪ、３．４３９−４４６（１９８４）により記載されている。そこに示 されているように、該遺伝子は、はとんど同一の９ｂｐ配列（第１図中ｒ）に挟 まれた３３ｂｐ配列の４個の反復から成る、第１イントロン中に位置する領域を 有する。この領域を１６９ｂｐ　仙ｆ　Ｉ断片（ｂ）中に単離し、それを末端修 復しそしてプラスミドｐ　ＵＣｌ３のＳｍａ１部位にクローニングすることによ り増幅した（Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ等、Ｇｅｎｅ１９゜２５９−２６８　（１９８２ ）を参照のこと〕。制限エンドヌクレアーゼ人ｖａ　ｎ　（Ａ）により第３及び 第４反復を開裂ゼルめることによリモノマーを単離した（ｃ）。（反復１及び２ 中の１基置換がこの部位を除去し、そして代りにＤｄｅ　Ｉ　（Ｄ）部位を形成 する。）非−同一人ｖａＩ［接着末端を介する３３ｂｐモノマーの連結により反 応単位数不明の頭：尾ポリマー（ｄ）が生成した。少なくとも１０個の反復を含 むポリマーを分取用アガロースゲル電気泳動により単離し、末端を修復し、ｐ　 ＵＣｌ３のＳｍａ１部位に連結し、そしてＥ、コリＪＭ８３中にクローン化した （Ｊ、Ｖｉｅｉｖａ等、前掲を参照のこと）。ｐ　ＡＶ３３．７と称する生じた プラスミド（ｅ）中のポリマーＤＮＡ挿入部の構造を、旦ａｍＨＩ　＋　Ｅｃｏ Ｒ工によりポリリンカーにおいて該挿入部を切り出し、α−３！Ｐ−ｄＣＴＰに より旦ａｍＨ１部位においてフィル−インラベル化し、そして人ｖａＩｒにより 部分消化することにより確認した。

ラベルされた部分消化生成物を２％アガロースゲル上での電気泳動により分離し た。ｐ　ＡＶ３３．７は（ｅ）に示すように７６７ｂｐＢａｍＨＩ一旦ｃｏＲＩ 断片中に含まれる３３ｂｐモノマーの２３反復を含有することが見出された。

（２）ミオグロビン３３ｂ　′プローブによるヒトー゛ツムのミニサテーイト令 にの゛　の配置′ バタテリオファージλＬ４７．１中にクローン化された１０〜２０ｋｂヒトＤＮ Ａ断片のライブラリー（Ｐ、Ｗｅｌｌｅｒ等、前掲、及びＷ、Ａ、Ｍ、レネン等 、Ｇｅｎｅ２０．２４９−２５９（１９８０）　）を、Ｐ。

Ｗｅｌｌｅｒ等、前掲、の方法により３２ｐ−ラベルされた、前記段階（１）中 に記載した７６７ｂｐ　ｐＡＶ３３．７挿入部とのハイブリダイゼーションによ りスクリーニングした。８個の陽性プラークの選択物を精製してλ３３．１−１ ５と称する組換体を得た。これらのファージＤＮＡのそれぞれを且１ｎｆＩ又は 且ａｅｍにより消化し、１．５％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてそ の中の３３−反復関連配列をｐ　ＡＶ３３．７　Ｄ　Ｎ　Ａとのサザン・プロッ ト・ハイブリダイゼーションにより位置決定した。各組換体は１個の“λ３３− 陽性”１釦ｆｌ及び且亜■断片を与えたが、λ３３．４及び１１は検出可能なユ ａｅＩ［Ｉ断片を与えなかった（これらの組換体中の反復領域中にＨａｅｌｌｌ 開裂部位が存在するため）。λ３３−陽性Ｈｉｎｆｌ及び且ａｅＩｎ断片を分取 用ゲル電気泳動により単離し、所望により末端修復し、そして２本積Ｄ　Ｎ　Ａ 　Ｍ１３３ｍｐ８の盈ｍａ１部位に平滑末端連結した（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ等、Ｇｅｎｅ１９．２６９−２７６（１９８２）　）　、　Ｅ、 コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩに形質転換した後隅性５５−Ｍ１３組換体を単 離し、そしてジデオキシヌクレオチド・チェイン−ターミネーション法により配 列決定した。すべてのλ３３−陽性断片がタンデム反復領域を含有しており、こ れは幾つかの場合には直接配列決定することができた。反復領域が配列決定プラ イマ一部位から遠すぎる他の場合には、Ｍ１３挿入部を制限エンドヌクレアーゼ による開裂によって短縮し、そして再度配列決定した。

λ３３−陽性断片の構造を、λ３３．１、３３．３、３３．４、３３．５　。

３３．６．３３．１０．３３．１１及び３３．１５と称する８個の地図の形で後 に示す。使用された実際の制限酵素及びヌクレオチド中の断片の長さはλ３３． １：旦憇■、２０００；　３３．０　：１釦ｆｌ、４６５；３３．４：且ｉｎｆ 　Ｉ　、　２０００；　３３．５：　旦ｉｎ　ｆ　Ｉ　、１６００；　３３．６ ：１耗■、７２０；　３３．１０：旦憇■、７２０；　３３．１１：１釦ｆ　Ｉ 　、　１０２０゜ｃｃａｇ　ｔａ　ｔｃｃ　ｔｇｇｇａａ　ｔ　ｔｃｇ　ｔａａ 　ｔｃａ　ｔｇｇ　ｔｃａ　ｔａｇｃ　ｔｇ　ｔ　ｔ　ｔｃｃ　ｔｇ　ｔｇ　狽 ■≠■ ラムダ　３３．１０ ａ　ｇａｃａｃ　ｔｇｃｃｃ　ｔｇｇ　ｔｇＢｃ　ｔｃ　ｔｇａｃｃｅｅｃ　ｔ ｇｃａｇｃｃ　ｔｃｅ　ｔａ　ｔｇｅ　ｔｃ　ｔａ−−−−−ｔｇｃ　ｔ　ｔｇ ｇｇｇｃａ　ｇｃａｃ　ｔｃａｃａｃａｃａｇ　ｔａａｇ　ｔｇｃｃｅａａｇ　 ｔｃａａａ　ｔｇａａａ　ｔａｃｃｔａｃａｇａ　ｔｇａｇｇ　ｔｇ　ｔｇ　ｔ ｇｃ　ｔｔａ　ｔ　ｔｃ　ｔｃ　ｔｇ　ｔｇｃａａｇａ　ｔ　ｔ　ｔｃａｇａｇ @ｔ （３）　λ３３−”　の「′西　■　に　しそしてそれに丑　される丑［コアー ”西　１の　および６各領域の反復配列を、ドツトマトリクス分析を用いて、ｐ 　ＡＶ３３．７中のミオグロビン３３ｂｐ反復配列と、及びその逆方向相補体と 比較した。非常に顕著に、ミオグロビン３３ｂｐ反復配列とλ３３−陽性断片の コンセンサス反復配列との間に配列類似性の１つの小さい明瞭な領域が見出され た。同じ領域が８個のすべてのλ３３断片の反復により共有されており、そして “共通コアー”と称されよう。下記のチャートはその比較を示す。

このチャートにおいて、前記段階（２）において決定された各コンセンサス配列 の全体が示される。これらは、ミオグロビン３３ｂｐプローブ中及びヒト−ゲノ ムＤＮＡから単離されたλ３３−陽性断片中のタンデムに反復する部分である。

このチャートは共通コアー領域を大文字スクリプトの１６ヌクレオチド長として 示す。

共通コアー領域 ＊この配列はトリマーであり、従ってフランキング領域はコアーに寄与する。

やはり、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、−は欠けたヌクレオチドで ある。これら１６ヌクレオチドについて実質的な程度の一致が存在し、その８個 は１００％の一致を示し、そして９番目の“Ｘ”はＡ又はＧのいずれかである範 囲で一致する。これら９ヌクレオチドには底列にアンダーラインが付されており 、共通コアー領域のヌクレオチドを示す。

小文字スクリプトで示されたタンデム反復配列の残基が共通コアー領域の縁に存 在する。各反復コンセンサスの始／終端が記号マにより特定され；λ３３．４及 びλ３３．１５の場合には非−整数の反復が存在し、そしてそのために別々の反 復開始及び終端が異る記号で示されている。共通コアー領域は複雑な分析によっ てのみ同定され得たことが認識されよう。

なぜなら、これはしばしばλ３３−陽性断片の１個のコンセンサス配列に全体と して属さず、そしてミオグロビン遺伝子３３ｂＰ反復の２個の連続する配列にま たがるからである。

この発明の範囲内にあるものとして定義されるポリヌクレオチドとの一致の程度 を説明するため、種々の決定要素を次の第１表に示す。

（４）多−型性」ヨトニゲノー表耽Ｎムー脈片涛ｊ個次ｐ区３３二」味性世り矛 ４とブ」巳−：ブーζ−の、Ａイニ４．ジノζ−イ二虻−二−クーしン」ごよ− チー複街委−ｔｂＪＬ不、：、、４ｓ−ｙ発甚第２図に関し、英国系ニーカサス 人（１〜６）の無作為サンプル及び大きな英アジア家系（７〜１８）の選ばれた 構成員から採取された白血球からＤＮＡを調製した。血統は便宜上男性を示す正 方形、女性を示す円形、及びこれらの間の線による結婚により示される。いとこ 間の２件の近身結婚を両親間の２木線で示す。ＤＮＡの１０ｕｇのサンプルをＨ ４ｎｆＩで消化し、２０ｅｍ長の２％アガロースゲルを通して電気泳動し、その 場で変性し、そしてプロッティングによりサルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ） ニトロセルロースフィルターに移した。

単鎖の３２ｐ−ラベル化ハイブリダイゼーションプローブを、ミニサテライト（ クンデム反復）領域を含有するＭ１３組換体から調製した。使用した正確なプロ ーブは後で記載する。

手順は次の通りとした。約０．４μｇの単鎖ＤＮＡを４ｎｇのツクーマー配列決 定プライマー団ル、Ｄｏｃｋ匈ｏｒｔｈ等、ＮｕｃｌｅｉｅＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ 、　９、１６９１−１７０６（１９８１））と、１０ｔｔｌの１０ｍＭ１’１ｇ ｃｆｆ２　、’１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−１４Ｃｊ！　（ｐＨ８，０）中で６０℃ にて３０分間アニールした。プライマー延長を、１６μ２の８０ｕＭ　ｄＡＴＰ 、　８０　、ｌｊＭ　ｄＧＴＰ、　８０　μＭ　ｄＴＴＰ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　−１１Ｃ！！　（ｐ）［８，０）　、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び３　ｐＥ　 （３０ｕ　Ｃ３）ｉｒ　−”Ｐ　−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ　ｍｍｏｌｅ−’） 及び１．ｃｒｊ？の５ユニツトμｌ　−’　Ｋｌｅｎｏ−断片（ベーリングー） を添加し、そして３７℃にて１５分間インキュベートすることにより行った。延 長は２．５ｔｔｌ！の０．５　ｍＭｄＣＴＰを添加しそして３７℃にてさらに１ ５分分間上−リンク（ｃｈａｓｉｎｇ）することにより完成した。

じチェーリンク”　（Ｃｈａｓ　ｉｎｇ）とはＭ１３ｓｓ　Ｄ　Ｎ　Ａの鋳型上 にｄｓＤＮＡの輪を完成するためにｄＮＴＰ混合物苓添加ｒることを意味する。

ＤＮＡを、挿入部中又は挿入部に対し７て遠位のＭ１３ポリリンター中の適当な 制限エンドヌク！／ア・−上部位において開裂せしめ、１／１０容量の１．５　 Ｍ　Ｎａ１１（、０，１Ｍ　ＤＫＴＡを添加することにより変性し、そしてプラ イマーから伸びる３２ｐ−、ラベル化単鎖ＤＮＡ１ｔｌｒ片を１．５％低融点ア ガロースゲル（シー・プラク）による電気泳動によって回収した。切り出された バンド（比活性＞　１０９ＣｐＨ１／、！ｊｇ　ＤＮＡ）を１ｍｇのアルカリ奪 取（ｓｈｅａｒｅ）　シたキャリヤーヒト胎Ｑｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ（０，３ＭＮａ０ １４、２０　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で１００℃にて５分間奪取し次にＨ（Ｊにて再中 和）の存在下で１００℃にて溶融せしめ、そＬ７てハイブリダイゼーションチャ ンバーに直接加えた。キャリヤーＤＮＡはまた反復ＤＮＡ配列へのその後のハイ ブリダイゼーションを抑制するためにも役立った。

使用した正確なハイブリダイゼーションプローブは、（Ａ）３３．１、ミニサテ ライト（６２ｎｔ配列の２６反復−１６１２ｎｔ）　＋約３６０ｎ　ｔのフラン テングヒトＤＮＡを含む約２０００ｎｔサブクローン化Ｈａｅｌｌｌ断片；　（ Ｂ）　３３．４、２０１５ｎｔ）ｆｉｎ　ｆ　Ｉ断片中に含まれるミニサテライ トのプライマー近位側の６９５ｎ　を非−ミニサテライトＥｃｏＲＩ断片；及び （Ｃ、Ｄ　、　Ｅ）　３３．１５　、λ３３．１５ミニサテライト配列（上に示 した共通コアー領域から平均２ヌクレオチド異る、１６ｎｔ配列の２９反復）　 ＋１２８ｎｔフランキングヒトＤＮＡを含む５９２ｎ　ｔサブクローン化断片、 であった。Ａ、Ｊ、　Ｊｅｆｆｒｅｙｓ等、Ｃｅ１１２１、５５５−５６４（１ ９８０）により記載されているようにしてハイブリダイゼーションを行った。

但し、バンクグラウンドラベル化を低くするためデキストランサルフェートを６ ％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレンゲルコール６０００により置き換えた。フィルターＡ 及びＢを０．５　ｘｓｓｃ中で６５゛にて一夜ハイブリダイズせしめ、そして６ ５℃にて０．２ＸＳＳＣ中で洗浄した。フィルター〇−Ｅはハイブリダイズせし め、そしてＩｘｓｓｃ中で６５℃にて洗浄した。フィルターを固定したタングス テン酸強化スクリーンを用いて一８０℃にて１〜３日間オートラジオグラフ処理 した。

第２図に示すように、反復コアープローブ３３．１５は且ｉｎｆ■で消化された ヒトＤＮＡにおいてハイブダイズする断片の極めて複雑なプロフィールを検出し た。最大（４〜２０ｋｎｔ）助ｆＩ断片のみが十分に分離され得、そしてこれら はハイブリダイゼーションプロフィールが固体特異的ＤＮＡ“指紋″を提供する 程度に極度の多望性を示した。

血統分析は、いとこ結婚の単一の血縁関係（第２図の１６〜１８）の間でさえ、 すべての個体が識別され得る程の、極度の多望性の多様性を確認した。第２図中 の家族＜Ｄ、Ｅ）は、大Ｈｉｎｆｌ断片のほとんどが各親から子孫のいくらかに のみ伝達されることを示し、これによって、これらの断片のほとんどかへテロ接 合状態で存在すること、及びこれらの大きな超可変断片のへテロ接合性は１００ ％に達しなければならないことが示される。これに対して、子孫中のすべての断 片は一方又は他方親に起因せしめることができ（唯１の例外を伴って）、そして それ由に１セントの安定に遺伝される遺伝マーカーを提供する。特異的に父から むすこに、又は母からむすめに伝達されるバンド屯奏モ犬、　（フィルターＤ、 第２図を参照のこと）。これはそれぞれＹ及びＸリンケージを除外し、そしてこ れらのミニサテライト断片が主として常染色体に由来することを意味する。これ らのＤＮＡ断片が常染色体のセット中のどこに由来するかはまだ知られていない が、これらは１つの常染色体の単一の領域に由来するのではない。そうではなく 、子孫中で独立して分離する親断片の対が同定され得る（フィルターＤ、第２図 を参照のこと）。正確には、少なくと６１のＡＢ又は−一子孫が存在すれば、１ 方の親における（そして他方から欠けている）１対のバンドＡＢは対立遺伝子的 ではあり得ず；　Ａ−又は−３組換子孫の存在はさらに、Ａ及び８間の密接なリ ンケージの欠如を確立する。第２図り中に示される家族のもとのオートラジオグ ラフの注意探し）検討は、それらの規準により、母における少なくとも１０個の 分離可能なバンドを示し、その内の８個は相互に非対立遺伝子的であり、そして 密接にリンクしていない。他の２個のバンドはそれぞれ８個の非リンク断片の１ つの対立遺伝子であるかもしれず、ここで八−及び−Ｂ子孫のみが分析される子 孫の限定された数においてのみ観察され、但しこのような少数のサンプルは、こ のような断片対が単一遺伝子座の対立遺伝子であることを証明するには十分でな い。

