JPS6248715A - 親水性多孔粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 この発明は、糖、タンパク、酵素等の分離、精製用担体
として用いられる親水性多孔粒子に関する。

〔背景技術〕

糖、タンパク、酵素等を担体を用いて分離、精製する方
法として、これらの物質の分子の大きさによって分離す
るゲルろ過性、物質のもつクーロン力の差によって分離
するイオン交換クロマトグラフィー、あるいは、酵素−
基質反応等の化学的親和力によって分離するアフィニテ
ィークロマトグラフィー等が一般に行われている。

従来、このような分離精製用の担体としては、寒天、デ
キストランあるいはセルロース等の天然系ゲルが用いら
れてきたが、これら天然系ゲルには、低ｐＨ領域で信頼
性が低い２機械的強度が弱い、保存中に微生物の攻撃を
受けやすい、乾燥させると粒子が破壊されて使用不能に
なってしまう等の欠点がある。

そこで、近時、これら天然系ゲルにかわるものとして、
有機あるいは無機の合成系ゲル（多孔粒子）が開発され
ている。

有機合成系ゲルとしては、アクリルアミド、２−ヒドロ
キシエチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート
、アクリル酸等の親水性七ツマ−を主成分とし、これに
、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレ
ート、メチレンビスアクリルアミド、ペンタエリスリト
ールジメタクリレート等の架橋剤を反応させて三次元構
造としたものや、親水性モノマーをポリマー粒子表面に
グラフト重合させたもの、ポリマー中のエステル基やア
セタール基を加水分解して水酸基に変換させたもの等が
あげられる。しかし、これら有機合成系ゲルには、タン
パクの非特異吸着が起こりやすい、常圧下での分離能が
悪い等の問題点がある一方、無機合成系ゲルとしては、
シリカゲル。

ガラスピーズ等があげられるが、これら無機合成系ゲル
にも、高ｐＨ領域での信頼性が低い、水系での信頼性が
低い（シリカ系）、糖やタンパクの非特異吸着がおこり
やすい（シリカゲル系）等の問題がある。

以上のように、現在、一般に用いられている各種のゲル
（天然系、有機および無機の合成系）は、それぞれ問題
点を抱えている。そこで、大規模工業用を含め、一般の
生物化学分野における分離精製用担体が具備すべき各種
の要件、すなわち・あらゆる溶剤に不溶で、充分な透過
性を有し、適当な機械的強度を持った球状粒子であるこ
と、糖やタンパク等の被分離物質を非特異的に吸着しな
いこと、化学的または生化学的に安定であること、固定
相として充分な反応性を有すること、親水性であること
、等を満足する分離精製用の担体が求められ４ている。

〔発明の目的〕

この発明は、以上の事情に漏みてなされたものであって
、大規模工業用の分離精製用担体等に使用できる親水性
多孔粒子を提供することを目的と、　　している。

〔発明の開示〕

以上の目的を達成するため、この発明は、以下の一般式
で表された、両末端に重合性二重結合を存するポリオキ
シエチレン化合物 Ｒ，−０→ＣＨ２−ＣＨ２−０←ｎＲＩ〔１４≦ｎ≦４
５〕 と、このポリオキシエチレン化合物と重合可能なモノマ
ーのうち、少くともポリオキシエチレン化合物が、これ
らの成分は溶解するが重合生成物は溶解しない性質を有
する、前記各成分合計の５〜１０倍量の溶剤に溶解され
てなる溶液を、開始剤の存在下、水分散系で懸濁重合し
てなる親水性多孔粒子を、その要旨としている。

以下に、この発明の詳細な説明する。

ここで、主成分である、両端末に重合性二重結合を有す
るポリオキシエチレン化合物は、下記の弐（Ｉ）であら
れされる。

Ｒ１−０→ＣＨｚ−ＣＨ２−０−）−−Ｒ１（Ｉ）式中
、ＲＩとしては、重合性二重結合を有する基、たとえば
、次式（ＩＩ）であられされた基が、好ましい。

（但し、Ｒ２はＨまたはＣＨ３） ポリオキシエチレン連鎖の長さｎは、この発明では、１
４≦ｎ≦４５の範囲内にある必要があるすなわち、発明
者らが、このポリオキシエチレン化合物と、疎水性ある
いは親水性の種々の七ツマ−とを用いて多孔粒子を合成
し、糖やタンパク等の吸着について検討を行ったところ
、これらの吸着が粒子表面の疎水性、すなわち、ポリオ
キシエチレンの連鎖長ｎに左右されることがわかった。

