JPS6244917B2

JPS6244917B2 -

Info

Publication number: JPS6244917B2
Application number: JP15049985A
Authority: JP
Inventors: Osamu Suzuki; Toshihiro Yokochi
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-07-09
Filing date: 1985-07-09
Publication date: 1987-09-24
Also published as: JPS6214791A

Description

【発明の詳細な説明】

［技術分野］本発明はγ−リノレン酸含量の高いホスフアチ
ジルエタノールアミンのモルテイエレラ属糸状菌
による製造方法に関するものである。［従来技術］モルテイエレラ属に属するイサベリナ、ビナセ
ア、ラマニアナ、ラマニアナ・アングリスポラ、
及びナナ等の糸状菌体を、高濃度の炭水化物を炭
素源とする培地に培養することにより、γ−リノ
レン酸含有脂質含量の高い菌体を高密度で生産す
る方法は既に提案されている。（特開昭60−
168391号公報（特願昭59−22394号））。ところで、グリセロ型リン脂質の一種類である
ホスフアチジルエタノールアミンは次式の様な構
造を持つことが知られている。その構造脂肪酸であるRCOOHあるいは
R′COOHにγ−リノレン酸含量が20％以上含む
ホスフアチジルエタノールアミンが微生物から製
造単離濃縮された従来技術は存在しない。［目的］本発明は、γリノレン酸含量の高いホスフアチ
ジルエタノールアミンの製造方法を提供すること
を目的とする。［構成］即ち、本発明によれば、γ−リノレン酸含量の
高いホスフアチジルエタノールアミンの生産にあ
たり、モルテイエレラ属に属するイサベリナ、ビ
ナセア、、ナナ、ラマニアナ、ラマニアナ・アン
グリスポラ又はナナの糸状菌菌株を高濃度の炭水
化物を炭素源とした培地に培養して、培地中に高
密度に得られるγ−リノレン酸を含む脂質の高含
量菌体より抽出されたγ−リノレン酸含有脂質の
アルコール抽出区分から効率よくγ−リノレン酸
含量の高いホスフアチジルエタノールアミンを例
えば吸着法で分離、濃縮することを特徴とするγ
−リノレン酸含量の高いホスフアチジルエタノー
ルアミンの製造方法が提供される。［菌体培養方法］本発明においては、用いる使用菌はモルテイエ
レラ（Mortierella）属のイサベリナ（isabell−
ina）［IFO7824，7884，7873，8183，8309］ビナ
セア（Vinacea）［IFO6738］、ナナ（nana）
［IFO8794］、ラマニアナ（ramani−ana）
［IFO8287］、ラマニアナ・アングリスポラ
（ramaniana var.anglispora）［IFO8187］の各種
菌株である。なお、上記した菌はいずれも財団法
人発酵研究所に保存され、IFOカタログ（菌株目
録）に記載されている糸状菌である。上記の糸状菌を培養する培地の炭素源である炭
水化物としては、たとえばグルコース、フラクト
ース、サツカロース、糖密、デン粉、木材糖化液
などが用いられる。炭水化物は培地１中に20〜
400ｇ用いられるのが好ましい。また窒素源とし
ては、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなど
の様な無機窒素源、または尿素、ペプトン、酵母
エキス、コーン、スチーブ・リカーなど有機窒素
源が用いられる。無機塩としては、例えば
KH₂PO₄，K₂HPO₄，NaCl，FeSO₄・7H₂O，
MgSO₄・7H₂O，ZnSO₄・7H₂Oなどが用いられ
る。その他必要に応じて微量要素、その他の栄養
源を添加する。上記糸状菌の培養は通常液体培地で、振とう培
養、通気撹拌培養などにより行われる。培地のPH
は3.0〜6.0が良く、通常２日〜10日間位培養が行
われる。更に、培養の初期すなわち初期培地に、
また通気撹拌培養の場合では前培養培地に、ある
いは培養の中間段階で酢酸あるいは酢酸塩（ナト
リウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩）を