結論として、コアープローブは、少なくとも幾つかの非すンク超可変遺伝子座上 で同時に有用な情報を与えることができる。この結論は例８においてさらに詳細 に検討される。

他方、他の２つのプローブ（フィルターＡ及びＢ、第２図）は、この発明に従わ ず、１個又は２個のバンドを与えるに過ぎず、そして多くの異るβ型性領域を同 時に検出することができず、そしてそれ由に一般的診断に用いることができない 。

班又 ヒトＤＮＡ　の　たなセントの口可・令すを　ｌＪ　るためのプローブ　の゛　 ■の゛づ　（コアー）のクローン化λ３３−陽性断片λ３３．５及びλ３３．６ に由来する他の２つのプローブを例１、段階（４）と同様にして調製した。

３３．５プローブはＭ１３ｍｐ８中にクローン化された３０８ｎｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ 断片から成りそして上記のコンセンサス配列の１４反復を含んで成り、これは７ ０ｎｔフランテングヒトＤＮＡと共に共通コアー配列の１７ｎｔ長の変形体であ る。３３．６１０−ブは１８反復の３７ｎｔ配列を含み、今度はこの配列は共通 コアー領域由来の約１２ｎｔの短縮配列の３反復＋その５′−末端における追加 のＴＣを含んで成る。１８　Ｘ　１７ｎｔ反復ブロックは９７ｎｔヒトＤＮＡに 挟まれていた。３７ｎｔ配列の構造は次のように表わすことができる。

ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣ ＴＧＧ　ＡＧＧ　Ａ−Ｇ　ＧＧＣ（又はＴＧＧ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　Ｇ−Ｃ）ＴＣ ＣＧＧ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＧＧに のプローブは同様にしてＭ１３ｍｐ８にクローン化された。

後の記載において、１ｉｎｔコンセンサス配列ＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧがこのプ ローブのために与えられる。

両プローブを３２ｐによりラベルし、そして例１１段階（４）と同様にして１４ の親類関係にない白人のパネルからのヒトＤＮＡにハイブリダイズせしめた。両 プローブは複雑な１セツトのハイブリダイスする断片を検出し、その多くは極度 にβ型性の変化を示した。３３．５により検出される幾つかの断片は新規であり 、そして３３．１５コアープローブによっては今まで検出されていないものであ る。３３．６プロープはほとんど完全に新しいセントのミニサテライトを検出し 、そしてこれらの正しいうけ継ぎが血統分析により証明された。（例８を参照の こと）。

次の例はこの発明をさらに説明しそして例示する。

サンプルＤＮＡの消化は好ましくは、ヌクレオチドの４塩基対を認識する制限エ ンドヌクレアーゼを用いて行われる。

最も長い超可変断片についてのＤＮＡ指紋パターンが使用される４ｂｐ認識制限 エンドヌクレアーゼから太き（独立していることが見出された。このことは、こ れらの大断片がより長いミニサテライトに由来するのではなく、そしてそれぞれ が、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を欠きそして正常な高密度の４ｂｐ開裂部 位を含有するヒ）ＤＮＡに挟まれた完全長の均一なミニサテライトを含有するこ とを強く示唆する。これは、これらの大ミニサテライト断片のほとんどがリンク しておらずそして独立して血統中に分かれることを示す前記の例及び例日におい て示される結果と一致する。

好ましい態様においては、ＤＮＡのサンプルを、２つの異る指紋をもたらす別々 のハイブリダイゼーションにおいて、２つの異るプローブ、例えばラムダ３３． １５及び３３．６断片からのプローブを用いて、二重指紋採取する。２人の無関 係の個体が同じ指紋を有する、すでに低い確率が、この手段によりさらに低下す る。例えば、例４は、好ましくは４ｋｂ末端の長さの不完全に分離するハイブリ ダイズＤＮＡ断片が無視される場合でさえ１０−１９という低い確立を示す。

この発明は父系試験の方法を含む。子におけるβ型性ミニサテライト断片の約半 分が父に由来し、そしてこれらの父系断片は母及び子のＤＮＡ指紋の比較により 同定することができる。これらの父系断片のすべてが通常父のＤＮＡ中に存在す るであろう。プローブ３３．１５及び４ｋｂ以上の長さのＤＮＡ断片を用いて、 仮定の父が子において典型的に同定される６つすべての父系特異的ＤＮＡ断片を 偶然に有する確率は１０−’のオーダーであり、そして両プローブ３３．６及び ３３．１５の使用はそれを１０−ｓのオーダーに低下せしめることが予想される 。

当然、正確な確率は正確な分離及び得られるＤＮＡパターンの複雑さに依存し、 そして４ｋｂ未満の長さの追加の父系断片が分析され、又は第３のプローブが用 いられれば、改善されるであろう。

ＤＮＡ指紋のため、１滴のヒト血液から十分なりＮＡ（０，５〜５マイクログラ ム）を迅速に単離することができる。

そして、そのＤＮＡがすでに指紋採取されている２人＋２人の姉妹を含む個体の 無作為パネルからＤＮＡ指紋が作成された。２人のあらかじめ特徴付けられた個 体はＤＮＡ指紋比較に基いて容易に且つ明瞭に同定することができ、実質的な数 のミニサテライト断片を共通に有する２人の姉妹も同様であった。

ＤＮＡは所与の個体の種々の細胞から採取することができ、すべて同じ指紋を与 える。従って***及び血液ＤＮＡについてＤＮＡ指紋は識別されず、−卵性双生 児のパターンも同様である。さらに、血液ＤＮＡのＤＮＡ指紋と、同じ個体に由 来するエプスタイン−バールウィルスで形質転換されたリンボブラストイドセル ラインから単離されたＤＮＡとの比較により示されるように、パターンは培養細 胞においても維持されるようである。

この発明を適用することができるヒト以外の動物にはほとんどの哺乳類、鳥、両 槽類及び魚が含まれる。例えば鶏、ハムスター、ラビット、マウス、スズメ、マ グソダカ、カエル、イモリ及び魚である。鶏の場合、ハイブリダイズするＤＮＡ 断片の非常に複雑な不鮮明な部分が生成した。Ｈａｅｍによる消化が“明瞭”な 指紋を残して不鮮明部分を除去した。従って、鶏のＤＮＡはまた、その反復単位 が１又は複数の且ａｅｍ開裂部位を含有する長いコアー含有サテライトを含有し 、従ってＨａｅｌＩ［による開裂が、ＤＮＡ電気泳動中にゲルの底部に泳動除去 される非常に小さいＤＮＡ断片にこのサテライトを縮小すると考えられる。時お り、他の動物が不鮮明なバンドを生成し、そしてこれらは、一層長い断片を開裂 せしめる適当な酵素により４）ＮＡが消化される場合、分離可能となるであろう と考えられる。

次の追加の例において、温度は°Ｃである。

例−亀 Ａ、Ｊ、Ｊａｆｆｒｅｙｓ、　Ｃｅ１１１８−１１−Ｌ　Ｏ（１９７９）により 記載されているようにして新鮮なヒト胎盤からＤＮＡを中離した。３つの個々の 胎盤を使用し、１〜３と標識した。Ｉ）ＮＡの８マイクムダラムのサンプルを、 完全消化を助けるため４ｍＭスペルミジントリクロリドの存在下でＨｉｎｆｌ及 び／又はΣ憇３Ａで消化し、フェノール抽出後にエタノール沈澱により回収し、 そして２０ｃｍ長の０．６％アガロースゲルを通して３０Ｖにて約２４時間、１ ．５　ｋｂ長未満のすべてのＤＮＡ断片がゲルから泳動除去されるまで電気泳動 した。次に、ＤＮＡをプロッティングによりサルトリウム−ニトロセルロースフ ィルターに移した。高圧活性（１０９ｅｐｍ”　Ｐ　／マイクログラムＤＮＡよ り大）単鎖Ｍ１３ＤＮＡ、プローブを例１、段階１に記載されているようにして 調製した。使用された正確なプローブは＝（ａ）　λ３３．５ミニサテライト（ １７ｎｔＸ１４反復）のほとんど十約６０ｎｔフランキングヒトＤＮＡを含んで 成る、Ｍ１３ｍｐ８のＳｍａ■部位にサブクローニングされた、２２０ｎｔＨａ ｅＩＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片から成る３３．５プローブ；（ｂ）ミニサテライト＋ 約５０ｎｔフランテングヒトＤＮＡから成る、Ｍ１８ｍＢのΣ＝Ｘ部位にサブク ローン化された、７２０ｎ　を且ａｅｌｌｌ断片から成る３３．６ブローブ；及 び（ｃ）例１、段階（４）と同じ３３．１５プローブ（これは、ミニサテライト ＋１２８ｎｔフランキングヒトＤＮＡを含む、Ｐｓｔ　Ｉ　＋　Ｓｍ５−１で消 化されたＭ１３ｍｐ１９　Ｄ　Ｎ　Ａ中にサブクローン化された、５９９ｎｔＰ ｓｔ　Ｉ　−ＡｈａｌＩＩ断片である）であった。

サザンブロソトハイブリダイゼーション及び洗浄は、Ｉｘｓｓｃ中で６５℃にて 、例１、段階（４）においてフィルター（＞Ｅ！７ついてずでに記載し７たよう にして行った。フィルターを、室温にて強化スクリーンを用いないで４日間オー トラジオグラフ処理した。

各プローブは異る断片パターンを生成し、その複雑さは使用されるテＩ・ラヌク レオチド制限エンドヌクレアーゼ゛から大いに独立である。第３図は得られたパ ターンを示す、ｄｋｂ長未満の多形性断片の分離はＨｉ＋ＢｆＩ＋〜Ｓ」旦３Ａ による二重消化において改良され、これは、１又は複数の反復単位内に蓄積され た一達ｕ３Ａ開裂部位を有する比較的分かれたそして不変の且１ｎｆｌミニサテ ライト断片によりおそらく生ずるバンクグラウンドハイブリダイゼーションの除 去に基く。二重消化においては、プロ・−ブ３３．１５により検出される分離可 能な多望性断片の数は、はとんどの又はすべての単復争位中に盈憇３Ａ開裂部位 をおそらく含有する長い阜消化化ミニサテライｌ−断片の約２０％を失うという 犠牲において、個体当り約１５から約２３に増加することができる。

ｕ− ２０人の血縁のない英国の白色人種の無作為抽出試料か１″）採取したヒト血液 ＤＮＡ８マイクログラムの試料を１釦ｆ　１で消化し、例３に記載したミニザテ ライトブローブ３３．６又は３３．１５を用いてサチン法によりハイブリッドを 形成した。各ＤＮＡの指紋（個体Ａ）を隣接ゲルトランクにおけるパターン（個 体Ｂ）と比較し、Ｂには明らかに存在しない、Ａにおけるバンドの数及びＢにお 番、）るほぼ同じオートラジオグラフ強度の同時泳動対応部を有するバンドの数 を記録した。下記の表に示した結果は、すべて対での比較に関する平均値である 。Ａにおける夕景（約６％）の付加的な弱いハイブリッド形成断片は、Ｂにおけ る強いハイブリッド形成断片と一致した。このような場合には、Ａにおけるバン ドがＢにも存在するか否かを決定することができないので、このような断片を無 視した６Ａ及びＢにおける同時泳動バンドが、常にＬＱミニサテライト座の同一 対立遺伝子である場合には、Ａにおける対立遺伝子がＢにも存在する平均確率Ｘ は、＝２（１−ｑＺ、従ってｑ＝１−（１−ｘ）”２によって平均対立遺伝子頻 度（同型接合性）ｑに関係する。実際、Ａ及びＢにおける同時泳動バンドの（未 知）割合は、異久エミニサテライト座から偶然に誘導され、従って平均対立遺伝 子頻度及び同型接合性の概算値は最大であり、ミニサテライト断片の電気泳動分 離に左右される。

第１表に示した確率は、示したＤＮＡの個々のサイズ断片に関するものである。

指紋の最も読みやすい部分、すなわち、大きさが４ｋｂ以上のすべてのＤＮＡに 関する全体的確率を得るため、３個の数値を組合せなければならない。例えば、 個体Ａ中のプローブ３３．１５によって検出されるすべての断片がＢにも存在す る平均確率は０．ＯＢ”・’　Ｘｏ、２０’−’　Ｘｏ、２７６−’　＝３　Ｘ 　１０−目である。Ａにおける２種のプローブ３３．１５及び３３．６によって 検出されるすべての断片がＢにも存在する確率は、５　Ｘ　１０−”である。

第２表 ３３．６１０−２０２．８−’：１．ＯＯ，１１０，０６６−１０５，１±１． ３　０．１８　０．０９４−６　５．９±１−６　０．２８　０．１５３３．１ ５１０−２０２．９　：：ｉ、ｏ　Ｏ，０８０，０４６−１０５，１±１°１　 ０．２０　０．１１４−６　６．７±１．２　０，２７　０．１５形 この例は、ＤＮＡ指紋の体細胞安定性及び父子鑑別への用途を説明するものであ る。

ＥＢウィルスによって形質転換され、液体窒素中に貯蔵されたリンパ芽球細胞系 統を２年後に液体培養で再び株化した。

これらの培養したリンパ球を住理食塩液で２回洗浄し、リンパ球ベレット及び白 血球からのＤＮＡをＡ、Ｊ、ＪｃｆｆｒｅｙｓによってＣｅ１１．１８巻１〜１ ０　（１９７９）に記載されようにして製造した。***から集めた***を、ＳＤ Ｓで溶解する前に、室温で５分間ＩＭ２−メルカプトエタノールで処理した以外 は同様にして***ＤＮＡを製造した。ＨｌｎｆＩで消化し、プローブ３３．６（ ａ）又は３３．１５　（ｂ）でハイブリッド形成したＤＮＡの５マイクログラム の試料を使用して例３に記載したようにしてＤＮＡ指紋を製造した。

ｉ汁１ この例は、種々のを椎動物のＤＮＡにおける極めて多形の領域を検出するための 本発明のプローブの使用を説明するものである。

鶏、すずめ及びちょうげんぼうから採取した血液、うさぎ及びマウスの肝臓、ヒ トの胎盤並びに蛙及び魚の消化管を除去した死体からＤＮＡ試料を製造した。８ μｇのＤＮＡ試料をＨｉｎｆｌで消化したが、鶏のＤＮＡについてはＨｉｎｆｌ で消化した。制限消化物を０．６％アガロースゲルを通して電気泳動し、変性し 、サルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ニトロセルロースフィルターに転移させ 、ヒトミニサテライトプローブ３３．１５を用いて前記のようにしてハイブリッ ドを形成した。

ハイブリッド形成の厳格さは１ｘｓｓｃ中で６５℃であった。

結果を、下記の試料について第５図に示す。

１．２　：血縁のないヒト胎盤ＤＮＡ ３　：アラスカ及びウィーンホワイト種のＦ１ハイブリッドからのウサギＤＮＡ ４　：アラスカ種からのウサギＤＮＡ ５．６　：野性で捕獲された２匹のギリシャマウスからのマウス（Ｍｕｓ　ｍｕ ｓｃｕｌｕｓ）　ＤＮＡ７　：近交系ＤＢＡ−２からのマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓ ｃｕｌｕｓ）ＮＡ ８　１近交系Ｃ５７／ＢＬＩＯからのマウス（ル捷−ｒｎｕｓｃｕ１ｕｓ）　Ｄ 　Ｎ　Ａ ９．１０：鶏ＤＮＡ　：注、ＤＮＡを１憇■で消化した。