例えば、メタクリル酸のヒドロキシエチルフタル酸エス
テル等の芳香族環を有する疎水性モノマーや、２，３−
ジヒドロキシエチルメタクリレート等の親木性モノマー
を、前記式（１）であられされたポリオキシエチレン化
合物と反応させて多孔粒子を作成し、ブルーデキストラ
ン（ファルマシア社製）、ウシ血清アルブミン、ヒトー
Ｔ−グロブリンについてその吸着性を測定したところ、
ポリオキシエチレン化合物の連鎖長ｎと吸着性との間に
明確な関係が観察された。そこで、さらに検討を行った
ところ、前述した連鎖長のポリオキシエチレン化合物を
用いれば、糖やタンパクを非特異的に吸着せず、しかも
、疎水性七ツマ−が配合されても充分な親水性を有し、
かつ、大型カラム充てん圧に耐える充分な力学的強度を
持った粒子が得られることを見出した。この発明におい
て連鎖長ｎが上のように規定される必要があるのは、こ
のような知見゛に基づく。

以上の化合物と重合可能な千ツマ−としては、例えば、
以下に示したような化合物があげられるアクリル酸、お
よびその誘導体くメチルアクリレート等のアルキルアク
リレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート等のヒド
ロキシアルキルアクリレート、ジメチルアミノアクリレ
ート等のジアルキルアミノアクリレート、グリシジルア
クリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパン
スホルン酸）、メタクリル酸、およびそのＢＡ　導体（
メチルメタクリレート、エチルメタクリレート等のアル
キルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレ
ート、２，３−ジヒドロキシエチルメタクリレート等の
ヒドロキシアルキルメタクリレート、ジエチルアミノメ
タクリレート等のジアルキルメタクリレート、グリシジ
ルメタクリレート、カリウムスルホプロピルメタクリレ
ート、２−ヒドロキシ−３−メククリルオキシブロピル
トリメチルアンモニウムクロリド）、スチレン、アクリ
ロニトリル、酢酸ビニル、ビニルピロリドン。

以上のようなモノマーが配合されることにより、多孔粒
子の親水性の増大、あるいは、粒子表面における親水性
−疎水性バランスの調整、力学的強度の改善、アフィニ
ティークロマトグラフィー用等のリガンド固定化担体と
しての−ＯＨ，−３○３　Ｈ，−ＣＯＯＨ，−ＰＯ：ｌ
　Ｈ等の官能基付与等を行うことができるのである。

以上のようなモノマーは、前記式（Ｉ）の化合物１００
〜５０重量％（以下、「％」と記す）に対し、０〜５０
％の範囲内で配合されることが好ましい。モノマーの配
合量が５０％を超えると、千ツマー自身の持つ性能が、
生成される多孔粒子に現れ、糖やタンパク等の非特異吸
着が生ずることが多い。また、水酸基等の親水性基を有
するモノマーを使用する場合には、上記理由に加えて、
次のような理由からもモノマーの配合量を０〜５０％の
範囲内にすることが好ましい。すなわち、前記、水酸基
等の親水性基を官能基として有するモノマーは、その配
合量が０〜５０％の範囲内であるときには、生成される
多孔粒子の親水性基の量と、このモノマーの配合量との
間に比例的な関係が存在する。このため、モノマーの配
合量を制御することで、生成される多孔粒子中の親水性
基の量（反応性官能基量）を変化させることが可能であ
る。しかし、モノマーの配合量が５０％を超えると、重
合により生成される多孔粒子中の反応性親水性基の量は
一定値を示し、かえって超過分のモノマーがムダになる
場合が多いのである。

前記式（１）の化合物と、モノマーとを以上に説明した
成分比率で配合し、つぎに、これらの成分は溶解するが
、これらの成分からなる重合生成物は溶解しない性質を
有する溶剤に前記成分を）岩解して、溶液とする。この
溶液を、開始剤の存在下、水分散系で懸濁重合させれば
、この発明の親水性多孔粒子が得られる。この重合方法
は・従来のを機合成系ゲルの製法と全く同じものである
が、前記各成分を前記成分比率で配合することで、この
発明の親水性多孔粒子が得られるのである。

溶剤はこの方法においては、重合される粒子中に孔を発
生させる働きを有しており、前記性質に加えて、水に相
溶しない５重合に関与しない等の性質を有したものであ
る必要がある。このような溶剤としては、これに限定さ
れるものではないが、例えば、次のような有機化合物が
あげられる。

ヘンゼア。トルエン、クロルヘンゼン、ｎ−ブタノール
、ｎ−オクタン。

これら溶剤の配合量は、この発明では、溶液中のこの溶
剤以外の成分、すなわち、弐（Ｉ）の化合物と七ツマ−
とを合わせたものの全重量の、５〜１０倍の溶剤を配合
する必要がある。なぜなら、この溶剤には、前述した孔
を発生させる働きの他に、その配合量に応じて孔径を変
える働きもあり、この発明の目的である分離精製用組体
に好ましい孔径の親水性多孔粒子を得るためには、前述
した範囲内の配合量の溶剤を配合する必要があるからで
ある。すなわち、この溶剤の配合量が５倍未満では生成
する孔径が小さすぎて従来の有機合成系ゲルとかわらな
いものになり、常圧下における糖やタンパクの分離能が
充分に得られなくなってしまい、配合量が１０倍を超え
ると生成する孔径が大きくなりすぎて多孔粒子の機械的
強度が充分に得られなくなってしまうため、前記範囲外
の親水性多孔粒子は分離精製用担体として不適当である
といえる。