炭素源濃度など培養条件に応じて0.1〜20ｇ／
培地の割合で加えることにより菌体の培養が行わ
れる（特願昭59−115162）。かくして、培養物中
にγ−リノレン酸など不飽和脂肪酸含量が行い脂
質の高含量菌体が生産性高く生産されるので、培
養物より菌体を分離し、脂質が糸状菌菌体中に含
まれるので、この菌体よりγ−リノレン酸など不
飽和脂肪酸含量の高い脂質を採取するのが好適で
ある。培養物より菌体の分離に当つては菌糸があ
まりのびず極めて小単位（１〜10細胞）で培養さ
れており、従つて、例えば遠心脱水器などにより
極めて容易に分離され、乾燥度の高い菌体（含水
率約60％）になる利点を有することが明らかにな
つた。［抽出方法］ γ−リノレン酸含量の高い脂質の採取は多段抽
出方法で行われる。すなわち、本発明において
は、モルテイエレラ属糸状菌体を、先ず、水の存
在下、アルコールを用いる第１抽出処理工程にお
いて抽出処理する。この場合、処理原料として用
いる菌体には、培地から遠心分離法や濾過法によ
つて分離された含水率50〜80％程度の含水菌体ケ
ーキや、その乾燥物を用いることができるが、経
済性の点からは、含水菌体ケーキを用いるのが有
利である。また、この第１抽出処理工程では、菌
体は、水の存在下、アルコール溶媒中で、機械力
を加えて破砕させることが必要であり、この菌体
破砕によつて効率的な抽出処理が達成される。こ
のような菌体破砕を伴う抽出装置としては、従来
公知の湿式粉砕機、例えば、ボールミル、マサツ
円板ミル、ヘンセルミキサー等を用いることがで
きる。このような粉砕機により菌体は、圧縮力や
マサツ力等の機械力を受け、その一部が破損ない
し破砕される。この場合、菌体を余りにも微細に
破砕することは好ましくなく、濾過性の点から
は、その菌体の粒径は実質上変化しない程度に機
械力を加えるのが好ましい。アルコール溶媒とし
ては、通常、メタノール、エタノール、プロパノ
ール等の低級アルコールが用いられるが、人体に
対する安全性の点から、エタノールの使用が好ま
しい。アルコール溶媒の使用割合は、菌体１重量
部（乾燥物基準）に対し、２〜７重量部、好まし
くは３〜６重量部の割合である。この第１抽出処
理工程では、極性脂質を溶出させるために、水の
存在下で抽出処理を行うことが必要であり、水の
存在量は、アルコール溶媒１重量に対し、0.2〜
0.7重量部、好ましくは0.3〜0.6重量部である。こ
の第１抽出処理系に対する水の添加は、水を含む
菌体を用いて実施し得る他、アルコール溶媒に添
加することによつて行うことができる。このよう
な抽出処理により、菌体に含まれる全極性脂質の
90％以上を抽出分離させることができ、また中性
脂質の一部が抽出される。また、この第１抽出工
程では、脂質回収率は、全脂質回収率に対し、通
常、５〜30重量％、好ましくは８〜25重量％であ
る。次に、前記で得た第１抽出生成物は第１固液分
離工程で破砕菌体成分と極性脂質を含むアルコー
ル溶媒成分とにそれぞれ分離される。この場合、
固液分離法としては、遠心分離法や、濾過分離法
等の慣用の方法が採用される。脂質分は得られた
極性脂質を含むアルコール溶媒成分から常法に従
つて減圧下で溶媒を蒸留留去することにより得ら
れる。［吸着分離法］前記多段抽出方法のアルコールを溶媒とした第
１段目の抽出操作により得られた脂質成分につい
て吸着カラムクロマトグラフイ法による分離操作
を行うことによりγ−リノレン酸含量の高いホス
フアチジルエタノールアミンは分離、精製され
る。すなわち、50〜300メツシユ好ましくは100〜
200メツシユのケイ酸（シリカゲル）、微粒多孔質
シリカ、シリカゲルＨ、シリカゲルＧ、ケイ酸マ
グネシウムなどを充填剤としたカラムを用いて、
ヘキサン、シクロヘキサン、四塩化炭素、ベンゼ
ン、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸水を
溶媒として用いて溶媒の極性に応じて、一種類な
いし２〜３種類混合した溶媒、例えばクロロホル
ムとメタノール４：１、３：２、１：１、１：２
混合溶媒などを順次流下することにより、各極性
脂質の吸着力の差により分離溶出が可能になり、
γ−リノレン酸含量の高いホスフアチジルエタノ
ールアミンが分離されて含まれる溶出液を得る。