１１．１２：すずめＤＮＡ １３．１４．１５．：ちょうげんばうＤＮＡ１６．１’７：蛙（Ｘｅｎｏｐｕｓ 　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａ１８．１９：小魚ＤＮＡ 試験したほとんどすべてのを椎動物から有効な種々のＤＮＡ指紋が得られ、明ら かにヒトＤＮＡ指紋と同程度に情報を与えることが判る。

また、Ｈｉｎｆｌで開裂したニワトリＤＮ’Ａは、ハイブリッド形成成りＮＡの あまり強くないが、極めて複雑な不明瞭部分く図示せず）を生じた。しかしなが ら、ＨａｅＩＩ［で消化すると、この汚点は除去され、きれいな多形指紋パター ンを生じた。

２つの近交系のマウスは、野性マウスより簡単な指紋を有する。これは、野性で は、はとんどの超可変ミニサテライト座が異型接合性であるが、近親交配すると 、同型接合性であり、近交系ではハイブリッド形成りＮＡ断片の数を半減するか らであると考えられる。

下記の例は、前記の特定のプローブの適用を更に説明するものである。

例ｊ− この例では、従来の遺伝的方法では、解決が不可能ではないにしても、極めて困 難であった移民の場合へのＤＮＡ指紋分析の使用を記載する。

この事例は、英国で生まれ、父親と再会するためガーナへ移民し、その後、母親 、兄弟及び２人の姉妹と再び一緒になるためため一人で英国へ戻ったガーナ人の 少年に関する。しかし、そこに、血縁のない少年又は全員がガーナで生活してい る母親の姉妹のうちの一人の息子とすり換えが起こったことを示唆する証拠があ った。その結果、帰国する少年は、英国への居住を許ｏＪされなかった。その家 族の弁護士の請求により、少年の母親を決定する分析が行われた。事を複雑にす るので、父親も、母親の姉妹も分析に利用されなかった。更に、母親は、少年が 彼女の息子であることを確信していたが、彼女は息子の父親については確かでな かった。従って、家族の利用しうる人員（母親Ｍ、兄弟Ｂ、姉妹Ｓ１及びＳｌ並 びに問題の少年Ｘ）から採取した血液ＤＮＡ試料からのＤＮＡ指紋を、それぞれ 、ヒトＤＮＡにおいて超可変ミニサテライトの異なる組み合わせを検出する、前 記の２種のミニサテライトプローブ３３．６及び３３．１５に対するサザン法に よるハイブリッド形成によって製造した。

母親（Ｍ）、問題の少年（Ｘ）、彼の兄弟（Ｂ）、姉妹（Ｓ１１．Ｓｌ）及び血 縁のない個体（Ｕ）からの血液ＤＮＡの８μｇの試料をＨｉｎｆｌで消化し、０ ．７％アガロースゲルにより電気泳動し、プローブに対してサザン法でハイブリ ッドを形成させた。オートラジオグラフを第６図に示す。母親（Ｍ）のＤＮＡ指 紋に存在する断片を短い水平線で示す。Ｍには存在しないが、問題となっていな い同胞（Ｂ、Ｓｌ、Ｓｌ）の少なくとも一人に存在する父性断片は、長い線で示 されている。Ｘに伝達された“母性”断片及び父性断片は、点で示されている。

ＸのＤＮＡ指紋は、付加的分離断片を含まない。種々の照射で取ったオリジナル オートラジオグラフからすべての断片を記録した。確実には記録できず、特にゲ ルの底部に向かう、部分的に分解された、比較的に弱いバンドは無視した。

第一工程は、超可変断片のパターンからＸの父性を確定することであった。父親 を利用できなかったが、彼のＤＮＡ指紋の大部分は、３人の問題になっていない 同胞（ＢＳ３１、Ｓｌ）の少なくとも一人に存在するが、Ｍには存在しない父性 異性ＤＮＡ断片から再構成することができた。こうして同定された３９の父性断 片のうち約半分が、ＸのＤＮＡ指紋に存在した。ＤＮＡ断片は、血縁のない個人 のＤＮＡ指紋（第６図における個人Ｕ参照）の間で共有されるのは希であるので 、これは、ＸがＢ、Ｓｌ及びＳｌと同一の父親を持つことを極めて強く示唆する 。これらの父性異性ＤＮＡ断片を除外した後、Ｘには４０個の断片が残りそのす べてがＭに存在していた。このことは、ＭがＸの母親であり、従ってＸ、Ｂ、Ｓ 】及びＳｌは真実の同胞であることを強く証明する。

−人の人のＤＮＡ指紋における断片が無作為に選択した第二の個体中に存在する 平均確率は、北口−０フパ人では約０．２であることは、既に上記した。父及び Ｍに関する対応する数値は０．２６であり、これらのガーナ人におけるＤＮＡ指 紋変異性は、北口−０フパ人のそれと有意には異ならないことを確定する。下記 の確率概算において、すべてのバンドが０．２６の均一な確率で共有されるとい う極めて控え目な仮定を行う（以下に、数量化する）。

第−の問題は、Ｘがこの家族の血縁であるか否かである。

Ｘのｒ）Ｎ　Ａ指紋は、６１の記録可能な断片を含み、そのすべてがＭ及び／又 は父親に存在する。Ｘが血縁を有しない場合には、彼のバンドのそれぞれがこれ らの両親に存在する確率は、１−　（１−０，２６）”　＝０．４５である。従 って、Ｍ及び／又は父親がＸのバンドの６１全部を偶然に有する確率は、０．４ ５”＝７Ｘ１０−”である６Ｘは、明らかにこの家族の血縁である。

次の間頭は、Ｍでない、曲縁のない婦人がＸの母親でありうるか否かである。Ｘ のＤＮＡ指紋は４０の゛母性”断片を含み、そのうち、われわれは約２５が特に 母親から受け継いだものと評価している。残りの断片は、母親、と父親との間で 共有され、従ってＭの母性についての証拠を挙げるため使用することはできない 、Ｘにおける２５の母性異性断片はずべて、Ｍに存在Ｌ７ている。ＭがＸと血縁 でないが、２５の断片をすべて共有する機会は、０．２６”＝　２　Ｘ　１０− ”である。従って、Ｘ及びＭは血縁を有し２なければならない。

最後の、最も困難な問題は、分析に利用されなかったＭの姉妹がＸの母でありう るか告かである（父親はもちろん、Ｍの夫でなければならない）。バンドが０． ２６の平均確率で任意の人に共有される場合、−人の人の断片が同胞にも存在す る対応する可能性は０．６２である。ＭがＸの真実の母の姉妹であり、偶然Ｃご Ｘの母性異性バンドを２５個すべて含む可能性は、従って、０．６２”＝　３　 Ｘ　１０−’である。従って、われわれは、なんら合理的な疑いをいれる余地も なく、ＭはＸの真実の母でなければならないと結論する。この証拠を、移民当局 に提供したところ、当局はＸに対する論争を止め、彼の英国居住を許司し、彼が 彼の家族とともに残ることを許した。

この困難な事例は、Ｄ　Ｎ　Ａ指紋が６重要な家族の人員が見つからない場合で さえ、親族関係の明白な積極的証拠を与λることができることを示す。この事例 は、Ｘが彼の同胞と同じ父親を有し１、この父親がＸにだけ伝えたバンドはなか った（平均して、１／１６の父性バンドが伝達される）という事実乙こよって簡 素化された。、“−のようなＸに独特な断片は、ＸとＭとの親族関係に関する証 明を明らかに弱めるが、実際には、必ずしも分析を無効にするものではない、Ｘ は２５の母性異性断片の他に、このような父性断片を５個より多数有するとは思 われない、ＸとＭｌご血縁関係がない場合又はＭがＸの叔母である場合に、３０ の特定のバンドのうら少なくとも２５（１ｆｆｉがＸとＭとで偶然に一致する可 能性は、それぞれ８×１０−”及び９Ｘ１０−’である。従って、この分析は、 強いものであり、このような事例のほとんどにおいて主張された親族関係を肯定 又は否定する明白な証拠を与える。通常は、もちろん、家族の関係者の全員を、 例えば父親論り弓こ父Ｃ１！、移民によって家族が再び一緒になるのが困難な場 合に、利用できるであろう。ＤＮＡ指紋は、はとんど常にこのような問題を解決 することができる。

−ｐＮ〜へ指紋ｐ−数更化 父親から特異的に安心３継いだ断片が３９個であるのに対し、Ｍには６１のＤ　 Ｎ　Ａ断片が記録されていた。父親の異型接合性ＤＮＡ断片の１／８はＢ、Ｓｌ 又はＳ２に伝達されておらず、従って父性異性断片の数に対する補正値は、３９ Ｘ８／７＝４５である。、Ｍ及び父のＤＮＡ指紋における断片の総数はほぼ等し いので、父の共有する、Ｍにおける断片の数は、約（６ｍ−４５）＝１６である 。Ｍ及び父親におけるバンド共有の平均確率Ｘは、従って、１６／６１　＝０． ２６であり、北ヨーロッパ人の無作為試料をスクリーニングすることからめた予 備概算値と一致する（ｘ−０，２、対照２）。

４５の父性バンドの約半分は、異型接合性バンドについて予測されるように、Ｂ 、Ｓｌ及びｓ２に（それぞれ１８゜２４及び１８個）伝達された。Ｍのバンドの 若干が父親にも存在し、従って子供のほとんど又は全員に伝達されていることか ら予測されるように、Ｍの６１のバンドのうち、半分より多くがＢ、Ｓｌ及びＳ ２によって（それぞれ３２．３８及び３９個）受は継がれた。ＭのＤＮＡ指紋が 子供全員に伝達されたｎ　（ｊ？ｔｌの共有バンド、及び半数の子供に伝えられ た（６１−ｎ）個の異型接合性バンドを含む場合には、ｎ　＋　Ｑ。

５　（６１−ｎ）　＝３６．３であり、ｎ＝１２の場合、Ｍ及び父親に共通の１ ６個のバンド（上記参照）の概算値と一致する。

ＸのＤＮＡ指紋は、２１の父性異性断片と４０のＭと共有するバンドからなる。

母性異性であり、父と共有でない後者のバンドの割合は、２つの方法で算出され る。第一に、母性異性バンドの数は、父性異性の数とほぼ等しく　４５／２　＝ ２２．５である。第二に、Ｘにおける４ｏの母性バンドのうちｎ個（約１２）は 、共有の母性／父性バンド（前記参照）であり、Ｘ乙こ２Ｈの母性異性バンドを 残す、Ｘが彼の母親から特異的に獲得し７た断片の数は従−２で、約２５である 。

イΣン　ドー共−イ１−９２−廊定率 １４’ｔ１１１人にナタける断片が第二の任意の人における同様な電気泳動分離 変及びオートラチジオグラフ強度のバンドによって一致する平均確率は、ｘ　（ ｘ　＝　０．２−０°２６、前記参照）と定義さｈ、る。ミニサテライト断片が 大きい程、恐らく、対立遺伝子頻度が低くなり、電気泳動分離が良くなるので、 共有される頻度は少なくなり、従って断片共有確率Ｘは不均一である。はとんど すべｔの断片は、独立して受け継がれるので、４＋ｌｄ人におけるｎ個すべての 断片が第二の任意の個人に存在する最高確率は、従って、ｘｎである。Ｘにおけ る不均一性は、この確率を低下する。

Ｕ賂、田トリノ達ン！ｕ１カー有 共有されるバンドが、常に、同じ超可変座の同一の対立遺伝子を表す場合には、 Ｘはｘ”１ｑ−ｑ”によって平均対立遺伝子頻度ｑに関係し、これにより個人に おける所定のバンドが同胞にも存在する確率は（４＋５ｑ−６ｑ”　＋ｑ’　） ／４（２−ｑ）であることが示される。

Ｘ　＝０．２６であるから、ｑは０．１４であり、記録により共有されている、 第一の同胞に存在するバンドの割合は、０．６２である。この確率は、任意の人 によって共有されるバンドが決して同一の対立遺伝子でない、即ち、多数のミニ サテライトが同一の大きさの対立遺伝子を有すると仮定すると、僅かに低下する 。

遺伝監ｑ分所公１匹ひりりいえ９道里 ヒトにおける連鎖分析、特に、大きい家系における病気の座と一緒に分離される 超ｃＩＪ変ＤＮＡ断片の研究のため、ＤＮＡ指紋を使用する可能性を測定するた め、２つの大家族のＤＮＡ指紋を調査した（一方は神経線維腫瘤に関して分離し 、他方はβ〜グロビン遺伝子集団に連鎖しない常染色体優性遺伝子によって明ら かに測定される胎盤ヘモグロビンの遺伝的残存に関して分離した）。

勇１ 頃１に　した西　群のＤＮＡ１″′　におけるｄ可崖ユ三」ｊゴヒＬ目り虹悲分 離 １旦ｆｌで消化した血液ＤＮＡ試料を長さ３５■の０．７％アガロースゲル上で 電気泳動し、ミニサテライトプローブ３３．６及び３３．１５に対してサザン法 でハイブリッドを形成させた。罹病していない父親（Ｆ）　、５人の息子（Ｓ） 及び６人の娘（Ｄ）について、ＤＮＡ指紋を第７図に示す、罹病した母親は研究 に利用しなかった。多数の神経線維腫にかかった子孫は（＋）で示し、残りの子 孫は、神経線維腫瘤の敞候を示さなかった。分離した父性（・）及び母性（０） 異型接合性ＤＮＡ断片を示し、短期間、中期及び長期照射でとったオリジナルオ ートグラフから直接、子孫への分離を記録した。

それぞれの子孫における位置及び相対的強度が両親のものと一致するＤＮＡ断片 だけを記録した。ＡＢ又は−一を子孫に分離するＤＮＡ断片の連鎖対ＡＢは、連 続線によって結合されている。Ａ−及び−Ｂを分離する対立遺伝子は点線で結合 されている。神経線維腫瘤に対する相引状態での連鎖の証拠を示す一つの母性断 片は、星印で示し、罹病した６人の子孫全員は、この断片を受け継ぎ、罹病して いない子供５人のうち４人はこのバンドを持たず、このバンドの遺伝と神経線維 腫瘤との間に１０／１１の一致を生じる。

林料及互方丈 旦Σ人皇岨 新鮮な血液を等容量の１　ｘＳＳＣ（ＳＳＣ、クエン酸ナトリウム食塩水、０． １５ＭＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７，０）、ヒストベーク （Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７）　（Ｓｉｇｍａ）上に積層し、遠心分離に より有核細胞を集めた。或いは、凍結した血液を二倍容量の１ｘｓｓｃ中で解凍 し、１０．０００ｇで１５分間、遠心分離することにより有核細胞及び核をベレ ット化した。Ｊｅｆｆｒｅｙｓ；Ａ、Ｊ、著、（１９７９）、Ｃｅ１１、土工、 １〜１０に記載されテいるようにして高分子量ＤＮＡを製造した。

サザン法によるノ ヒトＤＮＡの試料５μｇを４ｍＭのスペルミジントリクロリドの存在で２０単位 のＨｉｎｆＩを用いて３７℃で２時間消化し、フェノール抽出及びエタノール沈 殿によって回収した。

制限消化物を１６μｌのｕｚｏ＋４μｒのゲル負荷混合物（フィコール４００１ ２．５％、ブロモフェノールブルー０．２％、トリスアセテート０．２Ｍ、酢酸 ナトリウム０．１　ＭＳＥＤＴ＾　１ｍＭ、ｐ）ｌ　８．３　”）及び、５ｍｇ ／　ｎｊ！エチジウムプロミド２μ！中に溶解し、水平アガロースゲル（トリス アセテート４０ｍＭ、酢酸ナトリウム２０ｍＭ、ＥＤＴ＾０．２ｍＭ、エチジウ ムプロミド０．５．ｃｒｇ／　ｍｌ　（ｐＨ８，３）中の０．７％シグマ（Ｓｉ ｇｍａ）　Ｉ型アガロース、厚さ０．７　ｃｍ　Ｘ長さ２０ｃｍ又は３５印のゲ ル）上に置いた。