この発明の親水性多孔粒子は、以上のように、前記式（
１）の化合物を使用した点の他に、重合に関与しない溶
剤が、重合に関与する前記２成分の５〜１０倍という従
来にない大過剰添加されて合成される点にも特徴がある
。

ＨＰＬＣ用充てん剤として作られてきた従来の合成系ゲ
ルでは、その機械的強度を充分に保つ必要から、溶剤の
配合量の最大限度を、重合に関与する成分合計の約３倍
としてきた　（例えば、特公昭５４−０２４９９４号公
報、特公昭５４−１６０３００号公報等）。また、事実
、従来の合成系ゲルでは、溶剤を重合に関与する成分合
計の約３倍を超えて配合したのでは、多孔粒子を得るこ
とができなかった。例エバ、スチレンージビニルヘンゼ
ンまたは、２−ヒドロキシエチルメタクリレート−エチ
レングリコールジメタクリレート等、従来の低分子量架
橋剤を用いた系に、３倍を超えて５〜１０倍の溶剤を配
合し、合成したゲルは、極めて脆弱で、常圧でさえ、カ
ラムに充てん不可能な粉末となってしまうことが確認さ
れている。

これに対し、この発明では、前記式（１）の化合物を使
用ことによって、溶剤を従来にない大過剰添加しても、
前述したような大孔径の孔を有するとともに、充分な強
度を有し、生化学用分離材として適した親水性多孔粒子
を得ることを可能としたのである。

開始剤としては、通常の懸濁重合に使用されるラジカル
重合開始剤であれば、あらゆるものを使用することがで
きるが、好ま゛しい開始剤としては、次のような化合物
があげられる。

アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ヘンゾイル、ｔ−
ブチルパービバレート。

この親水性多孔粒子を分離、精製用担体として利用する
場合には、前記粒子の粒径は、分離性能や流速、処理時
間等を左右する重要な因子の１つである。したがって、
この親水性多孔粒子を製造する時には、その粒径を用途
に応じて制御する必要がある。親水性多孔粒子を前記懸
濁重合法で製造する場合には、一般の懸濁重合法と同様
に、前記各成分の種類や量５分散安定剤の種類や量、か
く拌翼の型やかく拌速度等の諸因子を調整することによ
って前記粒径の分布を１〜３００μｍの範囲内で制御す
ることが可能である。

以上のように、この発明の親水性多孔粒子は、ポリオキ
シエチレン連鎖を有する前記式（Ｉ）の化合物を主成分
としているため、糖やタンパク等の非特異的な吸着は発
生せず、これらの物質の回収率を天然系ゲル同等あるい
はそれ以上に高めることができる。また、親水性である
前記式（［）の化合物に、副成分として各種官能基を有
したモツマーを重合させることもできるため、その組繊
中にこれらの官能基をとり込むことが可能となり、粒子
の親水性をそこなわずに、固定相として充分な反応性を
も有することができるようになる。

しかも、前記式（Ｉ）の化合物が、モノマーと重合され
て３次元構造となるため、化学的にも往化学的にも安定
であらゆる溶剤にも不溶となり、機械的にも充分な強度
を持った球状の粒子を得ることができる。また重合に際
しては、前述したように、従来のを機合成系ゲルにくら
べて孔径の大きい多孔粒子を得ることができるため、分
離能を高めることができ、結果として、大規模工業用の
分離精製用担体として使用できる親水性多孔粒子が得ら
れるのである。

つぎに、この発明の実施例を比較例とあわせて説明する
。

（実施例１） ポリエチレングリコールジメタクリレート　（ｎ−２３
）を主成分とし、これに、２．３−ジヒドロキシエチル
メタクリレートをモノマーとして配合し、さらに、その
他の成分を第１表に示した成分比率で配合して混合溶液
を作成した。この混合溶液を、分散安定剤としてポリビ
ニルアルコール５ｇが配合された脱イオン水１，５ｅ中
に投入してかく拌、悲濁させ、Ｎ２雰囲気中７０℃、５
時間の反応を行った。反応後デカンテーションを行って
微少粒子を除去したのち、生成物を吸引ろ過し、親水性
多孔粒子を得た。得られた親水性多孔粒子をアセトン、
メタノール、純水の順に洗浄したあと、０．１　Ｍ　）
リス−塩酸＋０．１５Ｍ食塩のｐ）（８，０緩衝液に保
存した。このとき、湿潤状態での粒径を測定したところ
、４０〜３００μｍであった。この親水性多孔粒子を前
記緩衝液とともに１５　Ｘ　４５０　ｍｌのガラスカラ
ム中に充てんした。