この溶出液から常法により溶媒を減圧下で蒸留留
去することより、γ−リノレン酸含量の高いホス
フアチジルエタノールアミンが濃縮されることを
見出した。かくして、本発明によれば高濃度の炭水化物を
炭素源とする培地に高密度に培養された脂質含量
の高い菌体より採取された脂質からγ−リノレン
酸含量の高いホスフアチジルエタノールアミンの
製造が可能になる。［効果］ γ−リノレン酸［18：３（６，９，12）］はリ
ノール酸と共に哺乳動物では食飼として要求され
る必須脂肪酸である。これはγ−リノレン酸が体
内でビスホモ−γ−リノレン酸となり、さらには
アラキドン酸となる前駆体であること、ビスホモ
−γ−リノレン酸、アラキドン酸はそれぞれプロ
スタグランジン、E₁，Ｆ_1a及びE₂，Ｆ_2aとなり生
体中で極めて重要な生理的な役割をはたしている
からである。従つて、γ−リノレン酸含有脂質は
医薬品などとして利用できるものであることは明
らかである。とくに、γ−リノレン酸は生体内ではリン脂質
として蓄縮されていることが知られており、プロ
スタグランジンになる際の前駆体としてはリン脂
質状態の方がより有効に作用するものと考えられ
ることからこのようにγ−リノレン酸含量が20％
以上と高いホスフアチジルエタノールアミンの医
薬品としての用途は十分期待できる。なお、ホスフアチジルエタノールアミンはそれ
を主成分とするリン脂質混合物（レシチン）とし
て知られており、乳化剤などの食品添加物として
マーガリン、チヨコレートなどに用いられてい
る。［実施例］次に本発明を実施例により詳細に説明する。実施例グルコース60ｇ、KH₂PO₄2ｇ、
MgSO₄7H₂O0.3ｇ、NaCl0.1ｇ、マルト・エキス
0.2ｇ、イースト・エキス0.2ｇ、ペプトン0.1ｇ、
FeSO₄・7H₂O10mg、CaCl・2H₂O10mg、
CuSO₄・5H₂O0.2mg、MnSO₄・4H₂O1.0mgと窒素
源として（NH₄）₂SO₄3ｇ［Ｃ／Ｎ比（炭素源中の
炭素原子重量／窒素源中の窒素原子重量）は約
40］を脱イオン水100mlに混合した培地を基準と
して炭素源である炭水化物（グルコース、糖な
ど）の濃度を増加させた場合、その濃度に応じて
培地成分を増加して、又窒素源を尿素などに変え
た場合は同じＣ／Ｎ比になるように培地を調整し
た。この培地を30の培養槽では20仕込み、それ
ぞれ菌株を接種し、30℃の培養温度で所定の時
間、通気量0.5〜2.0vvmで300〜700rpmで撹拌し
て培養を行つた。培養後遠心分離法で菌体を集め
た。又、菌体の増殖量、脂質生成量及び培地中の
炭水化物濃度の測定を行うため、培養の中間段階
において所定の時間毎に100mlずつ試料の採取を
行い、ロ過法により菌体と培地の分離を行つた。
分離された菌体はその一部を含水率の定量のた
め、精秤し恒温槽中120℃で一昼夜乾燥し、含水
率を求め、残りの菌体について脂質の抽出を行つ
た。菌体からの脂質の抽出は、残りの湿菌体にク
ロロホルム−メタノール（２：1V／Ｖ）混液を
加え、ガラスビーズ存在下にホモジナイズするこ
とにより菌体の破砕と脂質の抽出を同時に行つ
た。なお、抽出を完全に行うため、これを５回繰
返し、全抽出液を集めた。上記抽出液をFlochの
分配洗浄法により精製した後、溶媒を減圧留去
し、重量法で全脂質量を測定した。菌体を除いた
培地については高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）により炭水化物（グルコース、フラク
トース、サツカロース）の濃度を測定し、濃度が
０になつた時点で培養を終了した。菌株モルテイエレラ・ラマニアナ・アングリス
ポラIFO8187、モルテイエレラ・ビナセア
IFO6738、モルテイエレラ・イサベリナIFO7824
について、グルコースを炭素源、尿素を窒素源と
した30培養槽により培養して得られた菌体増殖
量（乾燥重量ｇ／）、脂質生成量（ｇ／）、脂
質含量（％）、脂質中のγ−リノレン酸含量を表
−１にまとめて示した。なお培養時間として示し
た時間は炭素源であるグルコースが完全に消費さ
れ、培地中になくなつた時間でありその時間で培
養を停止した。表−１で３菌株ともγ−リノレン酸を含む脂質
が生産性高く生産されていることがわかる。