１０分間平衡化した後、長さ１．５ｋｂ未満のＤＮＡ断片すべてがゲルから電気 泳動するするまで、２Ｖ／ａｍで２４〜４８時間ゲルを電気泳動した。ニトロセ ルロースフィルター（Ｓａｒｔ−ＯｒｌＬＩＳ　％孔径０．４５μｍ）上にプロ ンティングさせることによりＤＮＡを転移させた。ヒトミニサテライトＭ１３組 み換え型３３．６及び３３．１５から、３２ｐでラベルした一本鎖プローブＤＮ Ａを製造し、１ｘｓｓｃ中で６５℃でサザン法によるプロットに対してハイブリ ッド形成をし、腫瘍用途に記載したようにオートラジオグラフィする。

ｉ二文光梶 ＢＢＣモデルＢマイクロコンピュータ−に分離データ及び連鎖の分析を記憶させ た。

第２表には、神経線維腫瘤の家族におけるミニサテライト標識をまとめる。

第３表 父親　母親 プローブ　邸、６　３３．１５　翌、６　３３．１５記録された断片数（ｎ）　 ２４　１７　１６　１６対立遺伝子対の数（ａ）　３　３　２　４連鎖対の数（ ｂ＞　１　０．　１　０ 記録された種々の座 の数（Ｃ）　２０　１４　１３　１２ 概算の総座数（Ｎ）　４３　２３　２７　１６記録された種々の座の数（ｃ）は 、ｎ−ａ−ｂによって得られる。未分離、従って未記録の断片を含むＤＮＡ指紋 全体を、Ｎ個の異型接合性座（２Ｎ断片）から誘導する。記録された（ｎ−ｂ） の明らかな断片がＤＮＡ指紋における２Ｎのバンドの無作為試料であると仮定す ると、所定のプローブによって検出される超可変声の概算の総数Ｎは、下記の式 により対立遺伝子対の数に関係する： （以下余白） 第４表神経線維腫瘤の家族における （た７トＡしＷＪｆ：：　５３．０：！：２．４％５超可変断片の分離 ４７．７±２．７％ 超ＯＪ変断片の伝達頻度（第７図）を研究するため、１１人の同胞における正確 に１人の子供に伝達され、記録されたｎ個のうち、プローブ３３．６及び３３° １５によって検出される断片の数を、伝達率５０％（第４表）と仮定して、二項 分布に存在する断片は同型接合性座からのものであってよ（、無視された。どの 子供にも伝達されなかった母性断片は７、母性ＤＮＡを利用できなかったので、 記録できなかった。平均伝達頻度（＋３．２．Ｍ、）も得られる。

最初に除外された対立遺伝子及び連鎖したバンドを有する父性又は母性断片の可 能なすべての対での比較を使用して、ＡＢ　（ＡＢ又は−−）に関して一致する 子孫の数を記録することによって断片の対ＡＢの間の連鎖を調べた（即ち、Ｃ座 を各両親について分析した。第３表参照、ｃ（ｃ−１）／２の対照比較を得る） 。０又は１１人の子供群中に現れる断片の対は、それぞれ対立遺伝子又は緊密に 連鎖した対を表す。

定義により、対はどの群にも属さない、観察された分布をＣ座のすべてが連鎖さ れていない場合（Ｕ）の予測値と比較する。この場合、正確にｒ（ＡＢ又は−一 −）の子孫を与える対による比較の数は、二項分布 座が密集し・均一に離れており、隣接する座が組み換え頻度θによって分離され ている（１０．２ｏ又は３０ｃＭ離れている）場合に予測されるものと分布を比 較する。従って、集団は、（ｃ−１）’Ｐｆｆｌ華位〔式中、甲−−１／２　Ｉ ｎ　（１−２０）〕にわたって広がっているであろう、Ｃ座（一方又は他方の対 立遺伝子のところで無作為に抽出）に関して、１１人同胞群中の正確にｒ　（Ａ Ｂ又は−一）の子孫を生じる対にる比較の数は、下記の弐によ−９て得られる： Σ゛“′ 〔式中Ｘ、はｉ同車位離れた２個の座の間の組み換えフラクションであり、Ｘｉ は間作製関数； ｘ　、−＋　／ア（ｌｅ　−Ｚ　ｉ　甲）によって得られる〕。

精 」λ− この研究に使用する２種のミニザテライトハイブリッド形成プローブを、主な用 途で詳述する。プローブ３３．１５は、コア配列の１６ｂｐ変異体が２９反復し て成るクローン化したヒトミニサテライトから成る。プローグ３３．６における ミニサテライトの反復単位は、コア配列の最も保存された１１ｂｐ３’末端の種 々の三量体であり、１８回反復される。コア及びブし１ブ反復単位の配列は、下 記のとおりである：Ａ コア　ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧ３３．１５　ＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡ ＧＧＴＧＧ３３．１６　ＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧ プローブ３３．６及び３３．１５プローブの配列及び反復長における差異により 、ヒトＤＮＡのＨｉｎｆｌ消化物中の長い超Ｅｌ変ミニサテライト断片の異なる パターンを検出することになるこの４ｂｐ制限エンドヌクレアーゼは、小さなフ ランキングＤＮＡを有するＤＮＡ断片における長い縦列−反復性ミニサテライト を放出することによって種々のミニサナライ］・の分離を最大にする。

ｎＪ且拉ｔ３　ケルＤ　Ｎ　Ａ　Ｊ！＃　■ｑ分梶個々のミニサナライ１−ＤＮ ＡｌｔＪｉ片の分離を調べるため、１１人の英国人の大きい同胞群を神経線維腫 瘤〔レフタリングハウゼン（Ｒｅｅｋ　１　ｉｎｇｈａｕｓｅｎ）民宿の〕、末 梢及び中枢神経系の腫瘍に伴う常染色体優性障害について分離した。遺伝的標識 形質は、まだ、この病気に連鎖されていなかった。

ｌ】人の子供（６人は罹病、５人は未罹病）の、プローブ３３．６及び３３．１ ５で検出される血液ＤＮＡ指紋を、第７図において、かれらの未罹病の父親と比 較した。ミニサナライトＤＮＡ１ｔＪｒ片の分離を、長さ３５ｃｍのアガロース ゲルでの電気泳動によって最大にした。

これらの超可変ミニサテライトの多く、特に極めて大きいＤＮＡ断片は、低い対 立遺伝子頻度を有し、前記のように血縁のない個体には、はとんど受け継がれな いので、神経線維腫瘤の家族におけるこれらの断片の多くは、異型接合状態で存 在し２、後代の若干の老乙このみ伝達される。罹病した母１１０）ＤＮＡを入手 できない場合でさえ、母に由来するミニサテライト す　い断片として容易Ｃ３−同定する、−とができた。父性断片も同様ｅ　Ｌこ して同定することができた。ノ゛ローブ３３，６及び３３．１５を用いて、この 同ｌＩａ群口、罠、昌ｌる４１の父性ＤＮＡ断片及び３２の母性ＤＮＡ断片の分 離（第７図、第３表）を記録する、”〉とがト、　できた。多数のイく１加的多 形断片も存在するが、ゲルから電で５１１　゛泳動で除去さβ′）、るか又は不 完全に分離さ、！１１、従って、錆実には記録できなかった。

この人きい同胞１！Ｙ　ｔこ、：；；けろづ“べての父性又は母性ＤＮＡ断片の 分離パターンを対ごＬｌ−較するごとによって１、断片の対立遺伝子対及び相中 状態での緊密な連鎖４示す対を同定することがでＡる（この同胞群乙におけるバ ンドの所定の対の同時分巽　離の可能牲は１／１０２４である）６父性及び母性 断片の対立遺伝子対の若干の例を、両方のプｒ）−ブで同定することができ一゛ 　だ（第７図）。また、ブｌ」−ブ３３　、６は母親及び父親に断片の連鎖対を 検出した。同様な連鎖は、第二の家系（以下に示す）に見られ、これは、ブＹ１ −ブ３３°６にハイブリッド形成する少＼　なくと≠）１つの超可変領域が、− ５ｉ−！１．ｆＮに関する内部開裂部位を含み、従って、開裂して家系にナタけ るミニサテライト“ハブロタイブ゛として同時に分離ずイ、２個以トの断片を生 じｌ　る長いミニサテライト／′ザテライトであることを示唆する。

笛　プローブ３３．１５を用いＹ−記録した多形Ｄ　Ｎ　Ａ断片は、３３．６に よって検出される断片の組み合わせには存在しなかった。両方のプローブにハイ プリントを形成した、このような断片は、同じ親から同じ子供へ伝達されたく即 ち、′連鎖した”）等しい大きさのバンドとして検出されたであろう。従って、 これらの２種のプローブは、ヒトミニサテライトの木質的に完全に異なるサブセ ットにハイブリッドを形成する。

対立遺伝子及び連鎖した断片を排除することによって、父親及び母親にそれぞれ ３４及び２５の明瞭な座が記録される（第３表）と結論された。座の約８０％に 関して、２個の対立遺伝子の１個だけが分離され、第二の対立遺伝子は恐らく比 較的短いミニサテライト断片のあまり分離されていない複合体に存在する。この ことは、恐らく、これらの縦列反復領域における等しくない交換によって起こる 、ミニサテライト対立遺伝子対に大きい差異が存在することを意味する。第７図 において確認された数個の対立遺伝子対は、実際に、実質的な長さの差異を示す 。対立遺伝子中に対合しうるバンドの割合から、プローブ３３．６及び３３．１ ５によって検出される全ＤＮＡ指紋に存在する異型接合状態の総数は、約４３〜 ６６であると概算することができ、このうち約半数は父親及び母親に記録される （第３表）。この同胞群における父性断片と母性断片との間の対立性を測定する ことはできない。

記録された父性座のすべては、常染色体性であり、娘（Ｘ連鎖）又は息子（Ｙ連 鎖）への特別な伝達を示さない。更に、父性ＤＮＡ断片のすべての対ＡＢは、明 らかに独立して子孫に分離して、平均して同数の（ＡＢ、−−）又は（Ａ−１− Ｂ）後代を生じる＊　、、＋ｔＥ確な数りよ、連鎖！−７ない座に関する予測さ れる２ＩＱ分布に従う。Ｎ、性Ｄ　Ｎ　Ａ断片は同様な挙動を示した。更に詳細 に分析すると１、−れらの座に関する最小の座−陣間隔は、≦３　（ｌｃＭ　（ ４６図単位）“でなければならないことが判る。それより間陥が狭いと、同時に 分離（相中状態で連鎖）するか、又は偽対立遺伝子ｒと１７で分離（相反状態で 連鎖）する傾向のある断片の対を相当数住しる（第４表）。従って、分離可能な ミニサナライｌ−座ば、長さ３０００ｅＭのヒトゲノムの少なくとも半分にわた ー、て広げられていなければならず、従っマ”、ヒトの常染色体の多数又は全品 にねたって散乱していなければならない。

一つの母性ミニサテライト断片（第７１図）は、神経線維腫瘤との相中連鎖の弱 いｆｉ＋Ｅ拠を示し、１０／１１人の子供はこの断片及び病気に関し了一致ｊ７ ている。（θ＝１０ｃＭ、ｐ＝０、００６）。し７かしながら１．２５個の箕な る母性遺伝子座が記録さり、たので、これらの座の少なくとも１個の対立遺伝子 が、イル外Ｃ；：、！Ｕ月！、、、ｘ鴛４１１−反欺慇での観察される連鎖度を 示す確率は、高い（ｐ　＝０．２４）ゎ 件亀 広−シフー家系ｑ旦ｙ９人、指紋−、、１１１８１７ｐ　ｌｊ今一１１Ｄ−可− 能−ηす１鎖β−地中海貧血痙及び遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰ　Ｆ　 Ｈ）について分離するグジャラ・−ト人の広範な４世代家系にＤＮＡ指紋の分析 を広げた。

第８Ａ図及び第８Ｂ図に示した標識分離パターンのオートラジオグラフを下記の ようにして製造した。

血液Ｄ　Ｎ　Ａの１０μｇの試料を一旦−１ｐｆｌで消化し、プローブ３３．６ 　（Ａ　）又は３３．１５　（１３）を使用り、て、第７図に記載したよ・）に Ｕ２てＩ）　Ｎ　Ａ指紋を製造した。比較的短い（２０ｃｍ）のアガロースゲル で電気泳動を行った。ａｈ１人の間の関係を第９図にボす。Ａでは、超可変断片 ａ、ｂ及びＣは緊密に連鎖し、家系の各個人にすべて存在するか又はすべて存在 しない。Ｂでは、バンドｇ及びＩＩｌ’Ｆｌｌ　（Ｈ）が同時に分離する。個人 ■７及び■８は、−理性双生児であり、区別できないＤＮＡ指紋を有する。

材料及び方法は、例８と同じであった。　”同時分離分析を第９Ａ図及び第９Ｂ 図に示す。

第９Ａ図において、■４からの３０個の超可変断片及び■５からの２７個の断片 の、子孫！１１１−１１への分離を、両親の断片の対ＡＢの可能な連鎖について スクリーニングした。

少なくとも６／７の（ＡＢ、−ｍ−）子孫を示す連鎖の可能な例を更にイ」加的 血縁関係で訓べた。２つの極めて明瞭な連鎖例を示す（ａ−ｆ、個人における断 片ａ−ｆの存在；・断片不存在）。断片ａ−Ｃ及びｅ、ｆはそれぞれ完全な同時 分離を示し、断片ｄは、ａ−ｃと同時に分離する傾向を有するが、同胞ＩＶ　１ −４は、情報を与えず１．・−理性双生児■７．８は、遺伝したａ−ｃを有する が、ｄを有し７ない組み換え型である。

第９Ｂ図には、β−地中海貧血症形質（０、ＩＦ）　、Ｈ１’Ｆｌ（（ｌ（）及 びミニサテライト断片ｇの遺伝を示す。個人が〉１％ＨｈＦ（正常）又は〉３％ １ｂＦ（β−地中海貧血症形質）を示した場合、その（ｌ／、１人は、ＩＩ　Ｐ 　Ｆ　Ｈを有するものと記録する。ｌ　Ｐ　Ｆ　Ｈ及びβ−地中海貧１ｆｌｔ症 形質は、ＩＩＩ　１．−１１及び■５−８に独立して分離１−、−１連鎖し、な い座によって測定される。断片ｇば、試験した個人においてＩＩ　１１　Ｆ　＋ １と完全６１−同時に分離する。

枯−限 第９図Ａ及び＋３に示したように、ＩＩ　Ｉ）Ｆの上昇は、β〜地中海貧血症形 質とは独立して伝達され、明らかにβ−グロビン遺伝子墾団に連鎖していない常 染色体優性座によって測定される。同様なサルチーニヤ人の家系はＧｉａｎｎｉ らによ−）てＥ？１ＢＯＪ０．２．９２１〜９２５　（１９８３）に報告されて いる。