卵アルブミンＡまたはヘモグロビンＢにブルーデキスト
ランＣ（※１）を混合したものを試料とし、これを前記
緩衝液とともに前記カラム中に流し、各成分の分離性能
を調べたところ、第１図（ａｌ、（ｂ）に示したように
、卵アルブミンＡまたはヘモグロビンＢとブルーデキス
トランＣとが完全に分離して検出された。このことから
、この発明の親水性多孔粒子は分離精製用担体として充
分な性能を有していることがわかった。

※１：ファルマシア社製、分子量２００万のデキストラ
ンにブルーの色素を共有結合させたもの。

一般に、クロマト展開時のマーカーとして用いられてい
る。

第　　　１　　　表 （実施例２〜５） 七ツマ−として、第２表に示した化合物を用いた以外は
実施例１と同様にして親水性多孔粒子を作成した。この
親水性多孔粒子を１ＯＸ１５０ｆｌガラスカラム中に充
てんし、ここへ、０．１　Ｍ　トリス−塩酸＋０．１５
Ｍ食塩のｐＨ８，０緩衝溶液中に濃度既知のウシ血清ア
ルブミン、ヒ’ｒ−ｒグロブリンおよびフ′ル−デキス
トランをｌ重合したものを流して吸着させた。そのあと
、この親水性多孔粒子を洗浄し、この洗浄液中に回収さ
れた前記各成分の量を２８０ｎｍの吸光分析によって測
定し、回収率を算出した。結果を第２表に示す。

（比較例１．２） 主成分として、ｎ＝＝１のエチレングリコールジメタク
リレートを使用した以外は、それぞれ、実施例２．３と
同様にして多孔粒子を作成し、回収率を測定した。結果
を同じ（第２表に示す。

第２表の結果より、従来の有機合成系ゲルである比較例
１，２では、被分離物質である各成分はほとんど回収す
ることができず、非特異的にごれらのゲルに吸着されて
しまった。これに対し、この発明の親水性多孔粒子であ
る実施例２〜５では、各成分を高い回収率で回収するこ
とができ、糖やタンパク等の被分離物質を非特異的に吸
着しないことがわかった。

〔発明の効果〕

この発明の親水性多孔粒子は、以上のように構成されて
おり、あらゆる溶剤に不溶、充分な透過性を有する。適
当な機械的強度を持った球状粒子である。糖やタンパク
等の被分離物質を非特異的に吸着しない、化学的または
生化学的に安定である。親水性である等の要件をすべて
満たしているため、生物活性物質の分離、精製用担体と
して好適に使用することが可能となっている。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、　（ｂｌは、それぞれ、この発明の親水
性多孔粒子を充てんしたカラムによる被分離物質の分離
状態の一例をあられすグラフである。 Ａ・・・卵アルブミン　Ｂ・・・ヘモグロビン　Ｃ・・
・ブルーデキストラン 代理人　弁理士　　松　木　武　彦 第１図 （ｂ）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の一般式で表された、両末端に重合性二重結
   合を有するポリオキシエチレン化合物Ｒ＿１−Ｏ−（Ｃ
   Ｈ＿２−ＣＨ＿２−Ｏ）＿ｎ−Ｒ＿１〔１４≦ｎ≦４５
   〕 と、このポリオキシエチレン化合物と重合可能なモノマ
   ーのうち、少くともポリオキシエチレン化合物が、これ
   らの成分は溶解するが重合生成物は溶解しない性質を有
   する、前記各成分合計の５〜１０倍量の溶剤に溶解され
   てなる溶液を、開始剤の存在下、水分散系で懸濁重合し
   てなる親水性多孔粒子。
2. （２）Ｒ＿１が次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但しＲ＿２はＨまたはＣＨ＿３） であらわされた基である特許請求の範囲第１項記載の親
   水性多孔粒子。
3. （３）ポリオキシエチレン化合物とモノマーの相互の配
   合割合が、ポリオキシエチレン化合物１００〜５０重量
   ％に対しモノマー０〜５０重量％の範囲内である特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の親水性多孔粒子。
4. （４）モノマーがアクリル酸およびその誘導体、メタク
   リル酸およびその誘導体、スチレン、アクリロニトリル
   、酢酸ビニルならびにビニルピロリドンよりなる群から
   選ばれた少なくとも１つの化合物である特許請求の範囲
   第１項から第３項までのいずれかに記載の親水性多孔粒
   子。