【表】表−１のモルテイエレラ属糸状菌の30培養槽
による大量培養により得られたγ−リノレン酸含
有脂質の高含量で含む菌体を遠心脱水器により、
脱水分離し、含水率50〜70％の菌体ブロツク（ケ
ーキ）を得る。この菌体ブロツク（以下、湿菌体
と呼ぶ）をオートクレーブ中で120℃、２気圧で
10分間減菌した後、以下に示すようにして脂質の
抽出を行つた。前記の湿菌体1.0〜1.7Kgを、内容積６のステ
ンレス製ボールミルに入れ、さらにエタノール２
を溶媒として加え、４時間ボールミルにより菌
体を破砕しながら抽出処理を行つた。抽出液を濾
過した後、得られた菌体（含水率3.4％）につい
て再度ヘキサン２を溶媒として用い、前記と同
様の抽出処理を７時間行つた。前記２段抽出方法による３菌株についての第１
段のエタノールによる脂質の対菌体抽出率が表−
２に示されている。このエタノール抽出脂質について、下記の方法
によるケイ酸（100〜200メツシユ）を充填剤とす
るカラムクロマトグラフイーを行いホスフアチジ
ルエタノールアミンの濃縮を行つた。すなわち、
前記抽出脂質１ｇに対して30ｇのケイ酸を充填し
たカラムに脂質を吸着させた後、中性脂質をクロ
ロホルムで糖脂質をアセトン、クロロホルム、メ
タノール４：１溶出液でホスフアチジルエタノー
ルアミン以外のリン脂質を流出した後、クロロホ
ルム、メタノール１：１を溶出液として溶出する
区分を得た。得られた区分について薄層クロマト
グラフイーによる分析の結果ホスフアチジルエタ
ノールアミンが純度ほぼ90％に濃縮されているこ
とを認めた。３菌株についてエタノール抽出脂質量に対する
抽出率は表−２の如く8.3〜11.5％と比較的高い
値であり、乾燥菌体に対する抽出率は0.45〜0.56
％であつた。このホスフアチジルエタノールアミンについて
加水分解した後、メチルエステル化を行い、その
脂肪酸組成を比べた結果γ−リノレン酸含量が
27.9％以上と中性脂質区分の約７％と異なり極め
て高い値が認められた。脂肪酸組成を表−２の欄
外に例示したがγ−リノレン酸以外の不飽和脂肪
酸としてはリノール酸及びオレイン酸含量が高い
特殊な脂肪酸組成を有するものであることが明ら
かになつた。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１モルテイエレラ属に属するイサベリナ、ビナ
セア、ラマニアナ、ラマニアナ・アングリスポラ
又はナナの菌株による高濃度の炭水化物を炭素源
とする培地に高密度に培養された脂質含量の高い
菌体より採取された脂質からγ−リノレン酸含量
の高いホスフアチジルエタノールアミンを分離、
濃縮することを特徴とするγ−リノレン酸含量の
高いホスフアチジルエタノールアミンの製造方
法。