第８Ａ図及び第８　Ｂ図には、祖父（ＩＩ　４）における３００種にの断片及び 祖母（■５）における２７の断片を記録した。

彼らの７人子孫（ｌｕｌｌ−１１）の研究により、神経線維腫瘤家族に関して記 載した基準を使用して、これらの断片は少なくとも２２の明瞭な非運ｔ）Ｙ父性 常染色体座及び１８の母性常染色体座から由来することが分かった。残りのＤＮ Ａ断片は、対立性又は他の断片−・の連鎖を証明するが、この小さい同胞群での 証明は可能ではない（両親のＩ）　Ｎ　Ａ断片の所定の対は、７の同胞群に連鎖 して又は対存遺伝子とし−Ｃ偶然に伝達される１／６４の可能性を有する）。更 に、家系の付加的人員において、連鎖の証拠を探し、２つの極めて強い連鎖例を 第８図及び第９図に示す。プローブ３３．６？：：よっ゛Ｃ検出される断片ａ、 ｂ及びＣは、■４からその子供（Ｉｌｌｌ−１１）及びそれから孫（ＩＶ　１８ ）に完全な連鎖で伝達される。組み換え型は、１４人の情報を与える後代に見ら れる（同時に分離するバンドに関してｐ＝４Ｘ　１０−’）　、　Ｊ＝記のよう に、これは、断片ａ−Ｃが一つの超司変座から由来するミニサテライ１“ハブロ タイブを表すことを意味する。また、ブ１コープ３３．１５によって検出される バンドｄは、バンドａ　−Ｃへ連鎖ｊ７たことを証明する。し２かしながら、一 方の同胞群（ＩＶ　ｌ　−４）は、両親が断片ｄを有するので、情報を与えない 、モして、他方（ＩＶ５−８）は組み換え型を含む（−理性双生児ＩＶ７．８） 、バンドｄとａ−ｃ集団との間の連鎖の証明は、従って弱い（θ−１０ｅＭ、　 ｐ＝０．０１）　、母性バンドｅ　（３３，６によって検出される）及びｒ（３ ３，１５によって検出される）は■４及び■５の子孫及び付加的血縁同胞群１１ １１５−２０及び■１　’７−２２において緊密な連鎖を示ず（２０人の情報を 与える後代、絹、み換え型なし、θ−ＯｃＭ、ｐ＝１０−６）。プローブ３３． ６及び３３．１５がミニサテライトの種々の組み合わせを検出し、断片ｅ及びｆ に交雑−ハイブリッドを形成しないので、これらの断片は２つの異なる常染色体 ミニサテライト座の間の確実な連鎖の例を表す。最後に、２個の連鎖群（断片ａ 　−Ｃ及びｅ−ｆ）は、同・−の座の対立遺伝子ではない＊　（ｉ！ｉ人の■１ は、父性ａ〜Ｃ集団と母性ｅ−ｆ対とを有する複合異型接合体である。両方の集 団は、彼の４人の子供のうち２人に伝達され、対立遺伝子として分離せず、その 代わりに、２つの連鎖しでいない超可変領域からＮＭ　Ｒされなければならない ことを確認する。

母性（■５）ミニサテライト断片は、β−地中海貧血ｈ１形質への著し、い連鎖 を示さず、従って、染色体１１１のβ−グロビン遺伝子集団へ緊密に連鎖してい ない。これに反して、長さ８．６ｋｂの母性断片（ｇ）＆よ１人の子孫及び孫の ３人の情報を与える同胞ＢＹにおいて旧〕Ｆ１１と同時に分離した（第９図）。

緊密な連鎖を、−］＼ず（θ−ＯｃＭ、ｐ＝２Ｘ１０”４）１２人の後代におい ては、ＫＭみ換え型は認められなか、った、１１５における１７個の座を調べた とい・う事実を、ち廟：しても、この連鎖は、なお有意である＜１７の記録され た座の少なくとも一つの座の対立遺伝子が偶然に１什ＦＨと同時分離を示す鱈率 は、（）。００４である）、更に、■５の断片ｇがただ１個のミニザテライト対 立遺伝子であり、−にに４聾っている２つの分離ＤＮＡ断片でないことを、Ｈｉ ｎｆｌＯ代わりに；ｐｕ３Ａで消化した、第９図に示した全個人のｏ　Ｎ　Ａ指 紋を調査することによって検討した。すべての積極的指紋は、ただ〜つのミニサ テライト断片について予測されたコ、うに、断片ｇと同様の大きさの対応する５ ａｑ３Ａ断片（８，２ｋｂ対８．６ｋｂ）を含んでいた。

ノ澤 ヒトの家系分析は、ミニサテライト断片１！・−ブによって検出されるＤＮＡ指 紋が、一方又は他方の両親を研究に利用できない家族においてさえ、多数の異型 接合性１）Ｎへ断片の分離を研究するため確実に使用できることを示す。このよ うな２つのプロ・−ブを使用し７で、１個人において同時に３４個までの超ｉｉ Ｊ変座を分析することができ、ヒトの遺伝学において、ＲＦＬＰを含めて、従来 法で得られるよりはるかに高い遺伝的標識形質生成速度を分析することができる 。個々の断片の低い四囲頻度と一緒に種々のミニザテラ−（１＝断片の安定な遺 伝により、分析された２・′）の家系に発見された連鎖例に示されるように、そ れらの断片は連鎖分析に理想的に好適になる。これらの超口１変ミニサテライト はｘ、１１み換えホットスポットでありうるが、長いミニサテライトで起こる不 等交換の概′Ｊ：Ｊ−速度（ｌ配遇了当たり約０．００１）は、ミニサテライト 座と近隣道伝、例えば病気の座との間の連鎖を著しく混乱させるには充分ではな い。

ミニサテライトプローブ３３．６及び３３．１５によって一緒に検出される超可 突座の総数は約６０であると算定される。これらの座の約半分の２個の対立遺伝 子の少なくとも１　（１ｉ１は、所定のＤＮＡ指紋で分離することができ、従っ て、ＤＮＡ指紋が異なれば、試験した座のスペクトルは同一ではなくなる。

これらの座のはとんど又は全部は、遺伝的には連鎖していす、従って、ヒトゲノ ムの相当な割合にわたって散乱１．７でいなければならない。それらの正確な位 置は、分かっていないので、クローニング及び個々の超可変ミニサテライト座の 領域的位置決定を待たねばならない。奇妙にも、研究したどちらの家系におし） 、でも、Ｘ又はＹ染色体上にミニサテライトはまだ認められなかった。約４３の 異なる座を、ＩＰＦＢ家族における（ｆｌｉｔ人■４と一緒に、神経線維腫瘤家 族の父親における可能な体性について記録した。Ｘ及びＹ染色体は一緒に雄のゲ ノムの約５％を構成するので、４３の無作為に分散した座がこれらの染色体上に 存在しない確率は、（０，９５）　”　＝　０．１である。従って、体性ミニサ テライトの明らかな欠損は、有意ではない。

これらの分散した超可変ミニサテライト座は、神経線維腫瘤及びＨＰＦＨへの連 鎖の仮の例によって示したよ・うに、病気の座に連鎖しまた標識０）研究Ｇ、二 Ｑ（嫡子・あり）１、（ｉｆ’、来のｔｐ座遺伝分析とは萱なり、異なろミニ、 叶ううイト対立遺伝子は、名−家系６、′、１３げる病気の鹿とＩＩ　ｉ！！　 ！−了いろと思ねｈ、ろので、血縁のない小さい家系の間でｆｌ！：　％連鎖デ ・・夕を即めるこ＾がでさない。

その代わりに、１）へＩＡ指紋だけが、広範な家系によマいＣ及び最も理セ、的 には、ただ−パ′すの大きい同胞群において、特に優性障害の速鎖の研究に適当 である３１ 、二こまでで、ブ１」・−フ（刊；（，６及び３：３．１５ば、４１８１人Ｃ， ７おいて３４までの常梁色イ、ドυ’−’ｉ＋Ｊ変庫・を記２スきせる、２こ： ！７．らの庫の少なくとも一つが所定の病気、の座に緊密に連鎖づるＯＪ能性は 、」３さ３０００ｃＭのヒ′、Ｉ・ｌ！ｌ　ｇＡ　ｐｌ　、７４、の３　＝　’ ｔ　’ｊ−’ｆｙイ［・の任意分散を仮定しで、２０％である。、、１１円；１ （家族の、ｌ−うな広範な家系については、はとんどの座のただ１個の対ず１遺 伝子が記録され−）るので、この確率は約１０？（になり、連鎖を検出するには 、この対立遺伝子は病気の座に相中−ｉメζｎＢで連鎖しなければならない。こ れらの確率を５０　％　’）’）ｙ　、、、ｂ、　Ｌこトげるｔ、′は７、−・ つの大きい同胞群？７こ号いて１０４を越スる超可突座の記録及び広範な家系に おいて２０８を越える座の記録が必要である５、これらの数ば、こ力、まで使用 １−また２種のミーサテライトプローブによっ了検出される吟の総数を越える。

しか１．７ながら、プローブ３３．６及び３３．１５は、超可突座の本質的とに 全体と１．て異なる組み合わせを検出し１、これは、種々のコア配列を＾むヒト ミニサテライトの総数が大きいこ、トを示唆する。

限定した単座標識を使用する従来のＩＩＺ　）・家系分析においては、！！識と 病気の座との間の連鎖の証明は、通常直接、病気の遺伝子のおよそのゲノムの位 置を与え、付加的家系を分析することによって更に確立することができる６ＤＮ Ａ指紋に関しては、逆も真である。超６Ｊ変ＤＮＡ断片と病気との間の可能な連 鎖を更に分析することは、分取用ゲル電気泳動及びクローニングによって断片を 単離して可能になる。単離したミニサテライトから、ミニサテライトを直接はさ む特異配列ＤＮＡ分節を使用するか、又は高厳格ハイブリッド形成における全ミ ニサテライトを使用することによって、座持異性ハイブリッド形成プローブを設 計することができる。このよ・うな座持異性プローブは、連鎖データを付加的家 族に広げるため及びヒトゲノム内にミニサテライトを局在化させるため使用する ことができる。この°アプローチは、グジャラート人の家系における、明らかに １１　Ｐ　Ｆ　Ｈに連鎖した８、２に１シュ３Ａミニサテライト断片をクローニ ングすることによって現在確認されている。

前記のように、それぞれがコア配列の異なる変異体を含むヒトミニサテライトか ら成るプローブ３３°５．３３．６及び３３．１５は、異なるＤＮＡ指紋を住じ 、従って、ヒト及び他のを椎動物のＩ）　Ｎ　Ａにおける超可変ミニサテライト 領域の種々の組み合わせを検出する。特に、プローブ３３ｏ６及び３３．’１５ は、各プローブに存在する反復コアの長さ及び正確な配列に差異がある結果とし て、ミニサテライトの種々の組み合わせを大部分又は全部検出する（第三の用途 及び八、Ｊ、Ｊｅｆｆｒｃｙｓ、　Ｖ、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｓ、Ｌ、Ｔｈｅｊｎ　％ 　Ｄ、Ｊ、Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ　＆　Ｂ、Ａ、Ｊ、Ｐｏｎｄｅｒによる“ＤＮ Ａ　”指紋°及びヒトの家系における連鎖分析”参照）他の：Ｊア配列の縦列反 復を（ｌａｐ用し２７付加的超０１変領域を検出する＝ｆ能性を試験するため、 一連の合成ミニサテライトを製造した。

イクリ−ｊ　、、−（ｔ− 人［′−ミニーサテーライー上−０２合成及びクロ　−二ンーリ１多コアプロ・ −ブを製造するアプローチを第１０図に概説する。第１（）図はＥ、７リ　（Ｅ 、ｃｏｌ　ｉ）の乗換ホソトスボソ！・イニシエーター配列（Ｃｈ　ｉ　、　Ｇ ＣＴＧＧＴＧＧ）のり「】−ン化ｊ７たヤＩ列反復を製造する方法を説明するも のである。ポリ・−Ｃｈｉ　ブ１コープを作る工程は、標準ＤＮＡ技法を使用し １、下記の、Ｉ：おりである： １、長さ！（ヌク１／オ丁〜ドのＣｂｉ配列の縦列反復を含む合成オリゴヌクレ オチドを、Ｉｌ、　Ｗ、　Ｄ、Ｍａｔｔ、ｅｓらの（１９８４）　（■２．）Ｉ Ｉ（ＯＪ、、−１支、８０１〜８０５）及びり、　Ｇ、　Ｂｒｅｎｎｅｒ　＆　 Ｗ、ν、　Ｓｈａｗ（１９８５）ＥＭＢＯＪ、４．５６１〜５６８の方法によっ て製造した。　ＣｈｉＯ相補配列の二重体から成る第一のオリゴヌクレオチドを 合成りまた。

２、　こ力２らの２種のオリゴヌ・クレオチドを１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、１０ｍ Ｍ）リス−）１ｃＩ　（ｐＨ８，Ｏ）中で３７℃で一緒にア、ニールしで、ＤＮ Ａの短い二本鎖分節を形成した５、第二のオリゴヌクレオチドの配列を、頭−尾 連結に適当な３−ヌクレオチド長の５′突出末端を有するアニールしまた分子を 生じるように選択した。

３、Ｔ４ポリヌク１／オチドキノ゛−・ゼ及びＡＴＩ’を用いて５′末端を燐酸 化した。

４、　ア；、−ルしたＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＩ’を用いて 鴎−属性で一緒に連結させて反復したＣｈｉ　ポリマーを製造した。

５、連結したポリマーを１．５％アガロースゲルでの電気泳動により大きさで分 離し、長さ１５（ｌ塩基対より大きいポリマーをＤＥ８１０紙上での電気泳動に より単離した（＋）ｒｅｔｚｅｎ。

Ｇ、　、Ｂｅ１１ａｒｄ、　Ｍ、　％　５ａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｒｉ＋　Ｐ、　 ＆　Ｃｈａｍｂｏｒ＋、　ｐ、、■のフレノウ断片を使用してフィルイン修復に よりプラント末端とし、Ｊ３ｍｐ１９　ＲＦＤ　Ｎ　Ａ　（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎ ｇ　＆　Ｊ、　Ｖｉｅｉｒａ、１９８２、　Ｇｅｎｅ　Ｉ　Ｌ、２６９〜２７６ ）のＳ　ｍａ　Ｉ部位中に連結した。

連結したＤ　Ｎ　Ａ　；ｊｉ、、−凡エニー去ＪＭ　１０１中に形質転換し、個 々の白色プラークから一本鎖ファージＤＮＡを単離した。

７°各クローン化単離物のＤＮＡ挿入部をジデオキシヌクレオチド法（Ｍ、　＋ ３．旧ｇｇｉｎ　、、　Ｔ、　Ｊ、　Ｇｉｂｏｎ　＆　Ｈ，Ｆ、　ｌｌｏｎｇｓ １９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔ！ＳＡ８０．３９ ６３〜３９６５）によって配列させて、ポリマー挿入部の長さ、方向及び配列を 測定した。成熟−末鎖ファージＤＮＡ中に５′→３′に指向するＣｈｉ配列の５ ０の１２列反復を含む組み換え型Ｍ１３ファージが見出され、これをＭ１３・コ アＡと言う〔即ち、挿入部は、ポリ　（Ｃｈｉ）であり、ポリ（Ｃｈｉの補体） ではない〕。

８、３Ｊ）−標識一本鎖ハイブリッド形成プローブを、ファージ３３°６及び３ ３．１５からプローブを製造するのと同じ方法を用いて、プライマー・エクステ ンション法により製造した。

例−↓−↓２πし−５− ）−」を走ｑ入史−ρ４−２斤←（）人−エーミ−そ一専一テーラーイ一−ト、 、　０）９製−ｊ１シ１−記の技法を用いて、更に５種のコ゛ア配列を合成し７ 、Ｍ】：３に多コア組みＩ費え型と１．２てクローン化して、組み換え型Ｍ　１ 　：３・−１アＡ−Ｆを得た。コアの長さ及び正確な配列を変えるようにコア変 異体を選択した。第り１表には、クローンＭ１３・コアＡ−Ｆにおける反復配列 をコア配列及び初期の用途で記載した、６簡に使用したプローブ３３ｏ５．３３ ．６及び３３．１５と比較してまとめる。コア配列における極めて変化し７ない 塩基に１−線を付ける。ヘクターＭ１３ｍｐ１９中の各挿入部の指向も示す〔− ・・は、挿入部がポリ　（コ゛ア）であり。・−は、挿入部がポリ　（：Ｊ、ア ）の相補配列であることを示す。〕小文字で六二かれた塩基は、二１７配列から の離脱を示す。各配列の＠華な特性を“注釈”にまとめる。

（以下余白） 例１６ 初期スクリーニングにおいて、２人の血縁のない個人のＤＮＡ消化物を３３．１ ５及びプローブＭ１３・コアＡ−Ｆのそれぞれで探索した（ｐｒｏｂｅｄ）。２ 個の血縁のない胎盤（１゜２）から（ＤＤＮへの８ｐｇ（７）試料をＨｉｎｆＩ で消化し、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、サチン法でプロットし、主用 途に記載した操作により３２ｐでラベルした各プローブに対してハイブリッドを 形成させた。生じるオートラジオグラフを第１１図に示す。全プローブは、各個 人における多数のＤＮＡ断片を検出した。

膨米 プローブＢ、Ｃ及びＤは、それぞれ、２人の個人の間で実質的に異なるＤＮＡ断 片の指紋を検出した。指紋は、プローブによって変動するが、若干の断片は１個 より多数のプローブによって選出され、ある程度、プローブ３３．１５によって 検出される超可変断片の組み合わせと重なった。プローブＢ−Ｄは、ずべてＤＮ Ａ指紋作装に適当であり、−緒に、ヒト及び他のを椎動物において試験すること ができる超可変ミニサテライトの数を拡張すると結論する。ここで、コア配列の 中心の最も保存される７塩基対分節だけを含むコアＣを用いて得られる有効な指 紋は、重要である。

コアの先端を更に切断してコアＥにおける６塩基対反復を生成させると、ＤＮＡ 指紋バクーンは、完全に変化して、試験した２人の個人によってほとんど共有さ れている断片の組み合わせを示した（即も、これらの断片は極端な多形変化を示 さない）。従って、コアＥは、ＤＮＡ指紋分析に対して、前に使用したプローブ ３３．５．３３，６及び３３．１５と同程度に有用なプローブであるとは思われ ない。このことは、また、−ｍに有効なりＮＡ指紋作製には、実際に最低７塩基 対のコア配列が必要であることを示唆する。また、コア（Ｍ２Ｓ・コアＧ）の中 心の最も保存的領域の破壊は、ＤＮＡ指紋パターンの複雑さ及び変動性を低減す ると思われる。

Ｍ２Ｓ・コアＡ（ポリＣｈｉ　）は、ハイブリッド形成りＮＡ断片の新規かつ強 いパターンを生じる。これらの断片の多くは、極めて太きく　（＞　１５ｋｂ） 　、あまり分離されず、場合によっては存在するＨｉｎｆｌ開裂部位を含む従来 の長いサテライト配列から誘導することができる。

プローブ３３．６及び３３．１５を使用して広範に特性決定した神経線維腫瘤に 罹病した家族で、Ｍ２Ｓ・コアＡによって製造されたパターンを更に分析した（ 例８及び第７図参照）。第１２図には、父親（Ｆ）　、６人の娘（Ｄ）及び５人 の息子（Ｓ）からのＤＮＡのＨｉｎｆｌ消化物からのＤＮＡ指紋を示す。常染色 体優性遺伝癌である神経線維腫瘤に罹病した個人は、十で示す。罹病した母親か らのＤＮＡは入手できなかった。分離する父性（・）及び母性（○）バンドを示 す。実線で結合したバンドは、連鎖され、点線で結合されたバンドは対立遺伝子 として分離する。（ｘ）を付υたバンドは、ブｒ）−ブ３３°１５を用いて予め 検出された。

Ｊ、ｌ′ｉ果 ブ１コープ３３．６及び３３．１５を用いで得られたＤ　Ｎ　Ａ指紋とは異なり 、変動性のレベルば比φ、り的低く、多数のｌｖｉ片がすべての子孫に伝達され る（即−Ｊｕｌ　、２、これらの断）１はその４５団１．二おいて一般的ごあり 、Ｊ慴１．ではなく、しば１−２ば同型接合状態で存在する）。６個の異型接合 性父性バンド及び９個の異型接合性母性バンドの置部（が、１１人の子供の同胞 群で記録された。

父性バンドの一つ及び母性バンドの対立遺伝子対をプローブ３３．１５でｆめ検 出した。バンドの対立遺伝子対及び連１１１シた対を排除した後、２個の新（， ７い父性遺伝子座及び６個の新しい母性遺伝ｆ座をプローブ３３．６又は３３． １５で予め記録されないまま残Ｌ、予め記録された３４＠の父性遺伝子座及び２ ５個の母性遺伝子座と比較する。従って、ポリＣｈｉ　プローブは、ヒトの遺伝 分析に限られた用途を有する。

例１６及び１７の結果は、第５表の最−に列に下線を付け、主用途の個所に論じ た９個の優性ヌクレオチドの重要性を確認させる。これらは、また、有効なプロ ーブコアには、ヌクレオチド６個の最小配列が必要であるという、主用途におい て行った予言を確認するのに大いに有効である。従って、コアＥは、最小利用性 を表し２、ヌクレオチド６個の他の配列、例えば以下に論じる配列ＴＧＧＧＣＡ は、限界的に改良された利用性を示すことができる。ヌクレオチド７個への増加 は、調査の枠内で極めて劇的である。

有用なコア配列の本質的要素を明確にする試みにおいて、代わりのヌクレオチド を示すため上に使用した変異体Ｘ及びＹを、下記のように完全な理論に有用に広 げることができる：Ｘ＝Ａ又はＣＰ＝Ｇではない ｙ＝ｃ又はＴ　（Ｑ＝Ａではない） Ｗ＝Ａ又はＴ　（Ｒ＝Ｃではない） Ｖ＝Ｃ又はＧ　（Ｓ　＝Ｔではない） （〇−任意） （）＝下記の考察には利用していない。

この用語を使用すると、本発明の態様は、下記の反復コア配列： ＧＰＧＧＧＣ見ＧＧＷＸＧ　（６） を含むポリヌクレオチドを含むと言うことができる。

前記の配列は、もちろん、最も代表的な１２個のヌクレオチドの配列を示す。し かしながら、７ヌクレオチドのコアＣも著しい利用性を有することが判り、上記 の１２コア配列からの“許容された”変異体を有するものを含めるため、一つの 態様は、下記の７コア配列： ＰＧＧＧ（ＪＧ　（７） の反復を含むポリヌクレオチドをも含むと言うことができる。

もちろん、ＰはコアＣにおけるのと同様にＴに等しいのが好ましい。他の最も好 適なものは、八であろう。

明瞭にするため、相同パーセンテージは第３表に既に示した。この用途の人ニブ ローブに関しては、反復は正確な反復であって、全体としてのミニサテライトの 相同性はコア配列の相同性によ、て示す（とができる。ζ二のことは、相同性を 括弧内に示した前記のブ１コープ３３．６．３３．１５及び３３．５には必ずし も真実でない。これは、反復間に生じる変異体による。

コアＦは、恐らく、有用性に関して最低相同率を示す。しかしながら、この不一 致は、恐らく、コア中に存在する中心基：ＴＧＧＧＣＡ　（８） の破壊によって誇張された。前記の基が最も有効なプロ・−ブＢ、Ｃ及びＹ）中 に存在し、あまり有効でないプローブＡ、　Ｅ及びＩパのずべてにおいては破壊 されていることは注目に値する。従って、式（６）をイｊする最低７０％の全相 同率を有する更に有効なプローブが得られることが予想される。

式（８）： ％式％） の中心６ボリスクレオチドがコアＥ中でも破壊されていることは注目に値する。

恐らく、前記の６ヌクレオチドコア配列は、更に有効であるが、長さをヌクレオ チド６から７に増加すると、更に優性な特性が証明されることが予想される。

従−って、本発明の態様は、コ゛ア配列ＴＧＧＧＣＡの反復を含むポリヌクレオ チドを含むと言うことができる。

更に一般的には、本発明は、・−態様として、すべての反復配列中に配列ＴＧＧ ＧＣＡが存在する前記の“第一の”定義によるポリヌクレオチドを含むと言うこ とができる。

別の態様から見れば、本発明は、コ）・が、式（２）に示しまた配列から選択さ れた、同じ５’−３’の意味で読まれる・少なくとも６個の連続したヌクレオチ ドの配列を表す前記の“第一の”定義のポリスクレオチドの変性を含むと言うこ とができる。“コア”は、すべての単位が配列ＴＧＧＧＣＡを含む限り、各反復 ｉｊｉ位に同じ配列を必ずしも有しない。

各単位の残りの基は、全単位長の束縛の範囲内で式（６）（又は更に好まし２く は（２））の配列と少なくとも７０％の相同率を有する。

肌生詩至双生児普府ま■性■剖淀− 双生児における接合生殖性の測定は、疫学的、遺伝的及び産科学的研究のためば かりでなく、−理性と二卵性双生児との予測に差異があるので、重要である。− 卵性双生児は、二卵性双生児より出生率が低く、体重が低く、医学的合併症が多 く、死亡率が高い。カフカズ人では、新生児の約３０％が異なる性を有し、従っ て二卵性である。胎盤膜を試験すると、別の２０％の事例が単絨毛膜性であり、 これらは常に一卵性であることが判る。残りの５０％は、集団のうちで比較的一 定な割合であり、同じ性を有し、二絨毛膜二羊膜胎盤を有し、−理性又は二卵性 でありうる。これらの場合の接合生殖性を測定するため、一般的外観の評価、指 紋、皮膚移植片、味覚試験及び遺伝的標識形質の測定を含めて種々の方法が使用 された。後者は、９５〜９８％の精度で、最も信頼性がある。しかし、はとんど の蛋白質及び抗原変異体の平均異型接合性が比較的低いので、通常、このような 標識形質を多数、調べなければならない。

下記の例では、１２Ｍ１の新生双生児からのＤＮＡを、前記のようなミニサテラ イトＤＮＡブロー・−ブを用いて試験した。

得られたＤ　Ｎ　Ａ“指紋”は、個人ごとに変化し、−卵性双生児だけが同一・ のバク−、ンを示ずことを証明する。性観察又は胎盤μ；験から接合生殖性を測 定することのできた７例においては、ＤＮＡの結果はこれらの所見と一致した。

他の５組の双生児対及び２組の三つ子において、ＤＮＡ分析により接合生殖性を 迅速に測定することができた。従って、本発明によるＤＮＡプローブは、多給妊 娠のすべての場合に、接合生殖性を積極的に測定することができる・一つの遺伝 的試験を３１供−末鎖ＤＮＡプローブ３３．６及び３３．１５を使用して、１２ 絹の新生双生児の接合生殖性を測定し、た。その詳細を第６表に示す。

第６表 症例　４胎年令　性別、　胎盤付着　ＤＮＡバ−一一〜−祥−へ−一−７−−、 　ターニス−１３８週間　ＦＦ　単絨毛膜性　同一 ２３８週間　ＭＦ　二絨毛膜性　非同−３３０週間　ＭＭ　二絨毛膜性　同一 ４３３週間　ＦＦ　単絨毛膜性　同一 ５４０週間　ＦＦ　二絨毛膜性　非同−６３７週間　ＭＦ　二絨毛膜性　非同− ７３２週間　ＦＦ　二絨毛膜性　同一 ８３４週間　ＭＦ　二絨宅膜性　非同−９３９週間　ＭＭ　二絨毛膜性　非同− １０３８週間　ＭＦ　二絨毛膜性　非同−１１２７週間　ＭＭ　二絨毛膜性　同 一１２３５週間　ＦＭ　二絨毛膜性　非同−＊すべでの胎盤は、二羊膜性であっ た。

出産時に集めた成帯血液の試料又は誕生の翌日に各乳児から得た末梢血液の試料 （０，５〜１．０ｍｉすをＤＮＡ抽出のため使用した。胎盤を試験して、胎盤が 単又は二羊膜性及び単又は二絨毛膜性であるかを測定した。ＤＮＡを標準法（Ｏ ｌｄ。

Ｊ、　Ｍ、、１１１ｇｇ５．　Ｄ、　Ｒ，著、遺伝子分析、Ｄ、Ｊ、　Ｗｅａｔ ｈｅｒａｌｌ、編集、Ｔｈｅ　Ｔｈａｌａｓｓａｃｍｉａｓ、血液学における方 法、チャーチル・リビングストーン、１．９８３）によって抽出し、１１０−１ ５ｐを旦１ｎｆＩで消化した。試料を長さ２２ｃ＋ｍの０．６％アガロースゲル で４５Ｖで約３６時間、長さ１．５ｋｂ未満のＤＮＡ断片がすべて、電気泳動に よりゲルから除かれるまで、電気泳動した。ＤＮＡをニトロセルロースフィルタ ーへプロッティングによって転移させ、真空下に８０℃で２時間ベーキングした 。−末鎖ＤＮＡプローブ、３３．１５及び３３．６を前記のように３２ｐでラベ ルした。

結果を第１３図に示す。

第１３図において、列ｌ及び２は、３３°６一本積ミニサテライトプローブを用 いて、症例１の各双生児に関して得られたＤＮＡバンドパターンを示す。例３〜 １９は、一本ｔＭ３３．１５プローブを用いて得られた“指紋”を示し、症例１ は、列３及び４に、症例２は、列５及び６に、症例３は、列７及び８に、症例４ は、列９及び１０に、症例５は、列１１及び１２に、症例６は、列１３及び１４ に、症例７は、列１５及び１６に示ず。列１７〜１９は、女性、男性及び女性の ３人の三つ子を示す。列ｌ及び２を列３及び４と比較すると、２種のプローブ３ ３．６及び３３．１５がミニサテライトバンドの種々の組み合わせを検出するこ とが判る。大きさの標識は、キロ塩基で示す。

７つの症例（第６表参照）では、双生児の性及びその胎盤膜の試験によって節単 に接合生殖性を測定することができた。

単絨毛膜性（又はり１羊膜性）胎盤を１ｆする双生児（例えば、症例１）はすべ て−理性であるが、−卵性双生児の約５０％が単絨毛膜性胎盤（２）を有するに すぎなかった。従って、症例１における双生児は、−理性でなければならず、３ ３．１５及び３３．６ブローブにより同一のＤＮＡパターンを示した（第１図） 、５つの症例においては、双生児は異なる性を有し、３３．１５及び３３．６ブ ローブにより異なるバンドパターンを示した。症例３．５．７．９及び１１にお いて、双生児は同じ性を有し、二絨毛膜性胎盤を有し、−理性又は二卵性であり うる。ＤＮＡ分析により、２＆Ｉｌの双生児（症例５及び９）が異なるバンドパ ターンを有し、従って、二卵性であったが、他の３組（症例３．７及び１］）で は同一のバンドパターンを有し、−理性を示すことが判った。

２組の新生三つ子を同様に研究した。両方の場合に、母親は妊娠を誘発するため 受精剤を服用していた。各三つ子は、特異なバントパターンを示した（例えば、 第１３図、列１７〜１９）。

結果を第１４図に示す。第１４図において、列１及び２は、一本１３４３３．１ ５を用いた結果を示し、列３及び４は、二本鎖３３．１５を用いた結果を示す。

貫上ニ 一本鎖又は二本鎖プローブは、それぞれの診断をするのに適切であるが、多数の 放射性−末鎖プローブを用いて多数のバンドを区別することができたく第１４図 ）。

これらの−末鎖プローブの代替物として、はとんどの実験室で一層親しまれてい る対応する二本鎖プローブを使用する可能性を調べた。使用した二本鎖プローブ は、ｉ）λ３３．１５からの“コア”ミニサテライトを含む二本ｔｉ６００ｂｐ 　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ａｈａｍ断片及び１ｉ）２３３．６からの“コア゛ミニサテラ イトを含む二本ｔ４　’７２０ｂｐ　Ｈａｅ　ｍ断片であった。これらをＤＮＡ １μｇ当たり０．５−１．　ＯＸ　１０”ｃｐｍＯ比活性になるまでニックトラ ンスレーションによってラベルした。予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形 成条件は、二本鎖プローブ用のハイブリッド形成緩衝液にｉ　ｘｓｓｃ及び１０ ％デキストラン硫酸を使用した以外は、前記の標準法に記載したとおりであった 。

フィルターを６５℃で１ｘｓｓｃ中で１時間洗浄し、増強スクリーンを用いて一 ７０℃で１〜３日間、電気泳動した。

皿土工及び上ｌ優考察 接合生殖性を独立に測定することができた７つの症例において、Ｄ　Ｎ　Ａの結 果は、性の観、察及び胎盤試験に基づく結論と一致した。他の５組においては、 ミニサテライトプローブを用いて接合生殖性の明快な測定が可能であった。同様 に、研究した２組の三つ子は二卵性であることが判った。

性の相違（二卵性）又は単絨毛膜性胎盤（−理性）によっては双生児の接合生殖 性を測定できない症例の５０％において、遺伝子分析を使用しなＬＪればならな い。このような試験による情報量は、試験する遺伝子座における多望性の程度及 び試験する座の数に比例する。多数の赤血球抗原及び酵素測定より、集団におけ る関係対立遺伝子頻度が既知である場合にだけ、９５−９８％程度の接合生殖性 の精度を達成できる（Ｎｙｌａｒｉｄｅｒ、　Ｐ、　Ｐ、　Ｓ、著、双生児出産 現象、Ｂａｒｒｏｎ、　Ｓ。

Ｌｏ、Ｔｈｏｍｓｏｎ＋＾、Ｍ、Ｐｆｆｉ、０ｂｓｔ、ｅｔｒｉｃａｌ　Ｅｐｉ ｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、ロンドン、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８３　 ：　１４３〜１６５　）　＊同様に、数種の異なるＤＮＡプローブを用いる多数 の制限酵素部位多型性を分析すると、−理性の“誤った陽性”の診断がかなりの パーセンテージで生じる（Ｄｅｒｏｍ、　Ｃ２、Ｂａｋｋｅｒ、　Ｅ、、Ｖｌｉ ｅｔ−ｉｎｅｃｋ、　Ｒ，Ｄｅｒｏｍ、　Ｒ，、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｅｒｇｈｅ 、Ｈ，、Ｔｈ１ｅｒｙ、　Ｍ、％Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｐ、著、ＤＮＡ変異体を用 いる新生双生児の接合生殖性測定、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｇｅｎｅｔ。、１９８５． ２２８２７９〜２８２）　、本発明によるミニサテライトプロー・ブは、この問 題を克服している。それというのは、検出する超可変ＤＮＡ分節が多数で、著し く変化しうるからである。前記のように、ハイブリッド形成ミニサテライト断片 は、無作為に選択された個人の間ではほとんど共有されない。血縁のない二人の 個人が、超可突座の種々の組み合わせを検出するプローブ３３．６及び３３．１ ５で同一のＤＮＡ指紋を示す可能性は、従って、天文学的であることは既に示し た（ｐ　＜　＜Ｎｏ−”　、例４参照）。断片の約半分を共有する同胞において は、遺伝的同一性をこのように“誤った陽性”に診断する確率は、＜１０−”で ある。従って、−末鎖ハイブリッド形成プローブ３３．６及び３３．１５を組み 合わせて使用すると、従来の遺伝的試験より高い精度が得られる。

−末鎖プローブによって検出される比較的弱いバンドの若干のものにハイブリッ ドを形成しない、一層普通の二本鎖ミニサテライトプローブを使用してさえ（第 １４図）　、ＤＮＡ指紋から、“誤った一卵性”の割合を＜１０−’に低下する のに充分な情報を得ることができる。

この接合生殖性測定法の別の利点は、分析には極めて僅かな試料しか必要でない ことである。通常、半ｍ！！の末梢血液又は調帯血液で、充分なりＮＡが得られ た。新生並びにそれより年令の高い双生児及び三つ子における接合生殖性を測定 する、この明瞭な手段を利用しうろことにより、種々の型の多脂妊娠の決定要素 及び影響に関する一層正確な疫学的研究が可能である。

下記の例では、分子量標識はオートラジオグラフでは得られないが、他の結果に おけるように、有効な一般的範囲は、１．５〜２０ｋｂであった。

Ｓ　へのＤＮＡ５　の゛ ミニサテライトプローブ３３．６及び３３．１５によって検出されるＤＮＡ指紋 の個体特異性により、ＤＮＡ指紋は法医学において個人の確認に理想的に適当に なる。ただ一つ不確かなことは、ＤＮＡが例えば乾いた血液又は***の庖疹中で ＤＮＡ指紋分析を行うのに充分に未分解状態で生存するか否かである。法医学検 体の分析可能性を測定するため、Ｉｌｏｍｅ　０ｆｆｉｃｅＣｅｎｔｒａｌ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ、　ＡｌｄｅｒｍａｓｔｏｎのＰ ｅｔｅｒＧｉｌｌ博士によって供給されたＤ□ＮＡ試料について予備研究を実施 した。

ｆｌ岨 布上の乾いた血液及び***のＱ痕を、Ｇ１１１博士によって実施されたＤＮＡ抽 出（ＩＭＤＴＴの存在でＳＯ５で溶解し、次いでフェノールで抽出し、エタノー ルで沈澱させる）の前に、種々の時間室温で放置した。同様に、新鮮な毛根及び ***の前後に採取した膣スワブからＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ試料をＨｉｎｆＩ で消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルター 上にプロットした。フィルターを前記の本発明の標準技法を用いて″ｔｐ−ラベ ル一本鎖本ロブローブ３３５でハイブリッドとした。

電気泳動した試料は、下記のとおりであった：１、布上の***庖疹４０μｍ、４ 週間後のもの。

２、新鮮な***４０μｌ。

３、新鮮な血−ｆｉ６０μｍ０ ４、布上の血液廐痕６０μＮ、４週間後のもの。

５、布上の血液序痕６ｏμｒ、２年後のもの。

６、毛根１５個。

注、１−６は、同じ人から採取した。

７６布」二の血液庖疹６０ｔｔｌ、男性、新鮮。

８．７と***後１時間Ｇこ１１から採取ｔ７た膣スワブ。

９、***後７時間に採取した以外は８と同じ。

１０．１１から採取した膣スワブ。

１１、布上の血液庖疹６０ｐ１２．女性、新鮮。

得られたＤＮＡ指紋を第１５図に示す、各試料から分析のため充分なりＮＡ　（ 約０．５〜３μｇ）を抽出した。ＤＮＡは、乾いた血液庖疹では２年経過したも のまで、乾いた***では２ケ月経過したものまで、あまり分解していす１．同じ 個人の新鮮な血液及び***から得られるものと同一のＤ　Ｎ　Ａ指紋を生じた。

１５個の毛根程度の小さいものからも同様にｌ）　Ｎ　Ａ指紋を得ることができ た。

***後に採取した膣スワブも、分解していないＤＮＡ指紋を生じた。しかしなが ら、スワブパターンは、主とし２て、男性の血液ではなく、女性の血液のものに 一致した。このことは、スワブから集められるＤＮＡはほとんど、綿棒で採取す る間に剥離した膣」二皮細胞からのものであり、***からのものではなかったこ とを示す。それにもかかわらず、***後の試料においては、３個の付加的な女性 のものではないバンドが検出された。これらは、男性の血液における主バンドに ・一致し、***からＨｌされたものでなければならない。このようなバンドを、 ***後７時間に採取した試料で検出することこれらの予備実験の結果は、ＤＮＡ が種々の法医学的検体中で損なわれずに維持され、従−３で、同定の目的で１． ：）　Ｎ　Ａ　Ｊ’ｊ□゛紋を少ムくとも若干の法医学的試料に適用しうろこ１ とを示す。

例えば、被店老の着衣の情液癲痕から強姦犯人の積極的確認が可能Ｌコなる。強 姦被害者からの膣スワブを用いる場合は、。

膣ＤＮＡが混入する点であまり確実ではない。し７かし、***Ｄ　Ｎ　ＡＯ単； ■（７ご必要な***の２−ＤＴＴ又はメルカブトエクノール〜媒介還元の前に償 １ｓ熔解によってこの女性のＤＮＡを除去すると、一層明白なり　ＮＡ指紋が生 じる。この場合に、強姦犯人の同定は、鞘液庖疹及び／又は膣スワブのＤＮＡ指 紋分析によって可能になる。

その後、Ｇ１１１博士と協力して行った最近の研究で、−最的に上述しまた予備 分離技法苓使用して、***後の膣スワブから***ＤＮＡの明瞭な“指紋”が得ら れることが確認された。

第１５Ａ図は、***後６．５時間に採取した２つの膣スワブからのＤＮＡ指紋（ 列３）を示す。列ｌには、相手の男性の血液試料からの指紋を示し、列２には、 女性から得た血液からのＤＮＡ指紋４示ず。スワブからの女性の細胞核を、ＳＤ Ｓ／プロティＪ〜−ゼ１（混合物中での予備培養によって優先的に溶解させた。

***核は、この処理に影古されず、従って、遠心分離によって女性の成分から分 離することができる。その後、***核をＳＯＳ　／プロテイナーゼに／ＤＴＴ混 合物で処理することにより溶解させた。

この分離操作が完全に有効であったことは明らかである。

***で汚染された膣スワブからの***ＤＮＡ指紋は、相手の男性の血液から得ら れた指紋と完全に一致した。

ヒトのミニサテライー」Ｌ隻二りを月１と（得り才１１ｉ済句寥、運Ｊμｄ丸初 ９Ｊす幻Ａ！紋。

剌」」ニー−２５ 犬、猫、羊、豚、烏及び牛から採取した血液からＤＮＡ試料を製造した。８μｇ の試料を適当な制限、エンドヌクレアーゼ（特に断らない限り、Ｈｉｎｆ　Ｉ） で消化し、制限消化物をフェノール抽出後にエタノール沈澱によって回収した。

制限消化物を水中に再溶解し、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、変性し、 ５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌニトロセルロースフィルターに転移させ 、前記のように′３２Ｐ−ラベルヒトミニサテライトプローブ３３．６又は３３ ．１５を用いてハイブリ、ドを形成させた。

□犬 プローブ３３．６を用いて犬の家族から得られたＤＮＡ指紋を第１６図に示す。

電気泳動した試料は、下記のとおりであった： 列１　ビーグル大の父親 列２　グレーバウンドの母親 例３．４及び５　これらの両親の“グリ−グル（Ｇｒｅａｇｌｅ）　”の子犬（ それぞれ雌、雄、雄）。

ヒトＤＮＡから得られたものと同様に複雑な、詳細なりＮＡ指紋が各人から得ら れた。父親及び母親（列１．２）から得られたパターンを比較することによって 判るように、ＤＮＡ指紋は著しい変異性を示した。３匹の子犬はすべて、それぞ れ、すべて父親及び／又は母親に由来をたどることのできるバンドから成る、異 なるＤＮＡ指紋を有する。従って、これらのＤＮＡ指紋は、人の場合と同様に、 犬における父性試験及び家系分析に有用である。

試料１〜３のＤＮＡは、僅かに分解しており、それにより、最大（最も緩徐に泳 動する）バンドの強度を優先的に減少した。この分解にもかかわらず、両親から 子孫へのバンドの伝達は、容易に測定できた。

皿又叉　購 第１７図は、（左）プローブ３３．６及び（右）プローブ３３．１５を用いて、 毛の短い家猫の家族からのＤＮＡ指紋を示す。

列１　母親 列２　父親 列３　小猫 プローブ３３．６及び３３．１５は、情報に富むＤＮＡ指紋を生じる。小猫のほ とんどのバンドは、母性又は父性であると記録することができ、従って、これら のＤＮＡ指紋は、猫における家系試験並びに個体の同定に適当である。

ｔＬＬ　ニ ブローブ３３．６　（左）及び３３．１５　（右）を用いて種々の羊から得たＤ ＮＡ指紋を第１８図に示す。試料は下記のものであった： 列１　交雑育種した雌 列２　交雑育種した雌 列３　ドーセット種の雌 列４　ハンプシャー×ドーセソト種の雌列５　ドーセント種の雄 両方のプローブにより冬草から個体特異性ＤＮＡ指紋が得られた。ＤＮＡ指紋は 、ヒトのＤＮＡ指紋より弱く、それほど複雑ではないが、同定及び遺伝学的目的 にはなお有用である。プローブ３３．６は、弱いバンドの範囲の他に、冬草にお いて１又は２個の極めて強い多形バンドを検出する。これらのバンドは、恐らく 、極めて高いプローブ３３．６相同性を示す、ただ一つのミニサテライト座から 誘導されたものである。

■１１　五及グユ 第１９図は、３頭の異なる豚（列１〜３）及び３頭の異なる馬（列４〜６）〔性 別及び育種は、特定されていない〕からのＤＮＡ指紋を示す。プローブ３３．６ 及び３３．１５は、各種と個体特異性ＤＮＡ指紋を生じる。特にプローブ３３． １５によるＤＮＡ指紋は、弱く、対応するヒトＤＮＡ指紋と比べて極めて少ない バンドを含むが、それでも両方のプローブの併用は、個体の同定に有用である。

ルｌ牛 第２０図は、牛家族及び付加的な牛についてプローブ３３．６を用いて得られた 基１ｎｆｌＤＮＡ消化物のＤＮＡ指紋を示す。

試料は、下記のとおりである： 〔列１　ヒト〕 列２　社中 列３　父牛 列４１及び２の子牛 列５　アンガス雄牛 列６　フレシアン底生 羊、豚及び馬の場合と同様に、かなり前車であるが、それでも個体性）１性のＤ ＮＡ指紋が各動物から得られた。子牛では、すべてのバンドは、社中及び／又は 父牛に由来をたどることができ、この動物の家系を確認することができた。

第２１図は、同じウジＤＮＡについてプローブ３３．１５を用いた結果を示す。

個々の列は、下記のものを示す。

３、　１及び２の子牛 ４°　アンガス雄牛 ５°　フレシ）′ン諸牛 るハイブリッド形成りＮＡバンドの強くて、分離できない程、複雑なパターンを 生じる。　ＢＪＬＬＩＩ消化物においては、この強いシグナルは、主として極め て大きいＤＮＡ断片に限られ、このシグナルが、ふさ状配列又は領域、恐ら〈従 来のサテライトＤＮＡから誘導されたものであることを示唆する。

基１ｎｆｌ消化物を短時間、オートラジオグラフィに付すと、４５−５０塩基対 の間の“横木”の間で周期性をもって（データは示さない）、ゲルの底部に向か ・う“はしご”状バンドを示す。従って、強いシグナルは、恐らく長さ４５−５ ０塩基対の反復単位を有するサテライトから誘導されたものである。強いシグナ ルは、Ｐ　ｖｕ　Ｔｉ　、旦封１又はＡｌｕＩで消化されたウシＤＮＡにおいて 著しく破壊されており、サテライトＤＮＡ反復単位がこれらの制限エンドヌクレ アーゼのそれぞれに対する１個以上の部位を含むが、Ｈｉｎｆｉ又はＢ　ＬＬ　 ＩＩ対する部位を含まないことを示唆する。これらは、正確に、４６塩基対反復 単位の１０００００縦列反復から成る１、７２０ウシサテライト（Ｅ、Ｐｏ５ｃ ｈｌ及びＲ，Ｅ、　５ｔｒｅｅｋ著、′ウシ１．７２０サテライトＤＮＡのプロ トタイプ配列”、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、皿、１４７〜１５３　：　１９８ ０）の性質である。

１．７２０反復単位の配列とコアプローブ３３．６反復単位及び３３．１５５反 復単との比較を、以下に示す；コア　ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＸＧ　１１ ｈａ　Ｉ　ＤｄｅＮ３３．１５　−　八ＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧ　ＩＡ ＬＬＬ　１３３．６　八ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧ　Ｐｖｕ　ＩＩ前記の式から明ら かなとおり、１．７２０サテライト反復単位は、コア配列の３′領域のほぼ完全 な複写を含む（一致部を＊で示した）。１．７２０反復におけるこの領域は、３ ３．１５の反復単位と優れた一致を示すが、３３．６とはあまり完全でない一致 を示す。これは、１．７２０サテライトＤＮＡがプローブ３３．１５によって検 出されるが、３３．６によっては検出されない（第２０図）理由を説明する。（ １，７２０サテライト反復単位（ミオグロビンλ３３ミニサテライトの反復単位 と偵でいる）は、コア（式（１）におけるＨ＋Ｊ＞１５）の各側にあまり多数の ミクレオチドを含みすぎて、本発明による多座プローブとして作用しない〕。

プローブ３３．１５にハイブリッドを形成するウシミニサテライトを検出するた め、ＤＮＡを人」ｕｌ又は−ｐｄｅｌで消化して、１．７２０サテライトをこの ゲルの底部から電気泳動により除かれる４６塩基対モノマーに還元した。第２１ 図は、ウシＤＮＡからのこれらの制御！！！酵素のそれぞれについて明瞭なりＮ Ａ指紋が実際６ご得られたことを示す（Ｍ３）。しかしながら、これらのバンド のほとんど全部は、各反復においてＡｊｕ　Ｉ及びＤｄｅＩ部位を失った（恐ら く、前記の下線を付した塩基の一方又は他方の突然変異により、重なる込〜１！ ！Ｉ及び−ｐｄｅＩ部位が破壊されることによって）、正常な１．７２０　ＤＮ Ａ内に埋めこまれた１、７２０サテライトＤＮＡの変異体ブロックから誘導され たものである。このことは、下記の事実を説明するであろう： ３１人ｎ１及び中通ｑｌ庇用いて、実際に同一のウシＤＮＡ指紋が得られた。

ｂ、極めて大きい断片は、−貫して５．、小さいものより強力にハイブリッドを 形成する（これらは対応して多くの１．７２０サテライト反復単位を含むからで ある。極めて大きいウシＤＮＡ！ｌ！Ｊ′ｒ片は、これらの単位を４４０個含む ）。ヒトにおいては、バンド強度は、大きさと共に連続して増加しない（第２１ 図）。

Ｃ，ウシＤＮＡ指紋断片のほとんど全部は、１．７２０反復単位内で１度で切断 する一！（ｈ−ａ　Ｉによって除去される（前記参照、データを示さない）。

ｄ、父牛（Ｎ（１２）　ＩＬ人＝１−μｍ消化物中にハイブリッド形成断片をほ とんど有しない。このこ−己よ、これらの変異体反復ブｏツクを含む１．’？？ ０サテラ・イ）ＤＮＡの領域が１、ｒＬ：Ｄｌすｌ物では欠失したことを示唆す る。

ｅ、社中（嵐１）及び子牛（Ｎａ　５　）のＤＮＡ指紋は、はとんど同一・であ る。社中は、恐らく欠失ｔコ関して異型接合性で、父牛に見られるのと同等で、 非欠失染色体（及び従って、全部のバンド）を偶然、子牛に伝達し７ていた。従 って、これらのバンドはすべてｉ’！！　鎖ＩＪ、ヒトにおいで起こるのと同様 に子孫に独立して伝達されない。

それにもかかわらず、試験した５頭のウシは、異なる“サテライト”ＤＮＡ指紋 パターンを示し、これらの異常な型の指紋は、個体の同定に有用であるが、多座 標識情報を得るには使用できない。

式（１）において、ｎが必ずしも３に等しくない場合にも、あるプローブは有効 に機能することができる。このようなプローブにおいては、コアを含まないＤＮ Ａ配列によって少なくとも１対の（Ｊ、コア、Ｋ）の反復を少なくとも更に２個 の反復から分離することができる。従って、“非コア”ＤＮＡ配列によって隔て された対中に（Ｊ、コア、Ｋ）配列が配列されている充分に長いブロー・ブを１ １！成することができる。

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ｆ［Ｇ、５ ＝　ｅＩｌ［Ｉ□１１１１王ｊ右 ＦＩＧ、６ Ｆ［Ｇ、７ 工≧−ｉｉ・鼻　ａ　トｔシ１壜嘲−−工とト１？ｔ＃　＠；　ミ　１１１１＊ ＊１≧−ｉ　ζ；　；↓　−ロ邊。

ロエ≧”　ＩＩ　ｉ　＃ｙ− ミー　ＩＮ　’ｉ　ｊ　番′４５ドｒ エミ、　ｌ　ｌ　ＩＩ− ミｅＩｌＩｌ ＝Ｎ ＝ロ　目　番４昏　１糟 ”：”　Ｈ１＃ｐｌｓ４＠ ≧−ｔ　Ｉｔ　ｌ＃瞥　［ ど　１　シ　１ く　≧〜　゛　１　番　・ ＝−■！　噂１１・１１嘲 ５’ＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧ３′ ３′ＣＡＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＣＧＡＣ５′□プロープ Ｆ［Ｇ、１２ Ｆ　５ＳＤＤＤＤＦＤＤＳＳＳ ＦＩＧ、１３ 〜　Ｉ　１１　・◆ −慢ず Ａ　６　６　晶 シ（〜　− Ｆ［Ｇ、１／。

２〇− ４１ｍ１４　・ ＦＩＧ、１５ １２３　ム　Ｓ　Ｓ　７　８　ｇｌｏ　１１ＦＩＧ、１５△ １２３　ξ　５ ＝＝＝； 、＄−＝２＝・ ＦＩ［３，１７ １２３［２３ χ３３・（、ｘ　３３−１ｒ ＦＩＧ、１８ ・　・−一−− ｘ　３３・ら　ｘ　３３・Ｉｓ’ ＦＩＧ、１９　”（内８ζこ変更なし〕ｘ　３ＥＬ（３ｗ　３３１Ｓ”　ｙ　３ ３ら　ｘ３？３／ｆＦｆＧ、２０ ― Ｘ　χ　×　／　Ｘ　× 手続補正書（方式） ％式％ ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　リスター　インスティチュート　オブプリベンティブ　メディスン ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ｌＯ号５、補正命令の日付 昭和６２年２月２４日（発送日） ６、補正の対象 （１）　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者 」の欄 （２）委任状 （３）　明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 （５）　法人証明書 （６）　図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１１（２）　（５）　別紙の通り （３）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の浄 書（内容に変更なし）（６）　図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付 書類の目録 （１）　訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 （５）法人証明書及びその翻訳文　各１通（６）浄書した図面の翻訳文　１通 国際調査報告 ―ｈ１１１１１＾ｎ内ａ＋＋ａｎ’＝　ＰＣＴ／ＧＢ　８５１００４？）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．５′→３′の意味に読まれる次の一般式：Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）ｎ・Ｌ（ １） 〔式中、 “コアー”は６個以上の連続するヌクレオチドを有する配列を表わし、該ヌクレ オチドは同じ意味に読まれる次の配列：【配列があります】（２） 【配列があります】（３） 【配列があります】（４） 【配列があります】（５Ａ） 【配列があります】（５Ｂ） （式中、ＸはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴであり、ＴはＴ又はＵであり、ｍは ０．１又は２であり、ｐは０又は１であり、ｑは０又は１であり、ｎは３以上で ある）のいずれかの中から選択され； Ｊ及びＫは一緒になって、反復単位内の０〜１５個の追加のヌクレオチドを表わ し；そして Ｈ及びＬはそれぞれ、反復配列の端に位置する０又は１以上の追加のヌクレオチ ドを表わし；そして次のこと、すなわち： （ｉ）“コアー”並びにＪ及びＫは各（Ｊ．コアー．Ｋ）反復単位中同じ配列又 は長さを有することは必ずしも必要でなく； （ｉｉ）“コアー”はまた変形体コアー配列を表わすこともでき； （ｉｉｉ）全ｎ反復配列中の実際の合計コアー配列は、同じ数ｎの反復単位にお いて、式２〜５について上に定義した“真”の合計コアー配列との７０％以上の 相同性を有する〕を有するポリヌクレオチド、並びにこれに対して相補的な配列 のポリヌクレオチド。 ２．各（Ｊ．コアー．Ｋ）反復配列中に存在するヌクレオチドの合計数が２５を 超えない、請求の範囲第１項に記載のポリヌクレオチド。 ３．コアーが最高１６のヌクレオチドを有する、請求の範囲第１項に記載のポリ ヌクレオチド。 ４．コアーが７個以上の連続するヌクレオチドの配列を表わす、請求の範囲第１ 項に記載のポリヌクレオチド。 ５．コアーが１２個以上の前記連続するヌクレオチドの配列を表わす特許請求の 範囲第１項に記載のポリヌクレオチド。 ６．コアーが、式（２）、（３）又は（４）中に示された配列から選択される１ ４〜１６個の前記連続するヌクレオチドの配列を表わす請求の範囲第１項に記載 のポリヌクレオチド。 ７．実際のコアー配列が真のコアー配列との８０％以上の相同性を有する、前記 いずれかの請求の範囲に記載のポリヌクレオチド。 ８．Ｊが０又は１であり、そしてＫが０又は１である、請求の範囲第７項に記載 のポリヌクレオチド。 ９．各（Ｊ．コアー．Ｋ）反復単位中に存在するヌクレオチドの合計数が２０を 超えない、前記いずれかの請求の範囲に記載のポリヌクレオチド。 １０．５′→３′の意味に読まれる次の一般式：Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）ｎ・Ｌ （１） 〔式中、 “コアー”は同じ意味に読まれる６〜１６個の連続するヌクレオチドの配列を表 わし、次のもの：（１）ヒト又は動物のゲノムＤＮＡを、反復単位当り約３３ｎ ｔのミオグロビンタンデム反復配列を含有するプローブにより探索することによ り得られる第１のヒト又は動物のミニサテライトの共通コアー領域； （２）ヒト又は動物のＤＮＡを、（１）を含んで成るタンデム反復配列を含有す るプローブにより探索することにより得られる第２のヒト又は動物のミニサテラ イトの共通コアー領域； （３）ヒト又は動物のゲノムＤＮＡを、（２）を含んで成るタンデム反復配列を 含有するプローブにより探索することにより得られる第３のヒト又は動物のミニ サテライトの共通コアー領域； から選択され、 前記タンデム反復配列が３つ以上の単位から成る〕で表わされるポリヌクレオチ ド；並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチド。 １１．５′→３′の意味に読まれる次の一般式：Ｈ．（Ｊ．コアー．Ｋ）・Ｌ（ １） 〔式中、 “コアー”は７５％以上のコンセンサスを示すヒト又は動物のゲノムＤＮＡの多 数のミニサテライトの共通コアー領域内からの６個以上の連続するヌクレオチド を有する配列のいずれかを示し； “コアー”は各反復単位中で同じ配列を有することは必ずしも必要でなく；そし て 他のすべての記号は請求の範囲第１項において定義される通りである〕 を有するポリヌクレオチド；並びにこれに対して相補的な配列のポリヌクレオチ ド。 １２．次の式： （５′）【配列があります】（３′）（６）（式中ＰはＧではなく、ＷはＡ又は Ｔ又はＵであり、そしてＸはＡ又はＧである） 内から選択される連続する（５′→３′）コアー配列を含有する６〜３６ｎｔの 配列の３以上の反復を有するポリヌクレオチド、又はその変形体（全反復中の実 質の合計コアー配列は、同じ数の反復内の式（６）について定義された“真”の 合計コアー配列との７０％以上の相同性を有することを条件とする）；並びにこ れに対して相同な配列のポリヌクレオチド。 １３．各反復又は変形体反復が式（６）の配列を含む、請求の範囲第１２項に記 載のポリヌクレオチド。 １４．連続する（５′→３′）配列： 【配列があります】（７） がすべての反復単位中に保存されており、Ｐ及びＷが請求のの範囲第１２項にお いて与えられた意味を有する、前記いずれかの請求の範囲に記載のポリヌクレオ チド。 １５．連続する（５′→３′）配列： 【配列があります】（８） がすべての反復単位中に保存されており、そしてＴがＴ又はＵである、前記いず れかの請求の範囲に記載のポリヌクレオチド。 １６．ＰがＴ又はＵである、請求の範囲第１２項〜第１５項のいずれかに記載の ポリヌクレオチド。 １７．ＷがＡである、請求の範囲第１２項〜第１６項のいずれかに記載のポリヌ クレオチド。 １８．再度引用された連続するコアー配列又は保存された配列が反復配列と同一 である、請求の範囲第１２項〜第１７項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 １９．次の連続する５′→３′コアー配列：【配列があります】（７） （式中ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴ又はＵであり、そしてＸはＡ又はＧである ） を含む３以上の反復を有するポリヌクレオチド、又はその変形体（全反復中の実 際の合計コアー配列が同じ数の反復中の式（７）について定義した“真”の合計 コアー配列との７０％以上の相同性を有することを条件とする）、並びにこれに 対して相補的な配列のポリヌクレオチド。 ２０．Ｗが５′末端においてＡであり、そして３′末端においてＴ又はＵである 、請求の範囲第１９項に記載のポリヌクレオチド。 ２１．多型性ミニサテライト−長さ特異的結合特性を有するポリヌクレオチドの 製造方法であって、（ｉ）他の多型性ＤＮＡ領域に対して限定されたハイブリダ イゼーションを行うことができるＤＮＡ中の天然タンデム反復配列を同定し、 （ｉｉ）そのような結合を仮に担当する反復配列の天然コンセンサスコアー配列 を同定し、そして （ｉｉｉ）天然反復配列より低いゲノム−遺伝子座特異性及び高い多形性断片受 容性を示す、ミニサテライト結合性を有する天然コンセンサスコアー配列に由来 する完全又は不完全タンデム反復配列を単離するか又は人工的に造成する、こと を含んで成る方法。 ２２．ポリヌクレオチドが請求の範囲第１項〜第２０項のいずれかにおいて定義 されている通りである請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．ヒト又は動物のＤＮＡ含有サンプルの遺伝的由来の決定において有用なポ リヌクレオチドプローブであって、ラベルされた又はマーカー成分を含むと共に 、制限エンドヌクレアーゼによるサンプルＤＮＡの断片化により得られる対応す るＤＮＡ断片への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする程度にヒ ト又は動物ゲノムのミニサテライト領域と相同である配列の３以上のタンデム反 復を含んで成るポリヌクレオチド（変形体を包含する）を含んで成り、そして次 のこと： ａ）前記反復がそれぞれ、異るゲノム遺伝子座からの多数のミニサテライト中に 存在する同様な長さのコンセンサスコアー領域と７０％以上相同であるコアーを 含有し；ｂ）前記コアーが６〜１６ヌクレオチド長であり；ｃ）コアーに寄与し ない反復単位内のヌクレオチドの合計数が１５以下である； ことを特徴とするプローブ。 ２４．前記コアーが、５′→３′と連続する配列：【配列があります】（７） 又は【配列があります】（８） （式中、ＰはＧではなく、ＷはＡ又はＴ又はＵである）を含有する、請求の範囲 第２３項に記載のプローブ。 ２５．前記ポリヌクレオチドが請求の範囲第１項〜第２０項に記載のポリヌクレ オチドであり、少なくとも前記反復ユニットが単鎖型である、請求の範囲第２３ 項に記載のプローブ。 ２６．請求の範囲第１項〜第２０項のいずれかにおいて定義された、ラベルされ たポリヌクレオチドから成り、少なくとも反復単位が単鎖形であるポリヌクレオ チドプローブ。 ２７．全体として単鎖形である請求の範囲第２３項〜第２６項のいずれかに記載 のプローブ。 ２８．ヒト又は動物のＤＮＡを含有するサンプルの遺伝的由来の決定において有 用なプローブの製造方法であって、請求の範囲第１項〜第２０項のいずれかの、 又は請求の範囲第２１項の方法により製造されたポリヌクレオチドにラベル又は マーカーを導入することを含んで成る方法。 ２９．ヒト又は動物のゲノムＤＮＡのサンプルを同定する方法であって、該ＤＮ Ａを請求の範囲第２３項〜第２７項のいずれかに記載のプローブにより探索し、 そして該ＤＮＡのハイプリダイズした断片を検出することを含んで成る方法。 ３０．前記検出される断片が、サンプルＤＮＡのタンデム反復配列を損傷するよ うに開裂しない制限酵素により開裂せしめることにより得られる、請求の範囲第 ２９項に記載の方法。 ３１．請求の範囲第２３項〜第２７項のいずれかに記載の２種類以上のプローブ を用いて得られる陽性断片のパターンを比較する、請求の範囲第２９項又は請求 の範囲第３０項に記載の方法。 ３２．遺伝される疾患、異常又は形質と関連するヒト又は動物のゲノムのミニサ テライト領域に遺伝子座特異的であり、そして家庭又は血統分析において請求の 範囲第２３項〜第２９項の１又は複数のプローブにより形成される個々のパター ンの比較により観察される前記疾患、異常又は形質に関連するバンドの単離を介 して得られるプローブ。 ３３．請求の範囲第２３項〜第２７項のいずれかに記載の１又は複数のプローブ を用いて得られ、そして癌と関連する染色体又はＤＮＡの異常と関連することが 観察される指紋バンドに由来するプローブ。 ３４．請求の範囲第２３項〜第２７項のいずれか又は第３３項に記載のプローブ の変形であって、（Ｊ．コアー．Ｋ）のタンデム配列の少なくとも１対がコアー を含まない配列によって少なくとも２つの他の配列から分離されており、これに よってｎが必ずしも３に等しくなく、他のすべての拘束が存在する変形。